Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vurdering av åpen sannsynlighet for mitokondriell permeabilitetsovergang pore i innstillingen av koenzym Q overskudd

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/63646
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Anesthesiology, Columbia University Medical Center

Summary

Denne metoden utnytter bidraget fra mitokondriell permeabilitetsporering til protonlekkasje med lav ledning for å bestemme spenningsterskelen for poreåpning hos neonatale skjøre X syndrommus med økt kardiomyyocytt mitokondrie coenzyme Q-innhold sammenlignet med wildtype-kontroll.

Abstract

Mitokondriepermeabilitetsporering (mPTP) er en spenningsportert, ikke-selektiv, indre mitokondriemembran (IMM) megakanal som er viktig for helse og sykdom. mPTP formidler lekkasje av protoner over IMM under åpning med lav ledningsevne og er spesielt hemmet av ciklosporin A (CsA). Coenzyme Q (CoQ) er en regulator av mPTP, og vevsspesifikke forskjeller har blitt funnet i CoQ-innhold og åpen sannsynlighet for mPTP i forebrain og hjerte mitokondrier i en nyfødt musemodell av skjøre X syndrom (FXS, Fmr1 knockout). Vi utviklet en teknikk for å bestemme spenningsterskelen for mPTP-åpning i denne mutantstammen, og utnytte rollen som mPTP som en protonlekkasjekanal.

For å gjøre dette ble oksygenforbruk og membranpotensial (ΔΨ) samtidig målt i isolert mitokondrier ved hjelp av polarografi og et tetrafenylfosfonium (TPP +) ion-selektiv elektrode under lekkasje respirasjon. Terskelen for mPTP-åpning ble bestemt ved utbruddet av CsA-mediert hemming av protonlekkasje ved spesifikke membranpotensialer. Ved hjelp av denne tilnærmingen ble forskjeller i spenningsgambling av mPTP nøyaktig definert i sammenheng med CoQ-overskudd. Denne nye teknikken vil tillate fremtidig undersøkelse for å forbedre forståelsen av fysiologisk og patologisk regulering av lavledningsåpning av mPTP.

Introduction

mPTP formidler permeabilitetsovergangen (PT), der IMM brått blir gjennomtrengelig for små molekyler og løsemidler 1,2. Dette slående fenomenet er et tydelig avvik fra IMM's karakteristiske impermeabilitet, noe som er grunnleggende for å etablere den elektrokjemiske gradienten som er nødvendig for oksidativ fosforylering3. PT, i motsetning til andre mitokondrietransportmekanismer, er en høylednings-, ikke-spesifikk og ikke-selektiv prosess, slik at passasjen av en rekke molekyler opp til 1,5 kDa 4,5. mPTP er en spenningsportert kanal i IMM hvis åpning endrer ΔΨ, ATP-produksjon, kalsium homeostase, reaktiv oksygenarter (ROS) produksjon og celle levedyktighet4.

Ved den patologiske ekstreme, ukontrollerte og langvarige høyledningsåpningen av mPTP fører til sammenbrudd av den elektrokjemiske gradienten, matrise hevelse, uttømming av matrise pyridin nukleotider, ytre membranbrudd, frigjøring av intermembrane proteiner (inkludert cytokrom c), og til slutt celledød 4,6. Slik patologisk mPTP-åpning har vært involvert i hjerte-iskemi-reperfusjonsskade, hjertesvikt, traumatisk hjerneskade, ulike nevrodegenerative sykdommer og diabetes 1,7. Imidlertid er lavlednings mPTP-åpning fysiologisk i naturen, og i motsetning til høyledningsåpning fører det ikke til dyp depolarisering eller mitokondrie hevelse4.

Lavledningsåpning av poren begrenser permeabiliteten til ~ 300 Da, tillater passasje av protoner uavhengig av ATP-syntese, og er en potensiell kilde til fysiologisk protonlekkasje5. Fysiolog mPTP-åpning forårsaker en kontrollert nedgang i ΔΨ, øker elektronstrømmen gjennom luftveiene i transportkjeden, og resulterer i en kort utbrudd eller blits av superoksid, noe som bidrar til ROS-signalering8. Regulering av slik forbigående mPTP-åpning er viktig for kalsium homeostase og normal cellulær utvikling og modning 4,9,10,11. Forbigående poreåpning i utvikling av nevroner utløser for eksempel differensiering, mens lukkingen av mPTP induserer modning i umodne kardiomyocytter 4,5.

Selv om den funksjonelle betydningen av mPTP i helse og sykdom er godt etablert, forblir den nøyaktige molekylære identiteten debattert. Fremdriften på mPTPs molekylære struktur og funksjon er grundig gjennomgått andre steder12. Kort sagt, for tiden har høy- og lavledningstilstander av mPTP blitt hypoteset om å bli formidlet av forskjellige enheter12. De ledende kandidatene er F1/F0 ATP syntase (ATP syntase) og adenin nukleotidtransportør (ANT) for høy- og lavledningsmodus, henholdsvis12.

Til tross for mangel på konsensus om den eksakte identiteten til den poredannende komponenten i mPTP, har visse nøkkelegenskaper blitt detaljert. Et veletablert trekk ved mPTP er at den er regulert av den elektrokjemiske gradienten slik at depolarisering av IMM fører til poreåpning13. Tidligere arbeid har vist at redokstilstanden til vicinal tiolgrupper endrer spenningsstrømmingen av mPTP, slik at oksidasjon åpner poren ved relativt høyere ΔΨs, og thiolgruppereduksjon resulterer i lukket mPTP-sannsynlighet14. Identiteten til den proteinholdige spenningssensoren er imidlertid ukjent.

Ulike små molekyler som modulerer porens åpne sannsynlighet er identifisert. For eksempel kan mPTP stimuleres til å åpne med kalsium, uorganisk fosfat, fettsyrer og ROS og kan hemmes av adeninkjerner (spesielt ADP), magnesium, protoner og CsA 5,12. Virkningsmekanismene til noen av disse regulatorene har blitt belyst. Mitokondriekalsium utløser mPTP-åpning i det minste delvis ved å binde seg til β-underenheten til ATP-syntasen15. ROS kan aktivere mPTP ved å redusere affiniteten for ADP og forbedre affiniteten for cyklofilin D (CypD), den best studerte proteinholdige mPTP-aktivatoren16. Aktiveringsmekanismen for mPTP ved uorganisk fosfat og fettsyrer er mindre klar. Når det gjelder endogene hemmere, antas ADP å hemme mPTP ved binding ved ANT- eller ATP-syntase, mens magnesium utøver sin hemmende effekt ved å fortrenge kalsium fra bindingsstedet 15,17,18,19.

Lav pH hemmer mPTP-åpning ved å protonere histidin 112 av den regulatoriske oligomycinfølsomhetsgivende protein (OSCP) subenheten til ATP-syntasen 12,20,21. Den prototypiske farmakologiske hemmeren av mPTP, CsA, virker ved å binde CypD og forhindre dens tilknytning til OSCP22,23. Tidligere arbeid har også vist at en rekke CoQ-analoger samhandler med mPTP, hemmer det eller aktiverer det24. I nyere arbeid fant vi bevis på en patologisk åpen mPTP, overdreven protonlekkasje og ineffektiv oksidativ fosforylering på grunn av en CoQ-mangel i forebrain mitokondrier av nyfødte FXS-musevalper25.

Lukking av poren med eksogen CoQ blokkerte den patologiske protonlekkasjen og induserte morfologiske modenhet av dendrittiske spines25. Interessant nok, i de samme dyrene, hadde FXS kardiomyocytter overdreven CoQ-nivåer og lukket mPTP-sannsynlighet sammenlignet med wildtype-kontroller26. Selv om årsaken til disse vevsspesifikke forskjellene i CoQ-nivåer er ukjent, understreker funnene konseptet om at endogen CoQ sannsynligvis er en nøkkelregulator for mPTP. Imidlertid er det et stort gap i vår kunnskap fordi mekanismen for CoQ-mediert hemming av mPTP forblir ukjent.

Regulering av mPTP er en kritisk determinant for cellesignalering og overlevelse4. Dermed er det viktig å oppdage mPTP-åpning innen mitokondrier når man vurderer spesifikke patofysiologiske mekanismer. Vanligvis bestemmes terskelen for poreåpning med høy ledning ved hjelp av kalsium for å utløse permeabilitetsovergangen. Slik kalsiumbelastning fører til sammenbrudd av membranpotensialet, rask frakobling av oksidativ fosforylering og mitokondrie hevelse27,28. Vi forsøkte å utvikle en metode for å oppdage mPTP-åpning med lav ledning in situ, uten å indusere den i seg selv.

Tilnærmingen utnytter rollen til mPTP som en protonlekkasjekanal. For å gjøre dette ble Clark-Type og TPP+ ion-selektive elektroder brukt til samtidig å måle oksygenforbruk og membranpotensial, henholdsvis i isolerte mitokondrier under lekkasje respirasjon29. Terskelen for mPTP-åpning ble bestemt ved utbruddet av CsA-mediert hemming av protonlekkasje ved spesifikke membranpotensialer. Ved hjelp av denne tilnærmingen ble forskjeller i spenningsgambling av mPTP i sammenheng med CoQ-overskudd nøyaktig definert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Institutional Animal Care and Use Committee of Columbia University Medical Center godkjenning ble oppnådd for alle metoder beskrevet. FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J) og kontroll (FVB) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) mus som brukes som modellsystemer for denne studien ble kommersielt anskaffet (se materialtabellen). Fem til elleve dyr ble brukt i hver eksperimentell gruppe. Postnatal dag 10 (P10) mus ble brukt til å modellere for et tidspunkt i menneskelig barndom.

1. Mitokondrieisolasjon fra musehjertet

  1. Klargjør buffere for mitokondrieisolasjons- og åndedrettseksperimenter som beskrevet i tabell 1. Oppbevars ved 4 °C hvis det gjøres på forhånd.
    1. Forbered 15 % tetthetsgradientmedium: Fortynn kommersiell tetthetsgradient middels til 80 % volum/volum (v/v) med fortynningsmiddel for tetthet. Fortynn ytterligere 80 % tetthetsgradient middels 15 % v/v ved å tilsette mitokondrieisolasjonsbuffer (MI)/bovint serumalbumin (BSA).
  2. Isoler mitokondrier fra friskt, ikke frossent vev for disse eksperimentene og bruk på forberedelsesdagen, vanligvis innen fem timerog 26. Utfør alle isolasjonstrinn på is.
    1. Decapitate musen og særpres hjertet. Vask straks 1-2 ganger i en Petri-tallerken med iskald MI/BSA. Klipp av atriet og hakk vevet.
    2. Overfør det hakkede hjertevevet til en homogenisator i glassglass som inneholder 1 ml MI/BSA. Homogeniser med en løsere (A) pestle (10 slag), deretter en strammere (B) pestle (10 slag).
    3. Sentrifuger homogenatet ved 1100 × g i 2 min ved 4 °C for å fjerne kjernefysisk og cellulært rusk.
    4. Ta supernatanten forsiktig uten å berøre noen fluffy pellet, og legg den forsiktig på toppen av 700 μL 15% tetthetsgradientmedium i et sentrifugerør. Sentrifuge ved 18.500 × g i 15 min ved 4 °C.
    5. Resuspend pellet i 1 ml sukrose buffer (SB)/BSA og sentrifugert ved 10.000 × g i 10 min ved 4 °C.
    6. Fjern og kast supernatanten helt. Bruk pelletsen i SB/BSA på nytt til et endelig volum på 55 μL.
    7. Kvantifisere mitokondrieproteininnhold ved hjelp av en standard analyse som bicinchoninic acid (BCA) proteinanalyse.

2. Mitokondrie oksygen (O2) forbruk og ΔΨ

  1. Oksygenelektrodemontering og kalibrering
    1. Sett opp og kalibrer oksygenelektroden (se materialtabellen) i henhold til produsentens anvisninger.
      1. Plasser en dråpe 50% kaliumklorid (KCl) elektrolyttløsning på toppen av kuppelen på elektrodeskiven.
      2. Legg et lite stykke ~ 2 cm2 sigarettpapir spacer dekket med et litt større stykke av den medfølgende polytetrafluoretylen (PTFE) membranen over elektrolyttdråpen.
      3. Bruk applikatorverktøyet som følger med, skyv den lille elektrodeskivens O-ring over elektrodens kuppel.
        MERK: Pass på at det ikke er luftbobler og at membranen er glatt.
    2. Fyll reservoaret godt på plass med elektrolyttløsningen.
    3. Plasser den større O-ringen i utsparingen rundt elektrodeskiven godt.
    4. Monter platen i elektrodekammeret og koble den til kontrollenheten.
    5. Tilsett 2 ml luftmettet deionisert vann til reaksjonskammeret og den PTFE-belagte magneten til kammeret.
    6. Koble kammeret til baksiden av kontrollenheten.
    7. Still temperaturen på 37 °C og rørehastigheten til 100.
    8. La det gå 10 min før systemtemperaturen likevektes før kalibrering påbegynnes.
    9. Under Kalibrering-fanen velger du Væskefasekalibrering for å utføre væskefasekalibrering. Kontroller at temperaturen er satt til 37 °C , rørehastigheten er 100, og trykket er satt til atmosfærisk trykk (101,32 kPa).
    10. Trykk OK og vent til signalet er platået.
    11. Når et platå er nådd, trykker du ok.
    12. Etabler null O2 i kammeret ved å tilsette en liten mengde (~20 mg) natriumdithionitt.
    13. Trykk OK og vent til signalet er platået.
    14. Når et platå er nådd, trykker du på Lagre for å godta kalibreringen.
  2. TPP+-selektiv elektrodeenhet
    1. Fyll TPP+- selektiv elektrodespiss med 10 mM TPP-oppløsning ved hjelp av den medfølgende sprøyten og den fleksible kanylen, og pass på å unngå luftbobler.
    2. Monter TPP+-selektive elektrodeapparatet, inkludert referanseelektroden og elektrodeholderen, (se Materialfortegnelse) i henhold til produsentens anvisninger.
    3. Løsne elektrodeholderhetten kort og sett den interne referanseelektroden inn i TPP+-spissen. Stram hetten for å feste spissen. Koble den medfølgende kabelen til elektrodeholderen og ekstraporten på kontrollboksen.
    4. Sett TPP+-selektiv elektroden og referanseelektrodene inn i den tilpassede stempelenheten for ionselektive elektroder. Koble referanseelektroden til referanseporten på kontrollboksen.
    5. Sett TPP+-selektive elektroder og referanseelektroder inn i den tilpassede stempelenheten for ion-selektive elektroder.
  3. Forberedelse av reaksjonskammer
    1. Tilsett reaksjonsblandingen i reaksjonskammeret: 10 mM succinat (kompleks II substrat), 5 μM rotenon (kompleks I-hemmer), 80 ng ml−1 nigericin (for å kollapse pH på tvers av IMM), 2,5 μg ml-1 oligomycin (for å indusere tilstand 4-respirasjon) og respirasjonsbuffer (RB)/BSA-reaksjonsbuffer til et endelig volum på 1 ml. Pass på at du ikke introduserer luftbobler i kammeret.
    2. Lukk kammeret med den tilpassede stempelenheten med TPP+-selektiv og referanseelektroden på plass. Velg GO for å starte innspillingen. Når kammeret er lukket, introduser ekstra reagenser direkte i reaksjonsløsningen ved hjelp av separate mikrosyringer modifisert med plastrør for å justere nålelengden.
  4. TPP+- kalibrering
    1. Når et stabilt spenningssignal er oppnådd, kalibrerer du TPP +-selektiv elektroden ved å legge til 1 μM trinn på en 0,1 mM TPP-løsning til en endelig konsentrasjon på 3 μM. Vær oppmerksom på at det er en logaritmisk nedgang i TPP+ spenningssignalet ved hvert tillegg.
      MERK: Kalibrer TPP+-selektiv elektroden ved starten av hvert eksperiment.
  5. Datainnsamling
    1. La O2 - og TPP+- sporene stabilisere seg, og tilsett 100 μg nytilberedte kardiomyocytt mitokondrier til reaksjonskammeret til en endelig konsentrasjon på 0,1 mg ml-1 via reagenstilsetningsporten i stempelenheten. Vær oppmerksom på nedgangen i O2-nivåene i kammeret når mitokondrier blir energiske og forbruker O2 og den brå økningen i TPP + spenningssignalet når mitokondriene genererer et membranpotensial og tar opp TPP + fra løsningen.
    2. Tilsett 2,5 μg ml-1 oligomycin for å indusere tilstand 4-åndedrett.
      MERK: O 2-forbrukshastigheten vil nå representere frekvensen av protonlekkasje respirasjon. Oligomycin kan legges til reaksjonskammeret før TPP+ som et alternativ.
  6. Vurdere den åpne sannsynligheten for mPTP
    1. Vær oppmerksom på at ΔΨ avtar over tid under lekkasje respirasjon. Når ønsket ΔΨ er nådd, tilsett 1 μM CsA (mPTP-hemmer) i reaksjonskammeret for å vurdere åpen sannsynlighet for mPTP ved det spesifikke ΔΨ.
    2. Mål effekten av CsA på O2-forbruk og ΔΨ før og etter CsA-tillegg
    3. Bestem spenningsavhengigheten til mPTP-åpningen ved å variere ΔΨ der CsA legges til i påfølgende eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Typisk O2-forbruk og ΔΨ kurver som genereres i disse eksperimentene, vises (figur 1A,B). Den logaritmiske nedgangen i spenningssignalet med TPP+-kalibrering vises ved starten av hvert eksperiment. Fraværet av dette logaritmiske mønsteret kan tyde på et problem med TPP+ selektiv elektrode. Mitokondrier genererer vanligvis ΔΨ umiddelbart etter tillegg til respiratorisk buffer. ΔΨ kan tolkes fra endringer i TPP+-spenning basert på Nernst-ligningen (logaritmisk forhold mellom [TPP+ inne i mitokondriematrisen] til [ekstern TPP+])30. Vær oppmerksom på at fysiologiske ΔΨ tilnærmer seg 2 μM TPP+-nivået i standardkurven. Spenningsterskler ble dermed definert i forhold til 2 μM TPP+-standarden (betegnet som Δ mV TPP+-spenningssignal).

For eksempel ble "high ΔΨ" definert som ~Δ0 mV (på 2 μM TPP+-nivå), en "mellomliggende ΔΨ" ble satt til ~Δ5 mV (under 2 μM TPP+), og "low ΔΨ" ble satt til ~Δ10 mV (under 2 μM TPP+) (figur 1A,B). I pilotforsøk viste mitokondrier ved Δ0 mV 100% mPTP lukket sannsynlighet, og de på Δ10 mV viste 100% åpen sannsynlighet; representative grafer vises i figur 1A,B. Δ5 mV-terskelen ble dermed vilkårlig valgt som mellomliggende ΔΨ. Legg merke til at i disse forsøkene, ved tilsetning av mitokondrier til reaksjonskammeret, er mitokondrier i tilstand 2 respirasjon der de blir utsatt for overflødig substrat. Mitokondrier stimuleres ikke til å gå inn i tilstand 3 med ADP; Som et resultat, når oligomycin er tilsatt, går de direkte til tilstand 4 oligomycin (lekkasje respirasjon). Som et resultat observeres en merkbar forskjell i oksygenforbruk vanligvis ikke etter oligomycintilskudd, noe som tyder på at ATP-syntasen bidrar minimalt til åndedrett under tilstand 2 (figur 1A, B). For å evaluere den åpne eller lukkede statusen til mPTP, sammenlignes O 2-forbrukshastigheten og membranpotensialet like før og like etter CsA-tillegg (figur 1C). En reduksjon i O 2-forbrukshastigheten og en økning og stabilisering av ΔΨ som svar på CsA indikerer lukking av en åpen mPTP (blokade av poremediert protonlekkasje) (figur 1C, svarte kurver).

Når mPTP er stengt, er det ingen nedgang i O 2-forbrukshastigheten, og ΔΨ øker ikke og stabiliserer seg, men fortsetter å falle (figur 1C, røde kurver). De eksperimentelle resultatene viser lignende lukkede og åpne mPTP-sannsynligheter ved henholdsvis høy og lav ΔΨs i FVB-kontroll og Fmr1 KO-hjertegetokondrier (figur 1D). Disse funnene er i samsvar med kjente spenningssensitive egenskaper til mPTP, hvor poren har en tendens til å være lukket ved høye ΔΨs og åpne ved lave ΔΨs13. Ved hjelp av denne metoden demonstrerte vi på en pålitelig måte den vanlige spenningsavhengigheten til mPTP i begge stammer. Interessant nok, ved mellomliggende ΔΨ (Δ5 mV-terskel), viste Fmr1 KO hjerte mitokondrier økt lukket mPTP-sannsynlighet sammenlignet med FVB-kontroller (figur 1D). Dermed viste Fmr1 KO hjerte mitokondrier et skifte i gating slik at poren krevde en lavere ΔΨ for åpning som skulle utløses. Dette er i samsvar med det forrige funnet at Fmr1 KOs har forhøyede nivåer av CoQ og en relativt lukket mPTP26. Dermed identifiserte metoden en optimal ΔΨ terskel for å løse forskjeller i mPTP-åpning. Det er viktig å definere denne ΔΨ terskelen vil gjøre det mulig å undersøke nærmere hvordan CoQ regulerer mPTP og hvordan CoQ-mangel fører til patologisk poreåpning i FXS.

Figure 1
Figur 1: Påvisning av lavlednings mPTP åpen sannsynlighet. (A, B) Representative kurver for samtidig O2-forbruk (rødt, tallene er rater i nmol av O2 ml-1 min-1 mg protein-1) med ΔΨ (svart, [TPP+]). Piler indikerer tilsetningen av TPP+, mitokondrier, oligomycin og CsA. Høye, mellomliggende og lavspenningsterskler i forhold til kalibreringsnivået på 2 μM TPP+ vises. Tilsetning av CsA ved høye (A) og lave (B) spenningsterskler vises. (C) Forstørret del av O2-forbruk (øvre) og ΔΨ (nedre) kurver i (A) og (B) ved CsA-tillegget, som illustrerer lukket mPTP (rød) ved høye ΔΨ (ufølsomme for CsA) og åpen mPTP (svart) ved lave ΔΨ (følsomme for CsA). (D) Sammendragsgrafer over mPTP åpen og lukket status ved høy, lav og mellomliggende ΔΨs vises for FVB-kontroller (svart) og Fmr1 KOs (grå). Fem til 11 dyr ble evaluert ved hver ΔΨ terskel; p-verdier ble beregnet ved hjelp av en kjikvadrattest, *p < 0,05. Forkortelser: ΔΨ = mitokondrielt membranpotensial; mPTP = mitokondrie permeabilitet overgang pore; TPP + = tetrafenylfosfonium; mitokt = mitokondrier; oligo = oligomycin; CsA = ciklosporin A; ΔΨ = ; KO = knockout. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Komponent MI/BSA* SB/BSA* Diluent for tetthetsgradient RB/BSA*
Mannitol 225 mM - - -
Sukrose 75 mM 250 mM 1 M 200 mM
HEPES 5 mM 5 mM 50 mM 5 mM
EGTA 1 mM 0,1 mM 10 mM -
KCl - - - 25 mM
KH2Po4 - - - 2 mM
MgCl2 - - - 5 mM
pH** 7.4 7.4 - 7.2
BSA*** 0.10% 0.10% - 0.02%
AP5A*** - - - 30 mM

Tabell 1: Buffere og løsninger.
* Filtrer gjennom 0,2 μm filtre
**Juster pH med 3 M kaliumhydroksid etter behov.
Angir bufferkomponenter som tilsetts like før mitokondrieisolasjon.
Forkortelser: MI = mitokondrie isolasjon buffer; SB = sukrosebuffer; RB = Respirasjonsbuffer; BSA = fettsyrefri bovint serumalbumin; HEPES = 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyre; EGTA = etylenglykol-bis (β-aminoetyl eter)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid; KCl = kaliumklorid; KH2PO4 = kaliumdihydrogenfosfat; MgCl2 = magnesiumklorid; AP5A = P1,P5-diadenosin-5' pentaphosphate pentasodium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette dokumentet beskriver en metode for å vurdere den åpne sannsynligheten for mPTP. Spesielt ble spenningsterskelen for mPTP-åpning med lav ledning bestemt ved å vurdere effekten av CsA-hemming på protonlekkasje over en rekke ΔΨs. Ved hjelp av denne teknikken kunne vi identifisere forskjeller i spenningsgambling av mPTP mellom FXS-mus og FVB-kontroller i samsvar med deres forskjeller i vevsspesifikt CoQ-innhold. Kritisk for suksessen til denne metoden er at mitokondrier er nyisolert før bruk og er av god kvalitet. Mitokondrier som enten er skadet under isolasjon eller for gamle, vil ikke kunne generere passende ΔΨ og vil vanligvis være frakoplet. Merk at mens matrise pH vanligvis bidrar til protonmotivkraften, brukes nigericin til å kollapse ΔpH over IMM i disse eksperimentene, som tidligere beskrevet i standardprotokoller som vurderer protonlekkasje29. Derfor, i dette tilfellet, tilsvarer protonmotivkraften ΔΨ, noe som forenkler den eksperimentelle tilnærmingen.

En annen viktig vurdering er at noen av inhibitorene som brukes i åndedrettsblandingen (som rotenon, oligomycin og CsA) er vanskelige å skylle bort mellom eksperimenter fordi de holder seg til plastoverflater i reaksjonskammeret, inkludert de ion-selektive elektrodene. Kammeret må vaskes rutinemessig med etanol og en suspensjon av grovt tilberedt fryse-tint mitokondrier for å "moppe opp" disse inhibitorene fra kammeret og redusere sannsynligheten for hemmeroverbæring som kan påvirke reproduserbarheten av eksperimenter.

Siden mitokondrier må være godt forberedt på å opprettholde sin integritet, er denne metoden ikke egnet til høygjennomstrømningsanalyser. I tillegg er det nødvendig med relativt store mengder mitokondrier for hvert eksperiment. Vanligvis, for P10 dyr, kan nok mitokondrier isoleres fra ett organ for å gjennomføre et enkelt eksperiment. Derfor er det vanligvis ikke mulig å teste forskjellige forhold på samme batch av mitokondrier. Hvis eksperimenter utføres med eldre dyr, er denne begrensningen mindre et problem, gitt den relativt større størrelsen på vev og organer.

Det finnes en rekke godt beskrevne metoder for å studere den åpne sannsynligheten for mPTP i isolerte intakte mitokondrier. Teknikker, som mitokondriematrise hevelse og kalsiumbelastning eller oppbevaringskapasitetsanalyser, utløser nødvendigvis høylednings-PT og tillater dermed ikke studiet av fysiolog lavledningsåpning som er av interesse for disse eksperimentene28. Patch-clamp teknikken gir en kraftig og direkte metode for å studere spenningsavhengigheten til høy- eller lavledningstilstander av mPTP31,32. Det er imidlertid en arbeidskrevende teknikk, hvor bare en enkelt mitokondrie og en enkelt eksperimentell tilstand kan studeres om gangen, noe som gjør komparative studier vanskeligere 32,33.

I tillegg er den ytre mitokondriemembranen vanligvis lysnet, og den indre mitokondriemembranen er vanligvis revnet i patch-klemmemetodene som brukes til isolerte mitokondrier, noe som kan føre til tap av mPTP-regulatoriske faktorer som ikke er nært forbundet med IMM31. Lavledningsåpning av mPTP har også blitt studert ved hjelp av en rekke fluorescensteknikker som vanligvis bruker en tetrametylrhodamin ester (for å vurdere endringer i ΔΨ) enten alene eller i kombinasjon med calcein, hvis intramitochondriale fluorescens er utsatt for koboltslukking når mPTP er åpen 8,34. Men i fluorescensbaserte tilnærminger, da endringer i ΔΨ uttrykkes som relative endringer i fluorescens, tillater tilnærmingen vanligvis ikke presis måling av ΔΨ 8,34.

Denne metoden gir en ny alternativ tilnærming for å vurdere åpningen av mPTP med lav ledning med hensyn til ΔΨ. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan etterforskere studere reguleringen av fysiologiske og patologiske mPTP spenningsskala. Denne teknikken holder også løfte om å bidra til å forstå mPTPs utviklingsrolle i organmodning, da den kan brukes på ulike vev og forskjellige utviklingsstadier. Denne tilnærmingen kan lett brukes til å studere spenningsgambling av mPTP i FXS mus forebrain vev, som tidligere viste redusert CoQ nivåer25. Videre foreslår vi at denne teknikken også kan brukes til å studere hvordan andre midler, endogene eller eksogene, påvirker spenningsgambling av mPTP. Dermed vil det vise seg å være et nyttig verktøy for å utvide forståelsen av mPTPs bidrag til helse og sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes av følgende tilskudd: NIH/NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia University Irving Medical Center Target of Opportunity Provost award til Institutt for anestesiologi (K.K.G.), Society of Pediatric Anesthesia Young Investigator Research Award (K.K.G.) og NIH/NINDS R01NS112706 (R.J.L.G.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Fisher Scientific 15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 PP systems 941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. Fisher Scientific 14-170-11B to modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free Sigma A7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm World Precision Inst. LLC DRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-Tips World Precision Inst. LLC KWIK-2  ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA) Sigma 324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME FXS mice, Fmr1 KO 
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME FVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk Cole-Parmer EW-07938-30 microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle Cole-Parmer EW-07938-02 microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete PP systems OXYTHERM+R oxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma 1374248
Mannitol Sigma M9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) Sigma D4022-10MG
Percoll Sigma P1644 medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl) Sigma P3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma 5.43841
Sucrose Sigma S0389
TPP+ Electrode Tips (3) World Precision Inst. LLC TIPTPP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rasola, A., Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).
  2. Szabó, I., Zoratti, M. The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).
  3. Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., Kühlbrandt, W. Molecular Biology of the Cell. Alberts, B., et al. 14, Garland Science. Chapter 14 767-830 (2002).
  4. Perez, M. J., Quintanilla, R. A. Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore. Developmental Biology. 426 (1), 1-7 (2017).
  5. Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).
  6. Javadov, S., Kuznetsov, A. Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d. Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).
  7. Dorn, G. W. Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure. Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).
  8. Boyman, L., et al. Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events. Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).
  9. Hom, J. R., et al. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation. Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).
  10. Hou, Y., et al. Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development. Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).
  11. Elrod, J. W., et al. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).
  12. Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).
  13. Bernardi, P. Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).
  14. Petronilli, V., et al. The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).
  15. Giorgio, V., et al. Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition. European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).
  16. Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).
  17. Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons. Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).
  18. Karch, J., et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD. Science Advances. 5 (8), (2019).
  19. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  20. Antoniel, M., et al. The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH. European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).
  21. Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).
  22. Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury. Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).
  23. Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore. British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).
  24. Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).
  25. Griffiths, K. K., et al. Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).
  26. Barajas, M., et al. The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart. Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).
  27. Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 11 187-196 (2018).
  28. Carraro, M., Bernardi, P. Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition. Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).
  29. Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 9 157-170 (2018).
  30. Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 6 109-119 (2018).
  31. Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1862 (3), 148357 (2021).
  32. Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).
  33. Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques. Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).
  34. Petronilli, V., et al. Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence. Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).

Tags

Biologi utgave 184
Vurdering av åpen sannsynlighet for mitokondriell permeabilitetsovergang pore i innstillingen av koenzym Q overskudd
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Griffiths, K. K., Wang, A., Levy, R. … More

Griffiths, K. K., Wang, A., Levy, R. J. Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess. J. Vis. Exp. (184), e63646, doi:10.3791/63646 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter