Summary
이 방법은 야생형 대조군에 비해 증가된 심근세포 미토콘드리아 코엔자임 Q 함량을 갖는 신생아 깨지기 쉬운 X 증후군 마우스에서 기공 개방에 대한 전압 역치를 결정하기 위해 낮은 전도도 양성자 누출에 대한 미토콘드리아 투과성 전이 기공의 기여를 이용한다.
Abstract
미토콘드리아 투과성 전이 공극(mPTP)은 건강 및 질병에 중요한 전압-게이팅된, 비선택적, 내부 미토콘드리아 막(IMM) 메가채널이다. mPTP는 저전도도 개방 동안 IMM을 통한 양성자의 누출을 매개하고 사이클로스포린 A(CsA)에 의해 특별히 억제된다. 코엔자임 Q (CoQ)는 mPTP의 조절자이며, 조직 특이적 차이는 깨지기 쉬운 X 증후군 (FXS, Fmr1 녹아웃)의 신생아 마우스 모델에서 전뇌 및 심장 미토콘드리아에서 CoQ 함량 및 mPTP의 개방 확률에서 발견되었다. 우리는이 돌연변이 균주에서 mPTP 개방에 대한 전압 임계 값을 결정하는 기술을 개발하여 양성자 누출 채널로서의 mPTP의 역할을 이용했습니다.
이를 위해, 산소 소비 및 막 전위(ΔΨ)를 편광 촬영과 누설 호흡 동안 테트라페닐포스포늄(TPP+) 이온 선택성 전극을 사용하여 분리된 미토콘드리아에서 동시에 측정하였다. mPTP 개방에 대한 역치는 특정 막 전위에서 양성자 누출의 CsA 매개 억제의 개시에 의해 결정되었다. 이 접근법을 사용하여, mPTP의 전압 게이팅의 차이는 CoQ 과잉의 맥락에서 정확하게 정의되었다. 이 새로운 기술은 mPTP의 저전도도 개방의 생리적 및 병리학적 조절에 대한 이해를 증진시키기 위한 미래의 조사를 가능하게 할 것이다.
Introduction
mPTP는 투과성 전이 (PT)를 매개하고, 이에 의해 IMM은 소분자 및 용질 1,2에 갑작스럽게 투과성이된다. 이러한 현저한 현상은 산화적 인산화3에 필요한 전기화학적 구배를 확립하는데 근본적인 IMM의 특성 불투과성으로부터 뚜렷한 출발이다. PT는 다른 미토콘드리아 수송 메커니즘과 달리 높은 전도도, 비특이적, 비선택적 과정으로, 최대 1.5kDa4,5의 다양한 분자의 통과를 허용한다. mPTP는 IMM 내의 전압 게이트 채널로, 개구부가 ΔΨ, ATP 생산, 칼슘 항상성, 반응성 산소 종 (ROS) 생산 및 세포 생존력4를 변경합니다.
병리학적 극단에서, mPTP의 조절되지 않고 장기간의 고전도도 개방은 전기화학적 구배의 붕괴, 매트릭스 팽윤, 매트릭스 피리딘 뉴클레오티드의 고갈, 외막 파열, 막간 단백질(시토크롬 c 포함)의 방출, 및 궁극적으로는 세포 사멸 4,6을 야기한다. 이러한 병리학적 mPTP 개방은 심장 허혈-재관류 손상, 심부전, 외상성 뇌 손상, 다양한 신경퇴행성 질환, 및 당뇨병 1,7에 연루되어 있다. 그러나, 저-전도도 mPTP 개방은 본질적으로 생리학적이며, 고전도도 개방과는 달리, 심오한 탈분극 또는 미토콘드리아 팽윤을 초래하지 않는다4.
기공의 낮은 전도도 개방은 투과성을 ~300 Da로 제한하고, ATP 합성과 무관하게 양성자의 통과를 허용하며, 생리학적 양성자 누출의 잠재적 원인이다(5). 생리학적 mPTP 개방은 ΔΨ의 제어된 감소를 야기하고, 호흡 수송 사슬을 통한 전자 플럭스를 증가시키며, 수퍼옥사이드의 짧은 버스트 또는 플래시를 초래하여, ROS 신호전달(8)에 기여한다. 이러한 일시적인 mPTP 개방의 조절은 칼슘 항상성 및 정상적인 세포 발달 및 성숙 4,9,10,11에 중요하다. 예를 들어, 발달하는 뉴런에서의 일시적인 기공 개방은 분화를 촉발시키는 반면, mPTP의 폐쇄는 미성숙 심근세포 4,5에서 성숙을 유도한다.
건강과 질병에서 mPTP의 기능적 중요성은 잘 확립되어 있지만, 정확한 분자 정체성은 여전히 논쟁의 여지가있다. mPTP의 분자 구조 및 기능에 대한 진행은 다른 곳(12)에서 종합적으로 검토되었다. 간략하게, 현재, mPTP의 높은- 및 낮은- 전도도 상태는 별개의 엔티티(12)에 의해 매개되는 것으로 가정되었다. 주요 후보는 각각 고전도도 및 저전도도 모드용 F1/F0 ATP 신타제(ATP 합성효소) 및 아데닌 뉴클레오티드 수송체(ANT)(12)이다.
mPTP의 기공 형성 성분의 정확한 동일성에 관한 합의가 결여되어 있음에도 불구하고, 특정 주요 특성이 상세화되었다. mPTP의 잘 확립된 특징은 IMM의 탈분극이 기공 개구(13)로 이어지도록 전기화학적 구배에 의해 조절된다는 것이다. 선행 연구는 vicinal 티올기의 산화환원 상태가 mPTP의 전압 게이팅을 변화시켜 산화가 상대적으로 더 높은 ΔΨs에서 기공을 개방하고, 티올기 감소가 닫힌 mPTP 확률14를 초래한다는 것을 보여주었다. 그러나, 단백질성 전압 센서의 동일성은 알려져 있지 않다.
기공의 개방 확률을 조절하는 다양한 소분자가 확인되었다. 예를 들어, mPTP는 칼슘, 무기 포스페이트, 지방산 및 ROS로 개방되도록 자극될 수 있고, 아데닌 뉴클레오티드 (특히 ADP), 마그네슘, 양성자, 및 CsA 5,12에 의해 억제될 수 있다. 이러한 규제 기관 중 일부의 작용 메커니즘이 해명되었습니다. 미토콘드리아 칼슘은 ATP 신타제15의 β 서브유닛에 결합함으로써 적어도 부분적으로 mPTP 개방을 촉발시킨다. ROS는 ADP에 대한 그의 친화도를 감소시키고 가장 잘 연구된 단백질성 mPTP 활성화제16인 사이클로필린 D(CypD)에 대한 그의 친화도를 향상시킴으로써 mPTP를 활성화시킬 수 있다. 무기 포스페이트 및 지방산에 의한 mPTP의 활성화 메카니즘은 덜 명확하다. 내인성 억제제에 관해서는, ADP는 ANT 또는 ATP 합성 효소에서 결합함으로써 mPTP를 억제하는 것으로 생각되며, 마그네슘은 결합 부위15,17,18,19에서 칼슘을 대체함으로써 억제 효과를 발휘합니다.
낮은 pH는 ATP 신타제 12,20,21의 조절 올리고마이신 감수성 부여 단백질 (OSCP) 서브유닛의 양성자화 히스티딘112에 의해 mPTP 개방을 억제한다. mPTP의 원형 약리학적 억제제인 CsA는 CypD에 결합하고 OSCP22,23과의 연관성을 방지함으로써 작용한다. 이전의 연구는 또한 다양한 CoQ 유사체가 mPTP와 상호작용하여, 이를 억제하거나 활성화시킨다는 것을 보여주었다(24). 최근 연구에서, 우리는 신생아 FXS 마우스 새끼25의 전뇌 미토콘드리아의 CoQ 결핍으로 인한 병리학 적으로 개방 된 mPTP, 과도한 양성자 누출 및 비효율적 인 산화 인산화의 증거를 발견했습니다.
외인성 CoQ를 사용한 기공의 폐쇄는 병리학적 양성자 누출을 차단하고 수지상 척추(25)의 형태학적 성숙을 유도하였다. 흥미롭게도, 동일한 동물에서, FXS 심근세포는 야생형 대조군26에 비해 과도한 CoQ 수준과 폐쇄된 mPTP 확률을 가졌다. CoQ 수준의 이러한 조직 특이적 차이의 원인은 알려지지 않았지만, 연구 결과는 내인성 CoQ가 mPTP의 핵심 조절자일 가능성이 높다는 개념을 강조합니다. 그러나, mPTP의 CoQ 매개 억제 메카니즘이 알려지지 않았기 때문에 우리의 지식에 큰 차이가 있다.
mPTP의 조절은 세포 신호전달 및 생존의 결정인자4이다. 따라서, 미토콘드리아 내에서 mPTP 개방을 검출하는 것은 특정 병리생리학적 메카니즘을 고려할 때 중요하다. 전형적으로, 고전도도 공극 개방에 대한 역치는 투과성 전이를 촉발시키기 위해 칼슘을 사용하여 결정된다. 이러한 칼슘 로딩은 막 전위의 붕괴, 산화적 인산화의 신속한 결합해제, 및 미토콘드리아 팽윤27,28을 초래한다. 우리는 저전도도 mPTP 개구부를 그 자체로 유도하지 않고 현장에서 검출하는 방법을 개발하고자 노력했습니다.
이 접근법은 양성자 누출 채널로서의 mPTP의 역할을 이용한다. 이를 위해, Clark-Type 및 TPP+ 이온 선택성 전극을 사용하여 누출 호흡(29) 동안 분리된 미토콘드리아에서 각각 산소 소비량과 막 전위를 동시에 측정하였다. mPTP 개방에 대한 역치는 특정 막 전위에서 양성자 누출의 CsA 매개 억제의 개시에 의해 결정되었다. 이 접근법을 사용하여, CoQ 초과의 맥락에서 mPTP의 전압 게이팅의 차이가 정확하게 정의되었다.
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Protocol
컬럼비아 대학 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 승인은 설명 된 모든 방법에 대해 획득되었습니다. 본 연구를 위한 모델 시스템으로 사용된 FXS(Fmr1KO)(FVB.129P2-Pde6b+ Tyr c-ch Fmr1tm1Cgr/J) 및 대조군(FVB)(FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) 마우스는 상업적으로 획득되었다(물자의 표 참조). 다섯 마리 내지 열한 마리의 동물을 각 실험군에 사용하였다. 출생 후 10일째(P10) 마우스를 인간 유아기의 시점 동안 모델링하기 위해 사용하였다.
1. 마우스 심장으로부터의 미토콘드리아 분리
- 표 1에 기재된 바와 같이 미토콘드리아 분리 및 호흡 실험을 위한 완충액을 준비한다. 미리 만든 경우 4°C에서 보관한다.
- 15 % 밀도 구배 매체를 준비하십시오 : 상업용 밀도 구배 매질을 밀도 구배 희석제로 80 % 부피 / 부피 (v / v)로 희석하십시오. 미토콘드리아 분리 완충액 (MI) / 소 혈청 알부민 (BSA)을 추가하여 80 % 밀도 구배 배지 15 % v / v를 추가로 희석하십시오.
- 이러한 실험을 위해 미토콘드리아를 냉동되지 않은 신선한 조직으로부터 분리하고 준비 당일, 전형적으로 5시간 이내에26시간 이내에 사용한다. 얼음 위에서 모든 격리 단계를 수행하십시오.
- 마우스를 무력화시키고 심장을 절제하십시오. 즉시 얼음처럼 차가운 MI / BSA로 페트리 접시에서 1-2 번 씻으십시오. 아트리움을 자르고 조직을 다듬습니다.
- 다진 심장 조직을 1mL의 MI/BSA가 들어있는 유리 균질기로 옮깁니다. 느슨한 (A) 유모 (10 스트로크)로 균질화 한 다음 더 단단한 (B) 유모 (10 스트로크)로 균질화하십시오.
- 균질액을 4°C에서 2분 동안 1,100 × g 에서 원심분리하여 핵 및 세포 파편을 제거하였다.
- 상층액을 푹신한 펠렛을 만지지 않고 부드럽게 취하고, 원심분리 튜브에서 15% 밀도 구배 배지 중 700 μL의 상부에 조심스럽게 겹쳐서 겹쳐준다. 4°C에서 15분 동안 18,500 × g 에서 원심분리한다.
- 펠렛을 1 mL의 수크로오스 완충액(SB)/BSA에 재현탁시키고, 4°C에서 10분 동안 10,000 × g 에서 원심분리하였다.
- 상층액을 완전히 제거하고 버립니다. 펠렛을 SB/BSA에 55 μL의 최종 부피로 재현탁시킨다.
- 비신코닌산(BCA) 단백질 분석법과 같은 표준 검정을 사용하여 미토콘드리아 단백질 함량을 정량한다.
2. 미토콘드리아 산소(O2) 소비 및 ΔΨ
- 산소 전극 조립 및 교정
- 제조업체의 지침에 따라 산소 전극을 설치하고 교정 하십시오 (재료 표 참조).
- 50% 염화칼륨(KCl) 전해질 용액을 전극 디스크의 돔 위에 떨어뜨립니다.
- 제공된 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 막의 약간 더 큰 조각으로 덮인 작은 조각∼2cm2 담배 종이 스페이서를 전해질 방울 위에 놓는다.
- 제공된 어플리케이터 도구를 사용하여 작은 전극 디스크 O 링을 전극의 돔 위로 밀어 넣습니다.
참고: 기포가 없고 멤브레인이 매끄럽게 되어 있는지 확인하십시오.
- 전해질 용액으로 저수지를 잘 보충하십시오.
- 더 큰 O-링을 전극 디스크 주위의 오목부에 잘 놓습니다.
- 디스크를 전극 챔버에 설치하고 제어 장치에 연결하십시오.
- 공기 포화 탈이온수 2 mL를 반응 챔버에 첨가하고 PTFE 코팅 자석을 챔버에 첨가한다.
- 챔버를 제어 장치의 후면에 연결합니다.
- 온도를 37°C로 설정하고 교반 속도를 100으로 설정합니다.
- 교정을 시작하기 전에 시스템 온도가 평형화될 때까지 10분 정도 기다립니다.
- 교정 탭에서 액상 교정을 선택하여 액상 교정을 수행합니다. 온도가 37°C로 설정되고, 교반 속도가 100이고, 압력이 대기압(101.32 kPa)으로 설정되어 있는지 확인합니다.
- OK를 누르고 신호가 고원이 될 때까지 기다립니다.
- 고원에 도달하면 OK를 누릅니다.
- 소량 (∼20 mg)의 나트륨 디티오나이트를 첨가하여 챔버 내에 O2제로 확립한다.
- OK를 누르고 신호가 고원이 될 때까지 기다립니다.
- 고원에 도달하면 저장을 눌러 보정을 수락합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 산소 전극을 설치하고 교정 하십시오 (재료 표 참조).
- TPP+-선택적 전극 어셈블리
- 제공된 주사기 및 유연한 바늘을 사용하여 TPP+- 선택적 전극 팁을 10 mM TPP 용액으로 채우고 기포를 피하기 위해 주의하십시오.
- 기준 전극 및 전극 홀더를 포함하는 TPP+-선택적인 전극 장치를 제조자의 지시에 따라 조립한다( 재료 표 참조).
- 간단히 설명하면, 전극 홀더 캡을 풀고 내부 기준 전극을 TPP+ 팁에 삽입합니다. 뚜껑을 조여서 팁을 고정시킵니다. 제공된 케이블을 전극 홀더와 컨트롤 박스의 보조 포트에 연결합니다.
- TPP+ 선택 전극 및 기준 전극을 이온 선택성 전극을 위한 적응된 플런저 어셈블리에 삽입합니다. 컨트롤 박스의 기준 포트에 참조 전극을 연결합니다.
- TPP+ 선택 및 기준 전극을 이온 선택성 전극을 위한 적응된 플런저 어셈블리에 삽입합니다.
- 반응 챔버 준비
- 반응 혼합물을 반응 챔버에 첨가한다: 10 mM 숙시네이트 (복합체 II 기질), 5 μM 로테논 (복합체 I 억제제), 80 ng mL-1 니게리신 (IMM을 가로질러 pH 구배를 붕괴시키기 위해), 2.5 μg mL-1 올리고마이신 (상태 4 호흡을 유도하기 위해), 및 호흡 완충액 (RB)/BSA 반응 완충액을 최종 부피 1 mL로 한다. 챔버에 기포가 유입되지 않도록주의하십시오.
- TPP+-선택성 및 기준 전극을 제자리에 장착한 적응형 플런저 어셈블리로 챔버를 닫습니다. GO를 선택하여 녹화를 시작합니다. 챔버가 닫히면 바늘 길이를 조정하기 위해 플라스틱 튜브로 개질 된 별도의 미세 주사기를 사용하여 추가 시약을 반응 용액에 직접 도입하십시오.
- TPP+ 캘리브레이션
- 안정적인 전압 신호가 얻어지면 0.1mM TPP 용액의 1μM 증분을 3μM의 최종 농도로 추가하여 TPP+ 선택적 전극을 교정합니다. TPP+ 전압 신호가 추가될 때마다 대수적으로 감소하는 것을 관찰하십시오.
참고: 각 실험 시작 시 TPP+ 선택 전극을 교정하십시오.
- 안정적인 전압 신호가 얻어지면 0.1mM TPP 용액의 1μM 증분을 3μM의 최종 농도로 추가하여 TPP+ 선택적 전극을 교정합니다. TPP+ 전압 신호가 추가될 때마다 대수적으로 감소하는 것을 관찰하십시오.
- 데이터 수집
- O2 및 TPP+ 트레이스가 안정화되도록 하고, 플런저 어셈블리의 시약 첨가 포트를 통해 갓 제조된 심근세포 미토콘드리아 100 μg을 반응 챔버에 최종 농도 0.1 mg mL-1로 첨가한다. 미토콘드리아가 통전되어O2를 소비하고 미토콘드리아가 막 전위를 생성하고 용액에서 TPP +를 흡수함에 따라 TPP + 전압 신호의 급격한 증가로 챔버 내의O2 수준의 감소를 관찰하십시오.
- 2.5 μg mL-1 올리고마이신을 첨가하여 상태 4 호흡을 유도하였다.
참고 :O2 소비율은 이제 양성자 누출 호흡 속도를 나타냅니다. 올리고마이신은 대안으로서 TPP+ 이전에 반응 챔버에 첨가될 수 있다.
- mPTP의 개방 확률 평가
- 누출 호흡 중에 ΔΨ가 시간이 지남에 따라 감소하는 것을 관찰하십시오. 원하는 ΔΨ에 도달하면, 1 μM CsA (mPTP 억제제)를 반응 챔버에 첨가하여 그 특정 ΔΨ에서 mPTP의 개방 확률을 평가한다.
- CsA 첨가 전후의O2 소비 및 ΔΨ에 대한 CsA의 영향 측정
- 연속적인 실험에서 CsA가 첨가되는 ΔΨ를 변화시킴으로써 mPTP 개방의 전압 의존성을 결정한다.
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Representative Results
이들 실험에서 생성된 전형적인O2 소비 및 ΔΨ 곡선이 도시되어 있다(도 1A, B). TPP+ 캘리브레이션을 통한 전압 신호의 대수 감소는 각 실험의 시작 부분에 표시됩니다. 이러한 로그 패턴의 부재는 TPP+ 선택적 전극에 문제점을 시사할 수 있다. 미토콘드리아는 전형적으로 호흡 완충제에 첨가 즉시 ΔΨ를 생성한다. ΔΨ는 Nernst 방정식([외부 TPP+]에 대한 [TPP+ 내부 미토콘드리아 매트릭스]의 로그 비율)30에 기초한 TPP+ 전압의 변화로부터 해석될 수 있다. 생리학적 ΔΨ는 표준 곡선의 2 μM TPP+ 수준에 근사한다. 전압 임계값은 따라서 2 μM TPP+ 표준(ΔmV TPP+ 전압 신호로 표시됨)에 대해 정의되었다.
예를 들어, "높은 ΔΨ"은 ~Δ0 mV (2 μM TPP+ 수준에서)로 정의되었고, "중간 ΔΨ"은 ~Δ5 mV (2 μM TPP+ 미만)에서 설정되었고, "낮은 ΔΨ"은 ~Δ10 mV (2 μM TPP+ 미만)에서 설정되었다 (도 1A, B). 파일럿 실험에서, Δ0 mV에서의 미토콘드리아는 100% mPTP 폐쇄 확률을 나타내었고, Δ10 mV에서의 미토콘드리아는 100% 개방 확률을 나타내었다; 대표적인 그래프는 도 1A, B에 도시되어 있다. 따라서 Δ5 mV 임계값은 중간 ΔΨ로서 임의로 선택되었다. 이 실험에서, 반응 챔버에 미토콘드리아를 첨가할 때, 미토콘드리아는 과잉 기질에 노출되는 호흡 상태 2에 있게 된다. 미토콘드리아는 ADP와 함께 상태 3에 진입하도록 자극되지 않는다; 결과적으로, 일단 올리고마이신이 첨가되면, 이들은 상태 4 올리고마이신으로 직접 전환된다(누출 호흡). 그 결과, 올리고마이신 첨가 후 산소 소비량의 상당한 차이가 전형적으로 관찰되지 않으며, 이는 ATP 신타제가 상태 2 동안 호흡에 최소한으로 기여한다는 것을 시사한다(도 1A,B). mPTP의 개방 또는 폐쇄 상태를 평가하기 위해, CsA 첨가 직전과 직후의O2 소모율 및 막 전위를 비교한다(도 1C). CsA에 반응하여O2 소모율의 감소 및 ΔΨ의 증가 및 안정화는 개방 mPTP의 폐쇄(기공 매개 양성자 누출의 봉쇄)를 나타낸다(도 1C, 검정 곡선).
mPTP가 폐쇄될 때,O2 소모율의 감소는 없고, ΔΨ는 증가하지 않고 안정화되지만 계속 하락한다(도 1C, 적색 곡선). 실험 결과는 FVB 대조군 및 Fmr1 KO 심장 미토콘드리아에서 각각 높은 ΔΨs와 낮은 ΔΨs에서 유사한 폐쇄 및 개방 mPTP 확률을 입증한다(도 1D). 이들 발견은 mPTP의 공지된 전압 민감성 특성과 일치하며, 여기서 기공은 높은 ΔΨs에서 폐쇄되고 낮은 ΔΨs(13)에서 개방되는 경향이 있다. 따라서, 이 방법을 사용하여, 우리는 두 균주 모두에서 mPTP의 일반적인 전압 의존성을 확실하게 입증하였다. 흥미롭게도, 중간 ΔΨ (Δ5 mV 역치)에서, Fmr1 KO 심장 미토콘드리아는 FVB 대조군에 비해 증가된 폐쇄 mPTP 확률을 입증하였다 (도 1D). 따라서, Fmr1 KO 심장 미토콘드리아는 개방이 촉발되기 위해 더 낮은 ΔΨ를 필요로 하는 기공이 게이팅의 이동을 입증하였다. 이는 Fmr1 KO가 CoQ 및 상대적으로 폐쇄된 mPTP(26)의 수준을 상승시켰다는 이전의 발견과 일치한다. 따라서, 상기 방법은 mPTP 개방의 차이를 해결하기 위해 최적의 ΔΨ 임계치를 동정하였다. 중요하게도,이 ΔΨ 임계 값을 정의하면 CoQ가 mPTP를 조절하는 방법과 CoQ 결핍이 FXS에서 병리학 적 기공 개방으로 이어지는 방법을 더 잘 이해할 수있는 추가 조사가 가능합니다.
도 1: 낮은 전도도 mPTP 개방 확률의 검출. (A, B) ΔΨ (검정, [TPP+])을 사용한 동시 O2소비의 대표적인 곡선 (적색, 숫자는O2 mL-1 min-1 mg 단백질-1의 nmol에서의 비율이다). 화살표는 TPP+, 미토콘드리아, 올리고마이신 및 CsA의 첨가를 나타낸다. 2μM TPP+ 교정 레벨에 대한 높음, 중간 및 낮은 전압 임계값이 표시됩니다. 높은(A) 및 낮은(B) 전압 임계값에서 CsA의 추가가 표시됩니다. (C) CsA 부가의 지점에서 (A) 및 (B)에서의O2 소비(상부) 및 ΔΨ(하부) 곡선의 확대된 섹션은, 높은 ΔΨ(CsA에 둔감함)에서의 폐쇄 mPTP(적색) 및 낮은 ΔΨ(CsA에 민감함)에서 개방된 mPTP(검정)를 예시한다. (d) FVB 대조군(검정) 및 Fmr1 KO(회색)에 대해 높음, 낮음 및 중간 ΔΨ에서의 mPTP 개방 및 폐쇄 상태의 요약 그래프가 도시되어 있다. 다섯 마리 내지 11마리의 동물을 각각의 ΔΨ 역치에서 평가하였고; p 값은 카이-제곱 검정, *p < 0.05를 사용하여 계산하였다. 약어: ΔΨ = 미토콘드리아 막 전위; mPTP = 미토콘드리아 투과성 전이 기공; TPP+ = 테트라페닐포스포늄; 미토 = 미토콘드리아; 올리고마이신=올리고마이신; CsA = 사이클로스포린 A; ΔΨ = ; KO = 녹아웃. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 구성 요소 | MI/BSA* | SB/BSA* | 밀도 구배 희석제 | RB/BSA* |
| 만니톨 | 225 밀리지미터 | - | - | - |
| 자당 | 75 밀리지미터 | 250 밀리가바이트 | 1 엠 | 200 밀리미터 |
| 헤페스 | 5 밀리지미터 | 5 밀리지미터 | 50 밀리지미터 | 5 밀리지미터 |
| 증권 시세 표시기 | 1 밀리지미터 | 0.1 밀리지미터 | 10 밀리지미터 | - |
| 증권 시세 표시기 | - | - | - | 25 밀리지미터 |
| KH2PO4 | - | - | - | 2 밀리지미터 |
| MgCl2 | - | - | - | 5 밀리지미터 |
| pH** | 7.4 | 7.4 | - | 7.2 |
| BSA*** | 0.10% | 0.10% | - | 0.02% |
| AP5A*** | - | - | - | 30 밀리지미터 |
표 1: 버퍼 및 솔루션.
* 0.2 μm 필터를 통한 필터
**필요에 따라 3M 수산화칼륨으로 pH를 조절하십시오.
미토콘드리아 분리 직전에 첨가되는 완충 성분을 나타낸다.
약어: MI = 미토콘드리아 분리 완충제; SB = 수크로오스 완충제; RB = 호흡 완충제; BSA = 지방산 무함유 소 혈청 알부민; HEPES = 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산; EGTA = 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산; KCl = 염화칼륨; KH2PO4 = 포타슘 디하이드로겐 포스페이트; MgCl2 = 염화마그네슘; AP5A = P1,P5-디아데노신-5' 펜타포스페이트 펜타소듐.
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Discussion
이 논문에서는 mPTP의 개방 확률을 평가하는 방법을 설명한다. 구체적으로, 저전도도 mPTP 개방에 대한 전압 임계값은 ΔΨs의 범위에 걸친 양성자 누출에 대한 CsA 억제의 효과를 평가함으로써 결정되었다. 이 기술을 사용하여, 우리는 FXS 마우스와 FVB 대조군 사이의 mPTP의 전압 게이팅의 차이가 조직 특이적 CoQ 함량의 차이와 일치하는지 확인할 수 있었다. 이 방법론의 성공에 중요한 것은 미토콘드리아가 사용 전에 신선하게 분리되어 있으며 좋은 품질이라는 것입니다. 격리 중에 손상되거나 너무 오래된 미토콘드리아는 적절한 ΔΨ를 생성 할 수 없으며 일반적으로 결합되지 않습니다. 매트릭스 pH는 전형적으로 양성자 동기력에 기여하지만, 니제리신은 양성자 누출29를 평가하는 표준 프로토콜에서 앞서 기술된 바와 같이, 이들 실험에서 IMM을 가로질러 ΔpH를 붕괴시키는데 사용된다는 점에 유의한다. 따라서, 이 경우, 양성자 동기력은 ΔΨ와 동등하며, 이는 실험 접근법을 단순화한다.
또 다른 중요한 고려 사항은 호흡 혼합물에 사용되는 일부 억제제 (예 : 로테논, 올리고마이신 및 CsA)가 이온 선택성 전극을 포함한 반응 챔버의 플라스틱 표면에 부착되기 때문에 실험 사이에 헹구기가 어렵다는 것입니다. 챔버는 에탄올 및 조잡하게 준비된 동결 해동 된 미토콘드리아의 현탁액으로 일상적으로 세척되어야하며, 챔버에서 이러한 억제제를 "걸레질"하고 실험의 재현성에 영향을 줄 수있는 억제제 이월의 가능성을 줄여야합니다.
미토콘드리아는 무결성을 유지하기 위해 신선하게 준비되어야하기 때문에이 방법은 고처리량 분석에 적합하지 않습니다. 또한, 각 실험마다 상대적으로 많은 양의 미토콘드리아가 필요합니다. 전형적으로, P10 동물의 경우, 단일 실험을 수행하기 위해 충분한 미토콘드리아를 하나의 기관으로부터 분리할 수 있다. 따라서 동일한 미토콘드리아 배치에서 다른 조건을 테스트하는 것은 일반적으로 불가능합니다. 실험이 오래된 동물과 함께 수행되는 경우, 조직 및 기관의 상대적으로 큰 크기를 감안할 때이 제한은 덜 문제가됩니다.
단리된 무손상 미토콘드리아에서 mPTP의 개방 확률을 연구하기 위해 다수의 잘 기술된 방법이 존재한다. 미토콘드리아 매트릭스 팽윤 및 칼슘 로딩 또는 보유 용량 분석과 같은 기술은 필연적으로 고전도도 PT를 트리거하고, 따라서 이들 실험(28)에서 관심의 대상이 되는 생리학적 저전도도 개방에 대한 연구를 허용하지 않는다. 패치-클램프 기술은 mPTP31,32의 고전도도 또는 저전도도 상태의 전압 의존성을 연구하는 강력하고 직접적인 방법을 제공한다. 그러나 한 번에 하나의 미토콘드리온과 단일 실험 조건 만 연구 할 수있는 힘든 기술이므로 비교 연구가 더욱 어려워집니다32,33.
또한, 외부 미토콘드리아 막은 전형적으로 용해되고, 내부 미토콘드리아 막은 전형적으로 단리된 미토콘드리아에 사용되는 패치-클램프 방법에서 파열되며, 이는 IMM31과 밀접하게 관련되지 않은 mPTP 조절 인자의 손실을 초래할 수 있다. mPTP의 저전도도 개방은 또한 단독으로 또는 칼세인과 조합하여 테트라메틸로다민 에스테르(ΔΨ의 변화를 평가하기 위해)를 전형적으로 사용하는 다양한 형광 기술을 사용하여 연구되었으며, 그의 트라미토콘드리아 형광은 mPTP가 개방될 때 코발트 담금질에 취약하다(8,34). 그러나, 형광 기반 접근법에서, ΔΨ의 변화가 형광의 상대적 변화로서 표현됨에 따라, 접근법은 전형적으로 ΔΨ 8,34의 정확한 측정을 허용하지 않는다.
이 방법은 ΔΨ에 대하여 mPTP의 저전도도 개방을 평가하기 위한 새로운 대안적 접근법을 제공한다. 이 접근법을 사용하여 조사관은 생리 학적 및 병리학 적 mPTP 전압 게이팅의 조절을 연구 할 수 있습니다. 이 기술은 또한 다양한 조직과 발달 단계에 적용될 수 있기 때문에 장기 성숙에서 mPTP의 발달 역할을 이해하는 데 도움이 될 것이라고 약속합니다. 이러한 접근법은 FXS 마우스 전뇌 조직에서 mPTP의 전압 게이팅을 연구하는데 용이하게 적용될 수 있으며, 이는 이전에 감소된 CoQ 수준(25)을 나타내었다. 또한, 우리는이 기술이 다른 제제, 내인성 또는 외인성, mPTP의 충격 전압 게이팅을 연구하는 데에도 사용될 수 있음을 제안한다. 따라서, 이는 건강 및 질병에 대한 mPTP의 기여에 대한 이해를 넓히는 유용한 도구임이 입증될 것이다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH / NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia University Irving Medical Center Target of Opportunity Provost Award to Department of Anesthesiology (K.K.G.), Society of Pediatric Anesthesia Young Investigator Research Award (K.K.G.), NIKH / NINDS R01NS112706 (R.J.L.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 15630080 | |
| Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 | PP systems | 941039 | |
| BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. | Fisher Scientific | 14-170-11B | to modify the length of the hamilton synringe as needed |
| Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free | Sigma | A7030-10G | |
| Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm | World Precision Inst. LLC | DRIREF-2 | |
| Electrode Holder for KWIK-Tips | World Precision Inst. LLC | KWIK-2 | ion selective electrode holder |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 324626 | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FXS mice, Fmr1 KO | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FVB mice | |
| Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk | Cole-Parmer | EW-07938-30 | microsyringe |
| Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle | Cole-Parmer | EW-07938-02 | microsyringe |
| Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete | PP systems | OXYTHERM+R | oxygen electrode and software |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | 1374248 | |
| Mannitol | Sigma | M9546-250G | |
| P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) | Sigma | D4022-10MG | |
| Percoll | Sigma | P1644 | medium for density gradient separation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P3911 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma | 5.43841 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| TPP+ Electrode Tips (3) | World Precision Inst. LLC | TIPTPP |
References
- Rasola, A., Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).
- Szabó, I., Zoratti, M. The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).
- Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., Kühlbrandt, W. Molecular Biology of the Cell. Alberts, B., et al. 14, Garland Science. Chapter 14 767-830 (2002).
- Perez, M. J., Quintanilla, R. A. Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore. Developmental Biology. 426 (1), 1-7 (2017).
- Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).
- Javadov, S., Kuznetsov, A. Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d. Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).
- Dorn, G. W. Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure. Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).
- Boyman, L., et al. Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events. Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).
- Hom, J. R., et al. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation. Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).
- Hou, Y., et al. Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development. Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).
- Elrod, J. W., et al. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).
- Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).
- Bernardi, P. Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).
- Petronilli, V., et al. The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).
- Giorgio, V., et al. Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition. European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).
- Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).
- Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons. Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).
- Karch, J., et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD. Science Advances. 5 (8), (2019).
- Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).
- Antoniel, M., et al. The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH. European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).
- Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).
- Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury. Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).
- Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore. British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).
- Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).
- Griffiths, K. K., et al. Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).
- Barajas, M., et al. The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart. Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).
- Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 11 187-196 (2018).
- Carraro, M., Bernardi, P. Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition. Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).
- Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 9 157-170 (2018).
- Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 6 109-119 (2018).
- Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1862 (3), 148357 (2021).
- Zoratti, M., Szabo, I.
- Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques. Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).
- Petronilli, V., et al. Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence. Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).
