Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mitokondriyal Geçirgenlik Geçiş Gözünün Koenzim Q Fazlalığı Ortamında Açık Olasılığının Değerlendirilmesi

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/63646
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Anesthesiology, Columbia University Medical Center

Summary

Bu yöntem, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin düşük iletkenlikli proton sızıntısına katkısından, vahşi tip kontrolüne kıyasla artmış kardiyomiyosit mitokondriyal koenzim Q içeriğine sahip yenidoğan kırılgan X sendromlu farelerde gözenek açılması için voltaj eşiğini belirlemek için kullanır.

Abstract

Mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözenekleri (mPTP), sağlık ve hastalıkta önemli olan voltaj kapılı, seçici olmayan, iç mitokondriyal membran (IMM) mega kanalıdır. mPTP, düşük iletkenlikli açıklık sırasında IMM boyunca protonların sızmasına aracılık eder ve özellikle siklosporin A (CsA) tarafından inhibe edilir. Koenzim Q (CoQ), mPTP'nin bir düzenleyicisidir ve CoQ içeriğinde dokuya özgü farklılıklar ve kırılgan X sendromunun (FXS, Fmr1 nakavtı) yenidoğan bir fare modelinde ön beyin ve kalp mitokondrisinde mPTP'nin açık olasılığı bulunmuştur. Bu mutant suşta mPTP açıklığı için voltaj eşiğini belirlemek için bir teknik geliştirdik ve mPTP'nin proton sızıntı kanalı olarak rolünden yararlandık.

Bunu yapmak için, oksijen tüketimi ve membran potansiyeli (ΔΨ), polarografi ve sızıntı solunumu sırasında bir tetrafenilfosfonyum (TPP +) iyon seçici elektrot kullanılarak izole mitokondride eşzamanlı olarak ölçülmüştür. mPTP açıklığı eşiği, belirli membran potansiyellerinde proton sızıntısının CsA aracılı inhibisyonunun başlangıcı ile belirlendi. Bu yaklaşım kullanılarak, mPTP'nin voltaj geçişindeki farklılıklar, CoQ fazlalığı bağlamında kesin olarak tanımlanmıştır. Bu yeni teknik, mPTP'nin düşük iletkenlikli açılmasının fizyolojik ve patolojik düzenlemesinin anlaşılmasını arttırmak için gelecekteki araştırmalara izin verecektir.

Introduction

mPTP, geçirgenlik geçişine (PT) aracılık eder, böylece İBB aniden küçük moleküllere geçirgen hale gelir ve 1,2'yi çözündürür. Bu çarpıcı fenomen, oksidatif fosforilasyon için gerekli elektrokimyasal gradyanı belirlemek için temel olan İBB'nin karakteristik geçirimsizliğinden belirgin bir sapmadır3. PT, diğer mitokondriyal taşıma mekanizmalarının aksine, 1.5 kDa 4,5'e kadar bir molekül aralığının geçişine izin veren, yüksek iletkenlikli, spesifik olmayan ve seçici olmayan bir işlemdir. mPTP, açıklığı ΔΨ, ATP üretimi, kalsiyum homeostazı, reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi ve hücre canlılığı4'ü değiştiren IMM içindeki voltaj kapılı bir kanaldır.

mPTP'nin patolojik aşırılıkta, kontrolsüz ve uzun süreli yüksek iletkenlikli açıklığı, elektrokimyasal gradyanın çökmesine, matris şişmesine, matriks piridin nükleotitlerinin tükenmesine, dış zar rüptürüne, membranlar arası proteinlerin salınmasına (sitokrom c dahil) ve nihayetinde hücre ölümüne yol açar 4,6. Bu patolojik mPTP açıklığı kardiyak iskemi-reperfüzyon hasarı, kalp yetmezliği, travmatik beyin hasarı, çeşitli nörodejeneratif hastalıklar ve diyabet 1,7 ile ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, düşük iletkenlikli mPTP açıklığı doğada fizyolojiktir ve yüksek iletkenlikli açıklığın aksine, derin depolarizasyona veya mitokondriyal şişmeye yol açmaz4.

Gözeneklerin düşük iletkenlik açıklığı, geçirgenliği ~ 300 Da ile sınırlar, protonların ATP sentezinden bağımsız geçişine izin verir ve fizyolojik proton sızıntısı5'in potansiyel bir kaynağıdır. Fizyolojik mPTP açıklığı, ΔΨ'de kontrollü bir düşüşe neden olur, solunum taşıma zinciri boyunca elektron akışını arttırır ve kısa bir süperoksit patlaması veya parlaması ile sonuçlanır, bu da ROS sinyallemesine katkıda bulunur8. Bu tür geçici mPTP açıklığının düzenlenmesi kalsiyum homeostazı ve normal hücresel gelişim ve olgunlaşma 4,9,10,11 için önemlidir. Örneğin, gelişmekte olan nöronlarda geçici gözenek açıklığı farklılaşmayı tetiklerken, mPTP'nin kapanması olgunlaşmamış kardiyomiyositlerde olgunlaşmayı indükler 4,5.

mPTP'nin sağlık ve hastalıktaki fonksiyonel önemi iyi kurulmuş olmasına rağmen, kesin moleküler kimliği tartışılmaya devam etmektedir. mPTP'nin moleküler yapısı ve işlevi konusundaki ilerleme, başka yerlerde kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmiştir12. Kısaca, şu anda, mPTP'nin yüksek ve düşük iletkenlik durumlarının, farklı varlıklar tarafından aracılık edildiği varsayılmıştır12. Önde gelen adaylar, sırasıyla yüksek ve düşük iletkenlik modları için F1 / F0 ATP sentaz (ATP sentaz) ve adenin nükleotid taşıyıcısıdır (ANT), 12.

mPTP'nin gözenek oluşturan bileşeninin tam kimliği konusunda fikir birliği olmamasına rağmen, bazı temel özellikler detaylandırılmıştır. mPTP'nin iyi bilinen bir özelliği, elektrokimyasal gradyan tarafından düzenlenmesidir, böylece İBB'nin depolarizasyonu gözenek açılmasına yol açar13. Önceki çalışmalar, vicinal tiol gruplarının redoks durumunun, mPTP'nin voltaj geçidini değiştirdiğini, böylece oksidasyonun gözenekleri nispeten daha yüksek ΔΨ'lerde açtığını ve tiol grubu azalmasının kapalı mPTP olasılığı14 ile sonuçlandığını göstermiştir. Bununla birlikte, proteinli voltaj sensörünün kimliği bilinmemektedir.

Gözeneklerin açık olasılığını modüle eden çeşitli küçük moleküller tanımlanmıştır. Örneğin, mPTP kalsiyum, inorganik fosfat, yağ asitleri ve ROS ile açılmaya teşvik edilebilir ve adenin nükleotidleri (özellikle ADP), magnezyum, protonlar ve CsA 5,12 tarafından inhibe edilebilir. Bu düzenleyicilerin bazılarının etki mekanizmaları açıklığa kavuşturulmuştur. Mitokondriyal kalsiyum, ATP sentaz15'in β alt birimine bağlanarak mPTP açılımını en azından kısmen tetikler. ROS, ADP'ye olan afinitesini azaltarak ve en iyi çalışılmış proteinli mPTP aktivatörü16 olan siklofilin D (CypD) için afinitesini artırarak mPTP'yi aktive edebilir. mPTP'nin inorganik fosfat ve yağ asitleri tarafından aktivasyon mekanizması daha az açıktır. Endojen inhibitörlere gelince, ADP'nin ANT veya ATP sentazına bağlanarak mPTP'yi inhibe ettiği düşünülürken, magnezyum kalsiyumu bağlanma bölgesinden 15,17,18,19 yerinden oynatarak inhibitör etkisini gösterir.

Düşük pH, ATP sentaz 12,20,21'in düzenleyici oligomisin duyarlılığı veren protein (OSCP) alt biriminin histidin112'sini protonlayarak mPTP açılmasını inhibe eder. mPTP'nin prototipik farmakolojik inhibitörü CsA, CypD'yi bağlayarak ve OSCP22,23 ile ilişkisini önleyerek etki eder. Önceki çalışmalar ayrıca çeşitli CoQ analoglarının mPTP ile etkileşime girdiğini, onu inhibe ettiğini veya24'ü aktive ettiğini göstermiştir. Son çalışmalarda, patolojik olarak açık bir mPTP, aşırı proton sızıntısı ve yenidoğan FXS fare yavrularının ön beyin mitokondrisinde CoQ eksikliğine bağlı olarak verimsiz oksidatif fosforilasyonun kanıtlarını bulduk25.

Gözeneklerin eksojen CoQ ile kapatılması patolojik proton sızıntısını bloke etti ve dendritik dikenlerin morfolojik olgunluğunu indükledi25. İlginç bir şekilde, aynı hayvanlarda, FXS kardiyomiyositleri aşırı CoQ seviyelerine sahipti ve wildtype kontrolleri26'ya kıyasla mPTP olasılığını kapattı. CoQ seviyelerindeki bu dokuya özgü farklılıkların nedeni bilinmemekle birlikte, bulgular endojen CoQ'nun muhtemelen mPTP'nin önemli bir düzenleyicisi olduğu kavramını vurgulamaktadır. Bununla birlikte, bilgimizde büyük bir boşluk vardır, çünkü mPTP'nin CoQ aracılı inhibisyon mekanizması bilinmemektedir.

mPTP'nin düzenlenmesi, hücre sinyalizasyonu ve sağkalımının kritik bir belirleyicisidir4. Bu nedenle, mitokondri içinde mPTP açıklığının saptanması, spesifik patofizyolojik mekanizmalar göz önüne alındığında anahtardır. Tipik olarak, yüksek iletkenlikli gözenek açma eşiği, geçirgenlik geçişini tetiklemek için kalsiyum kullanılarak belirlenir. Bu tür kalsiyum yüklemesi, membran potansiyelinin çökmesine, oksidatif fosforilasyonun hızlı bir şekilde ayrılmasına ve mitokondriyal şişmeye yol açar27,28. Düşük iletkenlikli mPTP açıklığını kendi başına indüklemeden in situ olarak tespit etmek için bir yöntem geliştirmeye çalıştık.

Yaklaşım, mPTP'nin proton sızıntı kanalı olarak rolünden yararlanır. Bunu yapmak için, Clark-Tipi ve TPP + iyon seçici elektrotlar, sızıntı solunumu sırasında izole mitokondride sırasıyla oksijen tüketimini ve membran potansiyelini aynı anda ölçmek için kullanıldı29. mPTP açıklığı eşiği, belirli membran potansiyellerinde proton sızıntısının CsA aracılı inhibisyonunun başlangıcı ile belirlendi. Bu yaklaşım kullanılarak, CoQ fazlalığı bağlamında mPTP'nin voltaj geçidindeki farklılıklar kesin olarak tanımlanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Columbia Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi açıklanan tüm yöntemler için onay alınmıştır. Bu çalışma için model sistemleri olarak kullanılan FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyr c-ch Fmr1 tm1Cgr/J) ve kontrol (FVB) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) fareleri ticari olarak edinilmiştir (bkz. Her deney grubunda beş ila on bir hayvan kullanıldı. Doğum sonrası gün 10 (P10) fareleri, insan bebekliğinde bir zaman noktasını modellemek için kullanıldı.

1. Fare kalbinden mitokondriyal izolasyon

  1. Tablo 1'de açıklandığı gibi mitokondriyal izolasyon ve solunum deneyleri için tamponlar hazırlayın. Önceden yapılmışsa 4 ° C'de saklayın.
    1. %15 yoğunluklu gradyan ortamı hazırlayın: ticari yoğunluk gradyan ortamını yoğunluk gradyanı seyreltici ile %80 hacim/hacme (v/v) kadar seyreltin. Mitokondriyal izolasyon tamponu (MI)/sığır serum albümini (BSA) ekleyerek %80 yoğunluk gradyan ortamı %15 v/v daha da seyreltin.
  2. Mitokondrileri bu deneyler için taze, dondurulmamış dokudan izole edin ve hazırlık gününde, tipik olarak beş saat içinde kullanın26. Tüm izolasyon adımlarını buz üzerinde gerçekleştirin.
    1. Farenin kafasını kesin ve kalbi tüketin. Hemen 1-2 kez Petri kabında buz gibi soğuk MI / BSA ile yıkayın. Atriyumu kesin ve dokuyu kesin.
    2. Kıyılmış kalp dokusunu 1 mL MI / BSA içeren bir cam-cam homojenizatöre aktarın. Daha gevşek (A) bir havane (10 vuruş), daha sonra daha sıkı bir (B) havaneli (10 vuruş) ile homojenize edin.
    3. Nükleer ve hücresel kalıntıları gidermek için homojenatı 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1.100 × g'da santrifüj yapın.
    4. Süpernatantı kabarık peletlere dokunmadan nazikçe alın ve bir santrifüj tüpünde 700 μL% 15 yoğunluk gradyan ortamının üzerine dikkatlice yerleştirin. 4 °C'de 15 dakika boyunca 18.500 × g'de santrifüj.
    5. Peleti 1 mL sakkaroz tamponu (SB) / BSA içinde yeniden askıya alın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10.000 × g'de santrifüj yapın.
    6. Süper natantı tamamen çıkarın ve atın. SB/BSA'daki peleti 55 μL'lik son hacme kadar yeniden askıya alın.
    7. Biskinkoninik asit (BCA) protein testi gibi standart bir tahlil kullanarak mitokondriyal protein içeriğini sayısallaştırın.

2. Mitokondriyal oksijen (O2) tüketimi ve ΔΨ

  1. Oksijen elektrodu montajı ve kalibrasyonu
    1. Oksijen elektrodunu üreticinin talimatlarına göre kurun ve kalibre edin ( Malzeme Tablosuna bakın).
      1. Elektrot diskinin kubbesinin üzerine %50 damla potasyum klorür (KCl) elektrolit çözeltisi yerleştirin.
      2. Elektrolit damlasının üzerine sağlanan politetrafloroetilen (PTFE) membranın biraz daha büyük bir parçası ile kaplanmış küçük bir parça ~2 cm2 sigara kağıdı ara parçası yerleştirin.
      3. Sağlanan aplikatör aletini kullanarak, küçük elektrot diski O-ring'i elektrotun kubbesi üzerine itin.
        NOT: Hava kabarcığı olmadığından ve membranın pürüzsüz olduğundan emin olun.
    2. Rezervuarı elektrolit çözeltisi ile iyice doldurun.
    3. Daha büyük O-ring'i elektrot diskinin etrafındaki girintiye iyice yerleştirin.
    4. Diski elektrot odasına takın ve kontrol ünitesine bağlayın.
    5. Reaksiyon odasına 2 mL hava doymuş deiyonize su ve odaya PTFE kaplı mıknatıs ekleyin.
    6. Odayı kontrol ünitesinin arkasına bağlayın.
    7. Sıcaklığı 37 °C'ye ve karıştırma hızını 100'e ayarlayın.
    8. Kalibrasyona başlamadan önce sistem sıcaklığının dengelenmesi için 10 dakika bekleyin.
    9. Kalibrasyon sekmesi altında, sıvı faz kalibrasyonu gerçekleştirmek için Sıvı Faz Kalibrasyonu'nu seçin. Sıcaklığın 37 °C'ye ayarlandığını, karıştırma hızının 100 olduğunu ve basıncın atmosferik basınca (101,32 kPa) ayarlandığını onaylayın.
    10. Tamam'a basın ve sinyalin plato yapmasını bekleyin.
    11. Bir platoya ulaşıldığında, Tamam'a basın.
    12. Az miktarda (~20 mg) sodyum ditionit ekleyerek odaya sıfır O2 oluşturun.
    13. Tamam'a basın ve sinyalin plato yapmasını bekleyin.
    14. Bir platoya ulaşıldığında, kalibrasyonu kabul etmek için Kaydet'e basın.
  2. TPP + seçici elektrot montajı
    1. TPP + seçici elektrot ucunu, sağlanan şırıngayı ve esnek iğneyi kullanarak 10 mM TPP çözeltisi ile doldurun ve hava kabarcıklarını önlemeye özen gösterin.
    2. Referans elektrot ve elektrot tutucu dahil olmak üzere TPP + seçici elektrot aparatını üreticinin talimatlarına göre monte edin (bkz.
    3. Kısacası, elektrot tutucu kapağını gevşetin ve dahili referans elektrodunu TPP + ucuna yerleştirin. Ucu sabitlemek için kapağı sıkın. Birlikte verilen kabloyu elektrot tutucusuna ve kontrol kutusunun yardımcı portuna bağlayın.
    4. TPP + seçici elektrot ve referans elektrotlarını, iyon seçici elektrotlar için uyarlanmış piston tertibatına yerleştirin. Referans elektrodunu kontrol kutusunun referans portuna bağlayın.
    5. TPP + seçici ve referans elektrotlarını, iyon seçici elektrotlar için uyarlanmış piston tertibatına yerleştirin.
  3. Reaksiyon odası hazırlığı
    1. Reaksiyon karışımını reaksiyon odasına ekleyin: 10 mM süksinat (kompleks II substrat), 5 μM rotenon (kompleks I inhibitörü), 80 ng mL−1 nigerisin (IMM'de pH gradyanını çökertmek için), 2.5 μg mL-1 oligomisin (durum 4 solunumu indüklemek için) ve solunum tamponu (RB) / BSA reaksiyon tamponu 1 mL'lik son hacme kadar. Odaya hava kabarcıkları sokmaktan kaçınmaya dikkat edin.
    2. TPP+seçici ve referans elektrodu yerinde olacak şekilde uyarlanmış piston tertibatı ile odayı kapatın. Kayda başlamak için GİT'i seçin. Oda kapatıldıktan sonra, iğne uzunluğunu ayarlamak için plastik boru ile modifiye edilmiş ayrı mikroşırıngalar kullanarak doğrudan reaksiyon çözeltisine ek reaktifler sürün.
  4. TPP+ kalibrasyonu
    1. Kararlı bir voltaj sinyali elde edildikten sonra, 3 μM'lik bir nihai konsantrasyona 0,1 mM'lik bir TPP çözeltisinin 1 μM artışını ekleyerek TPP + seçici elektrodu kalibre edin. Her eklemede TPP + voltaj sinyalinde logaritmik bir düşüş olduğunu gözlemleyin.
      NOT: Her deneyin başında TPP + seçici elektrodu kalibre edin.
  5. Veri toplama
    1. O2 ve TPP + izlerinin stabilize olmasına izin verin ve piston tertibatındaki reaktif ekleme portu aracılığıyla reaksiyon odasına 100 μg taze hazırlanmış kardiyomiyosit mitokondri ekleyin ve 0.1 mg mL-1'lik son konsantrasyona ekleyin. Mitokondri enerjilendirildikçe veO2'yi tüketirken odadakiO2 seviyelerindeki düşüşü ve mitokondri bir membran potansiyeli oluştururken ve çözeltiden TPP + 'yı alırken TPP + voltaj sinyalindeki ani artışı gözlemleyin.
    2. Durum 4 solunumu indüklemek için 2.5 μg mL-1 oligomisin ekleyin.
      NOT: O2 tüketim oranları artık proton sızıntısı solunumunun oranını temsil edecektir. Oligomisin, alternatif olarak TPP + 'dan önce reaksiyon odasına eklenebilir.
  6. mPTP'nin açık olasılığını değerlendirme
    1. Sızıntı solunumu sırasında ΔΨ'nin zamanla azaldığını gözlemleyin. İstenilen ΔΨ'ye ulaşıldıktan sonra, mPTP'nin bu spesifik ΔΨ'deki açık olasılığını değerlendirmek için reaksiyon odasına 1 μM CsA (mPTP inhibitörü) ekleyin.
    2. CsA'nınO2 tüketimi ve ΔΨ üzerindeki etkisini CsA ilavesinden önce ve sonra ölçün
    3. Ardışık deneylerde CsA'nın eklendiği ΔΨ'yi değiştirerek mPTP açıklığının voltaj bağımlılığını belirleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu deneylerde üretilen tipikO2 tüketimi ve ΔΨ eğrileri gösterilmiştir (Şekil 1A,B). TPP + kalibrasyonu ile voltaj sinyalindeki logaritmik düşüş, her deneyin başında gösterilir. Bu logaritmik modelin yokluğu, TPP + seçici elektrot ile ilgili bir sorun olduğunu düşündürebilir. Mitokondri tipik olarak solunum tamponuna eklendikten hemen sonra ΔΨ üretir. ΔΨ, Nernst denklemine dayanan TPP + voltajındaki değişikliklerden yorumlanabilir (mitokondriyal matris içindeki [TPP + 'nın logaritmik oranı] ile [harici TPP +])30. Fizyolojik ΔΨ'nin standart eğrinin 2 μM TPP+ seviyesine yaklaştığını unutmayın. Böylece voltaj eşikleri 2 μM TPP + standardına göre tanımlanmıştır (Δ mV TPP + voltaj sinyali olarak gösterilir).

Örneğin, "yüksek ΔΨ" ~Δ0 mV (2 μM TPP+ seviyesinde), "ara ΔΨ" ~Δ5 mV (2 μM TPP+'nın altında) ve "düşük ΔΨ" ~Δ10 mV (2 μM TPP+'nın altında) olarak tanımlanmıştır (Şekil 1A,B). Pilot deneylerde, Δ0 mV'deki mitokondri% 100 mPTP kapalı olasılık ve Δ10 mV'dakiler% 100 açık olasılık sergiledi; temsili grafikler Şekil 1A,B'de gösterilmiştir. Δ5 mV eşiği bu nedenle keyfi olarak ara ΔΨ olarak seçildi. Bu deneylerde, reaksiyon odasına mitokondri eklenmesi üzerine, mitokondrilerin aşırı substrata maruz kaldıkları durum 2 solunumunda olduğunu unutmayın. Mitokondri, ADP ile durum 3'e girmek için uyarılmaz; Sonuç olarak, oligomisin eklendikten sonra, doğrudan durum 4 oligomisin'e (sızıntı solunumu) geçerler. Sonuç olarak, oligomisin ilavesinden sonra oksijen tüketiminde kayda değer bir fark tipik olarak gözlenmez, bu da ATP sentazın durum 2 sırasında solunuma minimum düzeyde katkıda bulunduğunu düşündürmektedir (Şekil 1A, B). mPTP'nin açık veya kapalı durumunu değerlendirmek için,O2 tüketim hızı ve CsA ilavesinden hemen önce ve hemen sonra membran potansiyeli karşılaştırılır (Şekil 1C). O2 tüketim oranındaki bir düşüş ve CsA'ya yanıt olarak ΔΨ'nin artması ve stabilizasyonu, açık bir mPTP'nin (gözenek aracılı proton sızıntısının blokajı) kapandığını gösterir (Şekil 1C, siyah eğriler).

mPTP kapatıldığında,O2 tüketim oranında bir azalma olmaz ve ΔΨ artmaz ve stabilize olmaz, ancak düşmeye devam eder (Şekil 1C, kırmızı eğriler). Deneysel sonuçlar, FVB kontrolü ve Fmr1 KO kardiyak mitokondride sırasıyla yüksek ve düşük ΔΨ'lerde benzer kapalı ve açık mPTP olasılıklarını göstermektedir (Şekil 1D). Bu bulgular, gözeneklerin yüksek ΔΨ'lerde kapanma ve düşük ΔΨ'lerde13'te açılma eğiliminde olduğu mPTP'nin bilinen voltaja duyarlı özellikleri ile tutarlıdır. Bu nedenle, bu yöntemi kullanarak, her iki suşta da mPTP'nin olağan voltaj bağımlılığını güvenilir bir şekilde gösterdik. İlginç bir şekilde, ara ΔΨ'de (Δ5 mV eşiği), Fmr1 KO kardiyak mitokondri, FVB kontrollerine kıyasla kapalı mPTP olasılığının arttığını göstermiştir (Şekil 1D). Böylece, Fmr1 KO kardiyak mitokondri, geçişte bir kayma gösterdi, öyle ki gözenek açıklığın tetiklenmesi için daha düşük bir ΔΨ gerektirdi. Bu, Fmr1 KO'ların yüksek CoQ seviyelerine ve nispeten kapalı bir mPTP 26'ya sahip olduğu önceki bulgu iletutarlıdır. Böylece, yöntem mPTP açıklığındaki farklılıkları çözmek için optimal bir ΔΨ eşiği tanımladı. Önemli olarak, bu ΔΨ eşiğinin tanımlanması, CoQ'nun mPTP'yi nasıl düzenlediğini ve CoQ eksikliğinin FXS'de patolojik gözenek açılmasına nasıl yol açtığını daha iyi anlamak için daha fazla araştırmaya olanak sağlayacaktır.

Figure 1
Şekil 1: Düşük iletkenlikli mPTP açık olasılığının tespiti. (A, B) ΔΨ (siyah, [TPP +]) ile eşzamanlıO2 tüketiminin temsili eğrileri (kırmızı, sayılar O2 mL-1 dak-1 mg protein-1'in nmol cinsinden oranlarıdır). Oklar TPP +, mitokondri, oligomisin ve CsA'nın eklendiğini gösterir. 2 μM TPP+ kalibrasyon seviyesine göre yüksek, orta ve düşük voltaj eşikleri gösterilmiştir. Yüksek (A) ve düşük (B) voltaj eşiklerinde CsA ilavesi gösterilmiştir. (C) CsA ilavesi noktasında (A) ve (B)'dekiO2 tüketiminin (üst) ve ΔΨ (alt) eğrilerinin büyütülmüş bölümü, yüksek ΔΨ'de kapalı mPTP'yi (kırmızı) (CsA'ya duyarsız) ve düşük ΔΨ'de (CsA'ya duyarlı) açık mPTP'yi (siyah) gösterir. (D) FVB kontrolleri (siyah) ve Fmr1 KO'lar (gri) için yüksek, düşük ve orta ΔΨ'lerde mPTP açık ve kapalı durumunun özet grafikleri gösterilmiştir. Her ΔΨ eşiğinde beş ila 11 hayvan değerlendirildi; p değerleri ki-kare testi kullanılarak hesaplandı, *p 0.05 <. Kısaltmalar: ΔΨ = mitokondriyal membran potansiyeli; mPTP = mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözenekleri; TPP + = tetrafenilfosfonyum; mito = mitokondri; oligo = oligomisin; CsA = siklosporin A; ΔΨ = ; KO = nakavt. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Parça MI/BSA* SB/Lisans* Yoğunluk Gradyanı Seyreltici RB/BSA*
Mannitol 225 mM - - -
Sakaroz 75 mM 250 mM 1 milyon 200 mM
HEPES 5 mM 5 mM 50 mM 5 mM
cesaret 1 mM 0,1 mM 10 mM -
Kartal - - - 25 mM
KH2PO4 - - - 2 mM
MgCl2 - - - 5 mM
pH** 7.4 7.4 - 7.2
Lisans *** 0.10% 0.10% - 0.02%
AP5A*** - - - 30 mM

Tablo 1: Tamponlar ve çözeltiler.
* 0.2 μm filtrelerden süzün
**PH'ı 3 M potasyum hidroksit ile gerektiği gibi ayarlayın.
Mitokondriyal izolasyondan hemen önce eklenen tampon bileşenlerini gösterir.
Kısaltmalar: MI = mitokondriyal izolasyon tamponu; SB = sakkaroz tamponu; RB = Solunum tamponu; BSA = yağ asidi içermeyen sığır serum albümini; HEPES = 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit; EGTA = etilen glikol-bis (β-aminoetil eter)-N,N,N′,N′-tetraasetik asit; KCl = potasyum klorür; KH2PO4 = potasyum dihidrojen fosfat; MgCl2 = magnezyum klorür; AP5A = P1,P5-diadenosin-5' pentafosfat pentasodyum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda mPTP'nin açık olasılığını değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Spesifik olarak, düşük iletkenlikli mPTP açıklığı için voltaj eşiği, CsA inhibisyonunun bir dizi ΔΨ üzerindeki proton sızıntısı üzerindeki etkisinin değerlendirilmesiyle belirlendi. Bu tekniği kullanarak, FXS fareleri ve FVB kontrolleri arasındaki mPTP'nin voltaj geçişindeki farklılıkları, dokuya özgü CoQ içeriğindeki farklılıklarıyla tutarlı olarak tanımlayabiliriz. Bu metodolojinin başarısı için kritik olan, mitokondrilerin kullanımdan önce taze olarak izole edilmesi ve iyi kalitede olmasıdır. İzolasyon sırasında hasar gören veya çok eski olan mitokondriler, uygun ΔΨ üretemez ve tipik olarak ayrılır. Matris pH'ı tipik olarak proton tahrik kuvvetine katkıda bulunurken, nijerisin bu deneylerde IMM boyunca ΔpH'ı çökertmek için kullanıldığını, daha önce proton sızıntısı29'u değerlendiren standart protokollerde açıklandığı gibi kullanıldığını unutmayın. Bu nedenle, bu durumda, proton itici kuvveti, deneysel yaklaşımı basitleştiren ΔΨ'ye eşdeğerdir.

Bir diğer önemli husus, solunum karışımında kullanılan bazı inhibitörlerin (rotenon, oligomisin ve CsA gibi) deneyler arasında durulanmasının zor olmasıdır, çünkü iyon seçici elektrotlar da dahil olmak üzere reaksiyon odasının plastik yüzeylerine yapışırlar. Oda, bu inhibitörleri odadan "temizlemek" ve deneylerin tekrarlanabilirliğini etkileyebilecek inhibitör taşıma olasılığını azaltmak için rutin olarak etanol ve kabaca hazırlanmış dondurularak çözülmüş mitokondri süspansiyonu ile yıkanmalıdır.

Mitokondrilerin bütünlüklerini korumak için taze olarak hazırlanması gerektiğinden, bu yöntem yüksek verimli analizlere uygun değildir. Ek olarak, her deney için nispeten büyük miktarlarda mitokondriye ihtiyaç vardır. Tipik olarak, P10 hayvanları için, tek bir deney yapmak için bir organdan yeterli mitokondri izole edilebilir. Bu nedenle, aynı mitokondri partisi üzerinde farklı koşulların test edilmesi genellikle mümkün değildir. Deneyler yaşlı hayvanlarla yapılırsa, nispeten daha büyük doku ve organ boyutları göz önüne alındığında, bu sınırlama daha az sorundur.

İzole edilmiş bozulmamış mitokondride mPTP'nin açık olasılığını incelemek için iyi tanımlanmış bir dizi yöntem mevcuttur. Mitokondriyal matriks şişmesi ve kalsiyum yükleme veya tutma kapasitesi testleri gibi teknikler mutlaka yüksek iletkenlikli PT'yi tetikler ve bu nedenle bu deneylerde ilgi çekici olan fizyolojik düşük iletkenlik açıklığının incelenmesine izin vermez28. Yama kelepçesi tekniği, mPTP 31,32'nin yüksek veya düşük iletkenlik durumlarının voltaj bağımlılığını incelemek için güçlü ve doğrudan bir yöntem sağlar. Bununla birlikte, bir seferde yalnızca tek bir mitokondri ve tek bir deneysel koşulun çalışılabildiği zahmetli bir tekniktir, bu da karşılaştırmalı çalışmaları daha zor hale getirir32,33.

Ek olarak, dış mitokondriyal membran tipik olarak lize edilir ve iç mitokondriyal membran tipik olarak izole mitokondri için kullanılan yama-kelepçe yöntemlerinde yırtılır, bu da IMM31 ile yakından ilişkili olmayan mPTP düzenleyici faktörlerin kaybına neden olabilir. mPTP'nin düşük iletkenlikli açıklığı, tipik olarak bir tetrametilrodamin esteri (ΔΨ'deki değişiklikleri değerlendirmek için) tek başına veya kalsein ile kombinasyon halinde, intramitokondriyal floresansı mPTP açık olduğunda kobalt söndürmeye duyarlı olan çeşitli floresan teknikleri kullanılarak da incelenmiştir 8,34. Bununla birlikte, floresan tabanlı yaklaşımlarda, ΔΨ'deki değişiklikler floresandaki göreceli değişiklikler olarak ifade edildiğinden, yaklaşım tipik olarak ΔΨ 8,34'ün kesin ölçümüne izin vermez.

Bu yöntem, mPTP'nin ΔΨ ile ilgili olarak düşük iletkenlik açıklığını değerlendirmek için yeni bir alternatif yaklaşım sunmaktadır. Bu yaklaşımı kullanarak, araştırmacılar fizyolojik ve patolojik mPTP voltaj geçişinin düzenlenmesini inceleyebilirler. Bu teknik aynı zamanda mPTP'nin organ olgunlaşmasındaki gelişimsel rolünü anlamaya yardımcı olmayı vaat etmektedir, çünkü çeşitli dokulara ve farklı gelişim aşamalarına uygulanabilir. Bu yaklaşım, daha önce azalmış CoQ seviyeleri25 sergileyen FXS fare ön beyin dokusundaki mPTP'nin voltaj geçişini incelemek için kolayca uygulanabilir. Ayrıca, bu tekniğin, endojen veya eksojen diğer ajanların mPTP'nin voltaj geçidini nasıl etkilediğini incelemek için de kullanılabileceğini öneriyoruz. Böylece, mPTP'nin sağlık ve hastalığa katkısının anlaşılmasını genişletmek için yararlı bir araç olduğu kanıtlanacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklenmektedir: NIH / NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia Üniversitesi Irving Tıp Merkezi Anesteziyoloji Bölümü'ne Fırsat Provost Hedefi Ödülü (K.K.G.), Pediatrik Anestezi Derneği Genç Araştırmacı Araştırma Ödülü (K.K.G.) ve NIH / NINDS R01NS112706 (R.J.L.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Fisher Scientific 15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 PP systems 941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. Fisher Scientific 14-170-11B to modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free Sigma A7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm World Precision Inst. LLC DRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-Tips World Precision Inst. LLC KWIK-2  ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA) Sigma 324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME FXS mice, Fmr1 KO 
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME FVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk Cole-Parmer EW-07938-30 microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle Cole-Parmer EW-07938-02 microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete PP systems OXYTHERM+R oxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma 1374248
Mannitol Sigma M9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) Sigma D4022-10MG
Percoll Sigma P1644 medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl) Sigma P3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma 5.43841
Sucrose Sigma S0389
TPP+ Electrode Tips (3) World Precision Inst. LLC TIPTPP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rasola, A., Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).
  2. Szabó, I., Zoratti, M. The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).
  3. Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., Kühlbrandt, W. Molecular Biology of the Cell. Alberts, B., et al. 14, Garland Science. Chapter 14 767-830 (2002).
  4. Perez, M. J., Quintanilla, R. A. Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore. Developmental Biology. 426 (1), 1-7 (2017).
  5. Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).
  6. Javadov, S., Kuznetsov, A. Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d. Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).
  7. Dorn, G. W. Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure. Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).
  8. Boyman, L., et al. Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events. Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).
  9. Hom, J. R., et al. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation. Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).
  10. Hou, Y., et al. Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development. Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).
  11. Elrod, J. W., et al. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).
  12. Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).
  13. Bernardi, P. Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).
  14. Petronilli, V., et al. The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).
  15. Giorgio, V., et al. Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition. European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).
  16. Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).
  17. Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons. Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).
  18. Karch, J., et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD. Science Advances. 5 (8), (2019).
  19. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  20. Antoniel, M., et al. The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH. European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).
  21. Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).
  22. Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury. Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).
  23. Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore. British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).
  24. Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).
  25. Griffiths, K. K., et al. Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).
  26. Barajas, M., et al. The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart. Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).
  27. Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 11 187-196 (2018).
  28. Carraro, M., Bernardi, P. Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition. Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).
  29. Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 9 157-170 (2018).
  30. Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 6 109-119 (2018).
  31. Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1862 (3), 148357 (2021).
  32. Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).
  33. Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques. Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).
  34. Petronilli, V., et al. Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence. Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).

Tags

Biyoloji Sayı 184
Mitokondriyal Geçirgenlik Geçiş Gözünün Koenzim Q Fazlalığı Ortamında Açık Olasılığının Değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Griffiths, K. K., Wang, A., Levy, R. … More

Griffiths, K. K., Wang, A., Levy, R. J. Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess. J. Vis. Exp. (184), e63646, doi:10.3791/63646 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter