Summary
ここでは、ウォートンゼリー間葉系幹細胞から幹細胞の単離エクソソームをドーパミン負荷することで製剤を得ることを目指しました。エキソソームの単離と特性評価、得られたエクソソームへの薬物負荷、および開発された製剤の細胞毒性活性は、このプロトコルで説明されています。
Abstract
サイズが40〜200nmのエクソソームは、細胞外小胞の最小サブグループを構成します。細胞から分泌されるこれらの生理活性小胞は、細胞間のカーゴやコミュニケーションに積極的な役割を果たしています。エクソソームは、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、羊水、初乳、母乳、関節液、精液、胸膜などの体液に多く含まれています。エクソソームは、その大きさから、血液脳関門(BBB)を通過できることから、中枢神経系疾患において重要な役割を担っているのではないかと考えられます。そこで本研究では、ウォートンゼリー間葉系幹細胞(WJ-MSC)から単離したエクソソームにドーパミンを内包することで、エクソソームを用いたナノキャリアシステムの開発を目指しました。特性評価プロセスに合格したエクソソームをドーパミンとインキュベートしました。ドーパミンをロードしたエクソソームは、インキュベーションの最後に再特徴付けされました。ドーパミンをロードしたエクソソームを、薬物放出および細胞毒性アッセイで調査しました。その結果、ドーパミンがエクソソーム内にうまくカプセル化され、ドーパミンをロードしたエクソソームが線維芽細胞の生存率に影響を与えないことが示されました。
Introduction
重要な特徴を持つ生理活性小胞であるエクソソームは、40nmから200nmまでの大きさです。エクソソームは細胞膜に由来し、エンドソーム1の放出によって形成される。これらの構造は、細胞間コミュニケーターとして機能し、隣接する細胞と相互作用して活性分子の移動を促進します。エクソソームは、多くの異なる供給源から単離することができます。これらには、血漿、尿、脳脊髄液、唾液などの体液、および in vitro 条件下で培養された細胞株が含まれます。エクソソームは、脂質、タンパク質、核酸などの生体高分子を含むため、神経損傷の除去に重要な役割を果たします2。神経系の支持細胞であるグリアは3、エクソソーム を介して タンパク質やマイクロRNAをニューロンの軸索に伝達します4。
神経伝導の特徴であるミエリン鞘を形成する脂質も、エクソソームを介してオリゴデンドロサイトから放出される4,5。エクソソームは、シナプス可塑性、ニューロンストレス応答、細胞間コミュニケーション、脳内のニューロン新生などのプロセスにも関与しています6,7。エクソソームはナノ次元を持っているため、BBBを通過することができます。この膜8を貫通した後、間質液から脳脊髄液への特別な移行経路がある。エクソソームは、その表面特性により、薬物送達システムとして標的細胞と効率的に相互作用し、負荷された薬物を能動的に送達することができます。
エクソソームの表面には様々な接着性タンパク質(テトラスパニンおよびインテグリン)が発現しているため、これらの細胞外小胞は宿主細胞膜と容易に相互作用し、融合することができる9。エクソソームは、BBBに浸透する能力とその表面特性により、特に中枢神経系疾患の治療において、薬物送達システムとして使用できると考えられています。間葉系幹細胞(MSC)由来のエクソソームは、同種細胞療法と比較して免疫拒絶反応のリスクが低く、この点で、無細胞治療アプリケーションの重要な要素となり得る10。
ドーパミンは、脳内の欠乏がパーキンソン病(PD)の特徴である分子であり、日々悪化します11,12,13。PDは、中脳の黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの変性および運動ニューロン機能の喪失と関連していることが知られている14,15。ドーパミン作動性ニューロンの死は、神経伝達物質ドーパミンの脳線条体への供給を妨げる。その結果、PD特異的な症状が出現する16。PDのこれらの症状は、運動緩慢、姿勢の不安定性、硬直、特に安静時の振戦です12,13。パーキンソン病は2世紀以上前に初めて記述されたが、この疾患の病理学と病因を理解するための研究はまだ進行中であり、現在、パーキンソン病は複雑な全身性疾患であることが認められている17。ドーパミン欠乏症が起こり、神経細胞の80%以上が変性すると臨床的PD症状がみられると予測されている18。この疾患の治療では、運動症状を軽減するために不完全なドーパミン補給が好まれます。In vivo研究では、ドーパミンを脳に直接注入すると、動物の症状が大幅に軽減されることが示されています19。L-DOPA(L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン)やドーパミン受容体薬などのドーパミン前駆体は、ヒトでは脳へのドーパミンの直接注入が不可能であり、体内に入るドーパミンがBBB20を通過できないため、診療所で使用されています。これらのタイプの薬は、時間の経過とともに効果を失います。したがって、疾患の病態生理を明らかにし、PDの患者への影響を軽減するために、新しい治療戦略と治療法を開発することが非常に必要です。
近年、エクソソームを用いた研究は、神経系疾患の治療法と病態の双方に関する情報収集として注目されています。MSC由来のエクソソームは、神経損傷の炎症を軽減し、神経細胞の再生に寄与することが示されています21,22,23。さらに、MSC由来のエクソソームセクレトームは、特にドーパミン作動性ニューロンに対して神経栄養作用および神経保護作用を示すことにより、アポトーシスを減少させることが報告されています24,25。近年、エクソソームを治療用薬物送達システムとして用いるプラットフォームの研究が加速しています。多くの研究において、関連する薬物はエキソソームに容易にカプセル化され、標的細胞、組織、および臓器に安全に送達できることが観察されています26,27。インキュベーション、凍結/融解サイクル、超音波処理、および押出成形などのさまざまな方法を、エキソソームへの薬物ローディングに用いることができる28。
エキソソームまたはエキソソーム様小胞とのコインキュベーションにより、親油性小分子をこれらの送達システムに受動的にカプセル化することができます28,29,30。特に、クルクミン31、カタラーゼ30、ドキソルビシン32、パクリタキセル33などの様々な分子がエクソソームに効果的にロードされました。抗酸化活性を持つカタラーゼ含有エクソソームは、脳内の神経細胞やミクログリア細胞に効率よく蓄積し、強い神経保護活性を示すことが観察されている30。同じ研究では、ローディング効率を高めるために複合体に添加されたサポニンは、インキュベーション中の薬物ローディング率を増加させることがわかりました30,34。しかし、エクソソームへの薬物負荷の基準を確立するには、さらなる研究が必要です。
本稿では、WJ-MSCから単離したエクソソームにドーパミンをカプセル化することで、ナノキャリアシステムを開発した。WJ-MSCの培養、エクソソームの単離と特性評価、薬物ローディング実験、さまざまな技術によるドーパミン負荷エクソソームの特性評価、 in vitro 細胞毒性分析など、すべてのステップが詳細に説明されています。
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Protocol
注意: このプロトコルで使用されるすべての材料および機器に関連する詳細については、 部品表 を参照してください。
1. ウォートンゼリー間葉系幹細胞の培養・凍結保存
- WJ-MSC(ATCC製)を-80°Cの冷凍庫から取り出します。10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したDMEM-F12培地を含むフラスコに細胞を播種します。5%CO2を含むインキュベーターで37°Cでインキュベートします。
- 培地は2日ごとに交換してください。細胞が80%のコンフルエントに達したら継代します。継代する細胞を5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。
注:トリプシンを添加する前にPBSで洗浄すると、フラスコ表面から細胞を簡単に分離できます。 - PBSを除去し、フラスコに5 mLのトリプシン-EDTA溶液を加えます。フラスコを5%CO2を含むインキュベーターで37°Cで5分間インキュベートします。
- 上清をチューブに集め、1,500 x g で5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を除去し、ピペッティングにより1mLのDMEM-F12 + 10% FBSをチューブに加えます。
- 細胞をより大きなフラスコに移し、十分なエキソソームが得られるまでDMEM-F12 + 10%FBSを添加して培養を続けます35。
注:培養細胞は、10%ジメチルスルホキシド(DMSO)で100万/mLの密度で凍結し、-80°Cで保存します。
2. ウォートンゼリー間葉系幹細胞からのエクソソームの産生
注:エキソソームは、培養されたWJ-MSCから単離されます。 エキソソーム単離は、細胞がフラスコ表面を覆い、約80%の密度に達したときに行われます。
- フラスコから10%FBSを含む上清培地を取り出し、5 mLのPBSで細胞を洗浄します。PBSで洗い流した後、無血清DMEM-F12培地を細胞に添加します。フラスコを5%CO2インキュベーターで37°Cで48時間インキュベートします。インキュベーション後、無血清培地をチューブに回収し、-20°Cで保存します。
注:ステップ2.1では、180 mLの無血清培地を回収し、-20°Cで保存します。 解凍後、以下に説明するように、バッチ遠心分離プロセスが開始されます。 - エクソソームの単離
- 回収した無血清培地を300 x g で+4°Cで10分間遠心分離します。 上澄み液を慎重に抜き取り、別のチューブに移します。
- 採取した上清を2,000 × g で+4°Cで10分間遠心分離します。 上澄み液を慎重に抜き取り、別のチューブに移します。
- 採取した上清を10,000 × g で+4°Cで30分間遠心分離します。 上澄み液を慎重に抜き取り、別のチューブに移します。
- 採取した上清を超遠心チューブに移し、110,000 × g で130分間超遠心分離します。上清をゆっくりと除去し、1 mLのPBSをペレットに加えます。
- ペレットをボルテックスし、110,000 × g で+4°Cで70分間超遠心分離機にかけます36(図1)。上清をゆっくりと除去し、1 mLのPBSをペレットに加えます。
注:超遠心分離ステップが完了した後、得られたエキソソームは-80°Cで保存できます。 得られたペレットは、特性評価の準備が整いました。
図1:エクソソームの単離。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
3. エクソソームのキャラクタリゼーション
- ナノ粒子トラッキング分析(NTA)
注:ナノ粒子追跡分析は、単離されたエキソソームのサイズと濃度を決定するために実行されます。1x PBS溶液に使用する錠剤は、pH7.3〜7.5の範囲でなければなりません。1x PBS溶液には、10 mMのリン酸緩衝液、137 mMの塩化ナトリウム、2.7 mMの塩化カリウムが含まれています。溶液は、100mLの蒸留水に1PBS錠剤を添加することによって調製される。この調製した溶液をオートクレーブ滅菌する。- 10 μLのエクソソームに990 μLのPBSを添加して、エクソソームを100倍に希釈します。希釈した懸 ?? 液を使い捨てシリンジに入れます。.
- NTAデバイスの電源を入れ、コンピューターを接続します。ソフトウェアを開きます。
- シリンジ内のサンプルをデバイスのカセットセクションのチューブに注入します。デバイスのカセットカバーを閉じます。
- 開いたソフトウェアで、[ 分析の開始 ]ボタンをクリックします。 録音 ボタンを押して取得した結果を保存します。
- 動的光散乱解析
注:ゼータ電位およびサイズ測定用に単離されたエキソソームも、NTA分析と同じ方法で希釈されます。- 20 μLのエクソソームに980 μLのPBSを加えます。
- ゼータサイジングデバイスと接続されているコンピューターを開きます。ソフトウェアを開きます。
- 手順3.2.1の懸濁液を使い捨てキュベットに追加します。デバイスの蓋を開け、キュベットをカセットに入れて、蓋を閉めます。
- デバイスのソフトウェアでキュベットタイプを選択します。[ Start Analysis ]ボタンをクリックして、ゼータ電位と次元の解析を行います。
注:寸法分析とゼータ電位分析は別々に行われます。
4. エクソソームへのドーパミンのローディング
注:WJ-MSCsエキソソームの特性評価が完了した後、ドーパミンをロードしたエクソソームを薬物送達システムとして入手した。エクソソームへの薬物ローディングは、インキュベーション法を用いて行われる。
- ステップ2.2.5のエキソソーム懸濁液に3 mLのPBSを加えます。希釈した懸濁液を0.22μmフィルターでろ過して滅菌します。滅菌したエキソソーム懸濁液500μLを別のチューブに移します。
- ドーパミン溶液(0.5mg/mL)を蒸留水で調製する。500μLのドーパミン溶液をエクソソームを含むチューブに加えます。
- ステップ4.2で懸濁液にサポニンを加えます。調製したエキソソーム-ドーパミン懸濁液を37°Cで24時間インキュベートします。
注:サポニン濃度は、全溶液の0.002%を超えてはなりません。 - 懸濁液を90,000 × g で70分間超遠心分離し、培地から遊離ドーパミンとサポニンを除去します。単離されたエキソソームは、さらなる分析に使用するまで-20°Cで保管してください37。
注:調製したドーパミン溶液の安定性のために0.02%アスコルビン酸を添加します。
5. ドーパミン搭載エクソソームのキャラクタリゼーション
- ナノ粒子トラッキング分析(NTA)
注:ナノ粒子トラッキング分析は、単離されたエキソソームのサイズと濃度を決定するために実行されます。- 手順3.1.1〜3.1.4に従って、エクソソームを希釈し、NTAを実行します。
- 動的光散乱解析
注:ゼータ電位およびサイズ測定用に単離されたエキソソームも、NTA分析と同様に希釈されます。- 手順3.2.1-3.2.4に従って、エクソソームを希釈し、動的光散乱分析を実行します。
注:各溶液(サポニン、ドーパミン、エキソソーム-ドーパミン)のサイズとゼータ電位は別々に分析されます。
- 手順3.2.1-3.2.4に従って、エクソソームを希釈し、動的光散乱分析を実行します。
6. 高速液体クロマトグラフィー(HPLC)
注:エクソソームにロードされたドーパミンの量は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)法によって測定されます。得られた製剤中のドーパミンの存在を検出するために、エキソソームは特別なプロセスによって爆発される。
- 製剤を75°Cのヒーターに入れて蒸発させます。アセトニトリル(50:50の比率)を懸濁液とボルテックスに加えます。溶液を10分間超音波処理します。
- 溶液を10,000 × gで10分間遠心分離します。上清を0.22μmのフィルターでろ過します。
- C18 カラム、30 °C、流速 1 mL/分(移動相 H2O/アセトニトリル)を使用して、すべての分析種を分析します。230nm38での吸光度を測定する。
7. 薬物負荷容量(DL)測定と in vitro 薬物放出動態
- 薬物負荷量(DL)
注:エクソソームにロードされるドーパミンの量は、UV-Vis分光法を使用して定量されます。吸光度は280nmで読み取られます。合成中に採取された上清は、アンロードされた薬物の量を測定するために使用されます。上清中のドーパミン濃度は、ドーパミンの標準検量線 によって決定され ます。- 1 mg/mL のドーパミンのストック溶液を調製します。蒸留水を使用して、ストック溶液から0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mLの濃度を調製します。
注:調製したドーパミン溶液の安定性のために0.02%アスコルビン酸を添加します。 - 紫外分光光度計で280 nmのドーパミンの各希釈液の吸光度を測定することにより、標準検量線を生成します。
- 上清の吸光度を280nmで測定する。
- 式(1)39を用いてドーパミンの薬物負荷量を計算する。
DL (%) =
100 (1)
注: 分析は 3 回に分けて実行されます。
- 1 mg/mL のドーパミンのストック溶液を調製します。蒸留水を使用して、ストック溶液から0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mLの濃度を調製します。
- in vitro 薬物放出動態
注:ドーパミンをロードしたエクソソームの薬物放出動態は、透析膜を用いて行われます。PBS(pH 7.4)は、生理学的微小環境をシミュレートするための放出培地として使用されます。- ドーパミンを充填したエクソソーム1mLを透析膜に加えます。メンブレンをビーカーに入れます。ビーカーに15 mLのPBSを加えます。
- 1 mL の放出培地をビーカーで 0.5、1、2、4、6、および 8 時間サンプリングします。各時点で、サンプルの容量を新しいPBSと交換します。280 nmで指定された間隔で採取したサンプルを、UV-Vis分光計を使用して分析します。
- 式 (2)40 を使用して結果を計算します。
離型率(%)=
100(2)
注:検量線は、 in vitro 薬物放出動態を決定するために作成されています。ドーパミン溶液は、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、および5.0 mg / mLの濃度で調製されます。各濃度のUV吸光度値は、UV-Vis分光光度計で280nmで測定されます。
100 (1)
100(2)8. in vitro 細胞毒性試験
- 線維芽細胞の活性化と培養
- 線維芽細胞を-80°Cの冷凍庫から取り出します。DMEM-F12 + 10% FBSを含むフラスコに細胞を播種します。
- 5%CO2を含むインキュベーターで37°Cで細胞をインキュベートします。培地は2日ごとに交換してください。
- 細胞が80%のコンフルエントに達するまで細胞を継代します。手順1.3〜1.5に従います。1,500 × g で5分間遠心分離した後、上清を除去し、1 mLのDMEM-F12 + 10% FBSを添加し、96ウェルプレートに1ウェルあたり10,000個の細胞を播種します。
- DMEM-F12培地+ 10%FBSを添加し、5%CO2を含むインキュベーターで37°Cで18時間細胞をインキュベートします。インキュベーションの最後にウェルの培地を交換します。
- ドーパミンを充填したエクソソーム懸濁液のストックを準備します。ドーパミンを充填したエクソソーム製剤を培地で希釈し、100 μL/mL、250 μL/mL、500 μL/mL、1,000 μL/mLの濃度を得ます。
- 調製した濃度を、96ウェルプレートの各ウェル内の細胞に添加します。プレートを37°Cで18時間、5%CO241を含むインキュベーターでインキュベートします。
- MTT細胞生存率アッセイ
注:インキュベーションの最後に、細胞の生存率はMTTテストによって決定されます。- MTT 溶液 (5 mg/mL) を PBS で調製します。各ウェルに 10 μL の MTT 溶液を添加します。37°Cで4時間インキュベートします。
- インキュベーションの最後に、各ウェルに100 μLのDMSOを添加します。プレートを暗所で室温で30分間インキュベートします。ELISAリーダーで570 nm42,43の吸光度値を測定します。
注:MTT生存率試験は3回に分けて実施されます。
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Representative Results
エクソソームの単離と特性評価
ウォートンゼリー幹細胞を培養し、培養が十分な密度に達したら、無血清培地中で48時間インキュベートします。インキュベーション終了後、上清を-20°Cで保存します。 回収した上清をPBSで希釈し、超遠心分離を行います(図1)。得られた溶液は、NTAおよびDLS分析によって分析されます。エクソソームは、0.22μmのフィルターを通すことで滅菌されます。得られたエクソソームの平均サイズは98nmと判定された(動画 1)。遠心分離終了時に約100億個のエクソソーム粒子が得られました。NTA分析とDLS分析で明らかになったナノ粒子の数は、互いに一致しています。さらに、WJ-MSCに由来するエクソソームのゼータ電位は-15.7mVと測定されました(図2 および 図3)。
動画1:ウォートンゼリー由来エクソソームのナノ粒子トラッキング解析このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
エクソソームへのドーパミンのロード
NTA分析で計算されたように、ウォートンゼリーから分離されたサンプルの500μLには約15億個のナノ粒子が含まれていました。ドーパミン溶液(5mg/mL)を500μLのエキソソームと混合し、懸濁液を37°Cで24時間インキュベートした。 インキュベーション後、得られた溶液をNTAおよびDLS分析によって特徴付けました。NTAの結果によると、溶液の平均粒子径は110nmであることがわかりました。エクソソームとドーパミン負荷エクソソームの粒子サイズを比較すると、ドーパミン負荷エクソソームの寸法が有意に増加していることが明らかになりました。NTA分析とDLS分析で明らかになったナノ粒子の数は、互いに一致していました。さらに、ドーパミンをロードしたエクソソームのゼータ電位は-17.6 Mvと測定されました(図2および 図3)。
動画2:ドーパミン搭載エクソソームのナノ粒子追跡解析このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
| 見本 | ゼータ電位 |
| エクソソーム | -15.7mV ± 1.1 |
| サポニン | -12mV ± 0.7 |
| ドーパミン | -14.4mV ± 1.3 |
| ドーパミン搭載エクソソーム | -17.6 mV ± 0.8 |
表1:すべての溶液のゼータ電位。
DSL分析、ゼータサイザー、およびドーパミン、サポニン、およびドーパミン負荷エクソソーム溶液のゼータ電位表を 表 1に示す。
図2:エクソソームのナノ粒子追跡分析。 (a)エクソソーム;(B)ドーパミンをロードしたエクソソーム。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:ゼータサイザー分析 。 (A)エクソソーム、(B)ドーパミン搭載エクソソーム、(C)サポニン、(D)ドーパミン。省略形: d = サイズ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
溶液中のドーパミンの存在は、HPLC分析によって測定されました。ドーパミンをロードしたエクソソームを超遠心分離し、ろ過して遊離ドーパミンを除去しました。インキュベーション終了時にエクソソームへのドーパミンのロードが成功すれば、エクソソームの破裂後のドーパミンを直接測定することで検出することができます。この目的のために、ドーパミンをロードしたエキソソーム懸濁液を水蒸気で加熱し、アセトニトリルを添加し、懸濁液を超音波処理した。吸光度を230 nmで測定し、破壊されたエクソソームから放出されるドーパミンの量を評価しました。
図4:HPLC分析で測定した製剤中のドーパミンの存在。 すべての分析は、移動相が H2O/アセトニトリルの C-18 カラムを使用し、流速 1 mL/分、30 °C で行いました。 吸光度は230nmで測定し、ドーパミンの溶出をモニターします。(a)ドーパミン、(b)サポニン、(c)ドーパミン搭載エクソソーム。略語:HPLC = High-Speed Liquid Chromatography。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
HPLC分析の結果、ドーパミンのピークは6.45分で観察されました。サポニンの存在は、エクソソームの断片化後にも検出されました(図4)。
薬物負荷容量とin vitro薬物放出動態
ドーパミン負荷能は、UV分光光度法測定および式(1)および式(2)を用いて計算した。積載能力率は10.89±0.33であることがわかりました。累積薬物放出プロファイルを 図5に示します。薬物放出動態を8時間モニターしたところ、カプセル化されたドーパミンの74.8%が最初の8時間以内にエクソソームから放出されることが明らかになりました(図5)。
図5:累積薬物放出プロファイル。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
in vitro 細胞毒性試験
ドーパミンをロードしたエキソソームと遊離エキソソームの細胞毒性を線維芽細胞で調べました。線維芽細胞をさまざまな濃度の製剤(100 μL/mL、250 μL/mL、500 μL/mL、および1,000 μL/mL)に曝露し、18時間インキュベートしました。ドーパミンを充填したエクソソームは顕著な細胞毒性効果を示さなかったが、ドーパミンのカプセル化を高めるためにサポニンを製剤に添加すると、線維芽細胞の生存率が低下した(p < 0.05、 図6)。線維芽細胞をドーパミン負荷エクソソームで最大500μL/mLの濃度で処理すると、細胞生存率が増加しました。18時間のインキュベーション終了時に、MTT試験により細胞生存率を測定しました(図7)。結果の統計的有意性は、一元配置分散分析を実行することによって評価されました。
図6:製剤を細胞とインキュベートした後の顕微鏡画像(10倍)。 (A)ドーパミン、(B)サポニン、(C)ドーパミン搭載エクソソーム100μL/mL、(D)ドーパミン搭載エクソソーム250μL/mL、(E)ドーパミン搭載エクソソーム500μL/mL、(F)ドーパミン搭載エクソソーム1,000μL/mL。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:異なる濃度のドーパミン、サポニン、およびドーパミン負荷エクソソームで18時間インキュベートした細胞におけるMTT生存率試験結果の統計解析 。 (A)細胞毒性の結果、(B、C)統計解析。略語:D =ドーパミン;S = サポニン;Exo-DA1 = ドーパミン負荷エクソソーム 100 μL/mL;Exo-DA2 = ドーパミン搭載エクソソーム 250 μL/mL;Exo-DA 3 ドーパミン搭載エクソソーム 500 μL/mL;Exo-DA 4 = ドーパミン搭載エクソソーム 1,000 μL/mL;MTT = 3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
さらに、遊離エキソソームの細胞毒性効果も、同様の濃度の線維芽細胞で調査しました(図8)。実験の前に、エクソソームをPBSで希釈し、1mLあたり6,000万粒子にしました。次に、10μL、25μL、50μL、および100μLのエキソソーム懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに添加した。
図8:異なる濃度のエキソソームで18時間インキュベートした細胞におけるMTT生存率試験結果の統計解析 。 (A)細胞毒性結果、(B,C)統計解析。略語:EXO =エキソソーム;MTT = 3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
線維芽細胞の生存率は、他の濃度と比較して、500 μL/mLのドーパミン負荷エクソソームと25 μL/mLの遊離エクソソームで高いことがわかりました。しかし、どの濃度でも有意な細胞毒性は観察されませんでした。.
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Discussion
エキソソームは、ほとんどの細胞タイプ(MSC1など)から分泌される40〜200nmの寸法の小さな膜小胞です。細胞間のコミュニケーションを可能にすることができるエクソソームは、エンドサイトーシス、食作用、ミクロピノサイトーシス、脂質媒介性内在化、融合など、さまざまな方法で細胞に侵入することができます33,44。他のナノキャリア系と比較して、エクソソーム表面に見られる脂質とコレステロールは、親水性と疎水性の両方の分子を運ぶ能力を与え、コレステロール末端の水素結合により、タイトなパッケージングが可能になります45。
本研究では、MSC由来のエクソソームの単離、薬物負荷実験、および細胞毒性アッセイを実施しました。エクソソームは、細胞間のカーゴやコミュニケーションなどの重要な機能に加えて、神経新生、特に脳において重要な役割を担っていることが知られている6,7。さらに、MSC由来のエキソソームは、比較的忍容性が高く、固有の治療特性を有し、高い安定性とホーミング能力を示す46,47。近年、神経変性疾患は神経損傷による治療法がないため、エクソソーム応用などのナノスケールの治療法の研究が注目されています。さらに、エクソソームがBBBを通過する能力は、薬物キャリアシステムとして優れたプラットフォームになります。
エクソソームの単離にはいくつかの方法がありますが、ここでは、最も効果的な方法の1つとして受け入れられている超遠心分離法を使用しました。現在の研究では、ドナー細胞として選択されたWJ-MSCは、免疫原性が低いことで知られており47、臨床試験でエクソソームの供給源として使用されています48。次に、得られたエクソソームをドーパミン溶液とインキュベートし、その間にサポニンを溶液に添加して薬物ローディングの成功率を高めました。インキュベーションの最後に、遊離ドーパミンおよびサポニンを培地から除去した。サポニンは、エクソソームの膜結合コレステロールを選択的に除去し、エクソソーム脂質二重層に細孔を作り、ドーパミン分子の侵入を促進することが期待されています。その結果、おそらくドーパミンの負荷により、エクソソームの寸法がわずかに増加したことが観察されます。
ゼータ電位は、粒子間の静電反発力が大きく、粒子が凝集する傾向を示します。得られた製剤のゼータ電位は、以前の研究の結果と互換性があった49。インキュベーション期間の最後に実施したHPLC分析では、エクソソームの断片化後にドーパミンの存在が検出されました。前述したように、サポニンはドーパミンのカプセル化を促進します。薬物負荷能は、吸光度値39に基づくUV-vis分光光度法によって測定された。薬物ローディングのインキュベーション法は、他の方法に比べて簡便で安価であるが、この方法ではローディング効率が低い26。この研究では、積載量は約11%でした。サポニンは、細胞質膜50に対する有効な透過剤であり、ドーパミンによるエクソソームの負荷容量を増加させるようである。
将来の研究では、エキソソーム薬物の負荷効率を高めるために超音波処理法を好むことがより効果的である可能性があります38。累積薬物放出プロファイルは、8時間のインキュベーションの終わりに大量のドーパミンが放出されたことを明らかにしました。爆発的な放出は、 in vitro 放出試験の最初の5時間で観察されました。.エクソソーム製剤の放出プロファイルは、薬物特性、二重層流動性、分子量などの多くのパラメータに依存するため、多くの研究で1時間あたりの放出薬物の量に違いが観察される可能性がある51。さらに、この研究では、線維芽細胞に対する製剤の細胞毒性効果は観察されませんでした。.しかし、エクソソームへのドーパミン負荷を増加させるために添加されたサポニンの毒性作用は、線維芽細胞で検出されました。これらのデータによれば、エクソソームの内生性は、リポソーム、マイクロスフェア、マイクロエマルジョン、および他の合成薬物送達システムと比較した場合、自然かつユニークな利点である52。現在の方法の不利な点を低減するために、異なるトランスフェクション試薬、エレクトロポレーション技術、または内因性ドーパミン産生細胞、好ましくは遺伝子改変MSCをエキソソームの供給源として用いることができる。
エキソソームの単離は、このプロトコルで行われました。ただし、分離ステップは非常に長く困難なプロセスです。細胞培養から採取した上清が無血清培地中にあるように注意する必要があります。さらに、今日まで、エクソソームの量はタンパク質濃度と関連しています。しかし、エクソソーム粒子の数を算出して適用することで、臨床研究の精度を高めることができると提案しています。単離されたエクソソームの薬物ローディングに用いるインキュベーション法は、薬物ローディング容量の点で低いことがわかった。薬物負荷能力の高い超音波処理法は、より効果的な結果を得るのに役立つ可能性があります。
これらの知見は、WJ-MSC由来のエクソソームがドーパミン送達の強力な担体であることを示しました。BBBを通過する能力と免疫調節特性に加えて、パーキンソン病やその他の中枢神経系疾患の標的療法は、薬物を運ぶエクソソームで開発することができます。ただし、研究は in vivo で実施され、臨床試験で裏付けられる必要があります。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利害関係はないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、主にユルドゥズ工科大学科学研究プロジェクト(TSA-2021-4713)から提供された研究資金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 0.45 µm syringe filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 15 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| Acetonitrile | Sigma | 271004-1L | Used for HPLC analysis |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process | |
| Cell Culture Cabin | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Centrifugal | Hitachi | CF16RN | Used in the exosome isolation step |
| CO2 incubator with Safe Cell UV | Panasonic | Used for the cell culture process | |
| Dopamine hydrochloride H8502-10G | Sigma | H8502-10G | Used in exosome dopamine loading |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | To store cells and the resulting exosomes |
| Fridge | Panasonic | MPR-215-PE | Used to store cell culture and other materials |
| High performance liquid chromatography-HPLC | Agilent Technologies | The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated. | |
| Microscope- Primovert | Zeiss | Used to observe cells in cell culture. | |
| MTT Assay | Biomatik | Used to measure cell viability | |
| NanoSight NS300 | Malvern panalytical | Malvern panalytical | Used for exosome characterization |
| Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Used in the exosome isolation step | |
| PBS tablet | Biomatik | 43602 | In the preparation of the PBS solution |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Pipette Aid | Isolab | ||
| Precision balance-Kern | Kern-ABJ220-4NM | Used in the preparation of solutions | |
| Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Used to digest exosomes in HPLC analysis | |
| Saponin | Sigma | 47036-50G-F | It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process. |
| Spectrostar-Nano-Spectrophotometry | BMG LABTECH | Used for MTT and drug release analyzes | |
| SPSS 22 | statistical package program | ||
| Vorteks-FinePCR | FinePCR-FineVortex | Used to mix solutions homogeneously | |
| Water Bath 37 °C-Senova | Senova | Used in cell culture step | |
| Wharton’s jelly mesenchymal stem cells | ATCC | ||
| ZetaSizer | Malvern Nano ZS | Malvern Nano ZS | Used for exosome characterization |
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