Summary
Cette méthode exploite la contribution du pore de transition de perméabilité mitochondriale à la fuite de protons à faible conductance pour déterminer le seuil de tension pour l’ouverture des pores chez les souris atteintes du syndrome de l’X fragile néonatal avec une teneur accrue en coenzyme Q mitochondriale cardiomyocytaire par rapport au contrôle wildtype.
Abstract
Le pore de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP) est un méga-canal de membrane mitochondriale interne (IMM) voltage-dépendant, non sélectif et important pour la santé et la maladie. Le mPTP médie la fuite de protons à travers l’IMM lors de l’ouverture à faible conductance et est spécifiquement inhibé par la cyclosporine A (CsA). La coenzyme Q (CoQ) est un régulateur de la mPTP, et des différences spécifiques aux tissus ont été trouvées dans la teneur en CoQ et la probabilité ouverte de la mPTP dans le cerveau antérieur et les mitochondries cardiaques dans un modèle murin nouveau-né du syndrome de l’X fragile (FXS, Fmr1 knockout). Nous avons développé une technique pour déterminer le seuil de tension pour l’ouverture mPTP dans cette souche mutante, en exploitant le rôle du mPTP en tant que canal de fuite de protons.
Pour ce faire, la consommation d’oxygène et le potentiel membranaire (ΔΨ) ont été mesurés simultanément dans des mitochondries isolées à l’aide de la polarographie et d’une électrode sélective d’ions tétraphénylphosphonium (TPP+) pendant la respiration des fuites. Le seuil d’ouverture du mPTP a été déterminé par l’apparition d’une inhibition médiée par la CsA de la fuite de protons à des potentiels membranaires spécifiques. En utilisant cette approche, les différences de tension gating du mPTP ont été définies avec précision dans le contexte de l’excès de CoQ. Cette nouvelle technique permettra d’étudier à l’avenir la compréhension de la régulation physiologique et pathologique de l’ouverture à faible conductance du mPTP.
Introduction
Le mPTP médie la transition de perméabilité (PT), par laquelle l’IMM devient brusquement perméable aux petites molécules et solutés 1,2. Ce phénomène frappant s’écarte nettement de l’imperméabilité caractéristique de l’IMM, qui est fondamentale pour établir le gradient électrochimique nécessaire à la phosphorylation oxydative3. La PT, contrairement à d’autres mécanismes de transport mitochondrial, est un processus à haute conductance, non spécifique et non sélectif, permettant le passage d’une gamme de molécules jusqu’à 1,5 kDa 4,5. Le mPTP est un canal dépendant de la tension au sein de l’IMM dont l’ouverture modifie ΔΨ, la production d’ATP, l’homéostasie du calcium, la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et la viabilité cellulaire4.
À l’extrême pathologique, l’ouverture incontrôlée et prolongée à haute conductance du mPTP entraîne l’effondrement du gradient électrochimique, le gonflement de la matrice, l’épuisement des nucléotides pyridine de la matrice, la rupture de la membrane externe, la libération de protéines intermembranaires (y compris le cytochrome c) et, finalement, la mort cellulaire 4,6. Une telle ouverture pathologique de la PTP a été impliquée dans une ischémie cardiaque-reperfusion, une insuffisance cardiaque, une lésion cérébrale traumatique, diverses maladies neurodégénératives et le diabète 1,7. Cependant, l’ouverture mPTP à faible conductance est de nature physiologique et, contrairement à l’ouverture à haute conductance, ne conduit pas à une dépolarisation profonde ou à un gonflement mitochondrial4.
L’ouverture à faible conductance du pore limite la perméabilité à ~300 Da, permet le passage de protons indépendamment de la synthèse de l’ATP et constitue une source potentielle de fuite physiologique deprotons 5. L’ouverture physiologique de la mPTP provoque un déclin contrôlé de ΔΨ, augmente le flux d’électrons à travers la chaîne de transport respiratoire et entraîne une courte rafale ou un flash de superoxyde, contribuant à la signalisation ROS8. La régulation d’une telle ouverture transitoire de mPTP est importante pour l’homéostasie du calcium et le développement et la maturation cellulaires normaux 4,9,10,11. L’ouverture transitoire des pores dans les neurones en développement, par exemple, déclenche la différenciation, tandis que la fermeture du mPTP induit la maturation dans les cardiomyocytes immatures 4,5.
Bien que l’importance fonctionnelle du PTPm dans la santé et la maladie soit bien établie, son identité moléculaire précise reste débattue. Les progrès réalisés dans la structure moléculaire et la fonction du PTPNm ont fait l’objet d’un examen approfondi ailleurs12. Brièvement, à l’heure actuelle, les états de conductance élevée et faible du PTP ont été supposés être médiés par des entités distinctes12. Les principaux candidats sont l’ATP synthase F1/F0 (ATP synthase) et le transporteur de nucléotides d’adénine (ANT) pour les modes de conductance élevée et faible, respectivement12.
Malgré l’absence de consensus concernant l’identité exacte de la composante formant des pores du PTP, certaines caractéristiques clés ont été détaillées. Une caractéristique bien établie du mPTP est qu’il est régulé par le gradient électrochimique tel que la dépolarisation de l’IMM conduit à l’ouverture des pores13. Des travaux antérieurs ont montré que l’état redox des groupes thiol vicinaux modifie la grille de tension du mPTP, de sorte que l’oxydation ouvre le pore à des ΔΨs relativement plus élevés, et que la réduction du groupe thiol entraîne une probabilité mPTP fermée14. Cependant, l’identité du capteur de tension protéique est inconnue.
Diverses petites molécules qui modulent la probabilité d’ouverture du pore ont été identifiées. Par exemple, le mPTP peut être stimulé pour s’ouvrir avec du calcium, du phosphate inorganique, des acides gras et des ROS et peut être inhibé par les nucléotides d’adénine (en particulier l’ADP), le magnésium, les protons et le CsA 5,12. Les mécanismes d’action de certains de ces régulateurs ont été élucidés. Le calcium mitochondrial déclenche l’ouverture de la mPTP au moins en partie en se liant à la sous-unité β de l’ATP synthase15. Ros peut activer le mPTP en diminuant son affinité pour l’ADP et en améliorant son affinité pour la cyclophiline D (CypD), l’activateur protéique mPTP le mieux étudié16. Le mécanisme d’activation du mPTP par le phosphate inorganique et les acides gras est moins clair. En ce qui concerne les inhibiteurs endogènes, on pense que l’ADP inhibe le mPTP en se liant à l’ANT ou à l’ATP synthase, tandis que le magnésium exerce son effet inhibiteur en déplaçant le calcium de son site de liaison 15,17,18,19.
Un pH bas inhibe l’ouverture de la mPTP en protonant l’histidine 112 de la sous-unité de la protéine régulatrice de la sensibilité à l’oligomycine (OSCP) de l’ATP synthase 12,20,21. L’inhibiteur pharmacologique prototypique du mPTP, CsA, agit en liant CypD et en empêchant son association avec OSCP22,23. Des travaux antérieurs ont également montré qu’une variété d’analogues de la CoQ interagissent avec le mPTP, l’inhibant ou l’activant24. Dans des travaux récents, nous avons trouvé des preuves d’une mPTP pathologiquement ouverte, d’une fuite excessive de protons et d’une phosphorylation oxydative inefficace due à un déficit en CoQ dans les mitochondries du cerveau antérieur des bébés souris FXSnouveau-nés 25.
La fermeture du pore avec de la CoQ exogène a bloqué la fuite pathologique de protons et induit la maturité morphologique des épines dendritiques25. Fait intéressant, chez les mêmes animaux, les cardiomyocytes FXS avaient des niveaux excessifs de CoQ et une probabilité de mPTP fermée par rapport aux témoins de type sauvage26. Bien que la cause de ces différences spécifiques aux tissus dans les niveaux de CoQ soit inconnue, les résultats soulignent le concept selon lequel la CoQ endogène est probablement un régulateur clé de la mPTP. Cependant, il existe une lacune majeure dans nos connaissances car le mécanisme d’inhibition médiée par la CoQ de la PTPm reste inconnu.
La régulation du mPTP est un déterminant essentiel de la signalisation cellulaire et de la survie4. Ainsi, la détection de l’ouverture de la mPTP dans les mitochondries est essentielle lorsque l’on considère des mécanismes physiopathologiques spécifiques. En règle générale, le seuil d’ouverture des pores à haute conductance est déterminé à l’aide de calcium pour déclencher la transition de perméabilité. Une telle charge en calcium entraîne l’effondrement du potentiel membranaire, le découplage rapide de la phosphorylation oxydative et le gonflement mitochondrial27,28. Nous avons cherché à développer une méthode pour détecter l’ouverture mPTP à faible conductance in situ, sans l’induire en soi.
L’approche exploite le rôle du mPTP en tant que canal de fuite de protons. Pour ce faire, des électrodes sélectives d’ions de type Clark et TPP+ ont été utilisées pour mesurer simultanément la consommation d’oxygène et le potentiel membranaire, respectivement, dans des mitochondries isolées pendant la respiration des fuites29. Le seuil d’ouverture du mPTP a été déterminé par l’apparition d’une inhibition médiée par la CsA de la fuite de protons à des potentiels membranaires spécifiques. En utilisant cette approche, les différences de tension du mPTP dans le contexte de l’excès de CoQ ont été définies avec précision.
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Protocol
L’approbation du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Columbia University Medical Center a été obtenue pour toutes les méthodes décrites. Les souris FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J) et de contrôle (FVB) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) utilisées comme systèmes modèles pour cette étude ont été acquises commercialement (voir la Table des matériaux). Cinq à onze animaux ont été utilisés dans chaque groupe expérimental. Des souris postnatales de jour 10 (P10) ont été utilisées pour modéliser un point temporel dans la petite enfance humaine.
1. Isolement mitochondrial du cœur de la souris
- Préparer des tampons pour l’isolement mitochondrial et les expériences de respiration comme décrit dans le tableau 1. Conserver à 4 °C si c’est fait à l’avance.
- Préparer un milieu de gradient de densité de 15 % : diluer le milieu de gradient de densité commerciale à 80 % volume/volume (v/v) avec un diluant de gradient de densité. Diluer davantage le milieu de gradient de densité de 80 % à 15 % v/v en ajoutant un tampon d’isolement mitochondrial (IM)/albumine sérique bovine (BSA).
- Isolez les mitochondries de tissus frais et non congelés pour ces expériences et utilisez-les le jour de la préparation, généralement dans les cinq heures26. Effectuez toutes les étapes d’isolement sur la glace.
- Décapitez la souris et excisez le cœur. Laver immédiatement 1 à 2 fois dans une boîte de Petri avec du MI/BSA glacé. Coupez l’oreillette et hachez le tissu.
- Transférer le tissu cardiaque haché dans un homogénéisateur verre-verre contenant 1 mL de MI/BSA. Homogénéiser avec un pilon plus lâche (A) (10 coups), puis un pilon plus serré (B) (10 coups).
- Centrifuger l’homogénat à 1 100 × g pendant 2 min à 4 °C pour éliminer les débris nucléaires et cellulaires.
- Prenez le surnageant doucement sans toucher de granulés moelleux et superposez-le soigneusement sur 700 μL de milieu de gradient de densité de 15% dans un tube de centrifugeuse. Centrifuger à 18 500 × g pendant 15 min à 4 °C.
- Remettre la pastille dans 1 mL de tampon de saccharose (SB)/BSA et centrifuger à 10 000 × g pendant 10 min à 4 °C.
- Retirez et jetez complètement le surnageant. Remettre en suspension la pastille en SB/BSA jusqu’à un volume final de 55 μL.
- Quantifier la teneur en protéines mitochondriales à l’aide d’un test standard tel que le test de la protéine de l’acide bicinchoninique (BCA).
2. Consommation mitochondriale d’oxygène (O2) et ΔΨ
- Assemblage et étalonnage des électrodes d’oxygène
- Installez et étalonnez l’électrode d’oxygène (voir le tableau des matériaux) conformément aux instructions du fabricant.
- Placez une goutte de solution d’électrolyte de chlorure de potassium (KCl) à 50% sur le dôme du disque d’électrode.
- Placez un petit morceau ~ 2 cm2 espaceur de papier à cigarette recouvert d’un morceau légèrement plus grand de la membrane de polytétrafluoroéthylène (PTFE) fournie sur la goutte d’électrolyte.
- À l’aide de l’outil applicateur fourni, poussez le petit joint torique du disque d’électrode sur le dôme de l’électrode.
REMARQUE: Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air et que la membrane est lisse.
- Remplissez bien le réservoir avec la solution d’électrolyte.
- Placez le joint torique plus grand dans le renfoncement autour du disque d’électrode.
- Installez le disque dans la chambre à électrodes et connectez-le à l’unité de commande.
- Ajouter 2 mL d’eau désionisée saturée d’air à la chambre de réaction et l’aimant revêtu de PTFE à la chambre.
- Connectez la chambre à l’arrière de l’unité de commande.
- Réglez la température à 37 °C et la vitesse d’agitation à 100.
- Prévoyez 10 minutes pour que la température du système s’équilibre avant de commencer l’étalonnage.
- Sous l’onglet Étalonnage , sélectionnez Étalonnage de phase liquide pour effectuer l’étalonnage de phase liquide. Vérifiez que la température est réglée sur 37 °C, que la vitesse d’agitation est de 100 et que la pression est réglée sur la pression atmosphérique (101,32 kPa).
- Appuyez sur OK et attendez que le signal plafonne.
- Lorsqu’un plateau est atteint, appuyez sur OK.
- Établissez zéroO2 dans la chambre en ajoutant une petite quantité (~ 20 mg) de dithionite de sodium.
- Appuyez sur OK et attendez que le signal plafonne.
- Lorsqu’un plateau est atteint, appuyez sur Enregistrer pour accepter l’étalonnage.
- Installez et étalonnez l’électrode d’oxygène (voir le tableau des matériaux) conformément aux instructions du fabricant.
- Ensemble d’électrodes sélectives TPP+
- Remplissez l’embout de l’électrode sélective TPP+ avec une solution TPP de 10 mM à l’aide de la seringue et de l’aiguille flexible fournies, en prenant soin d’éviter les bulles d’air.
- Assemblez l’appareil à électrodes sélectives TPP+, y compris l’électrode de référence et le porte-électrode, (voir tableau des matériaux) conformément aux instructions du fabricant.
- En bref, desserrez le capuchon du porte-électrode et insérez l’électrode de référence interne dans la pointe TPP+. Serrez le capuchon pour fixer la pointe. Connectez le câble fourni au porte-électrode et au port auxiliaire du boîtier de commande.
- Insérez l’électrode sélective TPP+ et les électrodes de référence dans l’ensemble piston adapté pour électrodes sélectives d’ions. Connectez l’électrode de référence à l’orifice de référence du boîtier de commande.
- Insérez les électrodes sélectives TPP+ et de référence dans l’ensemble piston adapté pour électrodes sélectives d’ions.
- Préparation de la chambre de réaction
- Ajouter le mélange réactionnel à la chambre de réaction : 10 mM de succinate (substrat du complexe II), 5 μM de roténone (inhibiteur du complexe I), 80 ng de nigericine mL−1 (pour réduire le gradient de pH à travers l’IMM), 2,5 μg mL-1 oligomycine (pour induire une respiration à l’état 4) et tampon respiratoire (RB)/tampon de réaction BSA à un volume final de 1 mL. Veillez à éviter d’introduire des bulles d’air dans la chambre.
- Fermez la chambre avec l’ensemble piston adapté avec le TPP+-sélectif et l’électrode de référence en place. Sélectionnez GO pour démarrer l’enregistrement. Une fois la chambre fermée, introduisez des réactifs supplémentaires directement dans la solution réactionnelle à l’aide de microsyringes séparées modifiées avec des tubes en plastique pour ajuster la longueur de l’aiguille.
- Calibrage TPP+
- Une fois qu’un signal de tension stable est obtenu, calibrer l’électrode sélective TPP+ en ajoutant des incréments de 1 μM d’une solution de TPP de 0,1 mM à une concentration finale de 3 μM. Observez qu’il y a une baisse logarithmique du signal de tension TPP+ à chaque ajout.
REMARQUE: Calibrez l’électrode sélective TPP+ au début de chaque expérience.
- Une fois qu’un signal de tension stable est obtenu, calibrer l’électrode sélective TPP+ en ajoutant des incréments de 1 μM d’une solution de TPP de 0,1 mM à une concentration finale de 3 μM. Observez qu’il y a une baisse logarithmique du signal de tension TPP+ à chaque ajout.
- Acquisition de données
- Laissez les tracesO2 et TPP+ se stabiliser et ajoutez 100 μg de mitochondries cardiomyocytaires fraîchement préparées à la chambre de réaction jusqu’à une concentration finale de 0,1 mg mL-1 via le port d’addition de réactif dans l’ensemble piston. Observez la diminution des niveaux d’O2 dans la chambre à mesure que les mitochondries s’énergisent et consomment de l’O2 et l’augmentation brusque du signal de tension TPP + à mesure que les mitochondries génèrent un potentiel membranaire et absorbent le TPP + de la solution.
- Ajouter 2,5 μg mL-1 d’oligomycine pour induire une respiration à l’état 4.
REMARQUE: Les taux de consommation d’O2 représenteront désormais le taux de respiration par fuite de protons. L’oligomycine peut être ajoutée à la chambre de réaction avant le TPP+ comme alternative.
- Évaluation de la probabilité d’ouverture du mPTP
- Observez que ΔΨ diminue avec le temps pendant la respiration des fuites. Une fois que le ΔΨ désiré est atteint, ajouter 1 μM CsA (inhibiteur de mPTP) à la chambre de réaction pour évaluer la probabilité ouverte du mPTP à ce ΔΨ spécifique.
- Mesurer l’effet de la CsA sur la consommation d’O2 et de ΔΨ avant et après l’addition de CsA
- Déterminer la dépendance de tension de l’ouverture mPTP en faisant varier le ΔΨ auquel CsA est ajouté dans des expériences successives.
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Representative Results
La consommation typique d’O2 et les courbes ΔΨ générées dans ces expériences sont montrées (Figure 1A,B). La baisse logarithmique du signal de tension avec l’étalonnage TPP+ est montrée au début de chaque expérience. L’absence de ce schéma logarithmique peut suggérer un problème avec l’électrode sélective TPP+. Les mitochondries génèrent généralement ΔΨ immédiatement après l’ajout au tampon respiratoire. ΔΨ peut être interprété à partir des changements de tension TPP+ basés sur l’équation de Nernst (rapport logarithmique de [TPP+ à l’intérieur de la matrice mitochondriale] à [TPP+ externe])30. Notez que le ΔΨ physiologique se rapproche du niveau TPP+ de 2 μM de la courbe standard. Des seuils de tension ont ainsi été définis par rapport à la norme TPP+ de 2 μM (notée signal de tension Δ mV TPP+).
Par exemple, « ΔΨ élevé » a été défini comme ~Δ0 mV (au niveau de 2 μM TPP+), un « ΔΨ intermédiaire » a été défini à ~Δ5 mV (inférieur à 2 μM TPP+), et « faible ΔΨ » a été défini à ~Δ10 mV (inférieur à 2 μM TPP+) (Figure 1A,B). Dans les expériences pilotes, les mitochondries à Δ0 mV présentaient une probabilité fermée de 100% mPTP et celles à Δ10 mV présentaient une probabilité d’ouverture de 100%; des graphiques représentatifs sont présentés à la figure 1A,B. Le seuil de Δ5 mV a donc été choisi arbitrairement comme ΔΨ intermédiaire. Notez que dans ces expériences, lors de l’ajout de mitochondries à la chambre de réaction, les mitochondries sont à l’état de respiration 2 où elles sont exposées à un excès de substrat. Les mitochondries ne sont pas stimulées pour entrer dans l’état 3 avec ADP; en conséquence, une fois que l’oligomycine est ajoutée, ils passent directement à l’état 4 oligomycine (respiration de fuite). En conséquence, une différence appréciable dans la consommation d’oxygène n’est généralement pas observée après l’ajout d’oligomycine, ce qui suggère que l’ATP synthase contribue de manière minimale à la respiration pendant l’état 2 (Figure 1A, B). Pour évaluer l’état ouvert ou fermé du mPTP, le taux de consommation d’O2 et le potentiel de la membrane juste avant et juste après l’ajout de CsA sont comparés (Figure 1C). Une diminution du taux de consommation d’O2 et une augmentation et une stabilisation de ΔΨ en réponse à la CsA indiquent la fermeture d’un mPTP ouvert (blocage de la fuite de protons médiée par les pores) (Figure 1C, courbes noires).
Lorsque le mPTP est fermé, il n’y a pas de diminution du taux de consommation d’O2 , et ΔΨ n’augmente pas et ne se stabilise pas mais continue de baisser (Figure 1C, courbes rouges). Les résultats expérimentaux démontrent des probabilités de mPTP fermées et ouvertes similaires à des ΔΨ élevés et faibles, respectivement, dans le contrôle FVB et les mitochondries cardiaques Fmr1 KO (Figure 1D). Ces résultats sont cohérents avec les propriétés sensibles à la tension connues du mPTP, où le pore a tendance à être fermé à ΔΨs élevé et ouvert à faible ΔΨs13. Ainsi, en utilisant cette méthode, nous avons démontré de manière fiable la dépendance de tension habituelle du mPTP dans les deux souches. Fait intéressant, au seuil intermédiaire ΔΨ (seuil de Δ5 mV), les mitochondries cardiaques Fmr1 KO ont démontré une probabilité accrue de mPTP fermée par rapport aux témoins FVB (Figure 1D). Ainsi, les mitochondries cardiaques Fmr1 KO ont démontré un changement de grille tel que le pore nécessitait un ΔΨ inférieur pour que l’ouverture soit déclenchée. Ceci est cohérent avec la conclusion précédente selon laquelle les KO Fmr1 ont des niveaux élevés de CoQ et un mPTP26 relativement fermé. Ainsi, la méthode a identifié un seuil ΔΨ optimal pour résoudre les différences d’ouverture mPTP. Il est important de noter que la définition de ce seuil de ΔΨ permettra d’approfondir les recherches pour mieux comprendre comment la CoQ régule la mPTP et comment le déficit en CoQ conduit à l’ouverture pathologique des pores dans FXS.
Figure 1 : Détection de la probabilité d’ouverture mPTP à faible conductance. (A, B) Courbes représentatives de la consommation simultanée d’O2 (rouge, les nombres sont des taux en nmol de O2 mL-1 min-1 mg de protéine-1) avec ΔΨ (noir, [TPP+]). Les flèches indiquent l’ajout de TPP+, de mitochondries, d’olligomycine et de CsA. Les seuils de haute, moyenne et basse tension par rapport au niveau d’étalonnage TPP+ de 2 μM sont affichés. L’ajout de CsA aux seuils de tension élevée (A) et basse (B) est indiqué. (C) Section agrandie des courbes de consommation d’O2 (supérieure) et de ΔΨ (inférieure) en (A) et (B) au point d’addition de CsA, illustrant le mPTP fermé (rouge) à ΔΨ élevé (insensible au CsA) et le mPTP ouvert (noir) à faible ΔΨ (sensible au CsA). (D) Des graphiques récapitulatifs de l’état ouvert et fermé mPTP aux ΔΨs hauts, bas et intermédiaires sont présentés pour les commandes FVB (noir) et Fmr1 KOs (gris). Cinq à 11 animaux ont été évalués à chaque seuil de ΔΨ; Les valeurs de p ont été calculées à l’aide d’un test du chi carré, *p < 0,05. Abréviations : ΔΨ = potentiel membranaire mitochondrial ; mPTP = pore de transition de perméabilité mitochondriale; TPP+ = tétraphénylphosphonium; mito = mitochondries; oligo = oligomycine; CsA = cyclosporine A; ΔΨ = ; KO = KO. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Composant | MI/BSA* | SB/BSA* | Diluant à gradient de densité | RB/BSA* |
| Mannitol | 225 mM | - | - | - |
| Saccharose | 75 mM | 250 mM | 1 M | 200 mM |
| HEPES | 5 mM | 5 mM | 50 mM | 5 mM |
| L’EGTA | 1 mM | 0,1 mM | 10 mM | - |
| Kcl | - | - | - | 25 mM |
| KH2PO4 | - | - | - | 2 mM |
| MgCl2 | - | - | - | 5 mM |
| pH** | 7.4 | 7.4 | - | 7.2 |
| BSA*** | 0.10% | 0.10% | - | 0.02% |
| AP5A*** | - | - | - | 30 mM |
Tableau 1 : Tampons et solutions.
* Filtrer à travers des filtres de 0,2 μm
**Ajuster le pH avec 3 M d’hydroxyde de potassium au besoin.
Désigne les composants tampons qui sont ajoutés juste avant l’isolement mitochondrial.
Abréviations : MI = tampon d’isolement mitochondrial ; SB = tampon de saccharose; RB = tampon respiratoire; BSA = albumine sérique bovine sans acide gras; HEPES = acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique; EGTA = acide éthylène glycol-bis(β-aminoéthylique)-N,N,N′,N′-tétraacétique; KCl = chlorure de potassium; KH2PO4 = dihydrogénophosphate de potassium; MgCl2 = chlorure de magnésium; AP5A = P1,P5-diadénosine-5' pentaphosphate pentasodique.
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Discussion
Cet article décrit une méthode pour évaluer la probabilité d’ouverture du mPTP. Plus précisément, le seuil de tension pour l’ouverture mPTP à faible conductance a été déterminé en évaluant l’effet de l’inhibition de CsA sur la fuite de protons sur une plage de ΔΨs. En utilisant cette technique, nous avons pu identifier des différences dans la grille de tension du mPTP entre les souris FXS et les contrôles FVB compatibles avec leurs différences dans la teneur en CoQ spécifique des tissus. Un élément essentiel au succès de cette méthodologie est que les mitochondries sont fraîchement isolées avant utilisation et sont de bonne qualité. Les mitochondries endommagées pendant l’isolement ou trop âgées seront incapables de générer un ΔΨ approprié et seront généralement découplées. Notez que si le pH de la matrice contribue généralement à la force motrice du proton, la nigéricine est utilisée pour réduire le ΔpH à travers l’IMM dans ces expériences, comme décrit précédemment dans les protocoles standard évaluant la fuite deprotons 29. Par conséquent, dans ce cas, la force motrice du proton est équivalente à ΔΨ, ce qui simplifie l’approche expérimentale.
Une autre considération importante est que certains des inhibiteurs utilisés dans le mélange respiratoire (tels que la roténone, l’oligomycine et l’ASC) sont difficiles à rincer entre les expériences car ils adhèrent aux surfaces en plastique de la chambre de réaction, y compris les électrodes sélectives d’ions. La chambre doit être lavée régulièrement avec de l’éthanol et une suspension de mitochondries décongelées grossièrement préparées pour « éponger » ces inhibiteurs de la chambre et réduire la probabilité de transfert d’inhibiteurs pouvant affecter la reproductibilité des expériences.
Comme les mitochondries doivent être fraîchement préparées pour maintenir leur intégrité, cette méthode ne se prête pas à des analyses à haut débit. En outre, des quantités relativement importantes de mitochondries sont nécessaires pour chaque expérience. En règle générale, pour les animaux P10, suffisamment de mitochondries peuvent être isolées d’un organe pour mener une seule expérience. Par conséquent, il n’est généralement pas possible de tester différentes conditions sur le même lot de mitochondries. Si des expériences sont effectuées avec des animaux plus âgés, cette limitation est moins problématique, compte tenu de la taille relativement plus grande des tissus et des organes.
Un certain nombre de méthodes bien décrites existent pour étudier la probabilité ouverte du mPTP dans les mitochondries intactes isolées. Les techniques, telles que le gonflement de la matrice mitochondriale et les tests de charge calcique ou de capacité de rétention, déclenchent nécessairement une PT à haute conductance et ne permettent donc pas l’étude de l’ouverture physiologique à faible conductance qui présente un intérêt dans ces expériences28. La technique patch-clamp fournit une méthode puissante et directe pour étudier la dépendance à la tension des états de conductance élevée ou faible du mPTP31,32. Cependant, il s’agit d’une technique laborieuse, où une seule mitochondrie et une seule condition expérimentale peuvent être étudiées à la fois, ce qui rend les études comparatives plus difficiles32,33.
En outre, la membrane mitochondriale externe est généralement lysée et la membrane mitochondriale interne est généralement rompue dans les méthodes de patch-clamp utilisées pour les mitochondries isolées, ce qui peut entraîner la perte de facteurs régulateurs mPTP qui ne sont pas intimement associés à l’IMM31. L’ouverture à faible conductance du mPTP a également été étudiée à l’aide de diverses techniques de fluorescence utilisant généralement un ester de tétraméthylrhodamine (pour évaluer les changements dans le ΔΨ) seul ou en combinaison avec la calcéine, dont la fluorescence intramitochondriale est sensible à la trempe au cobalt lorsque le mPTP est ouvert 8,34. Cependant, dans les approches basées sur la fluorescence, comme les changements dans ΔΨ sont exprimés comme des changements relatifs dans la fluorescence, l’approche ne permet généralement pas de mesurer avec précision ΔΨ 8,34.
Cette méthode fournit une nouvelle approche alternative pour évaluer l’ouverture à faible conductance du mPTP par rapport à ΔΨ. En utilisant cette approche, les chercheurs peuvent étudier la régulation de la tension physiologique et pathologique mPTP. Cette technique est également prometteuse pour aider à comprendre le rôle développemental du PTP dans la maturation des organes, car il peut être appliqué à divers tissus et à différents stades de développement. Cette approche peut être facilement appliquée pour étudier la tension gating du mPTP dans le tissu du cerveau antérieur de souris FXS, qui présentait auparavant une diminution des niveaux de CoQ25. En outre, nous proposons que cette technique puisse également être utilisée pour étudier comment d’autres agents, endogènes ou exogènes, impactent le contrôle de la tension du mPTP. Ainsi, il s’avérera être un outil utile pour élargir la compréhension de la contribution du PTPm à la santé et à la maladie.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par les subventions suivantes : NIH/NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia University Irving Medical Center Target of Opportunity Provost award to the Department of Anesthesiology (K.K.G.), Society of Pediatric Anesthesia Young Investigator Research Award (K.K.G.), et NIH/NINDS R01NS112706 (R.J.L.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 15630080 | |
| Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 | PP systems | 941039 | |
| BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. | Fisher Scientific | 14-170-11B | to modify the length of the hamilton synringe as needed |
| Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free | Sigma | A7030-10G | |
| Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm | World Precision Inst. LLC | DRIREF-2 | |
| Electrode Holder for KWIK-Tips | World Precision Inst. LLC | KWIK-2 | ion selective electrode holder |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 324626 | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FXS mice, Fmr1 KO | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FVB mice | |
| Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk | Cole-Parmer | EW-07938-30 | microsyringe |
| Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle | Cole-Parmer | EW-07938-02 | microsyringe |
| Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete | PP systems | OXYTHERM+R | oxygen electrode and software |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | 1374248 | |
| Mannitol | Sigma | M9546-250G | |
| P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) | Sigma | D4022-10MG | |
| Percoll | Sigma | P1644 | medium for density gradient separation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P3911 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma | 5.43841 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| TPP+ Electrode Tips (3) | World Precision Inst. LLC | TIPTPP |
References
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