Summary
Qui, abbiamo mirato ad ottenere una formulazione caricando dopamina degli esosomi isolati di cellule staminali dalle cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton. In questo protocollo vengono descritti l'isolamento e la caratterizzazione degli esosomi, il caricamento del farmaco negli esosomi risultanti e l'attività citotossica della formulazione sviluppata.
Abstract
Gli esosomi di dimensioni comprese tra 40 e 200 nm costituiscono il sottogruppo più piccolo di vescicole extracellulari. Queste vescicole bioattive secrete dalle cellule svolgono un ruolo attivo nel carico e nella comunicazione intercellulare. Gli esosomi si trovano principalmente nei fluidi corporei come plasma, liquido cerebrospinale, urina, saliva, liquido amniotico, colostro, latte materno, liquido articolare, sperma e acido pleurico. Considerando le dimensioni degli esosomi, si pensa che possano svolgere un ruolo importante nelle malattie del sistema nervoso centrale perché possono passare attraverso la barriera emato-encefalica (BBB). Quindi, questo studio mirava a sviluppare un sistema di nanocarrier basato sugli esosomi incapsulando la dopamina in esosomi isolati dalle cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton (WJ-MSCs). Gli esosomi che hanno superato il processo di caratterizzazione sono stati incubati con dopamina. Gli esosomi carichi di dopamina sono stati ricaratterizzati alla fine dell'incubazione. Gli esosomi carichi di dopamina sono stati studiati in saggi di rilascio di farmaci e citotossicità. I risultati hanno mostrato che la dopamina poteva essere incapsulata con successo all'interno degli esosomi e che gli esosomi carichi di dopamina non influenzavano la vitalità dei fibroblasti.
Introduction
Gli esosomi, vescicole bioattive con caratteristiche significative, hanno dimensioni comprese tra 40 nm e 200 nm. Gli esosomi hanno origine dalla membrana cellulare e si formano a causa del rilascio degli endosomi1. Queste strutture fungono da comunicatori cellula-cellula e interagiscono con le cellule vicine per facilitare il trasferimento di molecole attive. Gli esosomi possono essere isolati da molte fonti diverse. Questi includono fluidi corporei come plasma, urina, liquido cerebrospinale, saliva e linee cellulari coltivate in condizioni di vitro . Gli esosomi hanno un ruolo importante nell'eliminazione dei danni ai nervi, grazie alle biomacromolecole che contengono, come lipidi, proteine e acidi nucleici2. La glia, che sono le cellule di supporto del sistema nervoso3, trasferisce proteine e micro RNA agli assoni dei neuroni attraverso gli esosomi4.
I lipidi che formano la guaina mielica, che sono una caratteristica della conduzione nervosa, vengono rilasciati anche dagli oligodendrociti attraverso gli esosomi 4,5. Gli esosomi sono anche coinvolti in processi come la plasticità sinaptica, la risposta allo stress neuronale, la comunicazione cellula-cellula e la neurogenesi nel cervello 6,7. Il fatto che gli esosomi possiedano dimensioni nanometriche consente loro di passare attraverso la BBB. Esiste una speciale via di transizione dal liquido interstiziale al liquido cerebrospinale dopo essere penetrata in questa membrana8. Grazie alle loro proprietà superficiali, gli esosomi possono interagire in modo efficiente con le cellule bersaglio come sistema di somministrazione dei farmaci e rilasciare attivamente i farmaci caricati.
A causa dell'espressione di varie proteine adesive (tetraspanine e integrine) sulla superficie degli esosomi, queste vescicole extracellulari possono facilmente interagire e fondersi con le membrane della cellula ospite9. Si ritiene che gli esosomi possano essere utilizzati come sistema di somministrazione di farmaci, soprattutto nel trattamento delle malattie del sistema nervoso centrale grazie alla loro capacità di penetrare nella BBB e alle loro proprietà superficiali. Gli esosomi derivati da cellule staminali mesenchimali (MSC) hanno un rischio inferiore di rigetto immunitario rispetto alle terapie cellulari allogeniche e, a questo proposito, possono essere una componente importante delle applicazioni di trattamento senza cellule10.
La dopamina è una molecola la cui carenza nel cervello è la caratteristica del morbo di Parkinson (PD), peggiorando di giorno in giorno11,12,13. È noto che la malattia di Parkinson è associata alla degenerazione dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra del mesencefalo e alla perdita delle funzioni dei motoneuroni14,15. La morte dei neuroni dopaminergici impedisce l'apporto del neurotrasmettitore dopamina allo striato cerebrale. Questo, a sua volta, provoca l'emergere di sintomi specifici del morbo di Parkinson16. Questi sintomi della malattia di Parkinson sono la bradicinesia, l'instabilità posturale, la rigidità e soprattutto il tremore a riposo12,13. Sebbene la malattia di Parkinson sia stata descritta per la prima volta più di due secoli fa, gli studi per comprendere la patologia e l'eziologia della malattia sono ancora in corso ed è attualmente accettato che la malattia di Parkinson sia una malattia sistemica complessa17. Si prevede che si verifichi una carenza di dopamina e si osservano sintomi clinici di Parkinson quando oltre l'80% dei neuroni degenera18. Nel trattamento della malattia, l'integrazione incompleta di dopamina è preferita per ridurre i sintomi motori. Studi in vivo hanno dimostrato che l'infusione diretta di dopamina nel cervello riduce significativamente i sintomi negli animali19. I precursori della dopamina come la L-DOPA (L-3,4-diidrossifenilalanina) e i farmaci del recettore della dopamina sono utilizzati in clinica perché l'infusione diretta di dopamina nel cervello non è possibile negli esseri umani e la dopamina che entra nel sistema non può attraversare la BBB20. Questi tipi di farmaci perdono la loro efficacia nel tempo. Tuttavia, non esiste ancora un approccio terapeutico curativo per la malattia di Parkinson. Quindi, c'è un'enorme necessità di sviluppare nuove strategie terapeutiche e modalità di trattamento per rivelare la fisiopatologia della malattia e ridurre l'impatto della malattia sui pazienti.
Gli studi basati sugli esosomi hanno recentemente attirato l'attenzione per la raccolta di informazioni sia sugli approcci terapeutici che sulle patologie delle malattie del sistema nervoso. È stato dimostrato che gli esosomi derivati dalle MSC riducono l'infiammazione nel danno ai nervi e contribuiscono alla rigenerazione neuronale21,22,23. Inoltre, è stato riportato che i secretomi esosomici derivati da MSC riducono l'apoptosi mostrando effetti neurotrofici e neuroprotettivi, in particolare sui neuroni dopaminergici24,25. La ricerca sulle piattaforme in cui gli esosomi sono utilizzati come sistemi terapeutici di somministrazione di farmaci ha subito un'intensa accelerazione negli ultimi anni. In numerosi studi, è stato osservato che i farmaci rilevanti possono essere facilmente incapsulati negli esosomi e somministrati in modo sicuro nelle cellule, nei tessuti e negli organi bersaglio26,27. Diversi metodi come l'incubazione, i cicli di congelamento/scongelamento, la sonicazione e l'estrusione potrebbero essere utilizzati per il caricamento del farmaco negli esosomi28.
La coincubazione con esosomi o vescicole simili agli esosomi consente di incapsulare passivamente piccole molecole lipofile in questi sistemi di rilascio28,29,30. In particolare, varie molecole come la curcumina 31, la catalasi30, la doxorubicina32 e il paclitaxel33 sono state efficacemente caricate negli esosomi. È stato osservato che gli esosomi contenenti catalasi, che hanno attività antiossidante, si accumulavano in modo efficiente nei neuroni e nelle cellule microgliali del cervello e mostravano forti attività neuroprotettive30. Nello stesso studio, è stato riscontrato che la saponina, aggiunta al complesso per aumentare l'efficienza di caricamento, aumenta la percentuale di carico del farmaco durante l'incubazione30,34. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per stabilire gli standard per il caricamento del farmaco negli esosomi.
Questo articolo descrive lo sviluppo di un sistema di nanocarrier mediante incapsulamento della dopamina in esosomi che sono stati isolati da WJ-MSCs. Tutte le fasi, tra cui la coltivazione di WJ-MSC, l'isolamento e la caratterizzazione degli esosomi, gli esperimenti di carico farmacologico, la caratterizzazione degli esosomi carichi di dopamina con varie tecniche e l'analisi della citotossicità in vitro sono spiegate in dettaglio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e le attrezzature utilizzati in questo protocollo.
1. Coltura e crioconservazione di cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton
- Rimuovere i WJ-MSC (dall'ATCC) dal congelatore a -80 °C. Seminare le cellule in un matraccio contenente terreno DMEM-F12 integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS). Incubarli a 37 °C in un incubatore contenente il 5% di CO2 .
- Cambiare il terreno di coltura ogni 2 giorni. Far passare le cellule quando raggiungono l'80% di confluenza. Lavare le cellule da far passare con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
NOTA: Il lavaggio con PBS prima dell'aggiunta di tripsina garantisce una facile separazione delle cellule dalla superficie del pallone. - Rimuovere il PBS e aggiungere 5 mL di soluzione di tripsina-EDTA nel pallone. Incubare il matraccio per 5 minuti a 37 °C in un incubatore contenente il 5% di CO2 .
- Raccogliere il surnatante nella provetta e centrifugare a 1.500 x g per 5 minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e aggiungere 1 mL di DMEM-F12 + 10% FBS alla provetta mediante pipettaggio.
- Trasferire le cellule in un matraccio più grande e continuare la coltura aggiungendo DMEM-F12 + 10% FBS fino a ottenere un numero sufficiente di esosomi35.
NOTA: Le cellule coltivate vengono congelate a una densità di 1 milione/mL con il 10% di dimetilsolfossido (DMSO) e conservate a -80 °C.
2. Produzione di esosomi da cellule staminali mesenchimali di Wharton's Jelly
NOTA: Gli esosomi sono isolati da WJ-MSC in coltura. L'isolamento degli esosomi viene eseguito quando le cellule coprono la superficie del pallone e raggiungono circa l'80% di densità.
- Rimuovere il terreno surnatante contenente il 10% di FBS dal matraccio e lavare le cellule con 5 mL di PBS. Aggiungere alle cellule un terreno DMEM-F12 privo di siero dopo il risciacquo con PBS. Incubare i palloni per 48 ore a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 . Dopo l'incubazione, raccogliere il terreno privo di siero nella provetta e conservare a -20 °C.
NOTA: Nella fase 2.1, 180 mL di terreno privo di siero vengono raccolti e conservati a -20 °C. Dopo lo scongelamento, viene avviato un processo di centrifugazione discontinuo, come descritto di seguito. - Isolamento degli esosomi
- Centrifugare il terreno privo di siero raccolto a 300 x g per 10 minuti a +4 °C. Prelevare con cautela il surnatante e trasferirlo in un'altra provetta.
- Centrifugare il surnatante raccolto a 2.000 × g per 10 minuti a +4 °C. Prelevare con cautela il surnatante e trasferirlo in un'altra provetta.
- Centrifugare il surnatante raccolto a 10.000 × g per 30 minuti a +4 °C. Prelevare con cautela il surnatante e trasferirlo in un'altra provetta.
- Trasferire il surnatante raccolto in provette per ultracentrifuga e ultracentrifugare a 110.000 × g per 130 min. Rimuovere lentamente il surnatante e aggiungere 1 mL di PBS al pellet.
- Vorticare il pellet e l'ultracentrifuga a 110.000 × g per 70 minuti a +4 °C36 (Figura 1). Rimuovere lentamente il surnatante e aggiungere 1 mL di PBS al pellet.
NOTA: Al termine delle fasi di ultracentrifugazione, gli esosomi ottenuti possono essere conservati a -80 °C. Il pellet ottenuto è ora pronto per la caratterizzazione.
Figura 1: Isolamento degli esosomi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. Caratterizzazione degli esosomi
- Analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA)
NOTA: L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle viene eseguita per determinare le dimensioni e la concentrazione degli esosomi isolati. Le compresse utilizzate per la soluzione PBS 1x devono essere comprese nell'intervallo di pH 7,3-7,5. 1x soluzione PBS contiene 10 mM di tampone fosfato, 137 mM di cloruro di sodio e 2,7 mM di cloruro di potassio. La soluzione si prepara aggiungendo 1 compressa di PBS in 100 mL di acqua distillata. Questa soluzione preparata viene sterilizzata in autoclave.- Diluire gli esosomi di 100 volte aggiungendo 990 μL di PBS a 10 μL di esosomi. Assumere la sospensione diluita in una siringa monouso.
- Accendere il dispositivo NTA e collegare il computer. Aprire il software.
- Iniettare il campione nella siringa nel tubo nella sezione della cassetta del dispositivo. Chiudere il coperchio della cassetta del dispositivo.
- Nel software che si apre, fare clic sul pulsante Avvia analisi . Salvare i risultati ottenuti premendo il pulsante Registra .
- Analisi dinamica della diffusione della luce
NOTA: Anche gli esosomi isolati per la misurazione del potenziale zeta e delle dimensioni vengono diluiti allo stesso modo dell'analisi NTA.- Aggiungere 980 μL di PBS a 20 μL degli esosomi.
- Aprire il dispositivo di dimensionamento zeta e il computer connesso. Aprire il software.
- Aggiungere la sospensione del punto 3.2.1 alla cuvetta monouso. Aprire il coperchio del dispositivo, posizionare la cuvetta nella cassetta e chiudere il coperchio.
- Selezionare il tipo di cuvetta nel software del dispositivo. Fare clic sul pulsante Avvia analisi per l'analisi dimensionale e del potenziale zeta.
NOTA: Le analisi vengono eseguite separatamente per l'analisi dimensionale e il potenziale zeta.
4. Carico di dopamina negli esosomi
NOTA: Dopo aver completato la caratterizzazione degli esosomi WJ-MSCs, gli esosomi carichi di dopamina sono stati ottenuti come sistema di somministrazione del farmaco. Il caricamento del farmaco negli esosomi viene eseguito utilizzando il metodo dell'incubazione.
- Aggiungere 3 mL di PBS alla sospensione dell'esosoma del passaggio 2.2.5. Sterilizzare la sospensione diluita mediante filtrazione utilizzando filtri da 0,22 μm. Trasferire 500 μL della sospensione dell'esosoma sterilizzata in un'altra provetta.
- Preparare una soluzione di dopamina (0,5 mg/ml) con acqua distillata. Aggiungere 500 μL di soluzione di dopamina nelle provette contenenti gli esosomi.
- Aggiungere saponina alla sospensione nella fase 4.2. Incubare la sospensione esosoma-dopamina preparata per 24 ore a 37 °C.
NOTA: La concentrazione di saponina non deve superare lo 0,002% della soluzione totale. - Ultracentrifugare la sospensione a 90.000 × g per 70 minuti per rimuovere la dopamina libera e la saponina dal terreno. Conservare gli esosomi isolati a -20 °C fino all'uso per ulteriori analisi37.
NOTA: Aggiungere acido ascorbico allo 0,02% per la stabilità della soluzione di dopamina preparata.
5. Caratterizzazione di esosomi carichi di dopamina
- Analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA)
NOTA: L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle viene eseguita per determinare le dimensioni e la concentrazione degli esosomi isolati.- Seguire i passaggi da 3.1.1 a 3.1.4 per diluire gli esosomi ed eseguire l'NTA.
- Analisi dinamica della diffusione della luce
NOTA: Anche gli esosomi isolati per la misurazione del potenziale zeta e delle dimensioni vengono diluiti in modo simile all'analisi NTA.- Seguire i passaggi da 3.2.1 a 3.2.4 per diluire gli esosomi ed eseguire l'analisi dinamica della diffusione della luce.
NOTA: Le dimensioni e i potenziali zeta per ciascuna soluzione (saponina, dopamina, esosoma-dopamina) vengono analizzati separatamente.
- Seguire i passaggi da 3.2.1 a 3.2.4 per diluire gli esosomi ed eseguire l'analisi dinamica della diffusione della luce.
6. Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)
NOTA: Le quantità di dopamina caricate negli esosomi sono misurate con il metodo della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Per rilevare la presenza di dopamina all'interno della formulazione ottenuta, gli esosomi vengono fatti esplodere con un processo speciale.
- Mettere la formulazione in una stufa a 75 °C per far evaporare. Aggiungere acetonitrile (rapporto 50:50) alla sospensione e al vortice. Sonicare la soluzione per 10 min.
- Centrifugare la soluzione per 10 minuti a 10.000 × g. Filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,22 μm.
- Analizzare tutti gli analiti utilizzando una colonna C18 a 30 °C a una velocità di flusso di 1 mL/min (la fase mobile H2O/acetonitrile). Misurare l'assorbanza a 230 nm38.
7. Misurazione della capacità di carico del farmaco (DL) e cinetica di rilascio del farmaco in vitro
- Capacità di carico del farmaco (DL)
NOTA: La quantità di dopamina caricata negli esosomi viene quantificata utilizzando la spettroscopia UV-Vis. L'assorbanza viene letta a 280 nm. I surnatanti raccolti durante la sintesi vengono utilizzati per misurare la quantità di farmaco scaricato. La concentrazione di dopamina nel surnatante viene determinata tramite una curva di calibrazione standard per la dopamina.- Preparare una soluzione madre di 1 mg/mL di dopamina. Preparare concentrazioni di 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 e 0,5 mg/mL dalla soluzione madre utilizzando acqua distillata.
NOTA: Aggiungere acido ascorbico allo 0,02% per la stabilità della soluzione di dopamina preparata. - Generare una curva di calibrazione standard misurando l'assorbanza di ciascuna diluizione di dopamina a 280 nm in uno spettrofotometro UV.
- Misurare l'assorbanza del surnatante a 280 nm.
- Calcolare la capacità di carico del farmaco per la dopamina usando l'Eq (1)39.
DL (%) =
100 (1)
NOTA: L'analisi viene eseguita in triplice copia.
- Preparare una soluzione madre di 1 mg/mL di dopamina. Preparare concentrazioni di 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 e 0,5 mg/mL dalla soluzione madre utilizzando acqua distillata.
- Cinetica di rilascio del farmaco in vitro
NOTA: La cinetica di rilascio del farmaco degli esosomi carichi di dopamina viene eseguita utilizzando una membrana di dialisi. Il PBS, pH 7,4, viene utilizzato come mezzo di rilascio per simulare un microambiente fisiologico.- Aggiungere 1 mL di esosomi carichi di dopamina alla membrana di dialisi. Mettere la membrana in un bicchiere. Aggiungere 15 ml di PBS nel becher.
- Campionare 1 mL di terreno distaccante in un becher a 0,5, 1, 2, 4, 6 e 8 ore. Ad ogni punto temporale, sostituire il volume del campione con PBS fresco. Analizzare i campioni prelevati a intervalli specificati a 280 nm utilizzando uno spettrometro UV-Vis.
- Calcolare i risultati utilizzando l'Eq (2)40.
Rilascio (%) =
100 (2)
NOTA: Viene preparata una curva di calibrazione per la determinazione della cinetica di rilascio del farmaco in vitro . La soluzione di dopamina viene preparata a concentrazioni di 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 e 5,0 mg/mL. Il valore di assorbanza UV di ciascuna concentrazione viene determinato a 280 nm con uno spettrofotometro UV-Vis.
100 (1)
100 (2)8. Test di citotossicità in vitro
- Rivitalizzazione e coltura dei fibroblasti
- Togliere i fibroblasti dal congelatore a -80 °C. Seminare le cellule in un pallone contenente DMEM-F12 + 10% FBS.
- Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore contenente il 5% di CO2 . Cambiare il terreno di coltura ogni 2 giorni.
- Far passare le cellule fino a raggiungere l'80% di confluenza. Seguire i passaggi 1.3-1.5. Dopo la centrifugazione a 1.500 × g per 5 minuti, rimuovere il surnatante, aggiungere 1 mL di DMEM-F12 + 10% FBS e seminare 10.000 cellule per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti.
- Aggiungere il terreno DMEM-F12 + 10% FBS e incubare le cellule a 37 °C per 18 ore in un incubatore contenente il 5% di CO2 . Cambiare il mezzo dei pozzetti alla fine dell'incubazione.
- Preparare la scorta di sospensione di esosomi carica di dopamina. Diluire la formulazione dell'esosoma carica di dopamina con un terreno per ottenere concentrazioni di 100 μL/mL, 250 μL/mL, 500 μL/mL e 1.000 μL/mL.
- Aggiungere le concentrazioni preparate sulle cellule all'interno di ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Incubare le piastre a 37 °C per 18 ore in un incubatore contenente il 5% di CO241.
- Saggio di vitalità cellulare MTT
NOTA: Al termine dell'incubazione, i rapporti di vitalità delle cellule sono determinati dal test MTT.- Preparare la soluzione di MTT (5 mg/mL) con PBS. Aggiungere 10 μL di soluzione di MTT a ciascun pozzetto. Incubare per 4 ore a 37 °C.
- Al termine dell'incubazione, aggiungere 100 μL di DMSO a ciascun pozzetto. Incubare le piastre per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Misurare i valori di assorbanza nel lettore ELISA a 570 nm42,43.
NOTA: Il test di vitalità MTT viene eseguito in triplice copia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolamento e caratterizzazione degli esosomi
Le cellule staminali della gelatina Wharton vengono coltivate e incubate in un terreno privo di siero per 48 ore quando la coltura raggiunge una densità sufficiente. Al termine dell'incubazione, il surnatante viene conservato a -20 °C. I surnatanti raccolti vengono diluiti con PBS e sottoposti a ultracentrifugazione (Figura 1). La soluzione ottenuta viene analizzata mediante analisi NTA e DLS. Gli esosomi vengono sterilizzati passando attraverso un filtro da 0,22 μm. La dimensione media degli esosomi ottenuti è stata determinata in 98 nm (Video 1). Alla fine della centrifugazione sono state ottenute circa 10 miliardi di particelle esosomiche. Il numero di nanoparticelle rivelate dalle analisi NTA e DLS è coerente tra loro. Inoltre, il potenziale zeta degli esosomi originati dalle WJ-MSC è stato misurato come -15,7 mV (Figura 2 e Figura 3).
Video 1: Analisi di tracciamento delle nanoparticelle di esosomi derivati da gelatina di Wharton. Clicca qui per scaricare questo video.
Caricamento di dopamina negli esosomi
Come calcolato nell'analisi NTA, c'erano circa 1,5 miliardi di nanoparticelle in 500 μL dei campioni isolati dalla gelatina di Wharton. La soluzione di dopamina (5 mg/mL) è stata miscelata con 500 μL di esosomi e la sospensione è stata incubata per 24 ore a 37 °C. Dopo l'incubazione, la soluzione ottenuta è stata caratterizzata da analisi NTA e DLS. Secondo i risultati dell'NTA, la dimensione media delle particelle della soluzione è risultata essere di 110 nm. Un confronto tra le dimensioni delle particelle degli esosomi e degli esosomi carichi di dopamina rivela che c'è stato un aumento significativo delle dimensioni degli esosomi carichi di dopamina. Il numero di nanoparticelle rivelate dalle analisi NTA e DLS era coerente tra loro. Inoltre, il potenziale zeta degli esosomi carichi di dopamina è stato misurato come -17,6 Mv (Figura 2 e Figura 3).
Video 2: Analisi di tracciamento di nanoparticelle di esosomi carichi di dopamina. Clicca qui per scaricare questo video.
| Campione | Potenziale Zeta |
| Esosoma | -15,7 mV ± 1,1 |
| Saponina | -12 mV ± 0,7 |
| Dopamina | -14,4 mV ± 1,3 |
| Esosoma carico di dopamina | -17,6 mV ± 0,8 |
Tabella 1: Potenziale Zeta di tutte le soluzioni.
Le analisi DSL, il sizer Zeta e la tabella del potenziale Zeta della soluzione di esosomi carica di dopamina, saponina e dopamina sono mostrate nella Tabella 1.
Figura 2: Analisi di tracciamento delle nanoparticelle degli esosomi. (A) Esosomi; (B) esosomi carichi di dopamina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi di Zetasizer . (A) Esosomi, (B) Esosomi carichi di dopamina, (C) Saponina, (D) Dopamina. Abbreviazione: d = dimensione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La presenza di dopamina nella soluzione è stata determinata mediante analisi HPLC. Gli esosomi carichi di dopamina sono stati ultracentrifugati e filtrati per rimuovere la dopamina libera. Se il carico di dopamina negli esosomi ha successo alla fine dell'incubazione, può essere rilevato mediante misurazione diretta della dopamina in seguito alla rottura degli esosomi. A questo scopo, la sospensione dell'esosoma carica di dopamina è stata riscaldata con vapore, acetonitrile aggiunto e la sospensione è stata sonica. L'assorbanza è stata misurata a 230 nm per valutare la quantità di dopamina rilasciata dagli esosomi interrotti.
Figura 4: Presenza di dopamina nella formulazione determinata dall'analisi HPLC. Tutte le analisi sono state eseguite utilizzando una colonna C-18 con una fase mobile di H2O/acetonitrile ad una velocità di flusso di 1 mL/min a 30 °C. L'assorbanza viene misurata a 230 nm per monitorare l'eluizione della dopamina. (A) Dopamina, (B) Saponina, (C) Esosomi carichi di dopamina. Abbreviazione: HPLC = cromatografia liquida ad alte prestazioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Come risultato dell'analisi HPLC, il picco risultante per la dopamina è stato osservato a 6,45 minuti. La presenza di saponina è stata rilevata anche dopo la frammentazione degli esosomi (Figura 4).
Capacità di carico del farmaco e cinetica di rilascio del farmaco in vitro
La capacità di carico della dopamina è stata calcolata utilizzando misure di spettrofotometria UV ed Eq (1) ed Eq (2). La percentuale di capacità di carico è risultata essere pari a 10,89 ± 0,33. Il profilo cumulativo di rilascio del farmaco è mostrato nella Figura 5. La cinetica di rilascio del farmaco monitorata per 8 ore ha rivelato che il 74,8% della dopamina incapsulata è stata rilasciata dagli esosomi entro le prime 8 ore (Figura 5).
Figura 5: Profilo cumulativo di rilascio del farmaco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Test di citotossicità in vitro
La citotossicità degli esosomi liberi e carichi di dopamina è stata studiata sui fibroblasti. I fibroblasti sono stati esposti a diverse concentrazioni di formulazioni (100 μL/mL, 250 μL/mL, 500 μL/mL e 1.000 μL/mL) e incubati per 18 ore. Sebbene gli esosomi caricati con dopamina non abbiano dimostrato effetti citotossici degni di nota, la saponina aggiunta alla formulazione per aumentare l'incapsulamento della dopamina ha ridotto la vitalità dei fibroblasti (p < 0,05, Figura 6). C'è stato un aumento della vitalità cellulare quando i fibroblasti sono stati trattati con esosomi carichi di dopamina fino a una concentrazione di 500 μL/mL. Al termine dell'incubazione di 18 ore, la vitalità cellulare è stata determinata mediante il test MTT (Figura 7). La significatività statistica dei risultati è stata valutata eseguendo ANOVA unidirezionale.
Figura 6: Immagini al microscopio (10x) dopo l'incubazione della formulazione con le cellule. (A) Dopamina, (B) Saponina, (C) Esosomi carichi di dopamina 100 μL/mL, (D) Esosomi carichi di dopamina 250 μL/mL, (E) Esosomi caricati con dopamina 500 μL/mL, (F) Esosomi carichi di dopamina 1.000 μL/mL. Barre di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Analisi statistica dei risultati dei test di vitalità MTT in cellule incubate per 18 ore con diverse concentrazioni di dopamina, saponina ed esosomi carichi di dopamina . (A) Risultati di citotossicità, (B,C) Analisi statistiche. Abbreviazioni: D = Dopamina; S = Saponina; Exo-DA1 = esosomi carichi di dopamina 100 μL/mL; Exo-DA2 = esosomi carichi di dopamina 250 μL/mL; Exo-DA 3 Esosomi caricati con dopamina 500 μL/mL; Exo-DA 4 = esosomi carichi di dopamina 1.000 μL/mL; MTT = bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Inoltre, gli effetti citotossici degli esosomi liberi sono stati studiati anche su fibroblasti a concentrazioni simili (Figura 8). Prima dell'esperimento, gli esosomi sono stati diluiti con PBS a 60 milioni di particelle per ml. Quindi, 10 μL, 25 μL, 50 μL e 100 μL della sospensione dell'esosoma sono stati aggiunti a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
Figura 8: Analisi statistica dei risultati dei test di vitalità MTT in cellule incubate per 18 ore con diverse concentrazioni di esosomi . (A) Risultati di citotossicità, (B,C) analisi statistiche. Abbreviazioni: EXO = esosomi; MTT = bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La vitalità dei fibroblasti è risultata più elevata con esosomi carichi di dopamina da 500 μL/mL ed esosomi liberi da 25 μL/mL rispetto ad altre concentrazioni. Tuttavia, non è stata osservata alcuna citotossicità significativa a nessuna concentrazione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gli esosomi sono piccole vescicole di membrana con dimensioni di 40-200 nm secrete dalla maggior parte dei tipi di cellule, ad esempio le MSC1. In grado di consentire la comunicazione tra le cellule, gli esosomi possono entrare nelle cellule in diversi modi come l'endocitosi, la fagocitosi, la micropinocitosi, l'internalizzazione mediata dai lipidi e la fusione33,44. Rispetto ad altri sistemi di nanocarrier, i lipidi e il colesterolo presenti sulla superficie dell'esosoma conferiscono la capacità di trasportare molecole sia idrofile che idrofobiche, con il legame idrogeno delle estremità del colesterolo che consente un imballaggio stretto45.
Nel presente studio sono stati eseguiti l'isolamento di esosomi derivati da MSC, esperimenti di carico farmacologico e saggi di citotossicità. È noto che gli esosomi hanno un ruolo importante nella neurogenesi, in particolare nel cervello, oltre alle loro funzioni significative come il carico e la comunicazione tra le cellule 6,7. Inoltre, gli esosomi derivati dalle MSC sono relativamente ben tollerati, hanno proprietà terapeutiche intrinseche e mostrano un'elevata stabilità e capacità di homing46,47. Negli ultimi anni, la ricerca sui metodi di trattamento su scala nanometrica, come le applicazioni degli esosomi, ha attirato un'ampia attenzione come trattamenti alternativi contro le malattie neurodegenerative, poiché non esiste una cura per questi disturbi causati da danni neuronali. Inoltre, la capacità degli esosomi di passare attraverso la BBB li rende piattaforme eccellenti come sistema di trasporto dei farmaci.
Sebbene esistano diversi metodi per l'isolamento degli esosomi, in questo caso abbiamo utilizzato il metodo di isolamento dell'ultracentrifuga, che è accettato come uno dei metodi più efficaci. Nel presente studio, le WJ-MSC, selezionate come cellule donatrici, sono note per il loro basso potenziale immunogenico47 e sono utilizzate come fonte di esosomi negli studi clinici48. Gli esosomi ottenuti sono stati poi incubati con una soluzione di dopamina durante la quale la saponina viene aggiunta alla soluzione per aumentare il successo del carico di droga. Alla fine dell'incubazione, la dopamina e la saponina libere sono state rimosse dal terreno. Ci si aspetta che la saponina rimuova selettivamente il colesterolo legato alla membrana degli esosomi e crei pori nei doppi strati lipidici esosomiali, promuovendo l'ingresso di molecole di dopamina. Di conseguenza, si osserva che le dimensioni degli esosomi sono leggermente aumentate, probabilmente a causa del carico di dopamina.
Il potenziale zeta mostra una maggiore repulsione elettrostatica tra le particelle e la loro tendenza ad aggregarsi. Il potenziale zeta della formulazione ottenuta era compatibile con i risultati di studi precedenti49. Nell'analisi HPLC eseguita alla fine del periodo di incubazione, è stata rilevata la presenza di dopamina dopo la frammentazione degli esosomi. Come accennato in precedenza, la saponina favorisce l'incapsulamento della dopamina. La capacità di carico del farmaco è stata misurata mediante spettrofotometria UV-vis sulla base dei valori di assorbanza39. Sebbene il metodo di incubazione per il caricamento del farmaco sia semplice e meno costoso di altri metodi, l'efficienza di caricamento è bassa in questo metodo26. In questo studio, la capacità di carico era di circa l'11%. La saponina è un efficace agente permeabilizzante per la membrana citoplasmatica50 e sembra aumentare la capacità di carico degli esosomi con dopamina.
In studi futuri, potrebbe essere più efficace preferire il metodo di sonicazione per migliorare l'efficienza di carico esosomialedel farmaco 38. Il profilo cumulativo di rilascio del farmaco ha rivelato che grandi quantità di dopamina sono state rilasciate alla fine di 8 ore di incubazione. Un rilascio esplosivo è stato osservato nelle prime 5 ore dello studio di rilascio in vitro . Poiché il profilo di rilascio delle formulazioni di esosomi dipende da molti parametri come le proprietà dei farmaci, la fluidità del doppio strato e il peso molecolare, in molti studi si possono osservare differenze nelle quantità di farmaci rilasciati all'ora51. Inoltre, in questo studio non sono stati osservati effetti citotossici delle formulazioni sui fibroblasti. Tuttavia, l'effetto tossico della saponina aggiunta per aumentare il carico di dopamina negli esosomi è stato rilevato sulle cellule dei fibroblasti. Secondo questi dati, l'endogeneità degli esosomi è un vantaggio naturale e unico rispetto ai liposomi, alle microsfere, alle microemulsioni e ad altri sistemi di somministrazione di farmaci sintetici52. Per ridurre gli svantaggi del metodo attuale, diversi reagenti di trasfezione, tecniche di elettroporazione o cellule produttrici di dopamina endogena, preferibilmente MSC geneticamente modificate, possono essere utilizzate come fonte di esosomi.
L'isolamento degli esosomi è stato condotto con questo protocollo. Tuttavia, la fase di isolamento è un processo molto lungo e difficile. Occorre prestare attenzione per garantire che il surnatante raccolto dalla coltura cellulare si trovi nel terreno privo di siero. Inoltre, fino ad oggi, le quantità di esosomi sono state associate alla concentrazione proteica. Tuttavia, proponiamo che il calcolo e l'applicazione del numero di particelle esosomiche possa aiutare ad aumentare l'accuratezza negli studi clinici. Il metodo di incubazione utilizzato per il caricamento di esosomi isolati è risultato basso in termini di capacità di carico del farmaco. Il metodo di sonicazione, che ha un'elevata capacità di carico del farmaco, può aiutare a ottenere risultati più efficaci.
Questi risultati hanno mostrato che gli esosomi derivati da WJ-MSC sono potenti vettori per la somministrazione di dopamina. Insieme alla loro capacità di espellere la BBB e alle loro proprietà immunomodulatorie, è possibile sviluppare terapie mirate per il Parkinson o qualsiasi altra malattia del sistema nervoso centrale con esosomi portatori di farmaci. Tuttavia, gli studi devono essere condotti in vivo e supportati da sperimentazioni cliniche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Il lavoro è stato sostenuto principalmente dai finanziamenti per la ricerca forniti dai progetti di ricerca scientifica dell'Università tecnica di Yıldız (TSA-2021-4713).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 0.45 µm syringe filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 15 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| Acetonitrile | Sigma | 271004-1L | Used for HPLC analysis |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process | |
| Cell Culture Cabin | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Centrifugal | Hitachi | CF16RN | Used in the exosome isolation step |
| CO2 incubator with Safe Cell UV | Panasonic | Used for the cell culture process | |
| Dopamine hydrochloride H8502-10G | Sigma | H8502-10G | Used in exosome dopamine loading |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | To store cells and the resulting exosomes |
| Fridge | Panasonic | MPR-215-PE | Used to store cell culture and other materials |
| High performance liquid chromatography-HPLC | Agilent Technologies | The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated. | |
| Microscope- Primovert | Zeiss | Used to observe cells in cell culture. | |
| MTT Assay | Biomatik | Used to measure cell viability | |
| NanoSight NS300 | Malvern panalytical | Malvern panalytical | Used for exosome characterization |
| Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Used in the exosome isolation step | |
| PBS tablet | Biomatik | 43602 | In the preparation of the PBS solution |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Pipette Aid | Isolab | ||
| Precision balance-Kern | Kern-ABJ220-4NM | Used in the preparation of solutions | |
| Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Used to digest exosomes in HPLC analysis | |
| Saponin | Sigma | 47036-50G-F | It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process. |
| Spectrostar-Nano-Spectrophotometry | BMG LABTECH | Used for MTT and drug release analyzes | |
| SPSS 22 | statistical package program | ||
| Vorteks-FinePCR | FinePCR-FineVortex | Used to mix solutions homogeneously | |
| Water Bath 37 °C-Senova | Senova | Used in cell culture step | |
| Wharton’s jelly mesenchymal stem cells | ATCC | ||
| ZetaSizer | Malvern Nano ZS | Malvern Nano ZS | Used for exosome characterization |
References
- Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. L., Kwon, Y. L. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
- Riazifar, M., et al. Stem cell-derived exosomes as nanotherapeutics for autoimmune and neurodegenerative disorders. ACS Nano. 13 (6), 6670-6688 (2019).
- Ursavaş, S., Darıci, H., Karaoz, E. Olfactory ensheathing cells: Unique glial cells promising for treatments of spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 99 (6), 1579-1597 (2021).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Fruhbeis, C., Frohlich, D., Kramer-Albers, E. M. Emerging roles of exosomes in neuron-glia communication. Frontiers in Physiology. 3 (119), 1-7 (2012).
- Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: new players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabil Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
- Saeedi, S., Israel, S., Nag, C., Turecki, G. The emerging role of exosomes in mental disorders. Translational Psychiatry. 9 (1), 122 (2019).
- Jan, A. T., et al. Perspective insights of exosomes in neurodegenerative diseases: A critical appraisal. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 317 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Pahuja, R., et al. Trans-blood brain barrier delivery of dopamine-loaded nanoparticles reverses functional deficits in Parkinsonian rats. ACS Nano. 9 (5), 4850-4871 (2015).
- Rao, S. S., Hofmann, L. A., Shakil, A. Parkinson's disease: Diagnosis and treatment. American Family Physician. 15 (74), 2046-2054 (2006).
- Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Frontiers Neuroscience. 11, 737 (2017).
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson disease in 2015: Evolving basic, pathological and clinical concepts in PD. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 65-66 (2016).
- Poewe, W., et al.
- Carlsson, T., Björklund, T. Restoration of the striatal dopamine synthesis for Parkinson's disease: Viral vector-mediated enzyme replacement strategy. Current Gene Therapy. 7 (2), 109-120 (2007).
- Simon, D. K., Tanner, C. M., Brundin, P. Parkinson disease epidemiology, pathology, genetics, and pathophysiology. Clinics in Geriatric Medicine. 36 (1), 1-12 (2020).
- Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. Journal of Parkinson's Disease. 3 (3), 255-269 (2013).
- Senthilkumar, K. S., et al. Unilateral implantation of dopamine-loaded biodegradable hydrogel in the striatum attenuates motor abnormalities in the 6-Hydroxydopamine model of Hemi-Parkinsonism. Behavioral Brain Research. 184 (1), 11-18 (2007).
- Krishna, R., Ali, M., Moustafa, A. A. Effects of combined MAO-B inhibitors and levodopa vs. monotherapy in Parkinson's disease. Frontiers Aging Neuroscience. 6, 180 (2014).
- Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. JAMA. 323 (6), 548-560 (2020).
- Rivero Vaccari, J. P. Exosome-mediated inflammasome signaling after central nervous system injury. Journal of Neurochemistry. 136, Suppl. S1 39-48 (2016).
- Han, D., Wu, C., Xiong, Q., Zhou, L., Tian, Y. Anti-inflammatory mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat model of spinal cord injury. Cell Biochemistry and Biophysics. 71 (3), 1341-1347 (2015).
- Vilaça-Faria, H., Salgado, A. J., Teixeira, F. G. Mesenchymal stem cells-derived exosomes: A new possible therapeutic strategy for Parkinson's disease? Cells. 8 (2), 118-135 (2019).
- Mendes-Pinheiro, B., et al. marrow mesenchymal stem cells secretome exerts neuroprotective effects in a Parkinson's disease rat model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 294 (2019).
- Kalani, A., Kamat, P. K., Chaturvedi, P., Tyagi, S. C., Tyagi, N. Curcumin-primed exosomes mitigate endothelial cell dysfunction during hyperhomocysteinemia. Life Sciences. 107 (1-2), 1-7 (2014).
- Kalani, A., Tyagi, A., Tyagi, N. Exosomes: Mediators of neurodegeneration, neuroprotection, and therapeutics. Molecular Neurobiology. 49 (1), 590-600 (2014).
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Molecular Therapy. 23 (5), 812-823 (2015).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
- Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
- Yang, T., et al. Exosome delivered anticancer drugs across the blood-brain barrier for brain cancer therapy in danio rerio. Pharmaceutical Research. 32 (6), 2003-2014 (2015).
- Chen, H. X., et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Disease. 11 (4), 288 (2020).
- Yu, F., et al. Olfactory ensheathing cells seeded decellularized scaffold promotes axonal regeneration in spinal cord injury rats. Journal of Biomedical Materials Research. 109 (5), 779-787 (2020).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Qu, M., et al. Dopamine-loaded blood exosomes targeted to brain for better treatment of Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 287, 156-166 (2018).
- Kim, M. S., et al. Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome MDR In cancer cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 12 (3), 655-664 (2016).
- Branquinho, R. T., et al. HPLC-DAD and UV-spectrophotometry for the determination of lychnopholide in nanocapsule dosage form: Validation and application to release kinetic study. Journal of Chromatographic Science. 52 (1), 19-26 (2014).
- Karagöz Kutlutürk, I., et al. Producing aflibercept loaded poly (lactic-co-glycolic acid) [PLGA] nanoparticles as a new ocular drug delivery system and its challenges. Fresenius Environmental Bulletin. 30 (2), 1481-1493 (2021).
- Setiawatie, E. M., et al. Viability of nigella sativa toothpaste with SLS compared non-SLS on fibroblast cell culture. Journal of International Dental and Medical Research. 14 (2), 525-528 (2021).
- Jebelli, A., Khalaj-Kondori, M., Rahmati-Yamchi, M. The effect of beta-boswellic acid on the expression of Camk4 and Camk2α genes in the PC12 cell line. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 10 (3), 437-443 (2020).
- Cantelmo, R. A., Santos, N. A., Santos, A. C., Regiane, S., Joca, L. Dual effects of S-Adenosyl-Methionine on Pc12 cells exposed to the dopaminergic neurotoxin MPP. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 72 (10), 1427-1435 (2020).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Kooijmans, S. A., Vader, P., van Dommelen, S. M., van Solinge, W. W., Schiffelers, R. M. Exosome mimetics: A novel class of drug delivery systems. International Journal of Nanomedicine. 7 (1), 1525-1541 (2012).
- Yuan, Z., Kolluri, K. K., Gowers, K. H., Janes, S. M. Trail delivery by MSC-derived extracellular vesicles is an effective anticancer therapy. Journal Extracell Vesicles. 6 (1), 1265291 (2017).
- Darici, H., Sun, E., Koyuncu-Irmak, D., Karaöz, E. Mesenchymal stem cells for the treatment of COVID-19: Why and when they should be used? in Human Mesenchymal Stem Cells. Journal of Stem Cells. Khan, M. 4 (15), 159-181 (2021).
- Koyuncu-Irmak, D., Darici, H., Karaoz, E. Stem cell-based therapy option in COVID-19: Is it promising? Aging and Disease. 11 (5), 1174-1191 (2020).
- Leblanc, P., et al. Isolation of exosomes and microvesicles from cell culture systems to study prion transmission. Exosomes Microvesicles. 1545, 153-176 (2017).
- Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect Of porphyrins. Journal of Control Release. 205, 35-44 (2015).
- Mehryab, F., et al. Exosomes as a next-generation drug delivery system: An update on drug loading approaches, characterization, and clinical application challenges. Acta Biomaterialia. 113, 42-62 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
