Summary
Intracerebrale infectie met het Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) in C57BL/6 muizen repliceert veel van de vroege en chronische klinische symptomen van virale encefalitis en daaropvolgende epilepsie bij menselijke patiënten. Dit artikel beschrijft de virusinfectie, symptomen en histopathologie van het TMEV-model.
Abstract
Een van de belangrijkste oorzaken van epilepsie is een infectie van het centrale zenuwstelsel (CZS); Ongeveer 8% van de patiënten die een dergelijke infectie overleven, ontwikkelt als gevolg daarvan epilepsie, met percentages die aanzienlijk hoger zijn in minder economisch ontwikkelde landen. Dit werk biedt een overzicht van het modelleren van epilepsie van infectieuze etiologie en het gebruik ervan als een platform voor nieuwe antiseizure compound testen. Een protocol van epilepsie-inductie door niet-stereotactische intracerebrale injectie van Theiler's murine encefalomyelitisvirus (TMEV) in C57BL/6-muizen wordt gepresenteerd, dat veel van de vroege en chronische klinische symptomen van virale encefalitis en daaropvolgende epilepsie bij menselijke patiënten repliceert. De klinische evaluatie van muizen tijdens encefalitis om de aanvalsactiviteit te controleren en de potentiële antiseizure-effecten van nieuwe verbindingen te detecteren, wordt beschreven. Bovendien worden histopathologische gevolgen van virale encefalitis en epileptische aanvallen zoals hippocampusschade en neuro-inflammatie aangetoond, evenals langetermijngevolgen zoals spontane epileptische aanvallen. Het TMEV-model is een van de eerste translationele, infectiegestuurde, experimentele platforms die het mogelijk maken om de mechanismen van epilepsieontwikkeling als gevolg van CZS-infectie te onderzoeken. Het dient dus ook om potentiële therapeutische doelen en verbindingen te identificeren voor patiënten met een risico op het ontwikkelen van epilepsie na een CZS-infectie.
Introduction
Een van de frequente gevolgen van virale encefalitis is epileptische aanvallen. Veel virale infecties veroorzaken symptomatische aanvallen tijdens de acute fase van de infectie; Het risico op dergelijke aanvallen is verhoogd met meer dan 20% bij het grote publiek 1,2,3. Patiënten die de infectie overleven, hebben ook een verhoogd risico van 4% -20% op het ontwikkelen van chronische epilepsie in de maanden tot jaren na infectie 1,4. Het Theiler's murine encefalomyelitis virus (TMEV) is geïdentificeerd als een geschikt virus om acute en chronische aanvallen te bestuderen in een muismodel van virale encefalitis 5,6,7. TMEV is een niet-omhuld, positief-zintuiglijk, enkelstrengs RNA-virus van de Picornaviridae-familie en wordt traditioneel gebruikt om demyelinisatie in het ruggenmerg van SJL-muizen te bestuderen, waartegen C57BL / 6 (B6) -muizen worden beschermd omdat ze het vermogen hebben om het virus snel na infectie te verwijderen. TMEV induceert echter acute aanvallen bij 50% -75% van de mannelijke en vrouwelijke B6-muizen binnen de eerste week na infectie (pi), terwijl ongeveer 25% -40% chronische epilepsie ontwikkelt weken tot maanden pi 2,5,6,8,9. Afgezien van aanvallen, vertonen de muizen ook de gemeenschappelijke histopathologie van een epileptische hippocampus met neurodegeneratie en gliose 5,6,8,10,11,12. Bovendien presteren TMEV-geïnfecteerde B6-muizen significant slechter in gedragstests voor leren en geheugen en hebben ze cognitieve comorbiditeit, die ook wordt gezien bij klinische patiënten met epilepsie13,14,15.
Traditioneel maken modellen van epilepsie en aanvallen gebruik van de toepassing van chemoconvulsieve stoffen of elektrische stimulatie om aanvallen te induceren; Deze modellen missen echter constructvaliditeit en vertonen vaak ernstigere aanvallen en hersenbeschadiging dan bij klinische patiëntenworden gezien 16. Er is geen model dat geschikt is voor elke onderzoeksvraag17. Het gebruik van het TMEV-model is vooral interessant als de predisponerende factoren van de ontwikkeling van aanvallen na een infectie van het CZS worden onderzocht of als verbindingen worden gescreend op hun antiseizure-efficiëntie.
Sinds het TMEV-model is vastgesteld en gebruikt in verschillende laboratoria internationaal, hebben de auteurs veel details geïdentificeerd die een succesvolle implementatie van het model mogelijk maken, bijvoorbeeld de specificiteit van verschillende virus- en muizenstammen. De meest betrouwbare aanvalsinductie werd gegenereerd met de Daniel's stam van TMEV en B6J muizen 2,5,6,8,9. Het model wordt momenteel gebruikt door het National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) als een platform om nieuwe geneesmiddelen tegen epilepsie en aanvallen te identificeren18,19. Dit artikel bevat het gedetailleerde protocol van virusinductie en klinische monitoring om andere onderzoekers in staat te stellen dit model van virale encefalitis te gebruiken om het begrip van de ziektemechanismen te vergroten, evenals voor het testen van geneesmiddelen.
Het volgende protocol weerspiegelt een studie die is ontworpen voor het testen van verbindingen in dit model, hoewel tal van andere soorten studies kunnen worden uitgevoerd. Muizen worden kort voor injectie verdoofd met de Daniel's stam van TMEV in het temporale gebied van de rechterhersenhelft (achterste en mediale naar het rechteroog). Afhankelijk van de onderzoeksvraag, als niet-geïnfecteerde controledieren nodig zijn, krijgen muizen steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4, inclusief KH 2 PO 4 [1,06 mM], NaCl [155,17 mM] en Na 2 HPO4·7H 2 O [2,97mM]) in plaats van TMEV. Eerdere ervaring bij TMEV-geïnfecteerde muizen heeft aangetoond dat door behandeling geïnduceerde aanvallen optreden tussen dag 3 en dag 7 na infectie. De frequentie van de injectie, de route en het tijdstip van testen van experimentele verbindingen variëren afhankelijk van hun eigenschappen. Het wordt aanbevolen om de virusinenting op een vrijdag uit te voeren, waardoor dag 3-7 aanvalsmonitoring de volgende week, maandag-vrijdag, kan plaatsvinden. Tijdens de controleweek van de aanvallen kunnen experimentele verbindingen tweemaal daags (i.p.) (met een tussenpoos van ten minste 4 uur) worden toegediend, tenzij anders wordt gesuggereerd door de kinetiek of het werkingsmechanisme van de verbinding. Monitoring van aanvallen tijdens de behandeling kan worden uitgevoerd op een vooraf bepaald tijdstip. Injectie- en observatietijden variëren afhankelijk van individuele verbindingen. Dieren worden geïnjecteerd met de teststof of met een medium in plaats van de geneesmiddelverbinding. Deze twee groepen kunnen analoog aan de experimentele groep worden behandeld en geobserveerd. Tijdens het experiment moet de ene persoon die de muizen hanteert en de aanvallen scoort, blind zijn voor de behandeling.
Protocol
Alle beschreven procedures werden goedgekeurd door de respectieve autoriteiten. Dieren worden onderhouden volgens de aanbevelingen in de "Guide for Care and Use of Laboratory Animals" (National Research Council) en in overeenstemming met het beleid van de Public Health Service en het Institutional Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van Utah, dierprotocol (nummer: 21-11009, Dept. of Pharmacology and Toxicology) en aan de Freie Universität Berlin (protocol: G0015/21, LAGeSo Berlin, Instituut voor Farmacologie en Toxicologie), respectievelijk. De resultaten in figuur 3 en figuur 5 werden goedgekeurd onder 33.9-42502-04-11/0516 en 33.9-42502-04-15/1892 (LAVES Oldenburg, afdeling Farmacologie, Toxicologie en Farmacie, Universiteit voor Diergeneeskunde Hannover).
1. Overwegingen en voorbereidingen voor het ontwerpen van de studie
- Virus
- De Daniel's stam van TMEV werd vriendelijk verstrekt door Robert Fujinami van de Universiteit van Utah. Oorspronkelijk werd het geïsoleerd van een muis in de Harvard-kolonie20. Zoek de specifieke classificatie en voorschriften voor biologische agentia in de respectieve landen op voordat u TMEV hanteert en bespreek met het institutionele bioveiligheidspersoneel om naleving van de voorschriften te garanderen. Meestal wordt TMEV geclassificeerd als BSL 2, afhankelijk van de stam en genetische modificaties. De standaarddosis die nodig is om bij een meerderheid van de dieren epileptische aanvallen te induceren is 3 x 105 plaquevormende eenheden (PFU).
OPMERKING: De dosis moet mogelijk worden aangepast, bijvoorbeeld als transgene muizen worden gebruikt. Over het algemeen zijn titers tussen 2 x 104 PFU en 2,44 x 107 PFU gebruikt om met succes aanvallen te induceren. Controledieren krijgen steriele PBS en ervaren geen aanvallen. Het virus infecteert geen mensen; PBM's (laboratoriumjas, handschoenen, veiligheidsbril) moeten echter te allen tijde door experimentatoren worden gedragen en muizenkarkassen en beddengoed moeten worden geautoclaveerd voordat ze worden weggegooid.
- De Daniel's stam van TMEV werd vriendelijk verstrekt door Robert Fujinami van de Universiteit van Utah. Oorspronkelijk werd het geïsoleerd van een muis in de Harvard-kolonie20. Zoek de specifieke classificatie en voorschriften voor biologische agentia in de respectieve landen op voordat u TMEV hanteert en bespreek met het institutionele bioveiligheidspersoneel om naleving van de voorschriften te garanderen. Meestal wordt TMEV geclassificeerd als BSL 2, afhankelijk van de stam en genetische modificaties. De standaarddosis die nodig is om bij een meerderheid van de dieren epileptische aanvallen te induceren is 3 x 105 plaquevormende eenheden (PFU).
- Dieren
- Gebruik voor het induceren en onderzoeken van aanvallen B6J-muizen, omdat andere muizenstammen niet noodzakelijkerwijs aanvallen vertonen, bijvoorbeeld SJL / J-, FVB / N- of Balb / c-muizen5. Er is geen verschil tussen vrouwelijke en mannelijke muizen in acute aanvalsfrequentie5. Voer de experimenten uit op adolescente tot volwassen muizen (vanaf de leeftijd van 5-6 weken).
- Dieet
- Dieet is vastgesteld als een bron van lab-to-lab variabiliteit in de ernst van de ziekte; Beschouw daarom het dieet als een potentiële factor voor variatie22.
- Groepsgrootte
- Aangezien niet alle dieren acute of chronische aanvallen ontwikkelen in dit model, gebruikt u ongeveer 20 muizen / groep voor samengestelde tests.
- Dierenwelzijn
- Als een muis significante nadelige effecten vertoont van de infectie of toediening van het onderzoeksmiddel (bijv. lethargie, slechte verzorging, overmatige roodheid en etterende afscheiding uit de wond) na een observatietijd bepaald door de lokale IACUC-richtlijnen (bijv. 48 uur), euthanaseer de muis humaan.
- Euthanaseer elke muis die extreem gewichtsverlies (>20%) vertoont tijdens de infectieperiode humaan.
- Als dieren niet goed eten, geef ze dan toegang tot aanvullende pellets bevochtigd met pediatrische elektrolytoplossing of iets dergelijks.
2. Virusinenting
- Sterilisatie van de injectiespuit
- Verwijder de dop van de insulinespuit. Voeg polyethyleen slangen toe als kraag rond de naald om een voldoende injectiediepte van 2,5 mm te garanderen. Dompel de spuit gedurende 30 minuten onder in ethanol. Plaats de spuit gedurende 30 minuten onder UV-licht.
- Plaats de dop terug op de naald. Wikkel de spuit in een sterilisatiezakje en plak het dicht. Etiket met de datum van bereiding.
- Virusinjectie
- Haal aliquots van Daniel's stam van TMEV uit de vriezer van −80 °C. Ontdooi het virus en houd het op ijs. Vermijd het ontdooien en opnieuw invriezen van het virus. Laad de spuit met de virussuspensie (3 x 105 PFU verdund in 20 μL PBS- of DMEM-kweekmedium).
LET OP: Het virus is besmettelijk voor muizen, maar niet voor mensen. - Maak de bank schoon met ontsmettingsmiddel en werk onder een rookvanger. Virusinenting is niet steriel maar is zo schoon mogelijk.
- Breng de muis over in de anesthesie-inductiekamer en gebruik 2% isofluraan in zuurstof om anesthesie te induceren. Het bereiken van chirurgische tolerantie duurt een paar minuten; Pas de concentratie aan op basis van de ademhaling van het dier en de diepte van de anesthesie.
- Breng de verdoofde muis over uit de anesthesiedoos onder de motorkap. Controleer de chirurgische tolerantie, bijvoorbeeld door teenknijpen. De hele procedure wordt uitgevoerd in minder dan 30 s, dus het dier hoeft tijdens de injectie geen isofluraan in te ademen. Voeg oogzalf toe om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
- Reinig de kop van het dier met een alcoholdoekje. Kantel de kop van de muis iets naar links zodat de injectieplaats naar boven wijst.
- Trek de huid een beetje naar achteren, steek de naald in het hoofd en injecteer 20 μL intracorticaal tot een diepte van 2,5 mm in het temporale gebied van de rechterhersenhelft (achterste en mediaal naar het rechteroog).
- Voer de injectie eenzijdig uit in dezelfde hersenhelft bij alle dieren. Gebruik het oog en oor als oriëntatiepunten voor de locatie van de pariëtale cortex. De plaatsing is eerder histologisch geverifieerd; zie figuur 1. Injectiecoördinaten volgens stereotaxische injectie in relatie tot bregma zijn -2,0 (AP); +3,0 (ML); −1,5 (DV).
- Laat de spuit 5-15 s zitten. Noteer of er lekkage is door de injectie of als er luchtbellen worden gezien - bereid in dat geval een nieuwe spuit voor. Wanneer u de spuit voorzichtig uittrekt, draait u deze iets. Breng oogzalf aan om uitdroging te voorkomen terwijl u onder narcose bent.
- OPTIONEEL: Codeer het dier op de staart of het oor, afhankelijk van de lokale procedures (optioneel maar gemakkelijk omdat het dier bewusteloos is).
- Breng het dier over naar een nieuwe kooi, die tijdens het herstel van de anesthesie half op/half van een verwarmingskussen (35-40 °C) wordt geplaatst. Laat de dieren niet onbeheerd achter totdat ze weer voldoende bij bewustzijn zijn gekomen om sternale lighouding te behouden.
OPMERKING: Dieren kunnen na herstel weer in groepsverband worden gehuisvest (besmette dieren worden niet gemengd met nep-geïnfecteerde dieren). Geïnfecteerde muizen mogen niet in dezelfde kamer worden gehuisvest als niet-geïnfecteerde muizen. - Houd het gewicht van de muizen de eerste 7 dagen pi bij, omdat ze afvallen na infectie en mogelijk extra voeding nodig hebben.
- Haal aliquots van Daniel's stam van TMEV uit de vriezer van −80 °C. Ontdooi het virus en houd het op ijs. Vermijd het ontdooien en opnieuw invriezen van het virus. Laad de spuit met de virussuspensie (3 x 105 PFU verdund in 20 μL PBS- of DMEM-kweekmedium).
Figuur 1: Schema van de TMEV-injectieprocedure. Van links naar rechts: Bij een injectie met de rechter pariëtale cortex wordt de naald iets lateraal geïnjecteerd van een denkbeeldige lijn tussen het oog en het tegenovergestelde oor. De kraag voor diepteregeling is aangegeven in geel. Het injectiekanaal is te zien in het coronale hersengedeelte, gemarkeerd door de pijl. De injectieplaats komt overeen met de coördinaten boven de pijl. De rechter afbeelding toont de verspreiding van het Theiler-virus (violet) binnen de CA1 van de hippocampusvorming. Het cijfer werd opgesteld met behulp van biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Testen van compounds
- Samengestelde bereiding
- Bekijk de formuleringsinstructies. Bereid de voertuigoplossing voor volgens de aanbevelingen of de meegeleverde instructies. Als voorbeeld wordt de procedure voor het anti-epileptische geneesmiddel levetiracetam (LEV) gepresenteerd. LEV vermindert de aanvalslast tot 30%-40% van de voertuigniveaus bij een dosis van 350 mg/kg. Het medium dat in deze studie wordt gebruikt, is 0,5% methylcellulose.
- Bereken doses afhankelijk van de verbinding. Weeg het medicijn af volgens de berekening. Voor de behandeling van 1 kg muizen, weeg 350 mg LEV af.
- Bereid een voorraadoplossing met het juiste volume voertuigoplossing, zoals voorgeschreven door de formuleringsinstructies (bijv. Ultrasoonapparaat, voertuighulpstoffen, enz.). Uitgaande van een injectievolume van 0,01 ml/g muis, zou het injectievolume voor 1 kg 10 ml zijn met 350 mg LEV, wat resulteert in een oplossing van 35 mg/ml19. Rapporteer de berekening en de dosis in mg/kg en het volume in ml.
OPMERKING: Een voorbeeldig protocol is te vinden op pagina 2 van Aanvullend Materiaal 1.
- Samengestelde toediening
- Randomiseer kooien naar het voertuig of de samengestelde groep. Gebruik mock-geïnfecteerde muizen voor studies naar de mechanismen van epilepsieontwikkeling of voor validatiedoeleinden, maar niet voor routinematige screening van geneesmiddelen.
- Rapporteer omgevingsomstandigheden zoals temperatuur, vochtigheid, tijdstip van de dag, enz.
- Vortex de oplossing met de compound en de voertuigoplossing. Zuig het voertuig of de verbinding op in een spuit en kleur de spuiten een kleurcode om verwarring te voorkomen.
- Weeg de dieren. Zorg ervoor dat B6J-muizen >18 g zijn op dag 3 pi (niet afgerond). Rapporteer het gewicht.
- Dien de verbinding toe (bijv. via intraperitoneale injectie of andere geschikte routes). Schrijf de tijd en route van toediening.
- Controleer de dieren op eventuele gedragsveranderingen na toediening van de verbinding, vooral na de eerste injecties. Als er epileptische aanvallen optreden, meld dan de intensiteit van de aanval volgens de Racine-schaal23; Zie stap 3.2.
OPMERKING: Een voorbeeldig protocol voor toediening van verbindingen is te vinden in Aanvullend Materiaal 1, pagina 3, terwijl aanvallen waargenomen tijdens toediening zouden worden geregistreerd op Aanvullend Materiaal 1, pagina's 4-5.
- Beslagleggingsmonitoring van door hantering geïnduceerde aanvallen
- Voer deze procedure uit door een experimentator die blind is voor de behandeling. Breng alle kooien naar de bank. Observeer de dieren 2x daags op aanvallen tijdens de lichtfase.
- Scoor de aanvalsactiviteit door een gemodificeerde Racine-schaal23: 0 = geen gedragsverandering, 1 = mond- en gezichtsbewegingen, 2 = hoofdknikken, 3 = unilaterale voorpoot clonus, 4 = bilaterale voorpoot clonus met opfok, 5 = gegeneraliseerde tonisch-clonische activiteit met verlies van houdingstonus, soms springen, 6 = langdurig en overmatig springen en hyperactiviteit. Rapporteer het aantal en de intensiteit van de aanvallen.
- Schuif een hok over de kooi om wat lawaai te maken.
- Breng elk dier over naar een andere doos en terug.
- Schud de kooi voorzichtig met een heen-en-weer beweging en zorg ervoor dat de kooi niet zo krachtig wordt geschud dat dieren de zijkanten of de bovenkant van de kooi raken en het risico lopen lichamelijk letsel op te lopen.
- Controleer alle dieren in de kooi op aanvallen. Op elk moment, als een muis een aanval heeft, breng deze dan terug naar de thuiskooi en noteer het niveau van de aanval zonder verdere stimulatie van de aanval door lawaai of hantering.
- Voor dieren die niet spontaan of na zacht schudden in de kooi hebben gegrepen, veroorzaken aanvallen door intensievere hantering: draai de muis voorzichtig om door hem van links naar rechts bij zijn staart te draaien.
OPMERKING: Dieren met epileptische aanvallen zijn hyperexciteerbaar en kunnen springerig zijn. - Observeer elk dier opnieuw op aanvalsgedrag. Herhaal het proces voor volgende kooien.
OPMERKING: Een voorbeeldig protocol voor de bewaking van inbeslagnames is te vinden in Aanvullend Materiaal 1, pagina's 6-7.
- Gegevensrapport over samengestelde effecten
- Analyseer de dagelijkse lichaamsgewichten met behulp van herhaalde metingen (RM) ANOVA.
- Gebruik de dagelijkse cumulatieve beslaglastwaarden voor een grafische weergave van de gegevens. Presenteer de werkzaamheidsgegevens (aantal dieren zonder racine stadium 3-5 aanvallen) als het aantal beschermd/het aantal geteste in elke respectieve groep (meestal N = 20). Vergelijk daarom de gegevens tussen de met voertuigen en drugs behandelde groepen voor reacties (in beslag nemen of niet-in beslag nemen) met behulp van een Fisher's exacte test.
OPMERKING: Een dier wordt beschouwd als "beschermd" tegen aanvallen als het een aanval van stadium 2 of minder heeft en niet-beschermde dieren hebben aanvallen van stadia 3-5. - Analyseer de verdraagbaarheidsgegevens op dezelfde manier, zoals het aantal dieren met gedragsstoornissen of toxische effecten / het aantal geteste dieren in elke groep. Let op eventuele nadelige effecten, inclusief sterfgevallen.
- Als minder dan 50% van de muizen die met het voertuig worden geïnjecteerd acuut grijpt, houd dan geen rekening met de gegevens.
Representative Results
Samengestelde effecten op acute aanvallen
Gedragsaanvallen worden geregistreerd als ze optreden tijdens drugsinjectie (DI) of tijdens de daaropvolgende AM / PM-aanvalsbehandeling / monitoringsessies. Aanvallen waargenomen tijdens het hanteren van aanvallen kunnen worden gepresenteerd als een heatmap, die wordt weergegeven in figuur 2 voor LEV (350 mg / kg). Voor de analyse van de aanvalslast wordt het gemiddelde van de uiteindelijke (dag 7) cumulatieve aanvalslastwaarden voor de met het medium behandelde groep genomen en door de Mann-Whitney U-test vergeleken met de met verbindingen behandelde groep (de waarden van de beslaglast omvatten die verzameld bij de observatie na injectie). Voor de werkzaamheid van verbindingen bepaalt de exacte test van Fisher of er een statistisch verschil in werkzaamheid is tussen met voertuigen en geneesmiddelen behandelde groepen. Op dezelfde manier worden verdraagbaarheidsgegevens geanalyseerd met de exacte test van Fisher. Lichaamsgewichtanalyse wordt uitgevoerd door ANOVA met herhaalde metingen om veranderingen in de loop van het experiment te bepalen, evenals verschillen tussen met verbindingen en voertuigen behandelde muizen.
Figuur 2: Een heatmap van gedragsaanvallen na testen met vehikel (0,5% methylcellulose) of LEV (350 mg/kg). Tweemaal daagse injecties traden 1 uur voorafgaand aan de behandeling en observaties van de aanvallen op. Gedragsaanvallen werden geregistreerd als ze optraden tijdens drugsinjectie (DI) of tijdens de daaropvolgende AM / PM-aanvallen behandeling / monitoringsessies. LEV (350 mg/kg) vermindert de aanvallen die worden waargenomen tijdens hanteringssessies aanzienlijk (35,9% van de last van de voertuigbeslag) gedurende de observatieperiode van 5 dagen. De heatmap wordt gemaakt door aanvallen fase 1-3 in groen, 4 in geel en 5 in oranje af te beelden. Dit nieuwe cijfer is gemaakt op basis van een gepubliceerde dataset19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Chronische epilepsie
Afgezien van de gerapporteerde aanvalslast in de eerste week pi, zijn er verschillende uitlezingen die nuttig kunnen zijn, afhankelijk van de studie en hypothese. Als dieren langdurig worden gehouden, zal een subgroep van geïnfecteerde dieren spontane epileptische aanvallen ontwikkelen na enkele weken pi, die minder vaak voorkomen dan acute aanvallen en dus EEG-registratie vereisen. Om EEG van muizen te registreren, moeten elektroden worden geïmplanteerd in een stereotaxische operatie24. Figuur 3 toont verschillende epileptische voorvallen in de chronische fase door EEG-registratie bij muizen die geïnfecteerd zijn met TMEV8.
Figuur 3: Typische EEG-sporen in de chronische fase (14 weken pi) na DA-virusinfectie bij muizen. (A-C) Representatieve EEG-gebeurtenissen waarbij geen gedragsmotorische correlatie werd waargenomen, d.w.z. (A) enkele spikes, (B) spikeclusters, (C) evenals een elektrografische, vermoedelijk focale aanval. (D-F) Representatieve EEG-gebeurtenissen met gedragscorrelaten. De muis geïllustreerd in D had epileptische gebeurtenissen met myoclonische spiertrekkingen (aangegeven met "M", vergezeld van bewegingsartefacten), stereotiepe bewegingen (aangegeven door "head press", wanneer de muis het hoofd plat op de grond drukte) of gedragsstilstand; "Scr" beschrijft een bewegingsartefact van krabben, (E) en (F) vertonen typische EEG-veranderingen tijdens gegeneraliseerde convulsieve aanvallen: (E) een Racine stadium 3-aanval met een duur van 22 s en 1 Hz, en (F) een stadium 5-aanval met een duur van 34 s en 5,4 Hz. Deze figuur is voor8 gepubliceerd en is met toestemming van Elsevier herdrukt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Histologie
Aangezien epilepsie en epileptische aanvallen meestal gepaard gaan met hippocampuspathologie bij patiënten, die wordt samengevat in experimentele modellen, analyseren de meeste laboratoria ook hippocampusveranderingen of het effect van een mogelijke antiseizurebehandeling op pathologie. Vaak geanalyseerde parameters omvatten hippocampale neurodegeneratie en krimp, evenals ontsteking door labeling voor specifieke immuuncelpopulaties. Voor dergelijke analyses worden muizen aan het einde van het experiment diep verdoofd totdat een ademstilstand optreedt en de hartslag aanzienlijk vertraagt of aritmie vertoont. Bloed wordt verwijderd door intracardiale perfusie van PBS gevolgd door 4% paraformaldehyde (PFA)25 om het weefsel te fixeren. Het weefsel wordt vervolgens bewerkt door cryosectie en (immuun-)kleuring26, gevolgd door microscopische analyses.
Figuur 4: Hippocampale degeneratie bij epileptische TMEV-geïnfecteerde muizen. (A,B) Cresylviolet-gekleurde coronale secties tonen normale cytoarchitectuur in een (A) controle (PBS) muis en hippocampusdegeneratie in een (B) TMEV-muis na 2 maanden pi. Opmerking: Vergrote laterale ventrikels, ineenstorting van de alveus en dunner worden van de piramidale cellaag. (C) Kwantificering van deze schade toont een significante afname van het hippocampusgebied en een overeenkomstige toename van het ventriculaire gebied van TMEV-muizen (N = 7) versus PBS-muizen (N = 6; gegevens zijn gemiddeld ± SEM; p < 0,001; Student's t-test). (D,E) NeuN-labeling illustreert verder de omvang van neuronaal celverlies in secties die na 6 maanden pi worden genomen. Pijlen geven gebieden aan met volledig piramidaal celverlies. (E) De gyrus dentate lijkt zelfs bij epileptische muizen relatief intact te zijn. Schaalbalk = (A,B) 2 mm; (D,E) 0,5 mm. Deze figuur is gepubliceerd voor6 en is herdrukt met toestemming van Oxford University Press. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve fotomicrografieën van verschillende ernst van T-celinfiltratie als gevolg van acute encefalitis 7 dagen na infectie. Seriële secties die de ipsilaterale dorsale hippocampus bevatten, werden gekleurd met antilichamen tegen CD3 om T-lymfocyten te labelen. (A,D) Een normale hippocampus zonder T-cel infiltratie zoals die verscheen bij nep-geïnfecteerde dieren. (B, E) Matige T-cel infiltratie zoals wordt gezien bij de meerderheid van TMEV-geïnfecteerde muizen. (C, F) Een ernstige infiltratie van T-lymfocyten, die alleen bij enkele van de geïnfecteerde muizen werd gezien. Deze figuur is voor8 gepubliceerd en is met toestemming van Elsevier herdrukt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier 1: Het aanvullende dossier bestaat uit het formulier dat wordt gebruikt voor compoundtesten in het TMEV-model. Pagina 1 geeft een overzicht van de experimentele opzet. Informatie over de verbinding, het medium en het bereiding van de samengestelde oplossing is opgenomen op pagina 1-2. Samengestelde toepassing is vastgelegd op pagina 3. De scorebladen op pagina's 4-5 worden gebruikt voor het registreren van de aanvallen die zijn waargenomen en gekwantificeerd door de experimentator die de samengestelde injectie uitvoert. Op pagina 4 kunnen gegevens worden verzameld voor kooien 1-4 van elk 5 muizen en op pagina 5 kunnen kooien 5-8 worden geregistreerd, wat het standaardaantal dieren is voor samengestelde tests in onze handen. De scorebladen op pagina's 6-7 worden gebruikt door de geblindeerde waarnemer die de observatie, hantering en zachte kooischudding 1 uur na elke samengestelde injectie uitvoert. Nogmaals, op deze voorbeeldige scorebladen kunnen voor in totaal acht kooien worden genoteerd. De laatste pagina 8 kan worden gebruikt voor het opnemen van andere waarnemingen of notities. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Dit is het eerste op infectie gebaseerde knaagdiermodel voor epilepsie dat onderzoek naar acute en chronische aanvalsontwikkeling mogelijk maakt. Het zal helpen bij het identificeren van medicijndoelen en nieuwe verbindingen voor ziektepreventie of -modificatie voor een van de meest voorkomende etiologieën van epilepsie.
Zoals hierboven beschreven, kan een zorgvuldige afweging van de batch en virale titer nodig zijn om ervoor te zorgen dat een adequaat deel van de met TMEV behandelde muizen door hantering geïnduceerde aanvallen vertoont. Als dieren minder aanvallen hebben dan normaal, gebruik dan een partij N = 20 dieren om de efficiëntie van het virus te controleren. Als de activiteit ervan afneemt (minder dan 50%), is het tijd om nieuwe aliquots te maken en deze te testen met N = 20 dieren. Als de nieuwe aliquots niet efficiënter zijn, moet een nieuwe partij van het virus worden gezuiverd. Voor sommige transgene muizenlijnen kan het nodig zijn om een lagere virale titer te gebruiken; Daarom moet de virale titer indien nodig worden verdund na voorbereidende experimenten. De meeste beschikbare gegevens over B6-muizen waren afkomstig van Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, VS of Charles River, Sulzfeld, Duitsland); echter, vergelijkbare aanvalspercentages bij B6-muizen verkregen uit Harlan (Eystrup, Duitsland) zijn bevestigd8. De aanvalspercentages van transgene dieren met een B6-achtergrond zijn vergelijkbaar met wildtype B6-muizen, maar kunnen verschillen als de genetische veranderingen van invloed zijn op virusinvasie, ontstekingsreactie of neurodegeneratie21. Acute aanvallen worden spontaan waargenomen, maar veroorzaakt door hantering en lawaai, dus het is van het grootste belang om alle dieren op dezelfde manier te behandelen wanneer de aanvalspercentages worden vergeleken. Tweemaal daagse behandelingssessies hebben eerder een hoge aanvalslast opgeleverd en een groter deel van de muizen vertoonde aanvallen tijdens dagen 3-7 na infectie 6,8,19. Extra behandelingssessies (dag 1 en dag 2) kunnen ook worden gebruikt om de beslaglast te verhogen. Verder kunnen dieren voorafgaand aan elke behandelingssessie worden geobserveerd om ervoor te zorgen dat er geen spontane aanvallen optreden. Een luide laboratoriumomgeving kan bijvoorbeeld epileptische aanvallen veroorzaken, die op hun beurt dieren ongevoelig kunnen maken voor door hantering geïnduceerde aanvallen tijdens testtijden.
Hoewel TMEV-infectie bij de meerderheid van de muizen door hantering geïnduceerde aanvallen veroorzaakt, is het onbekend waarom sommige dieren resistent zijn tegen deze behandeling. Zoals hierboven beschreven, kan het zijn dat elektrografische aanvallen (met minimaal of geen geassocieerd gedrag) optreden en normaal gesproken niet worden gekwantificeerd zonder gelijktijdige EEG-registratie. Het kan ook zijn dat kleine verschillen in injectielocatie een verminderd viraal effect in de hersenen vergemakkelijken; echter, aanvallen zijn gemeld na corticale en striatale infectie 5,6,8,9 als gevolg van tropisme van het virus naar de hippocampus. Voor geneesmiddelenscreeningstudies in dit model, om een vermindering van aanvallen te identificeren (bijv. Een vermindering van 50% van de aanvalslast), is een groter aantal dieren vereist voor elke groep (bijv. N = 20). Bovendien vereist de variabiliteit in aanvalsgedrag in dit model grotere verschillen in geneesmiddel- versus voertuigeffecten om een significante vermindering van aanvallen te identificeren. Daarom is een beperking van dit model de vereiste voor grotere groepsgroottes. Niettemin maken voldoende groepsgroottes het ook mogelijk om anti-epileptische en ontstekingsremmende effecten in dit model19 te identificeren.
De overgrote meerderheid van de waarneembare aanvallen in dit model treedt op tijdens de acute infectieperiode. Ondanks het optreden van hippocampusdegeneratie, immuuncelactivatie en cognitieve tekorten waargenomen bij muizen die met TMEV werden behandeld, ontwikkelt slechts een klein deel van de behandelde dieren uiteindelijk chronische, spontane aanvallen. Deze lage totale aanvalslast zou een groot aantal geïnfecteerde muizen vereisen om spontane aanvallen in dit model goed te bestuderen, wat buiten het bereik en de mogelijkheden van veel projecten valt. Diepte-elektrode-implantatie en EEG-monitoring zouden ook de belasting voor de proefdieren verhogen. Hoewel diepte-elektroden kunnen helpen bij de identificatie van spontane aanvalsactiviteit, kunnen veranderingen in de anatomie van de hippocampus na infectie een consistente plaatsing van de elektrode een uitdaging maken.
De dringende behoefte aan het identificeren van nieuwe behandelingen voor epilepsie vereist de ontwikkeling van modellen die kunnen worden gebruikt als een snelle screeningsmethode voor de werkzaamheid van antiseizures. Dit model biedt functies om aan dit dringende verzoek te voldoen. Bovendien maakt het feit dat het geen stereotactische chirurgie vereist, het een geschikt en gemakkelijk uit te voeren model voor het onderzoek van antiseizure-verbindingen.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
SB wordt ondersteund door een startsubsidie van de FU Berlin. KSW wordt ondersteund door R37 NS065434 en de ALSAM Foundation. LAB wordt ondersteund door een D-SPAN award 1F99NS125773-01. We bedanken Robert Fujinami, Ph.D. voor het verstrekken van het Theiler-virus en de University of Utah Cell Imaging Core Facility voor microscopie-ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent paper | - | - | any |
| Analytical balance | Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.) | 30216542 | 0. 1 mg–220 g |
| Animal balance | Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.) | STX2202 | 0.01 g–2200 g |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD (Mississauga, ON, Canada) | BD329461 | Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle - 1 mL |
| Daniel's strain of TMEV | kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah) | - | 3 x 105 plaque-forming units aliquot(s) |
| Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super | Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany | - | Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol |
| Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 22-363-750 | |
| Fluriso | VETone (Boise, ID, U.S.A) | 502017 | Isoflurane 250 mL, 2%–5% |
| Fume absorber | Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.) | - | - |
| General Protection Disposable SMS White Lab Coats | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 17-100-810A | |
| GraphPad Prism version 9 | (La Jolla, CA, U.S.A.) | ||
| Ice bucket | - | - | any |
| Microsoft Excel Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
| Microsoft Word Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
| Mouse cage | - | - | any mouse cage holding at least 5 mice |
| PrecisionGlide needles | BD (Mississauga, ON, Canada) | 329652 | BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes - 26 G x 3/8 - 0.45 mm x 10 mm |
| Self-Sealing Sterilizing Pouch | Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.) | NC9241087 | 12.6 x 25.5 cm |
| Small glass flask | - | - | any, volume 25 mL |
| sterile PBS | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 10010056 | |
| Stir bar | Carl Roth GmbH & CO. KG | X171.1 | size according to volume of solution |
| Stir plate | Carl Roth GmbH & CO. KG | AAN2.1 | |
| Syringe Luer-Lok | BD (Mississauga, ON, Canada) | 309628 | 1 mL syringe only |
| Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer | Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.) | EW-08895-23 | Bath sonicator - 0.5 gal, 115 V |
| Vehicle solution | - | - | depending on compound vehicle |
| Vortex REAX | Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Germany | 541-10000-00 |
References
- Getts, D. R., Balcar, V. J., Matsumoto, I., Müller, M., King, N. J. Viruses and the immune system: their roles in seizure cascade development. Journal of Neurochemistry. 104 (5), 1167-1176 (2008).
- Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Neurotropic viral infections leading to epilepsy: Focus on Theiler's murine encephalomyelitis virus. Future Virology. 6 (11), 1339-1350 (2011).
- Vezzani, A., et al.
- Misra, U. K., Tan, C. T., Kalita, J.
- Libbey, J. E., et al.
- Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Development of postinfection epilepsy after Theiler's virus infection of C57BL/6 mice. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (12), 1210-1219 (2010).
- Stewart, A. M., et al. Perspectives of zebrafish models of epilepsy: What, how and where next. Brain Research Bulletin. 87 (2-3), 135-143 (2012).
- Bröer, S., et al. Brain inflammation, neurodegeneration and seizure development following picornavirus infection markedly differ among virus and mouse strains and substrains. Experimental Neurology. 279, 57-74 (2016).
- Bröer, S., et al. Viral mouse models of multiple sclerosis and epilepsy: Marked differences in neuropathogenesis following infection with two naturally occurring variants of Theiler's virus BeAn strain. Neurobiology of Disease. 99, 121-132 (2017).
- Loewen, J. L., Barker-Haliski, M. L., Dahle, E. J., White, H. S., Wilcox, K. S. Neuronal Injury, gliosis, and glial proliferation in two models of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 75 (4), 366-378 (2016).
- Bell, L. A., Wallis, G. J., Wilcox, K. S. Reactivity and increased proliferation of NG2 cells following central nervous system infection with Theiler's murine encephalomyelitis virus. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 369 (2020).
- Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Theiler's virus infection chronically alters seizure susceptibility. Epilepsia. 51 (8), 1418-1428 (2010).
- Buenz, E. J., Rodriguez, M., Howe, C. L. Disrupted spatial memory is a consequence of picornavirus infection. Neurobiology of Disease. 24 (2), 266-273 (2006).
- Tramoni-Negre, E., Lambert, I., Bartolomei, F., Felician, O. Long-term memory deficits in temporal lobe epilepsy. Revue Neurologique. 173 (7-8), 490-497 (2017).
- Ponds, R. W., Hendriks, M. Cognitive rehabilitation of memory problems in patients with epilepsy. Seizure. 15 (4), 267-273 (2006).
- Sloviter, R. S. Experimental status epilepticus in animals: What are we modeling. Epilepsia. 12, 11-13 (2009).
- Löscher, W. Animal models of seizures and epilepsy: Past, present, and future role for the discovery of antiseizure drugs. Neurochemical Research. 42 (7), 1873-1888 (2017).
- Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
- Metcalf, C. S., et al. Screening of prototype antiseizure and anti-inflammatory compounds in the Theiler's murine encephalomyelitis virus model of epilepsy. Epilepsia Open. 7 (1), 46-58 (2021).
- Daniels, J. B., Pappenheimer, A. M., Richardson, S. Observations on encephalomyelitis of mice (DA strain). Journal of Experimental Medicine. 96 (6), 517-530 (1952).
- Käufer, C., et al. Chemokine receptors CCR2 and CX3CR1 regulate viral encephalitis-induced hippocampal damage but not seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8929-8938 (2018).
- Libbey, J. E., et al. The effects of diet on the severity of central nervous system disease: One part of lab-to-lab variability. Nutrition. 32 (7-8), 877-883 (2016).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
- Kim, J. E., Cho, K. O. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy and EEG monitoring using radiotelemetry system in mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tu, L., et al.
