Summary
Her beskriver vi en protokoll for å få rå giftekstrakt fra sjøemone og oppdage dens hemolytiske og fosfolipaseaktivitet.
Abstract
Havemone gift sammensetning inkluderer polypeptid og ikke-proteiner molekyler. Cytolytiske komponenter har et høyt bioteknologisk og biomedisinsk potensial for å designe nye molekylære verktøy. Sjøemone gift finner i kjertelceller fra ektoderm og sub-cellulære strukturer kalt nematocysts, som begge er fordelt over hele havets anemone kropp. Denne egenskapen innebærer utfordringer fordi cellene og nematocysten må lyses for å frigjøre giftkomponentene med andre ikke-giftige molekyler. Derfor er giften først avledet fra et råekstrakt (blanding av forskjellige og mangfoldige molekyler og vevsrester). Det neste trinnet er å oppdage polypeptider med spesifikke bioaktiviteter. Her beskriver vi en effektiv strategi for å få sjøemone råolje ekstrakt og bioassay for å identifisere tilstedeværelsen av cytolysiner. Det første trinnet innebærer billige og enkle teknikker (rørt og fryse-tine syklus) for å frigjøre cytolysiner. Vi fikk den høyeste cytolytiske aktiviteten og proteinet (~ 500 mg protein fra 20 g tørrvekt). Deretter ble polypeptidkompleksiteten til ekstraktet analysert av SDS-PAGE gel detekterende proteiner med molekylvekter mellom 10 kDa og 250 kDa. I den hemolytiske analysen brukte vi sauerøde blodlegemer og bestemte HU50 (11,1 ± 0,3 μg/ml). I motsetning ble tilstedeværelsen av fosfolipaser i råekstraktet bestemt ved hjelp av eggeplomme som substrat i et solid medium med agarose. Samlet sett bruker denne studien en effektiv og billig protokoll for å forberede råoljeekstraktet og bruker replikerbare bioassays for å identifisere cytolysiner, molekyler med bioteknologiske og biomedisinske interesser.
Introduction
Marine dyr er en rik kilde til biologisk aktive forbindelser. I de siste tiårene har sammensetningen av sjøemone gift tiltrukket seg vitenskapelig oppmerksomhet siden den består av et mangfold av polypeptider med hemolytisk, cytotoksisk, enzymatisk (fosfolipase, protease, chitinase) og nevrotoksisk aktivitet og hemmende effekter på proteolytisk aktivitet1. I tillegg er disse polypeptider potensielle kilder for utvikling av molekylære verktøy i bioteknologisk og terapeutisk bruk 2,3.
Det er få rapporter om sjøemongift og dens molekylære komponenter på grunn av kompleksiteten ved å skaffe giftet, til og med isolasjon og karakterisering av giftstoffer. Utvinningsmetodene som brukes i rapportene involverte lysis og tømming av innholdet i celler som er relatert og ikke relatert til giftproduksjonen1.
En spesiell egenskap i alle cnidarians er fraværet av et system for produksjon og frigjøring av giftet sentralisert i en enkelt anatomisk region. I stedet er nematocystene strukturer som holder giften 4,5. Andre typer celler, kalt epidermale kjertelceller, skiller også ut giftstoffer og fordeles også over hele kroppen av sjømoner6.
Den første og mest avgjørende utfordringen med å skaffe giftet er genereringen av et ekstrakt med tilstrekkelig manipulasjon i etterfølgende prosesser, uten inaktivering eller nedbrytning av labile proteiner. Deretter må cellene lyses, og komponentene - i dette tilfellet må polypeptider effektivt og raskt ekstraheres, unngå proteolyse og hydrolyse mens du eliminerer andre cellulære komponenter7.
Ulike metoder brukes for å oppnå rå ekstrakt av en sjøemone; noen innebærer å ofre organismen mens andre tillater det å bli holdt i live. Metoder som innebærer bruk av organismens hele kropp tillater frigjøring av de fleste giftstoffer fragiften 8, sammenlignet med metoder som holder organismer i live, som bare trekker ut noen komponenter i giftet9. Utarbeidelsen av et ekstrakt krever evaluering av tilstedeværelse og styrke av et stoff av interesse gjennom en bestemt bioassay, som inkluderer strategier for å observere de farmakologiske effektene ved in vivo eller in vitro metoder10.
Sjøemone gift inneholder cytolytiske polypeptider, poredannende toksiner (PFTs)11 og fosfolipaser12; Disse molekylene er modeller i studiet av protein-lipid interaksjon, molekylære verktøy i kreftterapi og biosensorer basert på nanopore3. Klassifiseringen av sjøemone PFTer utføres i henhold til deres størrelse eller molekylvekt, fra 5 kDa til 80 kDa. Den 20 kDa PFT, den mest studerte og kjent som actinoporins11, er av spesiell interesse for sitt biomedisinske potensial i utviklingen av molekylære verktøy for mulige applikasjoner som anticancer, antimikrobielle og nanoporebaserte biosensorer. En annen cytolysin, inkludert fosfolipaser, spesielt fosfolipase A2 (PLA2)13, frigjør en fettsyre på grunn og hydrolyserer fosfolipider, destabiliserer cellemembranen. På grunn av denne virkningsmekanismen lover PLA2 å være en viktig modell for studien og anvendelser i inflammatoriske sykdommer. Det kan tjene som modell for studier av lipidadferd i cellemembranen14.
Her beskriver vi en effektiv protokoll for å skaffe råoljeekstraktet fra sjøemone Anthopleura dowii Verrill, 1869, og oppdage hemolysiner og fosfolipaser. Begge er relevante giftstoffer som kan brukes som mal for å designe nye molekylære verktøy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sjøemonene ble samlet inn i henhold til retningslinjene fra Den nasjonale kommisjonen for akvakultur, fiskeri og mat fra den føderale regjeringen i Mexico (tillatelsesnummer PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Bioetikkkomiteen ved Institutt for bioteknologi, National Autonomous University of Mexico godkjente alle forsøkene med sjøanemoner. Saueblodprøven ble kjøpt ved Center for Practical Teaching and Research in Animal Production and Health (CEPIPSA, National Autonomous University of Mexico).
1. Organisme samling
- Samle sjø anemone A. dowii.
MERK: Her ble organismene samlet inn i lavvannsperioder i intertidalsonen utenfor kysten av Ensenada Baja, California, Mexico (figur 1A, B). - Transporter organismene til laboratoriet i beholdere med sjøvann (figur 1C).
- I laboratoriet rengjør organismene med destillert vann for hånd for å fjerne de store substratpartiklene som holder seg til kroppen.
- Frys straks organismene ved -80 °C i en ultrafryser i 72 timer.
- Plasser organismene i spesielle briller for frysetørking, med lyofiliseringsforhold på -20 °C, 0,015 psi, i 48 timer.
- Oppbevar de lyofiliserte organismene ved -20 °C til bruk.
2. Vevshydrering
- Rekonstituere 20 g tørrvekt av lyofiliserte organismer med 60 ml (1/3 m/v) 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,5 og 1 hemmercocktailtablett (Materialbord).
- Rør prøven kontinuerlig ved ~800 o/min, 4 °C, i 12 timer.
3. Giftfrigjøring
- For å indusere cellelys og nematocystutladning, frys prøven ved -20 °C i 12 timer, og plasser deretter beholderen i vann ved romtemperatur (RT) til den tiner opp til 90%. Gjenta denne prosedyren tre ganger.
MERK: Prøven tiner ikke 100%; det er avgjørende å opprettholde prøven ved ~ 4 °C for å forhindre proteinforringelse. - Vær oppmerksom på nematocysten som slippes ut under et konfokalt mikroskop. Ta 10 μL av prøven på et lysbilde og legg en deksleslip over den. Vær oppmerksom på et konfokalt mikroskop ved 100x og 60x forstørrelse. Her var det ikke nødvendig med et fargestoff.
- Behandle bildene som er tatt i det konfokale mikroskopet i ImageJ-programvaren (versjon 1.53c, Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij).
- Hvis tubule inne i nematocyst uncoils og er utenfor, blir nematocystene utladet; Deretter fortsetter du med neste trinn. Ellers må du bare utføre en fryse-tine syklus til.
- For å klargjøre ekstraktet, sentrifuger prøven ved 25.400 x g i 40 min, 4 °C, gjenopprett supernatanten og sentrifuger den igjen. Gjenta dette trinnet 3-4 ganger.
- Gjenopprett supernatanten og kast pelletsen. Det supernatante eller rå ekstraktet inneholder giftkomponentene (toksiner) og andre cellemolekyler, for eksempel lipider, karbohydrater og nukleinsyrer.
4. Mengde av totalt protein
- Bestem proteinkonsentrasjonen av råoljeekstraktet ved hjelp av et kommersielt Bradford kolorimetrisk analyse15-sett (Tabell over materialer).
- Fortynn fargestoffreagenset (en del fargestoff med fire deler destillert vann).
- Klargjør bovint serumalbumin (BSA) Fraction V (Table of Materials)-oppløsning ved 1 mg/ml konsentrasjon i fosfatbuffer (50 mM natriumfosfat, pH 7,5).
- Klargjør løsningene som er oppført i tabell 1 i triplikat.
- Bland hver løsning kraftig i en shaker i 4 s.
- Inkuber prøvene i 5 min ved RT, uten å riste.
- Mål absorbans (AU) ved 595 nm.
- Plott gjennomsnittene av prøven BSA absorbanser (AU vs. proteinkonsentrasjon), og bestem ligningen av grafen (Formel 1).
Formel 1
hvor y er absorbansen, m er skråningen av linjen, x er proteinkonsentrasjonen, og b er y-intercept. For å beregne rå ekstraktkonsentrasjon, løs for x som følger:
Formel 2
Formel 1
Formel 2
5. Bestem polypeptidgiftkompleksitet
- Monter glassbeholderen for vertikal gelelektroforese i henhold til håndboken.
- Forbered akrylamidblanding (30%): 29,2 g akrylamid, 0,8 g bis-akrylamid, det endelige volumet på 100 ml. Filtrer løsningen ved hjelp av en 0,45 μm membran. Oppbevar oppløsningen i en mørk flaske ved 4 °C. Deretter forbereder du blandingen for å løse gelen (tabell 2).
- SDS-PAGE gel består av en løsende gel og en stablingsgel. Klargjør gelene i henhold til løsningsvolumene som er definert i tabell 2. Under tilberedningen må du sørge for å opprettholde hver blanding ved 4 °C for å redusere polymerisasjonstiden.
MERK: Volumet av hver blanding varierer avhengig av utstyrsmerket som brukes; For denne protokollen tilsvarer volumene tilberedning av 15% akrylamidgel, 0,75 mm tykk, for et vertikalt elektroforesekammer (Materialbord). - Etter at akrylamidet har polymerisert, ~ 10 min, tilsett blandingen av stablingsgel.
- Forbered blandingen til stablingsgelen, legg den umiddelbart til glassplatene, og legg en kam for å danne brønnene for lasting av prøvene.
- Når stablingsgelen har polymerisert (~ 15 min), fjern kammen og legg glassbeholderen i et kammer for vertikal elektroforese.
- Plasser 200 ml elektrodebuffer (0,25 M Tris, 0,192 M glycin, 0,1 % SDS) i elektroforesekammeret.
- Analyser råekstraktet: Bland 30 μg råekstrakt med 5 μL proteinbelastningsbuffer (25% glyserol, 15% natriumdodecylsulfat, 25% 2-mercaptoetanol, 0,125 mM Tris pH 7, bromophenol blå 0,1 mg / ml) til denaturproteiner. Det endelige volumet må være <50 μL.
- Varm ved 90 °C i 5 minutter, avkjøl og sentrifuger i 3 s ved 1400 x g.
- Legg prøvene i brønnene på stablingsgelen. Last inn en standard molekylvektstige.
- Kjør elektroforese ved 25 mA konstant i 1 t 30 min.
- Fjern glassbeholderne fra elektroforesekammeret for å fortsette med farging av gelproteinene.
6. Proteinfarging
- Skyll gelen i 50 ml destillert vann for å fjerne rusk fra bufferelektroden.
- Kast vannet.
- For å unngå diffusjon av gelproteinene, legg til fikseringsløsningen (60 ml etanol, 20 ml eddiksyre og 20 ml destillert vann, sluttvolum 100 ml). Inkuber ved RT i 40 min med risting ved 80 o/min. Dekanter løsningen.
- Tilsett proteinkrysskoblingsløsningen (15 ml etanol, 0,25 ml glutaraldehyd, 50 ml destillert vann, sluttvolum 65,25 ml) og inkuber i 30 min ved RT med risting ved 80 o/min. Fjern løsningen.
- Vask gelen med 100 ml destillert vann i 5 min, og fjern vannet. Gjenta denne prosedyren fire ganger.
- Utfør proteinfarging med 50 ml Coomassie strålende blå R-250 filtrert oppløsning (40% metanol, 10% eddiksyre, 50% destillert vann, 0,1% fargestoff, sluttvolum 100 ml), omrøring ved 60 rpm i et laboratorium roterende oscillator ved RT i 15 minutter.
- Gjenopprett løsningen, som kan brukes til å flekke andre geler.
- For å eliminere overflødig fargestoff, legg til en destaining løsning (40 ml metanol, 10 ml eddiksyre, 50 ml destillert vann). Fortsett å røre (80 o/min) ved RT til båndene (flekkete proteiner) visualiserer.
- Oppbevar gelen i 50 ml destillert vann og skann bildet i et Gel-dokumentasjonssystem.
7. Forbered rød blodlegemeløsning
- Trekk ut 1 ml blod fra en sauens jugulære vene.
- Fjern kanylen fra sprøyten og tøm straks blod i et rør med 50 ml Alsever-oppløsning (0,002 M sitronsyre, 0,07 M NaCl, 0,1 M dekstrose og 0,027 M natriumsitrat som antikoagulant, pH 7,4).
- Inverter løsningen sakte tre ganger.
- Oppbevars ved 4 °C for overføring til laboratoriet.
- Sentrifuge ved 804 x g i 5 min ved 4 °C og kast supernatanten.
- Resuspend pellet i 30 ml Alsever-oppløsning. Tilsett løsningen ved å skyve den langs rørets indre vegger, og bruk en Pasteur plastpipette til å sakte gjenopplive cellene. Sentrifuge igjen ved 804 x g i 5 min, 4 °C. Gjenta denne prosedyren til supernatanten er avklart.
- Tilsett 15 ml Alsever-løsning; resuspend pellet sakte med en Pasteur plast pipette.
- Oppretthold det endelige volumet av Alsever-løsningen for å oppnå en konsentrasjon på 2 x 106 celler / ml, omtrent. Bruk deretter et Neubauer-kammer eller hemocytometer for å telle cellene.
MERK: Tell erytrocyttene i hemacytometer-lysbildet (Forbedret Neubauer). Lysbildet er et glide lysbilde på 30 mm x 70 mm x 4 mm. Senteret har to sølvfotplater (figur 2A) (en topp og ett bunngitter), hver 3 mm x 3 mm og to kanaler på sidene av rutenettet. Telleceller er i hjørnet og de midterste firkantene (røde firkanter i figur 2B). Den optimale konsentrasjonen av celler for telling bør være i rekkefølgen 106 celler. Den sentrale boksen har et overflateareal på 0,1 cm2, som tilsvarer 0,0001 ml. - Plasser en omslagsslipp over lysbildet.
- Plasser 10 μL av prøven mellom lysbildet og dekslene og vent til prøven utbetales.
- I et optisk mikroskop (forstørrelse 60x) utfører du tellingen i den første firkantede boksen. Tell bare cellene i det midterste rutenettet og cellene som berører øvre eller venstre marg i boksen.
- Bestem cellekonsentrasjon ved hjelp av følgende formel:
Formel 3
Hvis prøven er veldig konsentrert og fortynning er nødvendig, bruk deretter følgende ligning:
Formel 4
MERK: Når du tar erytrocyttoppløsningen til hemolysetesten, må du sakte homogenisere oppløsningen med en pasteurpipette i plast. - Utfør trinnene i triplikate for å redusere feil.
Formel 3
Formel 48. Hemolyseanalyse
- Forbered løsningsblandingene (i triplikater) som er angitt i tabell 3 i koniske 96-brønnsplater.
MERK: Bland erytrocyttene langsomt for å opprettholde en homogen suspensjon. - Inkuber i 1 time ved 37 °C, uten å riste.
- Sentrifuger platen ved 804 x g i 5 min ved 4 °C.
- Gjenopprett supernatanten i en annen 96-brønnsplate med en flat bunn.
- Hvis råekstraktet inneholder cytolysiner, vil erytrocytter lyse og frigjøre hemoglobin. Les absorbansen på 415 nm.
- Beregn hemolyseprosent ved hjelp av følgende formel:
% Hemolyse = ((Acrude extract-AAlsever buffer) / (AH2O-AAlsever)) x 100
MERK: Acrude ekstrakt, AAlsever buffer og AH2O tilsvarer absorbansen av erytrocytter med henholdsvis råekstraktet, absorbansen av Alsever-oppløsningen og absorbering av destillert vann. - Utfør en hemolysetest før og etter hver fryse- og tiningssyklus med 50 μg totalt protein fra råekstraktet.
- Bestem antall fryse- og opptiningssykluser som kreves for å nå 100% hemolytisk aktivitet.
- Beregn mengden ekstrakt som produserer hemolyse i 50% av erytrocyttene (HU50); følg den samme protokollen som er beskrevet i tabell 3, øk mengden sjøemoneoljeekstrakt, og design plottet med sigmoidale justeringer ved hjelp av passende programvare (f.eks. opprinnelse, materialfortegnelse).
9. Fosfolipase analyse
- Vask ett kyllingegg med 1% SDS i destillert vann.
- Skill eggeplommen fra eggehviten under sterile forhold.
- Forbered 50 ml 0,86% NaCl-løsning, og filtrer gjennom et 0,22 μm filter. Forbered deretter løsning A: Tilsett 12 ml eggeplomme og 36 ml 0,86% NaCl-løsning.
- Klargjør løsning B: Bland 300 mg agarose i 50 ml buffer (50 mM Tris, pH 7,5), filtrer gjennom et 0,22 μm filter. Varm opp oppløsningen i en mikrobølgeovn til den kokes. Avkjøl i varmt vann for å nå 43-45°C.
- Forbered løsning C: Forbered 10 mM CaCl2 og filtrer den med et 0,22 μm filter.
- Klargjør løsning D: 10 mg rhodamin 6G i 1 ml destillert vann.
- Under sterile forhold (laminær strømningshette) tilsettes 500 μL løsninger A og C til løsning B og 100 μL oppløsning D, bland og hell 25 ml i hver Petri-tallerken (90 x 15 mm).
- Vent til oppløsningen størkner under sterile forhold (30 min).
- Lag brønner (~2-3 mm diameter) med et tynt rør.
- Tilsett totalt 20 μL fosfatbuffer (negativ kontroll) i en brønn og 20 μL av en bestemt fosfolipase (positiv kontroll) i en annen brønn.
- Plasser forskjellige mengder av råekstraktproteinet, 5, 15, 25, 35, 45 μg, i de resterende brønnene, hver i et sluttvolum på 20 μL.
- Vent til agaren adsorberer alle prøvene (30 min).
- Inkuber ved 37 °C i 20 timer.
- Hvis en glorie dannes rundt brønnen, indikerer dette fosfolipaseaktivitet. Mål haloen dannet med en vernier caliper.
MERK: Utfør eksperimentet i triplikat (trinn fra 9.1-9.14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representative resultatene av protokollen som ble brukt til å oppnå rå ekstrakt av sjøemone viste at å kombinere to teknikker (agitasjon og sykluser med frysing og tining) ga en effektiv utslipp av nematocyster, og den totale mengden protein var 500 mg (8 mg / ml) (figur 3).
Råekstraktens proteinkompleksitet kunne observeres fra 10 kDa og større enn 250 kDa gjennom SDS-PAGE elektroforese. I tillegg ble cytolysiner påvist i molekylvektsonen på 15 kDa og 20 kDa, en rekke molekylvekter som kan tilsvare fosfolipaser13 eller actinoporiner3 (figur 4).
Den hemolytiske aktiviteten til ekstraktet før og under fryse- og tiningssyklusene økte til 100% hemolyse ble nådd med 50 μg av det totale råekstraktproteinet i de to siste syklusene. Mengden som trengs for å lyse 50 % saue erytrocytter (HU50) er 11,1 ± 0,3 μg/ml (figur 5). Fosfolipaseaktivitet ble oppdaget ved dannelsen av klare glorier i agarplatens områder, hvor råekstraktprøven ble påført. Resultatene viser tilstedeværelsen av fosfolipaseaktivitet fra 15 μg totalt protein. Haloens diameter økte på en doseavhengig måte, det vil si hvis mengden råoljeekstrakt økte, økte haloens diameter (figur 6A og tabell 4).
Figur 1: Sea anemone collection. (A) Intertidal sone i El Sauzal, Baja California Norte, Mexico. (B) Sjøemone samlet. (C) Anthoplerua dowii Verrill, 1869. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Hemacytometersklie. (A) I skredsenteret er det to sølvfotplater. (B) Celler i firkanter med rød omkrets telles. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Nematocyst-utslipp. Nematocyst (A) før og (B) etter stimuli. I B er nematocyst tubule utsatt og indikerer toksinfrigjøring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Elektroforetisk profil av sjøemoneoljeekstrakt. Sjøemone råolje ekstrakt ble analysert av SDS-PAGE 15% polyakrylamid gel og viste protein fra 10 kDa til 250 kDa av molekylvekt. Lane 1: protein stige, lane 2: sjø anemone gift. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Hemolyseanalyse i erytrocytter fra sauer. Hemoglobinfrigjøring ble oppdaget ved 415 nm. Forskjellig mengde protein ble analysert for å bestemme HU50, lik 11,1 ± 0,3 μg/ml. Hemolyseanalyser ble utført i triplikat. Stolpene representerer standardavviket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Fosfolipaseanalyse. Ulike mengder totalt protein ble analysert i agarose med eggeplomme i nærvær av Ca2+. Fosfolipaseaktivitet kan observeres rundt hver brønn som en glorie. Kontroller: fosfatbuffer (Fosf.) og en PLA2 fra en slange (F.A). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Rør | Destillert vann | BSA | Fargestoff (μL) | Endelig volum | |
| (μL) | (μg) | (μL) | (μL) | ||
| 1 | 800 | - | - | 200 | 1000 |
| 2 | 799 | 1 | 1 | 200 | 1000 |
| 3 | 797 | 3 | 3 | 200 | 1000 |
| 4 | 795 | 5 | 5 | 200 | 1000 |
| 5 | 793 | 7 | 7 | 200 | 1000 |
| 6 | 790 | 10 | 10 | 200 | 1000 |
| Rå ekstrakt (μL) | |||||
| 7 | 798-790 | fra 2 til 10 | 200 | 1000 | |
Tabell 1: Mengde protein ved Bradford-analyse.
| Løsning | Løse gel | Stabling gel |
| Avsatt vann | 1,1 ml | 1,4 ml |
| Akrylamidblanding (30 %) | 2,5 ml | 0,33 ml |
| Tris (1,5 M, pH 8,8), juster pH med HCl. | 1,3 ml | |
| Tris (0,5 M, pH 6,8), juster pH med HCl. | 0,25 ml | |
| Natrium dodecylsulfat (SDS) 10% (m/v) | 0,5 ml | 0,1 ml |
| Ammoniumpersulfat (APS) (10%) | 0,5 ml | 0,1 ml |
| N,N,Nˈ,Nˈ-tetrametyletylendiamin (TEMED) | 0,005 ml | 0,005 ml |
Tabell 2: Løsninger for tilberedning av en 15 % akrylamid-SDS-PAGE elektroforesegel.
| Brønn | Alserverløsning (μL) | Destillert vann | Rå ekstrakt | Erytrocyttoppløsning (μL) | Endelig volum | Forventet absorbans |
| (μL) | (μL) | (μL) | (415 nm) | |||
| 1 | 180 | - | - | 20 | 200 | ≤0.1 |
| 2 | - | 180 | - | 20 | 200 | ≤1.0 |
| 3 | 177–170 | - | 3–10 | 20 | 200 | 0.1–1.0 |
Tabell 3: Hemolyseanalyse for å kalibrere erytrocytter.
| Eksempel | Diameter på glorie (mm) |
| 15 μg F.A. | 0 |
| 30 μL Fosf. | 6.3 ± 0,5 |
| 5 μg | 0 |
| 15 μg | 2.3 ± 0,5 |
| 25 μg | 3.5 ± 0,5 |
| 35 μg | 4.1 ± 1 |
| 45 μg | 4.6 ± 0,8 |
Tabell 4: Diameter på gloriene ved ulike mengder protein fra råekstraktet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den høye etterspørselen etter nye forbindelser med anvendelser innen ulike fagområder og industri har ført til studiet av gift. Gift representerer en rik kilde til molekyler som fungerer som en mal for å generere nye molekylære verktøy. Imidlertid krever kompleksiteten til disse giftene implementering og kombinasjon av ulike metoder for å skaffe og studere dem.
Her viser vi en metode for å skaffe og analysere giftet til sjøemonen Anthopleura dowii, Verrill 1869, som kan brukes til å utforske giften til andre sjømoner som starter med lyofiliserte prøver, og deretter rå ekstrakt obtention. Lyofiliseringstrinnet tillot å bevare organismene til bruk og for at en del av prøven skulle brukes i henhold til eksperimentets behov, noe som muliggjør effektiv anvendelse av organismer, unngår innsamling av høyt antall av dem og opprettholder proteinstabilitet 7,16. Rå ekstraktpreparat med giftstoffer fra friske organismer er mer potent enn de som er isolert fra lyofiliserte organismer. Proteiner av råoljeekstrakt sparer imidlertid funksjon for mer tid når de fryses ved -20 °C17. Lyofilisering av organismene har også bioetiske implikasjoner siden dette tillater optimalisering i bruken av prøven og unngår innsamling av flere organismer.
Fryse- og tiningsmetoden gjør det mulig å jobbe med organismens komplette kropp, med fordelen av at cnida distribueres over hele kroppen. Det er imidlertid viktig å sykle fryse og tine effektivt (i lange perioder og andre teknikker) for å få mer gift. I andre rapporter utføres giftutvinning via korte tidssykluser, noe som reduserer mengden og mangfoldet av giftstoffer i råoljeekstraktet18,19.
Bradford-analysen som brukes til å bestemme den totale mengden protein oppnådd i råekstraktet, er en reproduserbar, billig og enkel metode som er kompatibel med råekstraktbetingelsene15. Det totale proteinet som er oppnådd her er høyere enn det rapporterte beløpet tidligere 20,21,22. Mangfoldet og overflod av giftstoffer i utvinningen vil avhenge av arten og samlingen av organismene.
Gelelektroforese ved SDS-PAGE er en effektiv teknikk som brukes til å analysere kompleksiteten til råekstrakt. Imidlertid er en god fiksering av proteiner med glutaraldehyd viktig når du analyserer proteiner med lavere molekylvekt og lavere overflod som kan diffusere fra gelen under fargingsprosessen23.
En fordel med å ha et ekstrakt med høy polypeptidkompleksitet er muligheten for å utføre en komplett proteomisk studie. Hvis dette ekstraktet blir utsatt for renselsesprosesser, er det mulig å identifisere et enda mer betydelig antall giftstoffer av bioteknologiske, økologiske og biomedisinske interesser24.
I studiet av gift er det generelt vanskelig å identifisere et molekyl eller en gruppe polypeptider med en bestemt funksjon. Derfor er det viktig å ha reproduserbare, spesifikke, raske og billige bioassays. Hemolytiske og fosfolipaseanalyser er de mest brukte til å studere cytolysiner i gifter. Som actinoporins har en høy affinitet for sphingomyelin, er det best å bruke erytrocytter med en høy mengde av denne lipiden i membranene siden færre prøver vil bli brukt på denne måten. I denne forstand er sauerytrocytter celler med høy sphingomyelin i membranen25. Hemolyseanalysen analyseres, og oppdager tilstedeværelsen av hemoglobin ved 415 nm absorbans. Denne bioassay indikerer bare at tilstedeværelsen av cytolysiner kan virke på erytrocytter. Det er imidlertid ikke mulig å bestemme hvilken type cytolysin som forårsaker hemolyse; Av denne grunn anbefaler vi å gjennomføre komplementære analyser.
Selv om eggeplommen agaroseanalyse gjør det mulig å identifisere tilstedeværelsen av forskjellige typer fosfolipaser avhengig av haloens farge, kan vi ikke skille forskjellige fosfolipaser for råekstraktet av A.dowii; en mulighet er det høye fosfolipase mangfoldet produsert av A. dowii26. For fremtidige studier foreslår vi å utføre denne analysen med en rå ekstraktkonsentrasjonsgradient, kanskje med protein nanogrammer.
Selv om det er molekyler i det marine økosystemet med høyt potensial i medisinske, bioteknologiske og industrielle områder, er det fortsatt mye å analysere og undersøke i giften til cnidarians.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesse i forhold til publiseringen av denne artikkelen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), med et tilskuddsnummer IT200819. Forfatterne erkjenner til Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC, for å sjekke den engelske grammatikken i dette manuskriptet; og den tekniske hjelpen til Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada) og Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). Vi takker også dr. Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) for å ha skaffet saueblod. Vi takker spesielt Dr José Saniger Blesa, ICAT-UNAM, for fasilitetene i laboratoriet hans for videoopptaket.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430766 | |
| 2-Bromophenol blue | Sigma | B75808 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| Acetic Acid Glacial | J.T. Baker | 9515-03 | |
| Acrylamide | Promega | V3115 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Bisacrylamide | Promega | V3143 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Sigma | A3059-100G | |
| Bradford Protein Assays | Bio-Rad | 5000006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 3894 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge tubes | Corning | CLS430829 | |
| ChemiDoc MP system | Bio-Rad | 1708280 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clear flat.bottom 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | Bio-Rad | #1610406 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610400 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| Ductless Enclosure | Labconco | Vertical | https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c |
| Gel Doc EZ | Bio Rad. | Gel Documentation System | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-4L | |
| Hemocytometer | Marienfeld | 650030 | |
| ImageJ (Software) | NIH, USA | Version 1.53c | |
| Incubator 211 | Labnet | I5211 DS | |
| Methanol | J.T. Baker | 9049-03 | |
| Mini-PROTEAN tetra cell | Bio-Rad | 1658000EDU | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3824-01 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4.H2O | J.T. Baker | 3818-05 | |
| Origin software | version 9 | To design the plot with sigmoidal adjustments | |
| Petridish | Falcon | 351007 | |
| Pipetman kit | Gilson | F167380 | |
| Precast mini gel | BioRad | 1658004 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26620 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 252433 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Sodium citrate dihydrate | JT Baker | 3646-01 | |
| Spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | G10S UV-VIS | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 77-86-1 | |
| Volt Power Supply | Hoefer | PS300B |
References
- Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
- Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses. The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).
- Ramírez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodríguez-Almazán, C. Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools. Biomolecules. 10 (4), 539 (2020).
- Fautin, D. G. Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon. Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).
- Moran, Y., et al. Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution. Marine Biotechnology. 15 (3), New York, N.Y. 329-339 (2013).
- Moran, Y., et al. Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).
- Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).
- Bulati, M., et al. Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines. BioMed Research International. 2016, 3849897 (2016).
- Orts, D. J. B., et al. Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum. Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).
- Hader, D., Erzinger, G. Bioassays: Advanced Methods and Applications. , Elsevier Science. (2017).
- Anderluh, G., Macek, P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria). Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).
- Nevalainen, T. J., et al.
- Razpotnik, A., et al. A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis - its primary structure and phylogenetic classification. The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).
- Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -H., Magrioti, V., Kokotos, G. Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
- Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).
- Morales-Landa, J. L., et al. Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea. Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).
- Sánchez-Rodríguez, J., Cruz-Vazquez, K. Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860). Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).
- de Oliveira, J. S., et al. Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization. Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).
- Norton, R. S., et al. Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).
- Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).
- Dion, A. S., Pomenti, A. A. Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement. Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).
- Ramírez-Carreto, S., et al. Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry. The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).
- Nelson, G. J. Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells. Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).
- Ramírez-Carreto, S., et al. Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869. Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).
