Summary
Hier beschrijven we een protocol om ruw gifextract uit zeeanemoon te verkrijgen en de hemolytische en fosfolipase-activiteit ervan te detecteren.
Abstract
De samenstelling van zeeanemoongif omvat polypeptide- en niet-eiwitmoleculen. Cytolytische componenten hebben een hoog biotechnologisch en biomedisch potentieel voor het ontwerpen van nieuwe moleculaire hulpmiddelen. Zeeanemoongif lokaliseert zich in glandulaire cellen van ectoderm en subcellulaire structuren die nematocysten worden genoemd, die beide verspreid zijn over het zeeanemoonlichaam. Deze eigenschap impliceert uitdagingen omdat de cellen en nematocysten moeten worden gelyseerd om de gifcomponenten vrij te geven met andere niet-toxische moleculen. Daarom is het gif eerst afgeleid van een ruw extract (mengsel van verschillende en diverse moleculen en weefselresten). De volgende stap is het detecteren van polypeptiden met specifieke bioactiviteiten. Hier beschrijven we een efficiënte strategie om het ruwe extract van zeeanemonen te verkrijgen en bioassay om de aanwezigheid van cytolysinen te identificeren. De eerste stap omvat goedkope en eenvoudige technieken (geroerde en vries-dooicyclus) om cytolysines vrij te geven. We verkregen de hoogste cytolytische activiteit en eiwit (~ 500 mg eiwit uit 20 g droog gewicht). Vervolgens werd de polypeptidecomplexiteit van het extract geanalyseerd door SDS-PAGE-gel die eiwitten detecteerde met molecuulgewichten tussen 10 kDa en 250 kDa. In de hemolytische test gebruikten we schapenrode bloedcellen en bepaalden HU50 (11,1 ± 0,3 μg / ml). Daarentegen werd de aanwezigheid van fosfolipase in het ruwe extract bepaald met behulp van eigeel als substraat in een vast medium met agarose. Over het algemeen gebruikt deze studie een efficiënt en goedkoop protocol om het ruwe extract te bereiden en past repliceerbare bioassays toe om cytolysinen, moleculen met biotechnologische en biomedische belangen te identificeren.
Introduction
Zeedieren zijn een rijke bron van biologisch actieve verbindingen. In de afgelopen decennia heeft de samenstelling van zeeanemoongif wetenschappelijke aandacht getrokken, omdat het een diversiteit aan polypeptiden omvat met hemolytische, cytotoxische, enzymatische (fosfolipase, protease, chitinase) en neurotoxische activiteit en remmende effecten op proteolytische activiteit1. Bovendien zijn deze polypeptiden potentiële bronnen voor de ontwikkeling van moleculaire hulpmiddelen in biotechnologisch en therapeutisch gebruik 2,3.
Er zijn weinig rapporten over zeeanemoongif en zijn moleculaire componenten vanwege de complexiteit van het verkrijgen van het gif, zelfs isolatie en karakterisering van toxines. De extractiemethoden die in de rapporten werden gebruikt, betroffen lysis en het legen van de inhoud van cellen die gerelateerd en niet gerelateerd zijn aan de gifproductie1.
Een bijzonder kenmerk in alle cnidarians is de afwezigheid van een systeem voor productie en afgifte van het gif gecentraliseerd in een enkel anatomisch gebied. In plaats daarvan zijn de nematocysten structuren die het gif 4,5 houden. Andere soorten cellen, epidermale kliercellen genaamd, scheiden ook toxines af en zijn ook verdeeld over het lichaam van zeeanemonen6.
De eerste en meest cruciale uitdaging bij het verkrijgen van het gif is het genereren van een extract met voldoende manipulatie in daaropvolgende processen, zonder de inactivatie of afbraak van labiele eiwitten. Vervolgens moeten de cellen worden gelyseerd en moeten de componenten - in dit geval polypeptiden - efficiënt en snel worden geëxtraheerd, waarbij proteolyse en hydrolyse worden vermeden terwijl andere cellulaire componenten wordengeëlimineerd 7.
Verschillende methoden worden gebruikt om het ruwe extract van een zeeanemoon te verkrijgen; sommige omvatten het opofferen van het organisme, terwijl anderen toestaan dat het in leven wordt gehouden. Methoden die het gebruik van het hele lichaam van het organisme impliceren, zorgen voor de afgifte van de meeste toxines uit het gif8, vergeleken met methoden die organismen in leven houden, die slechts enkele componenten van het gif9 extraheren. De bereiding van een extract vereist een evaluatie van de aanwezigheid en potentie van een stof van belang door middel van een specifieke bioassay, die strategieën omvat om de farmacologische effecten te observeren met behulp van in vivo of in vitro methoden10.
Zeeanemoongif bevat cytolytische polypeptiden, porievormende toxines (PFT's)11 en fosfolipase12; deze moleculen zijn modellen in de studie van eiwit-lipide interactie, moleculaire hulpmiddelen in kankertherapie en biosensoren op basis van nanopore3. De classificatie van zeeanemoon PFT's wordt uitgevoerd op basis van hun grootte of molecuulgewicht, van 5 kDa tot 80 kDa. De 20 kDa PFT, de meest bestudeerde en bekend als actinoporinen11, is van bijzonder belang vanwege zijn biomedische potentieel bij de ontwikkeling van moleculaire hulpmiddelen voor mogelijke toepassingen als antikanker, antimicrobiële en op nanoporiën gebaseerde biosensoren. Een ander cytolysine, waaronder fosfolipase, met name fosfolipase A2 (PLA2)13, geeft een vetzuur af en hydrolyseert fosfolipiden, waardoor het celmembraan wordt gedestabiliseerd. Door dit werkingsmechanisme belooft PLA2 een essentieel model te zijn voor de studie en toepassingen bij ontstekingsziekten. Het zou kunnen dienen als een model voor studies van lipidengedrag in het celmembraan14.
Hier beschrijven we een efficiënt protocol voor het verkrijgen van het ruwe extract van zeeanemoon Anthopleura dowii Verrill, 1869, en het detecteren van hemolysines en fosfolipases. Beide zijn relevante toxines die kunnen worden gebruikt als een sjabloon om nieuwe moleculaire hulpmiddelen te ontwerpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De zeeanemonen werden verzameld volgens de richtlijnen van de Nationale Commissie voor Aquacultuur, Visserij en Voedsel van de Federale Overheid van Mexico (vergunningsnummer PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Bio-ethische commissie van het Instituut voor Biotechnologie, Nationale Autonome Universiteit van Mexico keurde alle experimenten met zeeanemonen goed. Het schapenbloedmonster werd gekocht bij het Center for Practical Teaching and Research in Animal Production and Health (CEPIPSA, National Autonomous University of Mexico).
1. Verzameling van organismen
- Verzamel zeeanemoon A. dowii.
OPMERKING: Hier werden de organismen verzameld tijdens ebperioden in de intergetijdenzone voor de kust van Ensenada Baja, Californië, Mexico (figuur 1A, B). - Vervoer de organismen naar het laboratorium in containers met zeewater (figuur 1C).
- Reinig in het laboratorium de organismen met gedestilleerd water met de hand om de grote substraatdeeltjes te verwijderen die zich aan het lichaam hechten.
- Vries de organismen onmiddellijk in bij -80 °C in een ultravriezer gedurende 72 uur.
- Plaats de organismen in speciale glazen voor vriesdrogen, met lyofilisatieomstandigheden van -20 °C, 0,015 psi, gedurende 48 uur.
- Bewaar de gelyofiliseerde organismen bij -20 °C tot gebruik.
2. Hydratatie van het weefsel
- Reconstitueer 20 g drooggewicht van gelyofiliseerde organismen met 60 ml (1/3 w / v) van 50 mM natriumfosfaatbuffer, pH 7,5 en 1 remmercocktailtablet (tabel met materialen).
- Roer het monster in een magneetroerder gedurende 12 uur continu bij ~800 rpm, 4 °C.
3. Afgifte van toxines
- Om cellysis en nematocystafscheiding te induceren, vriest u het monster gedurende 12 uur in bij -20 °C en plaatst u de container vervolgens in water bij kamertemperatuur (RT) totdat het tot 90% ontdooit. Herhaal deze procedure drie keer.
OPMERKING: Het monster ontdooit niet 100%; het is van cruciaal belang om het monster op ~4 °C te houden om eiwitafbraak te voorkomen. - Observeer de nematocyst geloosd onder een confocale microscoop. Neem 10 μL van het monster op een dia en plaats er een coverslip overheen. Observeer onder een confocale microscoop bij 100x en 60x vergroting. Hier was een kleurstof niet nodig.
- Verwerk de beelden die zijn vastgelegd in de confocale microscoop in ImageJ-software (versie 1.53c, Wayne Rasband, National Institutes of Health, VS, https://imagej.nih.gov/ij).
- Als de tubulus in de nematocyst loskomt en buiten is, worden de nematocysten geloosd; ga dan verder met de volgende stap. Voer anders nog maar één vries-dooicyclus uit.
- Om het extract te verduidelijken, centrifugeert u het monster bij 25.400 x g gedurende 40 minuten, 4 °C, herstelt u het supernatant en centrifugeert u het opnieuw. Herhaal deze stap 3-4 keer.
- Recupereer het supernatant en gooi de pellet weg. Het supernatant of ruwe extract bevat de gifcomponenten (toxines) en andere celmoleculen, zoals lipiden, koolhydraten en nucleïnezuren.
4. Kwantificering van het totale eiwit
- Bepaal de eiwitconcentratie van het ruwe extract met behulp van een commerciële Bradford colorimetrische assay15 kit (Tabel met materialen).
- Verdun het kleurstofreagens (een deel kleurstof met vier delen gedestilleerd water).
- Bereid runderserumalbumine (BSA) Fractie V (Table of Materials)-oplossing bij een concentratie van 1 mg/ml in fosfaatbuffer (50 mM natriumfosfaat, pH 7,5).
- Bereid de in tabel 1 vermelde oplossingen in drievoud voor.
- Meng elke oplossing krachtig in een shaker gedurende 4 s.
- Incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij RT, zonder te schudden.
- Meet de absorptie (AU) bij 595 nm.
- Plot de gemiddelden van de BSA-absorpties van het monster (AU versus eiwitconcentratie) en bepaal de vergelijking van de grafiek (vergelijking 1).
Vergelijking 1
waarbij y de absorptie is, m de helling van de lijn, x de eiwitconcentratie en b de y-intercept. Om de concentratie van ruw extract te berekenen, lost u de x als volgt op:
Vergelijking 2
Vergelijking 1
Vergelijking 2
5. Bepaal de complexiteit van polypeptidegif
- Monteer de glazen container voor verticale gel-elektroforese volgens de handleiding.
- Bereid acrylamidemengsel (30%): 29,2 g acrylamide, 0,8 g bis-acrylamide, het uiteindelijke volume van 100 ml. Filtreer de oplossing met een membraan van 0,45 μm. Bewaar de oplossing in een donkere fles bij 4 °C. Bereid vervolgens het mengsel voor op de oplossende gel (tabel 2).
- De SDS-PAGE gel bestaat uit een oplossende gel en een stapelgel. Bereid de gels volgens de in tabel 2 gedefinieerde oplossingsvolumes. Zorg er tijdens de bereiding voor dat elk mengsel op 4 °C wordt gehouden om de polymerisatietijd te verkorten.
OPMERKING: Het volume van elk mengsel varieert afhankelijk van het merk van de gebruikte apparatuur; voor dit protocol komen de volumes overeen met de bereiding van 15% acrylamidegel, 0,75 mm dik, voor een verticale elektroforesekamer (tabel met materialen). - Nadat het acrylamide is gepolymeriseerd, voeg je ~ 10 minuten het mengsel van stapelgel toe.
- Bereid het mengsel voor op de stapelgel, voeg het onmiddellijk toe aan de glasplaten en plaats een kam om de putten te vormen voor het laden van de monsters.
- Zodra de stapelgel is gepolymeriseerd (~ 15 min), verwijdert u de kam en plaatst u de glazen container in een kamer voor verticale elektroforese.
- Plaats 200 ml elektrodebuffer (0,25 M Tris, 0,192 M glycine, 0,1% SDS) in de elektroforesekamer.
- Analyseer het ruwe extract: Meng 30 μg ruw extract met 5 μL eiwitbelastingsbuffer (25% glycerol, 15% natriumdodecylsulfaat, 25% 2-mercaptoethanol, 0,125 mM Tris pH 7, broomfenolblauw 0,1 mg / ml) om eiwitten te denatureren. Het uiteindelijke volume moet <50 μL bedragen.
- Verwarm bij 90 °C gedurende 5 minuten, koel af en centrifugeer gedurende 3 s bij 1.400 x g.
- Laad de monsters in de putjes van de stapelgel. Laad een standaard moleculaire gewichtsladder.
- Voer elektroforese uit op 25 mA constant gedurende 1 h 30 min.
- Verwijder de glazen containers uit de elektroforesekamer om door te gaan met het kleuren van de geleiwitten.
6. Eiwitkleuring
- Spoel de gel in 50 ml gedestilleerd water om vuil van de bufferelektrode te verwijderen.
- Gooi het water weg.
- Om de diffusie van de geleiwitten te voorkomen, voegt u de fixatieoplossing toe (60 ml ethanol, 20 ml azijnzuur en 20 ml gedestilleerd water, eindvolume 100 ml). Incubeer bij RT gedurende 40 minuten met schudden bij 80 tpm. Decanteer de oplossing.
- Voeg de eiwitvernetingsoplossing toe (15 ml ethanol, 0,25 ml glutaaraldehyde, 50 ml gedestilleerd water, eindvolume 65,25 ml) en incubeer gedurende 30 minuten bij RT met schudden bij 80 tpm. Verwijder de oplossing.
- Was de gel met 100 ml gedestilleerd water gedurende 5 minuten en verwijder het water. Herhaal deze procedure vier keer.
- Voer eiwitkleuring uit met 50 ml Coomassie briljantblauwe R-250 gefilterde oplossing (40% methanol, 10% azijnzuur, 50% gedestilleerd water, 0,1% kleurstof, eindvolume 100 ml), roerend bij 60 tpm in een laboratorium roterende oscillator bij RT gedurende 15 minuten.
- Herstel de oplossing, die kan worden gebruikt om andere gels te bevlekken.
- Om de overtollige kleurstof te elimineren, voegt u een ontsmettende oplossing toe (40 ml methanol, 10 ml azijnzuur, 50 ml gedestilleerd water). Blijf roeren (80 rpm) bij RT totdat de banden (gekleurde eiwitten) visualiseren.
- Bewaar de gel in 50 ml gedestilleerd water en scan de afbeelding in een geldocumentatiesysteem.
7. Bereid rode bloedceloplossing
- Extract 1 ml bloed uit de halsader van een schaap.
- Verwijder de naald uit de spuit en laat het bloed onmiddellijk in een buis met 50 ml Alsever-oplossing (0,002 M citroenzuur, 0,07 M NaCl, 0,1 M dextrose en 0,027 M natriumcitraat als antistollingsmiddel, pH 7,4).
- Keer de oplossing langzaam drie keer om.
- Bewaren bij 4 °C voor overbrenging naar het laboratorium.
- Centrifugeer bij 804 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Resuspend de pellet in 30 ml Alsever-oplossing. Voeg de oplossing toe door deze langs de binnenwanden van de buis te schuiven en, met behulp van een pasteur plastic pipet, de cellen langzaam opnieuw op te suspenderen. Centrifugeer opnieuw bij 804 x g gedurende 5 min, 4 °C. Herhaal deze procedure totdat het supernatant is opgehelderd.
- Voeg 15 ml Alsever-oplossing toe; resuspend de pellet langzaam met een pasteur plastic pipet.
- Handhaaf het uiteindelijke volume van De Alsever-oplossing om een concentratie van ongeveer 2 x 106 cellen/ml te bereiken. Gebruik vervolgens een Neubauer-kamer of hemocytometer om de cellen te tellen.
OPMERKING: Tel de erytrocyten in de hemacytometerschuif (Verbeterde Neubauer). De glijbaan is een glijbaan van 30 mm x 70 mm x 4 mm. Het midden heeft twee zilveren voetplaten (figuur 2A) (een boven- en een onderraster), elk 3 mm x 3 mm, en twee kanalen aan de zijkanten van het raster. Het tellen van cellen bevindt zich in de hoek- en middenvierkanten (rode vierkanten in figuur 2B). De optimale concentratie van cellen voor het tellen moet in de orde van 106 cellen liggen. De centrale doos heeft een oppervlakte van 0,1 cm2, wat overeenkomt met 0,0001 ml. - Plaats een deklap over de dia.
- Plaats 10 μL van het monster tussen de dia en de coverslip en wacht tot het monster is uitgedeeld.
- Voer in een optische microscoop (vergroting 60x) de telling uit in het eerste vierkante vak. Tel alleen de cellen in het middelste raster en de cellen die de bovenste of de linkermarge van het vak raken.
- Bepaal de celconcentratie met behulp van de volgende vergelijking:
Vergelijking 3
Als het monster zeer geconcentreerd is en verdunning vereist is, gebruik dan de volgende vergelijking:
Vergelijking 4
OPMERKING: Wanneer u de erytrocytenoplossing voor de hemolysetest inneemt, homogeniseert u de oplossing langzaam met een plastic Pasteur-pipet. - Voer de stappen in drievoud uit om fouten te verminderen.
Vergelijking 3
Vergelijking 48. Hemolyse-test
- Bereid de in tabel 3 aangegeven oplossingsmengsels (in drievoud) in conische 96-well-platen.
OPMERKING: Meng de erytrocyten langzaam om een homogene suspensie te behouden. - Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C, zonder te schudden.
- Centrifugeer de plaat bij 804 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Recupereer het supernatant in een andere 96-putplaat met een vlakke bodem.
- Als het ruwe extract cytolysinen bevat, zullen erytrocyten lyseren en hemoglobine afgeven. Lees de absorptie af bij 415 nm.
- Bereken het hemolysepercentage met behulp van de volgende vergelijking:
% Hemolyse = ((Acrude extract-AAlsever buffer) / (AH2O-AAlsever)) x 100
OPMERKING: Acrude-extract, AAlsever-buffer en AH2O komen overeen met respectievelijk de absorptie van erytrocyten met het ruwe extract, de absorptie van De alsever-oplossing en de absorptie van gedestilleerd water. - Voer een hemolysetest uit voor en na elke vries- en ontdooicyclus met 50 μg totaal eiwit uit het ruwe extract.
- Bepaal het aantal vries- en ontdooicycli dat nodig is om 100% hemolytische activiteit te bereiken.
- Bereken de hoeveelheid extract die hemolyse produceert in 50% van de erytrocyten (HU50); volg hetzelfde protocol als beschreven in tabel 3, verhoog de hoeveelheid ruwe zeeanemoonextract en ontwerp het perceel met sigmoïdale aanpassingen met behulp van geschikte software (bijv. Oorsprong, Materialentabel).
9. Fosfolipase-test
- Was een kippenei met 1% SDS in gedestilleerd water.
- Scheid het eigeel van het eiwit onder steriele omstandigheden.
- Bereid 50 ml 0,86% NaCl-oplossing voor en filtreer door een filter van 0,22 μm. Bereid vervolgens oplossing A: Voeg 12 ml eigeel en 36 ml 0,86% NaCl-oplossing toe.
- Bereidingsoplossing B: Meng 300 mg agarose in 50 ml buffer (50 mM Tris, pH 7,5), filtreer door een filter van 0,22 μm. Verwarm de oplossing in een magnetron tot het kookt. Koel af in warm water tot 43-45°C.
- Bereiding oplossing C: Bereid 10 mM CaCl2 en filtreer het met een filter van 0,22 μm.
- Bereiding Oplossing D: 10 mg rhodamine 6G in 1 ml gedestilleerd water.
- Voeg onder steriele omstandigheden (laminaire stromingskap) 500 μL oplossingen A en C toe aan oplossing B en 100 μL oplossing D, meng en giet 25 ml in elke petrischaal (90 x 15 mm).
- Wacht tot de oplossing stolt onder steriele omstandigheden (30 min).
- Maak putten (~ 2-3 mm diameter) met een dunne buis.
- Voeg in totaal 20 μL fosfaatbuffer (negatieve controle) toe in de ene put en 20 μL van een bepaalde fosfolipase (positieve controle) in een andere put.
- Plaats verschillende hoeveelheden van het ruw extract eiwit, 5, 15, 25, 35, 45 μg, in de resterende putten, elk in een eindvolume van 20 μL.
- Wacht tot de agar alle monsters adsorbeert (30 min).
- Incubeer bij 37 °C gedurende 20 uur.
- Als zich rond de put een halo vormt, duidt dit op fosfolipase-activiteit. Meet de halo gevormd met een vernier remklauw.
OPMERKING: Voer het experiment in drievoud uit (stappen van 9.1-9.14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representatieve resultaten van het protocol dat werd gebruikt om het ruwe extract van zeeanemonen te verkrijgen, toonden aan dat het combineren van twee technieken (agitatie en cycli van invriezen en ontdooien) een efficiënte afvoer van nematocysten opleverde, en de totale hoeveelheid eiwit was 500 mg (8 mg / ml) (figuur 3).
De eiwitcomplexiteit van het ruwe extract kon worden waargenomen vanaf 10 kDa en meer dan 250 kDa via SDS-PAGE-elektroforese. Daarnaast werden cytolysines gedetecteerd in de molecuulgewichtszone van 15 kDa en 20 kDa, een reeks molecuulgewichten die kunnen overeenkomen met fosfolipase13 of actinoporinen3 (figuur 4).
De hemolytische activiteit van het extract vóór en tijdens de vries- en ontdooicycli nam toe totdat 100% hemolyse werd bereikt met 50 μg van het totale ruwe extracteiwit in de laatste twee cycli. De hoeveelheid die nodig is om 50% schapeneroytrocyten (HU50) te lyseren is 11,1 ± 0,3 μg/ml (figuur 5). Fosfolipase-activiteit werd gedetecteerd door de vorming van heldere halo's in de gebieden van de agarplaat, waar het ruwe extractmonster werd aangebracht. De resultaten tonen de aanwezigheid van fosfolipase-activiteit vanaf 15 μg totaal eiwit. De diameter van de halo nam op een dosisafhankelijke manier toe, d.w.z. als de hoeveelheid ruw extract toenam, nam de diameter van de halo toe (figuur 6A en tabel 4).
Figuur 1: Zeeanemoon collectie. (A) Intergetijdenzone in El Sauzal, Baja California Norte, Mexico. (B) Verzamelde zeeanemonen. (C) Anthoplerua dowii Verrill, 1869. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Hemacytometer schuif. (A) In het diacentrum bevinden zich twee zilveren voetplaten. (B) Cellen in vierkanten met een rode omtrek worden geteld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Nematocystafscheiding. Nematocyst (A) voor en (B) na stimuli. In B wordt de nematocyst tubulus blootgesteld en duidt op toxineafgifte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Elektroforetisch profiel van ruw extract van zeeanemonen. Het ruwe extract van zeeanemonen werd geanalyseerd door SDS-PAGE 15% polyacrylamide-gel en toonde eiwit van 10 kDa tot 250 kDa molecuulgewicht. Rijstrook 1: eiwitladder, rijstrook 2: zeeanemoongif. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Hemolysetest bij erytrocyten van schapen. Hemoglobineafgifte werd gedetecteerd bij 415 nm. Verschillende hoeveelheden eiwit werden getest om HU50 te bepalen, gelijk aan 11,1 ± 0,3 μg / ml. Hemolyse-assays werden in drievoud uitgevoerd. De staven vertegenwoordigen de standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Fosfolipasetest. Verschillende hoeveelheden totaal eiwit werden getest in agarose met eigeel in aanwezigheid van Ca2+. Fosfolipase-activiteit kan rond elke put worden waargenomen als een halo. Controles: fosfaatbuffer (Fosf.) en een PLA2 van een slang (F.A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Buis | Gedestilleerd water | BSA | Kleurstof (μL) | Laatste deel | |
| (μL) | (μg) | (μL) | (μL) | ||
| 1 | 800 | - | - | 200 | 1000 |
| 2 | 799 | 1 | 1 | 200 | 1000 |
| 3 | 797 | 3 | 3 | 200 | 1000 |
| 4 | 795 | 5 | 5 | 200 | 1000 |
| 5 | 793 | 7 | 7 | 200 | 1000 |
| 6 | 790 | 10 | 10 | 200 | 1000 |
| Ruw extract (μL) | |||||
| 7 | 798-790 | van 2 tot 10 | 200 | 1000 | |
Tabel 1: Kwantificering van eiwit door Bradford assay.
| Oplossing | Gel oplossen | Stapelgel |
| Gedestilleerd water | 1,1 ml | 1,4 ml |
| Acrylamide mix (30%) | 2,5 ml | 0,33 ml |
| Tris (1,5 M, pH 8,8), pas de pH aan met HCl. | 1,3 ml | |
| Tris (0,5 M, pH 6,8), stel de pH in met HCl. | 0,25 ml | |
| Natriumdodecylsulfaat (SDS) 10% (w/v) | 0,5 ml | 0,1 ml |
| Ammoniumperssulfaat (APS) (10%) | 0,5 ml | 0,1 ml |
| N,N,Nˈ,Nˈ-tetramethylethyleendiamine (TEMED) | 0,005 ml | 0,005 ml |
Tabel 2: Oplossingen voor het bereiden van een 15% acrylamide SDS-PAGE elektroforesegel.
| Goed | Alserver oplossing (μL) | Gedestilleerd water | Ruw extract | Erytrocytenoplossing (μL) | Laatste deel | Verwachte absorptie |
| (μL) | (μL) | (μL) | (415 nm) | |||
| 1 | 180 | - | - | 20 | 200 | ≤0,1 |
| 2 | - | 180 | - | 20 | 200 | ≤1,0 |
| 3 | 177–170 | - | 3–10 | 20 | 200 | 0.1–1.0 |
Tabel 3: Hemolysetest om erytrocyten te kalibreren.
| Monster | Diameter van halo (mm) |
| 15 μg F.A | 0 |
| 30 μL Fosf. | 6,3 ± 0,5 |
| 5 μg | 0 |
| 15 μg | 2,3 ± 0,5 |
| 25 μg | 3,5 ± 0,5 |
| 35 μg | 4,1 ± 1 |
| 45 μg | 4,6 ± 0,8 |
Tabel 4: Diameter van de halo's bij verschillende hoeveelheden eiwit uit het ruwe extract.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De grote vraag naar nieuwe verbindingen met toepassingen op verschillende gebieden van wetenschap en industrie heeft geleid tot de studie van gif. Gif vertegenwoordigt een rijke bron van moleculen die dient als een sjabloon voor het genereren van nieuwe moleculaire hulpmiddelen. De complexiteit van deze gifstoffen vereist echter de implementatie en combinatie van verschillende methoden om ze te verkrijgen en te bestuderen.
Hier tonen we een methode voor het verkrijgen en analyseren van het gif van de zeeanemoon Anthopleura dowii, Verrill 1869, die kan worden gebruikt om het gif van andere zeeanemonensoorten te onderzoeken, te beginnen met gelyofiliseerde exemplaren en vervolgens ruwe extract obtention. De lyofilisatiestap maakte het mogelijk om de organismen te bewaren tot gebruik en om een deel van het monster te gebruiken volgens de behoeften van het experiment, waardoor de efficiënte toepassing van organismen mogelijk werd, het verzamelen van grote aantallen van hen werd vermeden en de eiwitstabiliteit werd gehandhaafd 7,16. Ruw extractpreparaat met toxines van verse organismen is krachtiger dan die geïsoleerd uit gelyofiliseerde organismen. Eiwitten van ruw extract behouden echter hun functie voor langere tijd wanneer ze worden ingevroren bij -20 °C17. Lyofilisatie van de organismen heeft ook bio-ethische implicaties, omdat dit optimalisatie in het gebruik van het monster mogelijk maakt en de verzameling van meer organismen voorkomt.
De vries- en ontdooimethode maakt het mogelijk om met het hele lichaam van het organisme te werken, met het voordeel dat cnida door het hele lichaam wordt verspreid. Het is echter essentieel om efficiënt te bevriezen en te ontdooien (voor lange periodes en andere technieken) om meer gif te verkrijgen. In andere rapporten wordt gifextractie uitgevoerd via korte tijdcycli, waardoor de hoeveelheid en diversiteit van toxines in het ruwe extract wordt verminderd18,19.
De Bradford-test die wordt gebruikt om de totale hoeveelheid eiwit in het ruwe extract te bepalen, is een reproduceerbare, goedkope en eenvoudige methode die compatibel is met de ruwe extractcondities15. Het totale eiwit dat hier wordt verkregen is hoger dan de eerder gemelde hoeveelheid 20,21,22. De diversiteit en overvloed aan toxines in de extractie zal afhangen van de soort en de verzameling van de organismen.
Gel-elektroforese door SDS-PAGE is een efficiënte techniek die wordt gebruikt om de complexiteit van ruw extract te analyseren. Een goede fixatie van eiwitten met glutaaraldehyde is echter belangrijk bij het analyseren van de eiwitten met een lager molecuulgewicht en een lagere abundantie die tijdens het kleuringsproces uit de gel kunnen diffunderen23.
Een voordeel van het hebben van een extract met een hoge polypeptidecomplexiteit is de mogelijkheid om een volledige proteomische studie uit te voeren. Als dit extract wordt onderworpen aan zuiveringsprocessen, is het mogelijk om een nog groter aantal toxines van biotechnologische, ecologische en biomedische belangen te identificeren24.
In de studie van gif is het identificeren van een molecuul of een groep polypeptiden met een specifieke functie over het algemeen moeilijk. Daarom is het essentieel om reproduceerbare, specifieke, snelle en goedkope bioassays te hebben. Hemolytische en fosfolipase-assays worden het meest gebruikt om cytolysines in gifstoffen te bestuderen. Omdat actinoporinen een hoge affiniteit hebben voor sfingomyeline, is het het beste om erytrocyten te gebruiken met een grote hoeveelheid van dit lipide in hun membranen, omdat er op deze manier minder monsters zullen worden gebruikt. In die zin zijn schapenerofyten cellen met een hoog sphingomyeline in hun membraan25. De hemolysetest wordt geanalyseerd en detecteert de aanwezigheid van hemoglobine bij 415 nm absorptie. Deze bioassay geeft alleen aan dat de aanwezigheid van cytolysines kan inwerken op erytrocyten. Het is echter niet mogelijk om het type cytolysine te bepalen dat hemolyse veroorzaakt; om deze reden raden we aan om aanvullende testen uit te voeren.
Hoewel de eigeel agarose-test het mogelijk maakt om de aanwezigheid van verschillende soorten fosfolipase te identificeren, afhankelijk van de kleur van de halo, kunnen we geen onderscheid maken tussen verschillende fosfolipases voor het ruwe extract van A.dowii; een mogelijkheid is de hoge fosfolipasediversiteit geproduceerd door A. dowii26. Voor toekomstige studies raden we aan deze test uit te voeren met een ruwe extractconcentratiegradiënt, misschien met eiwitnanogrammen.
Hoewel er moleculen in het mariene ecosysteem zijn met een hoog potentieel in medische, biotechnologische en industriële gebieden, is er nog veel te analyseren en te onderzoeken in het gif van cnidarians.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen tegenstrijdig belang hebben met betrekking tot de publicatie van dit artikel.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), met een subsidienummer IT200819. De auteurs erkennen aan Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC, voor het controleren van de Engelse grammatica van dit manuscript; en de technische bijstand van Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada) en Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). We danken ook dr. Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) voor het verkrijgen van schapenbloed. We bedanken in het bijzonder Dr. José Saniger Blesa, ICAT-UNAM, voor de faciliteiten in zijn laboratorium voor de video-opname.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430766 | |
| 2-Bromophenol blue | Sigma | B75808 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| Acetic Acid Glacial | J.T. Baker | 9515-03 | |
| Acrylamide | Promega | V3115 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Bisacrylamide | Promega | V3143 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Sigma | A3059-100G | |
| Bradford Protein Assays | Bio-Rad | 5000006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 3894 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge tubes | Corning | CLS430829 | |
| ChemiDoc MP system | Bio-Rad | 1708280 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clear flat.bottom 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | Bio-Rad | #1610406 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610400 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| Ductless Enclosure | Labconco | Vertical | https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c |
| Gel Doc EZ | Bio Rad. | Gel Documentation System | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-4L | |
| Hemocytometer | Marienfeld | 650030 | |
| ImageJ (Software) | NIH, USA | Version 1.53c | |
| Incubator 211 | Labnet | I5211 DS | |
| Methanol | J.T. Baker | 9049-03 | |
| Mini-PROTEAN tetra cell | Bio-Rad | 1658000EDU | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3824-01 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4.H2O | J.T. Baker | 3818-05 | |
| Origin software | version 9 | To design the plot with sigmoidal adjustments | |
| Petridish | Falcon | 351007 | |
| Pipetman kit | Gilson | F167380 | |
| Precast mini gel | BioRad | 1658004 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26620 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 252433 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Sodium citrate dihydrate | JT Baker | 3646-01 | |
| Spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | G10S UV-VIS | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 77-86-1 | |
| Volt Power Supply | Hoefer | PS300B |
References
- Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
- Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses. The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).
- Ramírez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodríguez-Almazán, C. Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools. Biomolecules. 10 (4), 539 (2020).
- Fautin, D. G. Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon. Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).
- Moran, Y., et al. Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution. Marine Biotechnology. 15 (3), New York, N.Y. 329-339 (2013).
- Moran, Y., et al. Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).
- Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).
- Bulati, M., et al. Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines. BioMed Research International. 2016, 3849897 (2016).
- Orts, D. J. B., et al. Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum. Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).
- Hader, D., Erzinger, G. Bioassays: Advanced Methods and Applications. , Elsevier Science. (2017).
- Anderluh, G., Macek, P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria). Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).
- Nevalainen, T. J., et al.
- Razpotnik, A., et al. A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis - its primary structure and phylogenetic classification. The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).
- Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -H., Magrioti, V., Kokotos, G. Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
- Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).
- Morales-Landa, J. L., et al. Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea. Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).
- Sánchez-Rodríguez, J., Cruz-Vazquez, K. Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860). Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).
- de Oliveira, J. S., et al. Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization. Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).
- Norton, R. S., et al. Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).
- Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).
- Dion, A. S., Pomenti, A. A. Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement. Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).
- Ramírez-Carreto, S., et al. Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry. The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).
- Nelson, G. J. Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells. Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).
- Ramírez-Carreto, S., et al. Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869. Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).
