Summary
Здесь мы описываем протокол получения экстракта сырого яда из морского анемона и выявления его гемолитической и фосфолипазной активности.
Abstract
Состав яда морского анемона включает полипептидные и небелковые молекулы. Цитолитические компоненты обладают высоким биотехнологическим и биомедицинским потенциалом для разработки новых молекулярных инструментов. Яд морского анемона находится в железистых клетках эктодермы и субклеточных структур, называемых нематоцистами, оба из которых распределены по всему телу морского анемона. Эта характеристика подразумевает проблемы, потому что клетки и нематоцисты должны быть лизированы для высвобождения компонентов яда с другими нетоксичными молекулами. Поэтому сначала яд получают из сырого экстракта (смесь различных и разнообразных молекул и тканевого мусора). Следующим шагом является обнаружение полипептидов со специфической биологической активностью. Здесь мы описываем эффективную стратегию получения сырого экстракта морского анемона и биоанализа для выявления присутствия цитолизинов. Первый шаг включает в себя недорогие и простые методы (цикл перемешивания и замораживания-оттаивания) для высвобождения цитолизинов. Мы получили самую высокую цитолитическую активность и белок (~500 мг белка из 20 г сухого веса). Далее полипептидную сложность экстракта анализировали с помощью геля SDS-PAGE, детектирующего белки с молекулярной массой от 10 кДа до 250 кДа. В гемолитическом анализе мы использовали эритроциты овец и определяли HU50 (11,1 ± 0,3 мкг/мл). Напротив, наличие фосфолипаз в сыром экстракте определяли с помощью яичного желтка в качестве субстрата в твердой среде с агарозой. В целом, это исследование использует эффективный и недорогой протокол для приготовления сырого экстракта и применяет воспроизводимые биоанализы для идентификации цитолизинов, молекул с биотехнологическими и биомедицинскими интересами.
Introduction
Морские животные являются богатым источником биологически активных соединений. В последние десятилетия состав яда морского анемона привлек научное внимание, поскольку он включает в себя разнообразие полипептидов с гемолитической, цитотоксической, ферментативной (фосфолипаза, протеаза, хитиназа) и нейротоксической активностью и ингибирующим действием на протеолитическую активность1. Кроме того, эти полипептиды являются потенциальными источниками для разработки молекулярных инструментов в биотехнологическом и терапевтическом использовании 2,3.
Существует мало сообщений о яде морского анемона и его молекулярных компонентах из-за сложности получения яда, даже выделения и характеристики токсинов. Методы экстракции, используемые в отчетах, включали лизис и опорожнение содержимого клеток, которые связаны и не связаны с производством яда1.
Особой характеристикой у всех книдарианцев является отсутствие системы производства и высвобождения яда, централизованной в единой анатомической области. Вместо этого нематоцисты представляют собой структуры, которые удерживают яд 4,5. Другие типы клеток, называемые клетками эпидермальной железы, также выделяют токсины и также распределяются по всему телу морских анемонов6.
Первой и наиболее важной проблемой в получении яда является генерация экстракта с достаточными манипуляциями в последующих процессах, без инактивации или деградации лабильных белков. Далее клетки должны быть лизированы, а компоненты — в данном случае полипептиды — должны быть эффективно и быстро экстрагированы, избегая протеолиза и гидролиза при одновременном устранении других клеточных компонентов7.
Для получения сырого экстракта морского анемона используются различные методы; некоторые из них связаны с принесением в жертву организма, в то время как другие позволяют сохранить его живым. Методы, которые подразумевают использование всего тела организма, позволяют высвобождать большинство токсинов из яда8, по сравнению с методами, которые поддерживают жизнь организмов, которые извлекают только некоторые компоненты яда9. Приготовление экстракта требует оценки присутствия и эффективности вещества, представляющего интерес, посредством специфического биоанализа, который включает в себя стратегии наблюдения фармакологических эффектов методами in vivo или in vitro 10.
Яд морского анемона содержит цитолитические полипептиды, порообразующие токсины (ПФТ)11 и фосфолипазы12; эти молекулы являются моделями в изучении белково-липидного взаимодействия, молекулярными инструментами в терапии рака и биосенсорами на основе нанопор3. Классификация ФФТ морских анемонов проводится по их размерам или молекулярной массе, от 5 кДа до 80 кДа. PFT 20 кДа, наиболее изученный и известный как актинопорины11, представляет особый интерес из-за его биомедицинского потенциала в разработке молекулярных инструментов для возможных применений в качестве противоопухолевых, противомикробных и нанопоровых биосенсоров. Другой цитолизин, включая фосфолипазы, в частности фосфолипазу A2 (PLA2)13, высвобождает жирную кислоту и гидролизует фосфолипиды, дестабилизируя клеточную мембрану. Благодаря такому механизму действия PLA2 обещает стать важной моделью для изучения и применения при воспалительных заболеваниях. Он может служить моделью для исследований поведения липидов в клеточной мембране14.
Здесь мы описываем эффективный протокол получения сырого экстракта из морского анемона Anthopleura dowii Verrill, 1869, и обнаружения гемолизинов и фосфолипаз. Оба являются релевантными токсинами, которые могут быть использованы в качестве шаблона для разработки новых молекулярных инструментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Морские анемоны были собраны в соответствии с руководящими принципами Национальной комиссии по аквакультуре, рыболовству и продовольствию федерального правительства Мексики (номер разрешения PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Комитет по биоэтике Института биотехнологии Национального автономного университета Мексики одобрил все эксперименты с морскими анемонами. Образец овечьей крови был приобретен в Центре практического обучения и исследований в области животноводства и здоровья (CEPIPSA, Национальный автономный университет Мексики).
1. Сбор организмов
- Собирают морского анемона A. dowii.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь организмы были собраны во время периодов отлива в приливной зоне у побережья Энсенада-Баха, Калифорния, Мексика (рисунок 1A,B). - Транспортируйте организмы в лабораторию в контейнерах с морской водой (рисунок 1С).
- В лаборатории очистите организмы дистиллированной водой вручную, чтобы удалить крупные частицы субстрата, прилипшие к телу.
- Немедленно заморозьте организмы при -80 °C в ультра-морозильной камере в течение 72 ч.
- Поместите организмы в специальные стаканы для сублимационной сушки, с условиями лиофилизации -20 °C, 0,015 psi, на 48 ч.
- Хранить лиофилизированные организмы при -20 °C до использования.
2. Гидратация тканей
- Восстановите 20 г сухой массы лиофилизированных организмов с 60 мл (1/3 вт/об) 50 мМ натрийфосфатного буфера, рН 7,5 и 1 таблеткой ингибитора коктейля (Таблица материалов).
- В магнитной мешалке непрерывно перемешивайте образец при ~800 об/мин, 4 °C, в течение 12 ч.
3. Высвобождение токсинов
- Чтобы вызвать лизис клеток и сброс нематоцисты, заморозьте образец при -20 °C в течение 12 ч, а затем поместите контейнер в воду комнатной температуры (RT) до тех пор, пока он не оттает до 90%. Повторите эту процедуру три раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец не оттаивает на 100%; крайне важно поддерживать образец при температуре ~4 °C, чтобы предотвратить деградацию белка. - Наблюдайте за нематоцистой, разряженной под конфокальным микроскопом. Возьмите 10 мкл образца на слайде и поместите поверх него крышку. Наблюдайте под конфокальным микроскопом при 100-кратном и 60-кратном увеличении. Здесь краситель был не нужен.
- Обрабатывайте изображения, полученные в конфокальном микроскопе, в программном обеспечении ImageJ (версия 1.53c, Wayne Rasband, National Institutes of Health, США, https://imagej.nih.gov/ij).
- Если каналец внутри нематоцисты отматывается и находится снаружи, нематоцисты разряжаются; затем перейдите к следующему шагу. В противном случае проведите только еще один цикл замораживания-оттаивания.
- Чтобы осветлить экстракт, центрифугируйте образец при 25 400 х г в течение 40 мин, 4 °C, извлеките супернатант и снова центрифугируйте его. Повторите этот шаг 3-4 раза.
- Восстановите супернатант и выбросьте гранулу. Супернатант или сырой экстракт содержит компоненты яда (токсины) и другие клеточные молекулы, такие как липиды, углеводы и нуклеиновые кислоты.
4. Количественное определение общего белка
- Определите концентрацию белка в сыром экстракте с помощью коммерческого набора колориметрического анализа Брэдфорда15 (Таблица материалов).
- Разбавить реагент красителя (одну часть красителя четырьмя частями дистиллированной воды).
- Готовят раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) фракции V (Таблица материалов) в концентрации 1 мг/мл в фосфатном буфере (50 мМ фосфата натрия, рН 7,5).
- Подготовьте растворы, перечисленные в таблице 1 , в трех экземплярах.
- Энергично перемешайте каждый раствор в шейкере в течение 4 с.
- Инкубировать образцы в течение 5 мин на RT, не встряхивая.
- Измерьте поглощение (AU) при 595 нм.
- Постройте средние значения абсорбции BSA образца (AU против концентрации белка) и определите уравнение графика (уравнение 1).
Уравнение 1
где y — поглощение, m — наклон линии, x — концентрация белка, а b — y-перехват. Чтобы рассчитать концентрацию сырого экстракта, решите для x следующим образом:
Уравнение 2
Уравнение 1
Уравнение 2
5. Определение сложности полипептидного яда
- Соберите стеклянный контейнер для вертикального гелевого электрофореза в соответствии с инструкцией.
- Готовят акриламидную смесь (30%): 29,2 г акриламида, 0,8 г бис-акриламида, конечный объем 100 мл. Отфильтруйте раствор с помощью мембраны 0,45 мкм. Хранить раствор в темном флаконе при температуре 4 °C. Затем подготовьте смесь для рассасывающего геля (табл. 2).
- Гель SDS-PAGE состоит из разрешающего геля и геля для укладки. Приготовьте гели в соответствии с объемами раствора, определенными в таблице 2. Во время приготовления убедитесь, что каждая смесь поддерживается при 4 °C, чтобы сократить время полимеризации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем каждой смеси варьируется в зависимости от марки используемого оборудования; для данного протокола объемы соответствуют приготовлению 15% акриламидного геля толщиной 0,75 мм, для вертикальной камеры электрофореза (Таблица материалов). - После того, как акриламид полимеризуется, ~10 мин, добавляют смесь укладочного геля.
- Подготовьте смесь для укладки геля, сразу же добавьте ее на стеклянные пластины и поместите гребень для формирования колодцев для загрузки образцов.
- После того, как гель для укладки полимеризуется (~ 15 мин), снимите гребень и поместите стеклянный контейнер в камеру для вертикального электрофореза.
- Поместите 200 мл электродного буфера (0,25 M Tris, 0,192 M глицина, 0,1% SDS) в камеру электрофореза.
- Анализ сырого экстракта: Смешайте 30 мкг сырого экстракта с 5 мкл белкового нагрузочного буфера (25% глицерина, 15% додецилсульфата натрия, 25% 2-меркаптоэтанола, 0,125 мМ Tris pH 7, бромфенол-синего 0,1 мг/мл) для денатуры белков. Конечный объем должен составлять <50 мкл.
- Нагревать при 90 °C в течение 5 мин, охлаждать и центрифугу в течение 3 с при 1 400 х г.
- Загрузите образцы в колодцы укладочного геля. Загрузите стандартную молекулярно-весовую лестницу.
- Запускают электрофорез при константе 25 мА в течение 1 ч 30 мин.
- Извлеките стеклянные контейнеры из камеры электрофореза, чтобы продолжить окрашивание гелевых белков.
6. Белковое окрашивание
- Промойте гель в 50 мл дистиллированной воды, чтобы удалить мусор с буферного электрода.
- Выбросьте воду.
- Чтобы избежать диффузии белков геля, добавляют раствор для фиксации (60 мл этанола, 20 мл уксусной кислоты и 20 мл дистиллированной воды, конечный объем 100 мл). Инкубировать на RT в течение 40 мин с встряхиванием при 80 об/мин. Декантируйте раствор.
- Добавляют белковый сшивающий раствор (15 мл этанола, 0,25 мл глутаральдегида, 50 мл дистиллированной воды, конечный объем 65,25 мл) и инкубируют в течение 30 мин на РТ с встряхиванием при 80 об/мин. Удалите раствор.
- Вымойте гель 100 мл дистиллированной воды в течение 5 минут и удалите воду. Повторите эту процедуру четыре раза.
- Проводят белковое окрашивание 50 мл раствора Coomassie бриллиантового синего R-250 (40% метанол, 10% уксусная кислота, 50% дистиллированная вода, 0,1% краситель, конечный объем 100 мл), перемешивание при 60 об/мин в лабораторном ротационном генераторе при РТ в течение 15 мин.
- Восстановите раствор, который можно использовать для окрашивания других гелей.
- Для устранения избытка красителя добавляют очищающий раствор (40 мл метанола, 10 мл уксусной кислоты, 50 мл дистиллированной воды). Продолжайте помешивать (80 об/мин) при RT до тех пор, пока полосы (окрашенные белки) не визуализируются.
- Храните гель в 50 мл дистиллированной воды и сканируйте изображение в системе документирования геля.
7. Приготовьте раствор эритроцитов
- Извлеките 1 мл крови из яремной вены овцы.
- Извлеките иглу из шприца и немедленно слейте кровь в пробирку с 50 мл раствора Alsever (0,002 М лимонной кислоты, 0,07 М NaCl, 0,1 М декстрозы и 0,027 М цитрата натрия в качестве антикоагулянта, рН 7,4).
- Медленно переворачивайте раствор три раза.
- Хранить при температуре 4 °C для передачи в лабораторию.
- Центрифугу при 804 х г в течение 5 мин при 4 °С и выбросьте супернатант.
- Повторно суспендировать гранулу в 30 мл раствора Alsever. Добавьте раствор, сдвинув его по внутренним стенкам трубки и, используя пластиковую пипетку Пастера, медленно повторно суспендируйте клетки. Центрифуга снова при 804 х г в течение 5 мин, 4 °C. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока не прояснится супернатант.
- Добавить 15 мл раствора Alsever; медленно восстанавливайте гранулы пластиковой пипеткой Pasteur.
- Поддерживают конечный объем раствора Alsever для достижения концентрации 2 х 106 клеток/мл, приблизительно. Затем используйте камеру Нойбауэра или гемоцитометр для подсчета клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитайте эритроциты в гемацитометрическом слайде (улучшенный Neubauer). Затвор представляет собой слайд размером 30 мм x 70 мм x 4 мм. Центр имеет две серебряные подножки (рисунок 2A) (одна верхняя и одна нижняя сетка), каждая 3 мм х 3 мм, и два канала по бокам сетки. Подсчет ячеек находится в угловом и центральном квадратах (красные квадраты на рисунке 2B). Оптимальная концентрация клеток для подсчета должна быть порядка 106 клеток. Центральная коробка имеет площадь поверхности 0,1см2, что эквивалентно 0,0001 мл. - Поместите крышку поверх слайда.
- Поместите 10 мкл образца между слайдом и крышкой и подождите, пока образец распределится.
- В оптическом микроскопе (увеличение 60x) выполните подсчет в первой квадратной коробке. Подсчитывайте только ячейки в центральной сетке и те, которые касаются верхнего или левого поля поля.
- Определите концентрацию клеток с помощью следующего уравнения:
Уравнение 3
Если образец очень концентрированный и требуется разбавление, то используйте следующее уравнение:
Уравнение 4
ПРИМЕЧАНИЕ: При взятии раствора эритроцитов для гемолиза медленно гомогенизируйте раствор пластиковой пипеткой Пастера. - Выполните действия в трех экземплярах, чтобы уменьшить количество ошибок.
Уравнение 3
Уравнение 48. Гемолизный анализ
- Готовят раствор смеси (в трех экземплярах), указанные в таблице 3 , в конических 96-луночных пластинах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Медленно перемешайте эритроциты, чтобы сохранить однородную суспензию. - Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C, не встряхивая.
- Центрифугировать пластину при 804 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Восстановите супернатант в другой 96-луночной плите с плоским дном.
- Если сырой экстракт содержит цитолизины, эритроциты будут лизироваться и высвобождать гемоглобин. Считывается поглощение при 415 нм.
- Рассчитайте процент гемолиза, используя следующее уравнение:
% Гемолиз = ((Acrude extract-AAlsever буфер) / (AH2O-AAlsever)) x 100
ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракт Acrude, буфер AAlsever и AH2O соответствуют абсорбции эритроцитов с сырым экстрактом, абсорбции раствора Alsever и абсорбции дистиллированной воды, соответственно. - Выполняйте тест гемолиза до и после каждого цикла замораживания и оттаивания с 50 мкг общего белка из сырого экстракта.
- Определить количество циклов замораживания и оттаивания, необходимых для достижения 100% гемолитической активности.
- Рассчитать количество экстракта, который производит гемолиз в 50% эритроцитов (HU50); следовать тому же протоколу, описанному в таблице 3, увеличить количество сырой добычи морских анемонов и спроектировать участок с сигмоидальными корректировками с использованием соответствующего программного обеспечения (например, Origin, Table of Materials).
9. Анализ фосфолипазы
- Вымойте одно куриное яйцо с 1% SDS в дистиллированной воде.
- Отделите яичный желток от яичного белка в стерильных условиях.
- Приготовьте 50 мл 0,86% раствора NaCl и процедите через фильтр 0,22 мкм. Затем приготовьте раствор А: добавьте 12 мл яичного желтка и 36 мл 0,86% раствора NaCl.
- Приготовить раствор В: Смешать 300 мг агарозы в 50 мл буфера (50 мМ Tris, рН 7,5), процедить через фильтр 0,22 мкм. Разогрейте раствор в микроволновой печи до кипения. Охладить в теплой воде до 43-45°C.
- Подготовьте раствор C: Подготовьте 10 мМ CaCl2 и процедите его фильтром 0,22 мкм.
- Приготовить раствор D: 10 мг родамина 6 г в 1 мл дистиллированной воды.
- В стерильных условиях (ламинарный проточный колпак) добавьте 500 мкл растворов А и С к раствору В и 100 мкл раствора D, перемешайте и влейте 25 мл в каждую чашку Петри (90 х 15 мм).
- Дождитесь затвердевания раствора в стерильных условиях (30 мин).
- Сделайте лунки (~2-3 мм диаметром) с тонкой трубкой.
- Добавьте в общей сложности 20 мкл фосфатного буфера (отрицательный контроль) в одной лунке и 20 мкл определенной фосфолипазы (положительный контроль) в другой скважине.
- Поместите различные количества сырого экстрактного белка, 5, 15, 25, 35, 45 мкг, в оставшиеся скважины, каждая в конечном объеме 20 мкл.
- Подождите, пока агар адсорбирует все образцы (30 мин).
- Инкубировать при 37 °C в течение 20 ч.
- Если вокруг колодца образуется ореол, это свидетельствует об активности фосфолипазы. Измерьте ореол, образованный суппортом Вернье.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эксперимент в трех экземплярах (шаги из 9.1-9.14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Репрезентативные результаты протокола, использованные для получения сырого экстракта морского анемона, показали, что сочетание двух методов (перемешивание и циклы замораживания и оттаивания) приводило к эффективному разгрузке нематоцист, а общее количество белка составляло 500 мг (8 мг/мл) (рисунок 3).
Сложность белка сырого экстракта можно наблюдать от 10 кДа и более 250 кДа с помощью электрофореза SDS-PAGE. Кроме того, цитолизины были обнаружены в молекулярно-массовой зоне 15 кДа и 20 кДа, диапазон молекулярных масс, которые могут соответствовать фосфолипазам13 или актинопоринам3 (фиг.4).
Гемолитическая активность экстракта до и во время циклов замораживания и оттаивания увеличивалась до тех пор, пока не был достигнут 100% гемолиз с 50 мкг общего белка сырого экстракта в последних двух циклах. Количество, необходимое для лизирования 50% эритроцитов овец (HU50), составляет 11,1 ± 0,3 мкг/мл (рисунок 5). Активность фосфолипазы была обнаружена путем образования прозрачных ореолов в областях агаровой пластины, куда был нанесен образец сырого экстракта. Результаты показывают наличие активности фосфолипазы от 15 мкг общего белка. Диаметр ореола увеличивался дозозависимым образом, т.е. если количество сырого экстракта увеличивалось, диаметр ореола увеличивался (фиг.6А и таблица 4).
Рисунок 1: Коллекция морских анемонов. А) Приливная зона в Эль-Саузале, Нижняя Калифорния, Мексика. (B) Собранные морские анемоны. (C) Anthoplerua dowii Verrill, 1869. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Гемацитометр слайд. (А) В центре слайда находятся две серебряные подножки. (B) Подсчитываются ячейки в квадратах с красным периметром. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Разряд нематоцисты. Нематоцисты (А) до и (Б) после раздражителей. В В каналец нематоцисты подвергается воздействию и указывает на высвобождение токсинов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Электрофоретический профиль сырого экстракта морского анемона. Сырой экстракт морского анемона был проанализирован 15% полиакриламидным гелем SDS-PAGE и показал белок от 10 кДа до 250 кДа молекулярной массы. Полоса 1: белковая лестница, полоса 2: яд морского анемона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Анализ гемолиза в эритроцитах овец. Высвобождение гемоглобина было обнаружено при 415 нм. Для определения HU50 было проанализировано различное количество белка, равное 11,1 ± 0,3 мкг/мл. Анализы гемолиза проводились в трех экземплярах. Бары представляют стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Анализ фосфолипазы. Различные количества общего белка анализировали в агарозе с яичным желтком в присутствии Ca2+. Активность фосфолипазы можно наблюдать вокруг каждой скважины, как ореол. Элементы управления: фосфатный буфер (Fosf.) и PLA2 от змеи (F.A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Тюбик | Дистиллированная вода | БСА | Краситель (мкл) | Заключительный том | |
| (мкл) | (мкг) | (мкл) | (мкл) | ||
| 1 | 800 | - | - | 200 | 1000 |
| 2 | 799 | 1 | 1 | 200 | 1000 |
| 3 | 797 | 3 | 3 | 200 | 1000 |
| 4 | 795 | 5 | 5 | 200 | 1000 |
| 5 | 793 | 7 | 7 | 200 | 1000 |
| 6 | 790 | 10 | 10 | 200 | 1000 |
| Сырой экстракт (мкл) | |||||
| 7 | 798-790 | от 2 до 10 | 200 | 1000 | |
Таблица 1: Количественное определение белка методом анализа Брэдфорда.
| Решение | Разрешающий гель | Укладочный гель |
| Высушенная вода | 1,1 мл | 1,4 мл |
| Акриламидная смесь (30%) | 2,5 мл | 0.33 мл |
| Tris (1,5 М, pH 8,8), отрегулируйте pH с помощью HCl. | 1,3 мл | |
| Трис (0,5 М, рН 6,8), отрегулируйте рН с помощью HCl. | 0.25 мл | |
| Додецилсульфат натрия (SDS) 10% (мас./об.) | 0,5 мл | 0.1 мл |
| Персульфат аммония (APS) (10%) | 0,5 мл | 0.1 мл |
| N,N,Nˈ,Nˈ-тетраметилэтилендиамин (TEMED) | 0.005 мл | 0.005 мл |
Таблица 2: Растворы для приготовления 15% акриламида SDS-PAGE электрофорезного геля.
| Колодец | Раствор Альсервера (мкл) | Дистиллированная вода | Добыча сырой нефти | Раствор эритроцитов (мкл) | Заключительный том | Ожидаемое поглощение |
| (мкл) | (мкл) | (мкл) | (415 нм) | |||
| 1 | 180 | - | - | 20 | 200 | ≤0,1 |
| 2 | - | 180 | - | 20 | 200 | ≤1.0 |
| 3 | 177–170 | - | 3–10 | 20 | 200 | 0.1–1.0 |
Таблица 3: Гемолизный анализ для калибровки эритроцитов.
| Образец | Диаметр ореола (мм) |
| 15 мкг F.A | 0 |
| 30 мкл Fosf. | 6.3 ± 0.5 |
| 5 мкг | 0 |
| 15 мкг | 2.3 ± 0.5 |
| 25 мкг | 3.5 ± 0.5 |
| 35 мкг | 4.1 ± 1 |
| 45 мкг | 4.6 ± 0.8 |
Таблица 4: Диаметр ореолов при различных количествах белка из сырого экстракта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Высокий спрос на новые соединения с применением в различных областях науки и промышленности привел к изучению яда. Яд представляет собой богатый источник молекул, который служит шаблоном для генерации новых молекулярных инструментов. Однако сложность этих ядов требует реализации и сочетания различных методов их получения и изучения.
Здесь мы показываем метод получения и анализа яда морского анемона Anthopleura dowii, Verrill 1869, который может быть использован для исследования яда других видов морских анемонов, начиная с лиофилизированных образцов, а затем грубого экстракта обтенции. Стадия лиофилизации позволила сохранить организмы до момента использования и для использования части образца в соответствии с потребностями эксперимента, что позволило эффективно применять организмы, избегать сбора большого их количества и поддерживать стабильность белка 7,16. Приготовление сырого экстракта с токсинами из свежих организмов является более мощным, чем те, которые выделены из лиофилизированных организмов. Однако белки сырого экстракта сохраняют свою функцию в течение большего времени при замораживании при -20 °C17. Лиофилизация организмов также имеет биоэтические последствия, поскольку это позволяет оптимизировать использование образца и избежать сбора большего количества организмов.
Метод замораживания и оттаивания позволяет работать со всем телом организма, при этом преимущество книды распределяются по всему телу. Тем не менее, важно циклически замораживать и размораживать эффективно (в течение длительных периодов времени и других методов), чтобы получить больше яда. В других отчетах экстракция яда осуществляется с помощью коротких временных циклов, уменьшая количество и разнообразие токсинов в сыром экстракте 18,19.
Анализ Брэдфорда, используемый для определения общего количества белка, полученного в сыром экстракте, является воспроизводимым, недорогим и простым методом, совместимым с условиямисырого извлечения 15. Общий белок, полученный здесь, выше, чем количество, о котором сообщалось ранее 20,21,22. Разнообразие и обилие токсинов при добыче будет зависеть от вида и коллекции организмов.
Гель-электрофорез SDS-PAGE является эффективным методом, используемым для анализа сложности сырого экстракта. Однако хорошая фиксация белков глутаровым альдегидом важна при анализе белков с более низкой молекулярной массой и меньшим содержанием, которые могут диффундировать из геля во время процесса окрашивания23.
Одним из преимуществ наличия экстракта с высокой полипептидной сложностью является возможность проведения полного протеомного исследования. Если этот экстракт подвергнуть процессам очистки, то можно выявить еще более значительное количество токсинов биотехнологического, экологического и биомедицинского характера24.
При исследовании яда идентификация молекулы или группы полипептидов с определенной функцией, как правило, затруднена. Поэтому важно иметь воспроизводимые, специфические, быстрые и недорогие биоанализы. Гемолитические и фосфолипазные анализы являются наиболее используемыми для изучения цитолизинов в ядах. Поскольку актинопорины имеют высокое сродство к сфингомиелину, лучше всего использовать эритроциты с большим количеством этого липида в их мембранах, поскольку таким образом будет использоваться меньше образцов. В этом смысле эритроциты овец представляют собой клетки с высоким содержанием сфингомиелина в их мембране25. Анализ гемолиза, выявляющий наличие гемоглобина при абсорбции 415 нм. Этот биоанализ только указывает на то, что присутствие цитолизинов может действовать на эритроциты. Однако определить тип цитолизина, вызывающего гемолиз, не представляется возможным; по этой причине мы рекомендуем проводить дополнительные анализы.
Хотя анализ агарозы яичного желтка позволяет выявить наличие различных типов фосфолипаз в зависимости от цвета ореола, мы не можем различить разные фосфолипазы для сырого экстракта A.dowii; возможно высокое разнообразие фосфолипазы, производимое A. dowii26. Для будущих исследований мы предлагаем выполнить этот анализ с градиентом концентрации сырого экстракта, возможно, с белковыми нанограммами.
Хотя в морской экосистеме есть молекулы с высоким потенциалом в медицинских, биотехнологических и промышленных районах, еще многое предстоит проанализировать и исследовать в яде книдарианцев.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующего интереса в отношении публикации данной статьи.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Программой апойо проекта исследований и инноваций в области технологий (PAPIIT) с номером гранта IT200819. Авторы выражают признательность Тому Масселману, Rock Paper Editing, LLC, за проверку английской грамматики этой рукописи; и техническая помощь Саманты Хименес (СИСЕСЕ, Энсенада) и Хуана Мануэля Барбосы Кастильо (Институт физики Селулара, УНАМ). Мы также благодарим д-ра Аугусто Сезара Лизаразо Чапарро (CEPIPSA) за получение овечьей крови. Мы особенно благодарим д-ра Хосе Санигера Блесу, ICAT-UNAM, за оборудование в его лаборатории для видеозаписи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430766 | |
| 2-Bromophenol blue | Sigma | B75808 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| Acetic Acid Glacial | J.T. Baker | 9515-03 | |
| Acrylamide | Promega | V3115 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Bisacrylamide | Promega | V3143 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Sigma | A3059-100G | |
| Bradford Protein Assays | Bio-Rad | 5000006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 3894 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge tubes | Corning | CLS430829 | |
| ChemiDoc MP system | Bio-Rad | 1708280 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clear flat.bottom 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | Bio-Rad | #1610406 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610400 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| Ductless Enclosure | Labconco | Vertical | https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c |
| Gel Doc EZ | Bio Rad. | Gel Documentation System | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-4L | |
| Hemocytometer | Marienfeld | 650030 | |
| ImageJ (Software) | NIH, USA | Version 1.53c | |
| Incubator 211 | Labnet | I5211 DS | |
| Methanol | J.T. Baker | 9049-03 | |
| Mini-PROTEAN tetra cell | Bio-Rad | 1658000EDU | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3824-01 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4.H2O | J.T. Baker | 3818-05 | |
| Origin software | version 9 | To design the plot with sigmoidal adjustments | |
| Petridish | Falcon | 351007 | |
| Pipetman kit | Gilson | F167380 | |
| Precast mini gel | BioRad | 1658004 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26620 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 252433 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Sodium citrate dihydrate | JT Baker | 3646-01 | |
| Spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | G10S UV-VIS | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 77-86-1 | |
| Volt Power Supply | Hoefer | PS300B |
References
- Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
- Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses. The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).
- Ramírez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodríguez-Almazán, C. Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools. Biomolecules. 10 (4), 539 (2020).
- Fautin, D. G. Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon. Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).
- Moran, Y., et al. Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution. Marine Biotechnology. 15 (3), New York, N.Y. 329-339 (2013).
- Moran, Y., et al. Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).
- Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).
- Bulati, M., et al. Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines. BioMed Research International. 2016, 3849897 (2016).
- Orts, D. J. B., et al. Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum. Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).
- Hader, D., Erzinger, G. Bioassays: Advanced Methods and Applications. , Elsevier Science. (2017).
- Anderluh, G., Macek, P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria). Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).
- Nevalainen, T. J., et al.
- Razpotnik, A., et al. A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis - its primary structure and phylogenetic classification. The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).
- Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -H., Magrioti, V., Kokotos, G. Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
- Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).
- Morales-Landa, J. L., et al. Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea. Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).
- Sánchez-Rodríguez, J., Cruz-Vazquez, K. Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860). Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).
- de Oliveira, J. S., et al. Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization. Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).
- Norton, R. S., et al. Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).
- Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).
- Dion, A. S., Pomenti, A. A. Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement. Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).
- Ramírez-Carreto, S., et al. Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry. The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).
- Nelson, G. J. Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells. Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).
- Ramírez-Carreto, S., et al. Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869. Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).
