Summary
在这里，我们旨在通过从沃顿果冻间充质干细胞中分离的干细胞外泌体的多巴胺负载来获得一种制剂。外泌体分离和表征，药物加载到所得外泌体中，以及所开发制剂的细胞毒性活性在本方案中描述。
Abstract
大小在 40 到 200 nm 之间的外泌体构成了细胞外囊泡的最小亚群。这些由细胞分泌的生物活性囊泡在细胞间货物和通讯中起着积极作用。外泌体主要存在于体液中，如血浆、脑脊液、尿液、唾液、羊水、初乳、母乳、关节液、精液和胸膜酸。考虑到外泌体的大小，人们认为它们可能在中枢神经系统疾病中发挥重要作用，因为它们可以穿过血脑屏障 （BBB）。因此，本研究旨在通过将多巴胺封装到从沃顿果冻间充质干细胞（WJ-MSCs）中分离的外泌体中来开发一种基于外泌体的纳米载体系统。通过表征过程的外泌体与多巴胺一起孵育。负载多巴胺的外泌体在孵育结束时重新表征。在药物释放和细胞毒性测定中研究了多巴胺负载的外泌体。结果表明，多巴胺可以成功地包封在外泌体内，并且负载多巴胺的外泌体不影响成纤维细胞的活力。
Introduction
外泌体是具有显着特征的生物活性囊泡，大小范围为 40 nm 至 200 nm。外泌体起源于细胞膜，是由于内体1 的释放而形成的。这些结构充当细胞间的通讯器，并与相邻细胞相互作用，以促进活性分子的转移。外泌体可以从许多不同的来源分离出来。这些包括体液，如血浆、尿液、脑脊液、唾液，以及在 体外 条件下培养的细胞系。外泌体在消除神经损伤方面发挥着重要作用，这要归功于它们所含的生物大分子，如脂质、蛋白质和核酸2。胶质是神经系统3 的支持细胞， 通过 外泌体4 将蛋白质和微 RNA 转移到神经元的轴突。
形成髓鞘的脂质是神经传导的特征，也通过外泌体从少突胶质细胞中释放出来 4,5。外泌体还参与突触可塑性、神经元应激反应、细胞间通讯和大脑神经发生等过程 6,7。外泌体具有纳米尺寸的事实使它们能够通过BBB。穿透该膜后，从间质液到脑脊液有一条特殊的过渡途径8。由于其表面特性，外泌体可以作为药物递送系统与靶细胞有效相互作用，并主动递送负载的药物。
由于各种粘附蛋白（四跨膜蛋白和整合素）在外泌体表面的表达，这些细胞外囊泡可以很容易地与宿主细胞膜相互作用和融合9。人们认为外泌体可以用作药物递送系统，特别是在治疗中枢神经系统疾病时，因为它们能够穿透BBB及其表面特性。与同种异体细胞疗法相比，间充质干细胞 （MSC） 衍生的外泌体具有较低的免疫排斥风险，在这方面，它们可以成为无细胞治疗应用的重要组成部分10.
多巴胺是一种分子，其大脑中的缺乏是帕金森病（PD）的特征，每天都在恶化11,12,13。众所周知，PD与中脑黑质中多巴胺能神经元的变性和运动神经元功能的丧失有关14,15。多巴胺能神经元的死亡阻止了神经递质多巴胺向脑纹状体的供应。这反过来又导致PD特异性症状的出现16。帕金森病的这些症状是运动迟缓、姿势不稳、僵硬，尤其是静止性震颤12,13。尽管帕金森病在两个多世纪前首次被描述，但了解该疾病的病理学和病因学的研究仍在进行中，目前人们认为帕金森病是一种复杂的全身性疾病17。据预测，当超过80%的神经元退化时，会发生多巴胺缺乏症，并观察到临床PD症状18。在疾病的治疗中，优选不完全的多巴胺补充以减轻运动症状。体内研究表明，将多巴胺直接注入大脑可显着减轻动物的症状19.多巴胺前体如L-DOPA（L-3,4-二羟基苯丙氨酸）和多巴胺受体药物在临床上使用，因为人类不可能将多巴胺直接输注到大脑中，并且进入系统的多巴胺不能穿过BBB20。这些类型的药物会随着时间的推移而失去效力。然而，目前尚无针对帕金森病的根治性治疗方法，因此，开发新的治疗策略和治疗方式以揭示疾病的病理生理学并减少帕金森病对患者的影响是非常必要的。
最近，基于外泌体的研究因收集有关神经系统疾病的治疗方法和病理学的信息而引起了人们的关注。MSC 衍生的外泌体已被证明可以减少神经损伤中的炎症并有助于神经元再生21,22,23。此外，据报道，MSC 衍生的外泌体分泌组通过显示神经营养和神经保护作用来减少细胞凋亡，尤其是对多巴胺能神经元24,25。近年来，对将外泌体用作治疗性药物递送系统的平台的研究急剧加快。在许多研究中，已经观察到相关药物可以很容易地封装到外泌体中并安全地递送至靶细胞、组织和器官中 26,27。孵育、冻融循环、超声处理和挤压等不同方法可用于将药物加载到外泌体中28。
与外泌体或外泌体样囊泡共孵育可使亲脂性小分子被动封装到这些递送系统中28,29,30。特别是姜黄素31、过氧化氢酶30、多柔比星32和紫杉醇33等多种分子被有效地装载到外泌体中。据观察，具有抗氧化活性的含过氧化氢酶的外泌体在大脑的神经元和小胶质细胞中有效积累，并表现出很强的神经保护活性30。在同一项研究中，发现添加到复合物中以增加负载效率的皂苷在孵育期间增加了载药百分比30,34。然而，需要进一步的研究来建立外泌体的药物负荷标准。
本文描述了通过将多巴胺封装到从 WJ-MSC 中分离的外泌体中来开发纳米载体系统。详细解释了所有步骤，包括WJ-MSCs的培养、外泌体的分离和表征、载药实验、用各种技术表征多巴胺负载的外泌体以及 体外 细胞毒性分析。
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Protocol
注意：有关本协议中使用的所有材料和设备的详细信息，请参阅 材料表 。
1. 沃顿果冻间充质干细胞的培养和冷冻保存
- 从-80°C冰箱中取出WJ-MSC（来自ATCC）。将细胞接种到含有补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 的 DMEM-F12 培养基的烧瓶中。将它们在37°C下在含有5%CO2的培养箱中孵育。
- 每 2 天更换一次培养基。当细胞达到 80% 汇合度时传代细胞。用 5 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤要传代的细胞。
注意：在加入胰蛋白酶之前用PBS洗涤可确保细胞与烧瓶表面轻松分离。 - 取出PBS，向烧瓶中加入5mL胰蛋白酶-EDTA溶液。将烧瓶在37°C下在含有5%CO2的培养箱中孵育5分钟。
- 将上清液收集到管中，并以1,500× g 离心5分钟。离心后，除去上清液，通过移液向管中加入 1 mL DMEM-F12 + 10% FBS。
- 将细胞转移到更大的烧瓶中，并通过加入DMEM-F12 + 10%FBS继续培养，直到获得足够的外泌体35。
注：将培养的细胞用10%二甲基亚砜（DMSO）以100万/mL的密度冷冻并储存在-80°C。
2. 沃顿氏果冻间充质干细胞外泌体的生产
注：外泌体是从培养的WJ-MSCs中分离出来的，当细胞覆盖烧瓶表面并达到约80%的密度时，进行外泌体分离。
- 从烧瓶中取出含有 10% FBS 的上清液培养基，并用 5 mL PBS 洗涤细胞。用 PBS 冲洗后向细胞中加入无血清 DMEM-F12 培养基。在5%CO2培养箱中将烧瓶在37°C孵育48小时。孵育后，将无血清培养基收集在管中并储存在-20°C。
注：在步骤2.1中，收集180mL无血清培养基并储存在-20°C。 解冻后，开始分批离心过程，如下所述。 - 外泌体分离
- 将收集的无血清培养基在+4°C下以300× g 离心10分钟。 小心地取出上清液并将其转移到另一个试管中。
- 将收集的上清液在+4°C下以2,000× g 离心10分钟。 小心地取出上清液并将其转移到另一个试管中。
- 将收集的上清液在+4°C下以10,000× g 离心30分钟。 小心地取出上清液并将其转移到另一个试管中。
- 将收集的上清液转移到超速离心管中，并以110,000× g 超速离心130分钟。慢慢除去上清液，向沉淀中加入 1 mL PBS。
- 涡旋沉淀并在+4°C36下以110,000×g超速离心70分钟（图1）。慢慢除去上清液，向沉淀中加入 1 mL PBS。
注：超速离心步骤完成后，获得的外泌体可以储存在-80°C。 获得的颗粒现在可以进行表征。
图 1：外泌体分离。 请点击这里查看此图的较大版本.
3. 外泌体的表征
- 纳米粒子跟踪分析（NTA）
注：进行纳米颗粒跟踪分析以确定分离的外泌体的大小和浓度。用于1x PBS溶液的片剂必须在pH 7.3-7.5的范围内。1x PBS溶液含有10mM磷酸盐缓冲液，137mM氯化钠和2.7mM氯化钾。通过在100mL蒸馏水中加入1 PBS片剂来制备溶液。该制备的溶液通过高压灭菌灭菌。- 通过将 990 μL PBS 加入 10 μL 外泌体中，将外泌体稀释 100 倍。将稀释的悬浮液放入一次性注射器中。
- 打开 NTA 设备并连接计算机。打开软件。
- 将注射器中的样品注入设备盒部分的管道中。关闭设备的盒盖。
- 在打开的软件中，单击“ 开始分析 ”按钮。保存按 “记录 ”按钮获得的结果。
- 动态光散射分析
注：用于 zeta 电位和大小测量分离的外泌体也以与 NTA 分析相同的方式稀释。- 将 980 μL PBS 加入 20 μL 外泌体中。
- 打开 zeta 尺寸调整设备和连接的计算机。打开软件。
- 将步骤 3.2.1 中的悬浮液添加到一次性比色皿中。打开设备盖，将比色皿放入盒中，然后合上盖子。
- 在设备的软件中选择比色皿类型。单击 “开始分析 ”按钮进行 zeta 电位和尺寸分析。
注： 尺寸分析和 zeta 电位的分析是分开进行的。
4. 多巴胺加载到外泌体中
注：WJ-MSCs外泌体表征完成后，获得负载多巴胺的外泌体作为药物递送系统。使用孵育方法将药物加载到外泌体中。
- 从步骤2.2.5开始向外泌体悬浮液中加入3mL PBS。通过使用0.22μm过滤器过滤对稀释的悬浮液进行灭菌。将 500 μL 灭菌的外泌体悬浮液转移到另一个试管中。
- 用蒸馏水制备多巴胺溶液（0.5mg / mL）。将 500 μL 多巴胺溶液加入含有外泌体的试管中。
- 在步骤4.2中将皂苷添加到悬浮液中。将制备的外泌体 - 多巴胺悬浮液在37°C孵育24小时。
注意：皂苷浓度不应超过总溶液的0.002%。 - 将悬浮液以 90,000 × g 超速离心 70 分钟，以从培养基中除去游离多巴胺和皂苷。将分离的外泌体储存在-20°C，直至用于进一步分析37。
注：添加0.02%抗坏血酸，以保持制备的多巴胺溶液的稳定性。
5. 多巴胺负载外泌体的表征
- 纳米颗粒跟踪分析（NTA）
注：进行纳米颗粒跟踪分析以确定分离的外泌体的大小和浓度。- 按照步骤3.1.1-3.1.4稀释外泌体并进行NTA。
- 动态光散射分析
注：用于 zeta 电位和大小测量的分离外泌体也与 NTA 分析类似地稀释。- 按照步骤3.2.1-3.2.4稀释外泌体并进行动态光散射分析。
注：分别分析每种溶液（皂苷，多巴胺，外泌体 - 多巴胺）的大小和zeta电位。
- 按照步骤3.2.1-3.2.4稀释外泌体并进行动态光散射分析。
6. 高效液相色谱（HPLC）
注：通过高效液相色谱（HPLC）方法测量加载到外泌体中的多巴胺的量。为了检测所获得的制剂中多巴胺的存在，外泌体通过特殊过程引爆。
- 将配方放入75°C加热器中蒸发。将乙腈（50：50比例）加入悬浮液中并涡旋。超声处理溶液10分钟。
- 将溶液以10,000× g离心10分钟。通过0.22μm过滤器过滤上清液。
- 使用C18色谱柱在30°C下以1mL/min的流速分析所有分析物（流动相H2O/乙腈）。测量230nm处的吸光度38。
7. 载药量（DL）测定及 体外 药物释放动力学
- 载药量 （DL）
注：使用紫外-可见光谱法量化加载到外泌体中的多巴胺量。吸光度在280nm处读取。合成过程中收集的上清液用于测量卸载药物的量。上清液中的多巴胺浓度 通过 多巴胺的标准校准曲线测定。- 制备 1 mg/mL 多巴胺的储备溶液。使用蒸馏水从储备溶液中制备浓度为 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 和 0.5 mg/mL。
注：添加0.02%抗坏血酸，以保持制备的多巴胺溶液的稳定性。 - 通过在紫外分光光度计中测量多巴胺在280nm处的每种稀释度来生成标准校准曲线。
- 测量上清液在280nm处的吸光度。
- 使用方程（1）39计算多巴胺的载药量。
DL （%） =
100 （1）
注：分析一式三份。
- 制备 1 mg/mL 多巴胺的储备溶液。使用蒸馏水从储备溶液中制备浓度为 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 和 0.5 mg/mL。
- 体外 药物释放动力学
注：使用透析膜进行多巴胺负载外泌体的药物释放动力学。PBS，pH 7.4，用作模拟生理微环境的释放介质。- 向透析膜中加入 1 mL 负载多巴胺的外泌体。将膜放入烧杯中。向烧杯中加入 15 mL PBS。
- 在烧杯中取样 1 mL 离型培养基，分别在 0.5、1、2、4、6 和 8 小时。在每个时间点，用新鲜的PBS替换样品的体积。使用紫外-可见光谱仪分析在280nm处以指定间隔采集的样品。
- 使用方程（2）40计算结果。
释放 （%） =
100 （2）
注：准备用于测定 体外 药物释放动力学的校准曲线。制备浓度为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5.0mg/mL的多巴胺溶液。用紫外-可见分光光度计在280nm处测定每种浓度的紫外吸光度值。
100 （1）
100 （2）8. 体外 细胞毒性试验
- 成纤维细胞的活化和培养
- 从-80°C冰箱中取出成纤维细胞。将细胞接种到含有DMEM-F12 + 10%FBS的烧瓶中。
- 将细胞在37°C下在含有5%CO2的培养箱中孵育。每 2 天更换一次培养基。
- 传代细胞，直到它们达到 80% 汇合度。按照步骤 1.3-1.5 操作。以 1,500 × g 离心 5 分钟后，除去上清液，加入 1 mL DMEM-F12 + 10% FBS，并在 96 孔板中每孔接种 10,000 个细胞。
- 加入DMEM-F12培养基+ 10%FBS，并将细胞在37°C下在含有5%CO2的培养箱中孵育18小时。在孵育结束时更换孔的培养基。
- 准备负载多巴胺的外泌体悬浮液的储备液。用培养基稀释负载多巴胺的外泌体制剂，以获得 100 μL/mL、250 μL/mL、500 μL/mL 和 1,000 μL/mL 的浓度。
- 将制备的浓度添加到96孔板的每个孔内的细胞上。将板在37°C下在含有5%CO241的培养箱中孵育18小时。
- MTT细胞活力测定
注：在孵育结束时，细胞的活力比通过MTT测试确定。- 用PBS制备MTT溶液（5mg / mL）。向每个孔中加入 10 μL MTT 溶液。在37°C孵育4小时。
- 在孵育结束时，向每个孔中加入 100 μL DMSO。将板在室温下在黑暗中孵育30分钟。在ELISA读数器中测量570nm处的吸光度值42,43。
注意：MTT 活力测试一式三份进行。
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Representative Results
外泌体分离和表征
当培养物达到足够的密度时，将沃顿果冻干细胞培养并在无血清培养基中孵育48小时。孵育结束后，将上清液储存在-20°C。 将收集的上清液用PBS稀释并进行超速离心（图1）。通过NTA和DLS分析分析得到的溶液。外泌体通过0.22μm过滤器进行灭菌。获得的外泌体的平均大小被确定为 98 nm（视频 1）。离心结束时获得约100亿个外泌体颗粒。NTA和DLS分析揭示的纳米颗粒数量彼此一致。此外，源自WJ-MSCs的外泌体的zeta电位测量为-15.7mV（图2 和 图3）。
视频1：沃顿果冻衍生外泌体的纳米颗粒跟踪分析。请按此下载此影片。
将多巴胺加载到外泌体中
根据 NTA 分析的计算，在 500 μL 沃顿果冻分离的样品中大约有 15 亿个纳米颗粒。将多巴胺溶液（5mg / mL）与500μL外泌体混合，并将悬浮液在37°C下孵育24小时。 孵育后，通过NTA和DLS分析对获得的溶液进行表征。根据NTA结果，发现溶液的平均粒径为110 nm。外泌体和负载多巴胺的外泌体的粒径比较表明，负载多巴胺的外泌体的尺寸显着增加。NTA和DLS分析揭示的纳米颗粒数量彼此一致。此外，多巴胺负载外泌体的 zeta 电位测量为 -17.6 Mv（图 2 和 图 3）。
视频2：负载多巴胺的外泌体的纳米颗粒跟踪分析。请按此下载此影片。
| 样本 | Zeta 电位 |
| 外泌体 | -15.7 毫伏 ± 1.1 |
| 皂素 | -12 mV ± 0.7 |
| 多巴胺 | -14.4 毫伏 ± 1.3 |
| 多巴胺负载的外泌体 | -17.6 毫伏 ± 0.8 |
表 1：所有解决方案的 Zeta 电位。
DSL分析、多巴胺、皂苷和多巴胺负载外泌体溶液的Zeta大小和Zeta电位表如 表 1所示。
图2：外泌体的纳米颗粒跟踪分析。 （A） 外泌体;（B）负载多巴胺的外泌体。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：Zetasizer 分析 。 （A）外泌体，（B）负载多巴胺的外泌体，（C）皂苷，（D）多巴胺。缩写：d = size。 请点击这里查看此图的较大版本.
通过HPLC分析测定溶液中多巴胺的存在。对负载多巴胺的外泌体进行超速离心和过滤以除去游离多巴胺。如果在孵育结束时成功将多巴胺加载到外泌体中，则可以通过在外泌体破裂后直接测量多巴胺来检测。为此，将负载多巴胺的外泌体悬浮液用蒸汽加热，加入乙腈，并将悬浮液超声处理。在 230 nm 处测量吸光度以评估从破坏的外泌体释放的多巴胺量。
图 4：通过 HPLC 分析确定配方中多巴胺的存在。 所有分析均使用流动相为H2O/乙腈的C-18色谱柱在30 °C下以1 mL/min的流速进行。 在230nm处测量吸光度以监测多巴胺的洗脱。（A）多巴胺，（B）皂苷，（C）负载多巴胺的外泌体。简称：HPLC=高效液相色谱法。 请点击这里查看此图的较大版本.
作为HPLC分析的结果，在6.45 min处观察到多巴胺的峰值。外泌体片段化后也检测到皂苷的存在（图4）。
载药能力和 体外 药物释放动力学
使用紫外分光光度法测量和方程 （1） 和方程 （2） 计算多巴胺负载能力。加载能力百分比为 10.89 ± 0.33。累积药物释放曲线如图 5所示。监测 8 小时的药物释放动力学显示，74.8% 的包封多巴胺在前 8 小时内从外泌体释放（图 5）。
图5：累积药物释放曲线。 请点击这里查看此图的较大版本.
体外 细胞毒性试验
研究了多巴胺负载和游离外泌体对成纤维细胞的细胞毒性。将成纤维细胞暴露于不同浓度的制剂（100 μL/mL、250 μL/mL、500 μL/mL 和 1,000 μL/mL）中，孵育 18 小时。尽管负载多巴胺的外泌体没有显示出任何显着的细胞毒性作用，但添加到制剂中的皂苷以增加多巴胺的包封会降低成纤维细胞活力（p < 0.05， 图6）。当用浓度高达 500 μL/mL 的多巴胺负载外泌体处理成纤维细胞时，细胞活力增加。在18小时孵育结束时，通过MTT测试确定细胞活力（图7）。通过单因素方差分析评估结果的统计学意义。
图 6：制剂与细胞孵育后的显微镜图像 （10x）。 （A） 多巴胺，（B） 皂苷，（C） 多巴胺负载外泌体 100 μL/mL，（D） 多巴胺负载外泌体 250 μL/mL，（E） 多巴胺负载外泌体 500 μL/mL，（F） 多巴胺负载外泌体 1,000 μL/mL。比例尺 = 100 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7：用不同浓度的多巴胺、皂苷和负载多巴胺的外泌体孵育 18 小时的细胞中 MTT 活力测试结果的 统计分析。 （A）细胞毒性结果，（B，C）统计分析。缩写：D = 多巴胺;S = 皂苷;Exo-DA1 = 多巴胺负载的外泌体 100 μL/mL;Exo-DA2 = 负载多巴胺的外泌体 250 μL/mL;Exo-DA 3 多巴胺负载外泌体 500 μL/mL;Exo-DA 4 = 负载多巴胺的外泌体 1,000 μL/mL;MTT = 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四氮唑溴化物。 请点击这里查看此图的较大版本.
此外，还研究了游离外泌体对相似浓度的成纤维细胞的细胞毒性作用（图8）。实验前，外泌体用PBS稀释至每毫升6000万个颗粒。然后，将 10 μL、25 μL、50 μL 和 100 μL 的外泌体悬浮液加入到 96 孔板的每个孔中。
图 8：用不同浓度的外泌体孵育 18 小时的细胞中 MTT 活力测试结果的 统计分析。 （A）细胞毒性结果，（B，C）统计分析。缩写：EXO = 外泌体;MTT = 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四氮唑溴化物。 请点击这里查看此图的较大版本.
与其他浓度相比，500 μL/mL 负载多巴胺的外泌体和 25 μL/mL 游离外泌体的成纤维细胞活力更高。然而，在任何浓度下均未观察到显着的细胞毒性。
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Discussion
外泌体是大多数细胞类型分泌的尺寸为 40-200 nm 的小膜囊泡，例如 MSCs1。外泌体能够实现细胞之间的通讯，可以以不同的方式进入细胞，例如内吞作用、吞噬作用、微胞饮作用、脂质介导的内化和融合33,44。与其他纳米载体系统相比，在外泌体表面发现的脂质和胆固醇赋予了携带亲水性和疏水性分子的能力，胆固醇末端的氢键允许紧密包装45。
本研究采用MSC来源的外泌体分离、载药实验和细胞毒性试验等方法。众所周知，外泌体在神经发生中起着重要作用，特别是在大脑中，此外还具有重要的功能，例如货物和细胞之间的交流6,7。此外，MSC衍生的外泌体具有相对良好的耐受性，具有固有的治疗特性，并显示出高稳定性和归巢能力46,47。近年来，由于神经元损伤引起的神经退行性疾病无法治愈这些疾病，因此外泌体应用等纳米级治疗方法的研究作为神经退行性疾病的替代疗法引起了广泛关注。此外，外泌体通过BBB的能力使其成为作为药物载体系统的极好平台。
虽然外泌体分离有几种方法，但本文，我们使用了超速离心分离方法，它被公认为最有效的方法之一。在目前的研究中，被选为供体细胞的WJ-MSCs以其低免疫原性潜力47而闻名，并在临床试验中被用作外泌体的来源48。然后将获得的外泌体与多巴胺溶液一起孵育，在此期间将皂苷添加到溶液中以增加载药成功率。在孵育结束时，从培养基中除去游离多巴胺和皂苷。皂苷有望选择性地去除外泌体的膜结合胆固醇，并在外泌体脂质双层中产生孔隙，促进多巴胺分子的进入。结果，观察到外泌体的尺寸略有增加，可能是由于多巴胺负荷。
zeta 电位显示出粒子之间的更大静电排斥力及其聚集趋势。所获得制剂的 zeta 电位与先前研究的结果相容49.在孵育期结束时进行的HPLC分析中，在外泌体片段化后检测到多巴胺的存在。如上所述，皂苷促进多巴胺的包封。基于吸光度值39，通过紫外-可见分光光度法测量载药量。虽然用于载药的孵育方法比其他方法简单且成本更低，但该方法的载药效率较低26。在这项研究中，负载能力约为 11%。皂苷是细胞质膜50 的有效透化剂，似乎可以增加多巴胺外泌体的负载能力。
在未来的研究中，首选超声处理方法以提高外泌体载药效率可能更有效38。累积药物释放曲线显示，在孵育8小时结束时释放了大量的多巴胺。在 体外 释放研究的前5小时内观察到爆炸性释放。由于外泌体制剂的释放曲线取决于许多参数，例如药物性质、双层流动性和分子量，因此在许多研究中可以观察到每小时释放药物量的差异51。此外，在这项研究中，未观察到制剂对成纤维细胞的细胞毒性作用。然而，在成纤维细胞上检测到添加皂苷以增加多巴胺负荷到外泌体中的毒性作用。根据这些数据，与脂质体、微球、微乳液和其他合成药物递送系统相比，外泌体的内生性是一种自然而独特的优势52。为了减少当前方法的缺点，可以使用不同的转染试剂、电穿孔技术或内源性多巴胺产生细胞，优选转基因的MSCs作为外泌体的来源。
用该方案进行外泌体分离。然而，隔离步骤是一个非常漫长和困难的过程。应注意确保从细胞培养物中收集的上清液位于无血清培养基中。此外，迄今为止，外泌体的数量与蛋白质浓度有关。然而，我们提出计算和应用外泌体颗粒的数量可以帮助提高临床研究的准确性。发现用于分离外泌体载药的孵育方法在载药能力方面较低。超声处理方法具有较高的载药量，可能有助于获得更有效的结果。
这些发现表明，WJ-MSC衍生的外泌体是多巴胺递送的强大载体。除了它们通过BBB的能力和免疫调节特性外，帕金森氏症或任何其他中枢神经系统疾病的靶向治疗都可以使用携带药物的外泌体进行开发。然而，研究应 在体内 进行，并得到临床试验的支持。
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Disclosures
作者声明他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作主要由耶尔德兹技术大学科学研究项目 （TSA-2021-4713） 提供的研究资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 0.45 µm syringe filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 15 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| Acetonitrile | Sigma | 271004-1L | Used for HPLC analysis |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process | |
| Cell Culture Cabin | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Centrifugal | Hitachi | CF16RN | Used in the exosome isolation step |
| CO2 incubator with Safe Cell UV | Panasonic | Used for the cell culture process | |
| Dopamine hydrochloride H8502-10G | Sigma | H8502-10G | Used in exosome dopamine loading |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | To store cells and the resulting exosomes |
| Fridge | Panasonic | MPR-215-PE | Used to store cell culture and other materials |
| High performance liquid chromatography-HPLC | Agilent Technologies | The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated. | |
| Microscope- Primovert | Zeiss | Used to observe cells in cell culture. | |
| MTT Assay | Biomatik | Used to measure cell viability | |
| NanoSight NS300 | Malvern panalytical | Malvern panalytical | Used for exosome characterization |
| Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Used in the exosome isolation step | |
| PBS tablet | Biomatik | 43602 | In the preparation of the PBS solution |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Pipette Aid | Isolab | ||
| Precision balance-Kern | Kern-ABJ220-4NM | Used in the preparation of solutions | |
| Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Used to digest exosomes in HPLC analysis | |
| Saponin | Sigma | 47036-50G-F | It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process. |
| Spectrostar-Nano-Spectrophotometry | BMG LABTECH | Used for MTT and drug release analyzes | |
| SPSS 22 | statistical package program | ||
| Vorteks-FinePCR | FinePCR-FineVortex | Used to mix solutions homogeneously | |
| Water Bath 37 °C-Senova | Senova | Used in cell culture step | |
| Wharton’s jelly mesenchymal stem cells | ATCC | ||
| ZetaSizer | Malvern Nano ZS | Malvern Nano ZS | Used for exosome characterization |
References
- Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. L., Kwon, Y. L. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
- Riazifar, M., et al. Stem cell-derived exosomes as nanotherapeutics for autoimmune and neurodegenerative disorders. ACS Nano. 13 (6), 6670-6688 (2019).
- Ursavaş, S., Darıci, H., Karaoz, E. Olfactory ensheathing cells: Unique glial cells promising for treatments of spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 99 (6), 1579-1597 (2021).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Fruhbeis, C., Frohlich, D., Kramer-Albers, E. M. Emerging roles of exosomes in neuron-glia communication. Frontiers in Physiology. 3 (119), 1-7 (2012).
- Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: new players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabil Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
- Saeedi, S., Israel, S., Nag, C., Turecki, G. The emerging role of exosomes in mental disorders. Translational Psychiatry. 9 (1), 122 (2019).
- Jan, A. T., et al. Perspective insights of exosomes in neurodegenerative diseases: A critical appraisal. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 317 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Pahuja, R., et al. Trans-blood brain barrier delivery of dopamine-loaded nanoparticles reverses functional deficits in Parkinsonian rats. ACS Nano. 9 (5), 4850-4871 (2015).
- Rao, S. S., Hofmann, L. A., Shakil, A. Parkinson's disease: Diagnosis and treatment. American Family Physician. 15 (74), 2046-2054 (2006).
- Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Frontiers Neuroscience. 11, 737 (2017).
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson disease in 2015: Evolving basic, pathological and clinical concepts in PD. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 65-66 (2016).
- Poewe, W., et al.
- Carlsson, T., Björklund, T. Restoration of the striatal dopamine synthesis for Parkinson's disease: Viral vector-mediated enzyme replacement strategy. Current Gene Therapy. 7 (2), 109-120 (2007).
- Simon, D. K., Tanner, C. M., Brundin, P. Parkinson disease epidemiology, pathology, genetics, and pathophysiology. Clinics in Geriatric Medicine. 36 (1), 1-12 (2020).
- Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. Journal of Parkinson's Disease. 3 (3), 255-269 (2013).
- Senthilkumar, K. S., et al. Unilateral implantation of dopamine-loaded biodegradable hydrogel in the striatum attenuates motor abnormalities in the 6-Hydroxydopamine model of Hemi-Parkinsonism. Behavioral Brain Research. 184 (1), 11-18 (2007).
- Krishna, R., Ali, M., Moustafa, A. A. Effects of combined MAO-B inhibitors and levodopa vs. monotherapy in Parkinson's disease. Frontiers Aging Neuroscience. 6, 180 (2014).
- Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. JAMA. 323 (6), 548-560 (2020).
- Rivero Vaccari, J. P. Exosome-mediated inflammasome signaling after central nervous system injury. Journal of Neurochemistry. 136, Suppl. S1 39-48 (2016).
- Han, D., Wu, C., Xiong, Q., Zhou, L., Tian, Y. Anti-inflammatory mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat model of spinal cord injury. Cell Biochemistry and Biophysics. 71 (3), 1341-1347 (2015).
- Vilaça-Faria, H., Salgado, A. J., Teixeira, F. G. Mesenchymal stem cells-derived exosomes: A new possible therapeutic strategy for Parkinson's disease? Cells. 8 (2), 118-135 (2019).
- Mendes-Pinheiro, B., et al. marrow mesenchymal stem cells secretome exerts neuroprotective effects in a Parkinson's disease rat model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 294 (2019).
- Kalani, A., Kamat, P. K., Chaturvedi, P., Tyagi, S. C., Tyagi, N. Curcumin-primed exosomes mitigate endothelial cell dysfunction during hyperhomocysteinemia. Life Sciences. 107 (1-2), 1-7 (2014).
- Kalani, A., Tyagi, A., Tyagi, N. Exosomes: Mediators of neurodegeneration, neuroprotection, and therapeutics. Molecular Neurobiology. 49 (1), 590-600 (2014).
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Molecular Therapy. 23 (5), 812-823 (2015).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
- Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
- Yang, T., et al. Exosome delivered anticancer drugs across the blood-brain barrier for brain cancer therapy in danio rerio. Pharmaceutical Research. 32 (6), 2003-2014 (2015).
- Chen, H. X., et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Disease. 11 (4), 288 (2020).
- Yu, F., et al. Olfactory ensheathing cells seeded decellularized scaffold promotes axonal regeneration in spinal cord injury rats. Journal of Biomedical Materials Research. 109 (5), 779-787 (2020).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Qu, M., et al. Dopamine-loaded blood exosomes targeted to brain for better treatment of Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 287, 156-166 (2018).
- Kim, M. S., et al. Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome MDR In cancer cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 12 (3), 655-664 (2016).
- Branquinho, R. T., et al. HPLC-DAD and UV-spectrophotometry for the determination of lychnopholide in nanocapsule dosage form: Validation and application to release kinetic study. Journal of Chromatographic Science. 52 (1), 19-26 (2014).
- Karagöz Kutlutürk, I., et al. Producing aflibercept loaded poly (lactic-co-glycolic acid) [PLGA] nanoparticles as a new ocular drug delivery system and its challenges. Fresenius Environmental Bulletin. 30 (2), 1481-1493 (2021).
- Setiawatie, E. M., et al. Viability of nigella sativa toothpaste with SLS compared non-SLS on fibroblast cell culture. Journal of International Dental and Medical Research. 14 (2), 525-528 (2021).
- Jebelli, A., Khalaj-Kondori, M., Rahmati-Yamchi, M. The effect of beta-boswellic acid on the expression of Camk4 and Camk2α genes in the PC12 cell line. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 10 (3), 437-443 (2020).
- Cantelmo, R. A., Santos, N. A., Santos, A. C., Regiane, S., Joca, L. Dual effects of S-Adenosyl-Methionine on Pc12 cells exposed to the dopaminergic neurotoxin MPP. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 72 (10), 1427-1435 (2020).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Kooijmans, S. A., Vader, P., van Dommelen, S. M., van Solinge, W. W., Schiffelers, R. M. Exosome mimetics: A novel class of drug delivery systems. International Journal of Nanomedicine. 7 (1), 1525-1541 (2012).
- Yuan, Z., Kolluri, K. K., Gowers, K. H., Janes, S. M. Trail delivery by MSC-derived extracellular vesicles is an effective anticancer therapy. Journal Extracell Vesicles. 6 (1), 1265291 (2017).
- Darici, H., Sun, E., Koyuncu-Irmak, D., Karaöz, E. Mesenchymal stem cells for the treatment of COVID-19: Why and when they should be used? in Human Mesenchymal Stem Cells. Journal of Stem Cells. Khan, M. 4 (15), 159-181 (2021).
- Koyuncu-Irmak, D., Darici, H., Karaoz, E. Stem cell-based therapy option in COVID-19: Is it promising? Aging and Disease. 11 (5), 1174-1191 (2020).
- Leblanc, P., et al. Isolation of exosomes and microvesicles from cell culture systems to study prion transmission. Exosomes Microvesicles. 1545, 153-176 (2017).
- Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect Of porphyrins. Journal of Control Release. 205, 35-44 (2015).
- Mehryab, F., et al. Exosomes as a next-generation drug delivery system: An update on drug loading approaches, characterization, and clinical application challenges. Acta Biomaterialia. 113, 42-62 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
