Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En modell för epilepsi av infektiös etiologi med Theilers murina encefalomyelitvirus

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/63673
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,2, 3
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Utah, 2Interdepartmental Program in Neuroscience, University of Utah, 3Faculty of Veterinary Medicine, Institute of Pharmacology and Toxicology, Freie Universität Berlin

Summary

Intracerebral infektion med Theilers murina encefalomyelitvirus (TMEV) hos C57BL / 6-möss replikerar många av de tidiga och kroniska kliniska symtomen på viral encefalit och efterföljande epilepsi hos mänskliga patienter. Detta dokument beskriver virusinfektion, symtom och histopatologi för TMEV-modellen.

Abstract

En av de främsta orsakerna till epilepsi är en infektion i centrala nervsystemet (CNS); Cirka 8% av patienterna som överlever en sådan infektion utvecklar epilepsi som en konsekvens, med priser som är betydligt högre i mindre ekonomiskt utvecklade länder. Detta arbete ger en översikt över modellering av epilepsi av infektiös etiologi och användning av den som en plattform för nya tester av anfallsmedel. Ett protokoll för epilepsiinduktion genom icke-stereotaktisk intracerebral injektion av Theilers murina encefalomyelitvirus (TMEV) hos C57BL/6-möss presenteras, vilket replikerar många av de tidiga och kroniska kliniska symtomen på viral encefalit och efterföljande epilepsi hos mänskliga patienter. Den kliniska utvärderingen av möss under encefalit för att övervaka anfallsaktivitet och upptäcka de potentiella antianfallseffekterna av nya föreningar beskrivs. Vidare visas histopatologiska konsekvenser av viral encefalit och anfall såsom hippocampus skada och neuroinflammation, liksom långsiktiga konsekvenser såsom spontana epileptiska anfall. TMEV-modellen är en av de första translationella, infektionsdrivna, experimentella plattformarna som möjliggör undersökning av mekanismerna för epilepsiutveckling som en följd av CNS-infektion. Således tjänar det också till att identifiera potentiella terapeutiska mål och föreningar för patienter som riskerar att utveckla epilepsi efter en CNS-infektion.

Introduction

En av de frekventa konsekvenserna av viral encefalit är epileptiska anfall. Många virusinfektioner utlöser symptomatiska anfall under infektionens akuta fas; Risken för sådana beslag ökar med över 20% bland allmänheten 1,2,3. Patienter som överlever infektionen har också en ökad risk på 4% -20% att utveckla kronisk epilepsi under månaderna till åren efter infektion 1,4. Theilers murina encefalomyelitvirus (TMEV) har identifierats som ett lämpligt virus för att studera akuta och kroniska anfall i en musmodell av viral encefalit 5,6,7. TMEV är ett icke-höljet, enkelsträngat RNA-virus med positiv känsla av familjen Picornaviridae och har traditionellt använts för att studera demyelinisering i ryggmärgen hos SJL-möss, som C57BL / 6 (B6) möss skyddas från eftersom de har förmågan att rensa viruset snabbt efter infektion. TMEV inducerar dock akuta anfall hos 50% -75% av manliga och kvinnliga B6-möss inom den första veckan efter infektion (pi), medan cirka 25% -40% utvecklar kronisk epilepsi veckor till månader pi 2,5,6,8,9. Förutom anfall visar mössen också den gemensamma histopatologin för en epileptisk hippocampus med neurodegeneration och glios 5,6,8,10,11,12. Dessutom presterar TMEV-infekterade B6-möss signifikant sämre i beteendetester för inlärning och minne och har kognitiv komorbiditet, vilket också ses hos kliniska patienter med epilepsi13,14,15.

Traditionellt använder modeller av epilepsi och anfall antingen applicering av kemokonvulsiva ämnen eller elektrisk stimulering för att inducera anfall; Dessa modeller saknar dock konstruktionsvaliditet och uppvisar ofta allvarligare anfall och hjärnskador än vad som ses hos kliniska patienter16. Det finns ingen modell som är lämplig för varje forskningsfråga17. Att använda TMEV-modellen är särskilt intressant om de predisponerande faktorerna för anfallsutveckling efter en infektion i CNS undersöks eller om föreningar screenas för deras antianfallseffektivitet.

Eftersom TMEV-modellen har etablerats och använts i flera olika laboratorier internationellt har författarna identifierat många detaljer som möjliggör framgångsrik implementering av modellen, t.ex. specificiteten hos olika virus- och musstammar. Den mest tillförlitliga anfallsinduktionen genererades med Daniels stam av TMEV- och B6J-möss 2,5,6,8,9. Modellen används för närvarande av National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) som en plattform för att identifiera nya läkemedel mot epilepsi och anfall18,19. Detta dokument innehåller det detaljerade protokollet för virusinduktion och klinisk övervakning för att tillåta andra forskare att använda denna modell av viral encefalit för att främja förståelsen av sjukdomsmekanismerna, liksom för läkemedelstestning.

Följande protokoll återspeglar en studie utformad för sammansatt testning i denna modell, även om många andra typer av studier kan utföras. Möss bedövas kort före injektion med Daniels stam av TMEV i den tidiga regionen på höger halvklot (bakre och mediala till höger öga). Beroende på forskningsfrågan, om icke-infekterade kontrolldjur krävs, får möss steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4, inklusive KH 2 PO 4 [1,06 mM], NaCl [155,17 mM] och Na 2 HPO4 · 7H 2 O [2,97mM]) istället för TMEV. Tidigare erfarenhet av TMEV-infekterade möss har indikerat att hanteringsinducerade anfall inträffar mellan dag 3 och dag 7 efter infektion. Frekvensen för injektion, administreringsväg och tid för testning av experimentella föreningar varierar beroende på deras egenskaper. Det rekommenderas att utföra virusinokulering på en fredag, vilket gör att dag 3-7 anfallsövervakning kan ske följande vecka, måndag-fredag. Under anfallsövervakningsveckan kan experimentella föreningar administreras (i.p.) två gånger dagligen (med minst 4 timmars mellanrum) om inte föreningens kinetik eller verkningsmekanism föreslår något annat. Anfallsövervakning under behandlingen kan utföras vid en tidigare bestämd tidpunkt. Injektions- och observationstiderna varierar beroende på enskilda föreningar. Djur injiceras med testföreningen eller med ett vehikel i stället för läkemedelsföreningen. Dessa två grupper kan hanteras och observeras analogt med experimentgruppen. Under experimentet bör den person som hanterar mössen och poängsätter anfallen vara blindad för behandlingen.

Protocol

Alla beskrivna förfaranden godkändes av respektive myndigheter. Djur underhålls enligt rekommendationerna i "Guide for Care and Use of Laboratory Animals" (National Research Council) och i enlighet med Public Health Service policy och Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Utah, djurprotokoll (nummer: 21-11009, Institutionen för farmakologi och toxikologi) och vid Freie Universität Berlin (protokoll: G0015/21, LAGeSo Berlin, Institutet för farmakologi respektive toxikologi). Resultaten som visas i figur 3 och figur 5 godkändes enligt 33.9-42502-04-11/0516 och 33.9-42502-04-15/1892 (LAVES Oldenburg, Institutionen för farmakologi, toxikologi och farmaci, University of Veterinary Medicine Hannover).

1. Överväganden och förberedelser för utformningen av studien

  1. Virus
    1. Daniels stam av TMEV tillhandahölls vänligt av Robert Fujinami från University of Utah. Ursprungligen isolerades den från en mus i Harvardkolonin20. Leta upp den specifika klassificeringen och reglerna för biologiska agenser i respektive land innan du hanterar TMEV och diskutera med den institutionella biosäkerhetspersonalen för att säkerställa att reglerna följs. Vanligtvis klassificeras TMEV som BSL 2, beroende på stam och genetiska modifieringar. Standarddosen som krävs för att framkalla anfall hos en majoritet av djuren är 3 x 105 plackbildande enheter (PFU).
      OBS: Dosen kan behöva anpassas, till exempel om transgena möss används. Sammantaget har titrar mellan 2 x 104 PFU och 2,44 x 107 PFU använts för att framgångsrikt framkalla anfall. Kontrolldjur får steril PBS och upplever inte anfall. Viruset infekterar inte människor; PPE (labbrock, handskar, skyddsglasögon) bör dock bäras av experimenter hela tiden, och muskroppar och sängkläder bör autoklaveras före bortskaffande.
  2. Djur
    1. För att inducera och undersöka anfall, använd B6J-möss, eftersom andra musstammar inte nödvändigtvis visar anfall, t.ex. SJL / J, FVB / N eller Balb / c-möss5. Det finns ingen skillnad mellan hon- och hanmöss i akut anfallsfrekvens5. Utför experimenten på ungdomar till vuxna möss (börjar vid 5-6 veckors ålder).
  3. Diet
    1. Kost har fastställts som en källa till lab-till-lab variabilitet i sjukdomens svårighetsgrad; Betrakta därför kosten som en potentiell faktor för variation22.
  4. Gruppens storlek
    1. Eftersom inte alla djur utvecklar akuta eller kroniska anfall i denna modell, använd cirka 20 möss / grupp för sammansatt testning.
  5. Djurskydd
    1. Om någon mus uppvisar signifikanta biverkningar av infektionen eller administreringen av prövningssubstansen (t.ex. letargi, dålig skötsel, överdriven rodnad och purulent urladdning från såret) efter en observationstid som bestäms av de lokala IACUC-riktlinjerna (t.ex. 48 timmar), avliva musen humant.
    2. Avliva vilken mus som helst som visar extrem viktminskning (>20%) under infektionsperioden humant.
    3. Om djuren inte äter ordentligt, ge dem tillgång till kompletterande pellets fuktade med pediatrisk elektrolytlösning eller liknande.

2. Virusinokulering

  1. Sterilisering av injektionssprutan
    1. Ta bort locket på insulinsprutan. Lägg till polyetenslang som en krage runt nålen för att säkerställa ett tillräckligt injektionsdjup på 2,5 mm. Sänk ner sprutan i etanol i 30 minuter. Placera sprutan i UV-ljus i 30 minuter.
    2. Sätt tillbaka locket på nålen. Linda in sprutan i en steriliseringspåse och tejpa den stängd. Märk med beredningsdatum.
  2. Virusinjektion
    1. Få alikvoter av Daniels stam av TMEV från frysen på −80 °C. Tina viruset och håll det på is. Undvik att tina och frysa viruset igen. Fyll sprutan med virussuspensionen (3 x 105 PFU utspädd i 20 μL PBS eller DMEM odlingsmedium).
      VARNING: Viruset är smittsamt för möss men inte för människor.
    2. Rengör bänken med desinfektionsmedel och arbeta under en rökabsorbent. Virusinokulering är inte steril men är så ren som möjligt.
    3. Överför musen till anestesiinduktionskammaren och använd 2% isofluran i syre för att inducera anestesi. Att nå kirurgisk tolerans tar några minuter; Justera koncentrationen baserat på djurets andning och anestesidjup.
    4. Överför den bedövade musen från anestesiboxen under huven. Kontrollera kirurgisk tolerans, t.ex. genom tånyp. Hela proceduren utförs på mindre än 30 s, så djuret behöver inte andas in isofluran under injektionen. Tillsätt ögonsalva för att förhindra torkning av hornhinnan.
    5. Rengör djurets huvud med en alkoholkudde. Luta musens huvud något åt vänster så att injektionsstället pekar uppåt.
    6. Dra huden lite bakåt, sätt in nålen i huvudet och injicera 20 μL intrakortiskt till ett djup av 2,5 mm i den tidiga regionen på höger halvklot (bakre och mediala till höger öga).
    7. Utför injektionen ensidigt på samma halvklot hos alla djur. Använd ögat och örat som landmärken för placeringen av parietal cortex. Placeringen har tidigare verifierats histologiskt; se figur 1. Injektionskoordinater enligt stereotaxisk injektion i förhållande till bregma är -2,0 (AP); +3,0 (ML); −1,5 (DV).
    8. Låt sprutan sitta på plats i 5-15 sekunder. Skriv ner om det finns läckage från injektion eller om luftbubblor ses - förbered i så fall en ny spruta. När du försiktigt drar ut sprutan, vrid den något. Applicera ögonsalva för att förhindra torrhet under anestesi.
    9. VALFRITT: Koda djuret på svansen eller örat beroende på lokala procedurer (valfritt men enkelt eftersom djuret är medvetslöst).
    10. Överför djuret till en ny bur, som placeras halvt på/halvt av en värmedyna (35-40 °C) under återhämtning från anestesin. Lämna inte djuren utan uppsikt förrän de har återfått tillräckligt med medvetande för att bibehålla sternal liggande.
      OBS: Djur kan gruppinhysas igen efter återhämtning (infekterade djur blandas inte med mockinfekterade djur). Infekterade möss ska inte placeras i samma rum som icke-infekterade möss.
    11. Håll koll på mössens vikt under de första 7 dagarna pi eftersom de går ner i vikt efter infektion och kan kräva ytterligare utfodring.

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av TMEV-injektionsproceduren. Från vänster till höger: För en injektion av höger parietal cortex injiceras nålen något lateralt av en imaginär linje mellan ögat och motsatt öra. Kragen för djupkontroll indikeras i gult. Injektionskanalen kan ses i koronal hjärnsektion, markerad med pilen. Injektionsstället motsvarar koordinaterna ovanför pilen. Den högra bilden visar fördelningen av Theiler-viruset (violett) inom CA1 i hippocampusformationen. Figuren utarbetades med hjälp av biorender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.

3. Testning av sammansatta ämnen

  1. Sammansatt beredning
    1. Läs igenom formuleringsinstruktionerna. Förbered fordonslösningen enligt rekommendationer eller instruktioner. Som ett exempel presenteras proceduren för det antiepileptiska läkemedlet levetiracetam (LEV). LEV minskar anfallsbördan till 30% -40% av fordonsnivåerna vid en dos av 350 mg / kg. Vehikeln som användes i denna studie är 0,5 % metylcellulosa.
    2. Beräkna doser beroende på föreningen. Väg ut läkemedlet enligt beräkningen. För behandling av 1 kg möss, väga ut 350 mg LEV.
    3. Bered en stamlösning med lämplig volym fordonslösning, enligt formuleringsinstruktionerna (t.ex. ultraljudsbehandling, hjälpämnen för fordon etc.). Med tanke på en injektionsvolym på 0,01 ml/g mus skulle injektionsvolymen för 1 kg vara 10 ml med 350 mg LEV, vilket resulterar i en lösning på 35 mg/ml19. Rapportera beräkningen och dosen i mg/kg och volymen i ml.
      OBS: Ett exempel på protokoll finns på sidan 2 i Kompletterande material 1.
  2. Sammansatt administrering
    1. Randomisera burar till vehikeln eller föreningsgruppen. Använd mockinfekterade möss för studier om mekanismerna för epilepsiutveckling eller för valideringsändamål men inte för rutinmässig läkemedelsscreening.
    2. Rapportera miljöförhållanden som temperatur, luftfuktighet, tid på dagen etc.
    3. Virvla lösningen med föreningen såväl som fordonslösningen. Aspirera fordonet eller föreningen i en spruta och färgkoda sprutorna för att förhindra förväxling.
    4. Väg djuren. Se till att B6J-möss är >18 g på dag 3 pi (inte rundade). Rapportera vikten.
    5. Administrera föreningen (t.ex. genom intraperitoneal injektion eller andra lämpliga vägar). Skriv tid och administreringsväg.
    6. Övervaka djuren för eventuella beteendeförändringar efter sammansatt administrering, särskilt efter de första injektionerna. Om anfall inträffar, rapportera anfallsintensitet enligt Racine-skalan23; Se steg 3.2.
      OBS: Ett exempel på ett protokoll för sammansatt administrering finns i kompletterande material 1, sidan 3, medan beslag som observerats under administrering skulle registreras på kompletterande material 1, sidorna 4-5.
  3. Anfallsövervakning av hanteringsinducerade anfall
    1. Utför denna procedur av en experimenter blind för behandlingen. Ta med alla burar till bänken. Observera djuren för anfall 2x dagligen under ljusfasen.
    2. Poängsätt anfallsaktiviteten med en modifierad Racine-skala23: 0 = ingen förändring i beteende, 1 = mun- och ansiktsrörelser, 2 = huvudnickning, 3 = ensidig frambenklonus, 4 = bilateral frambenklonus med uppfödning, 5 = generaliserad tonisk-klonisk aktivitet med förlust av postural ton, ibland hoppning, 6 = långvarig och överdriven hoppning och hyperaktivitet. Rapportera antalet anfall och deras intensitet.
    3. Skjut en penna över buren för att göra lite ljud.
    4. Överför varje djur till en annan låda och tillbaka.
    5. Skaka buren försiktigt med en rörelse fram och tillbaka, var försiktig så att du inte skakar buren så kraftigt att djuren kommer att slå i sidorna eller toppen av buren och riskerar att drabbas av fysisk skada.
    6. Övervaka alla djur i buret för anfall. När som helst, om en mus har ett anfall, överför det tillbaka till hemburet och skriv ner nivån på anfallet utan ytterligare anfallsstimulering genom buller eller hantering.
    7. För djur som inte har gripit spontant eller efter försiktig burskakning, utlösa anfall genom mer intensiv hantering: Vänd försiktigt musen genom att vända den vid svansen från vänster till höger.
      OBS: Djur med anfall är hyperexcitable och kan vara hoppiga.
    8. Observera varje djur för anfallsbeteende igen. Upprepa processen för efterföljande burar.
      OBS: Ett exempel på protokoll för beslagsövervakning finns i Kompletterande material 1, sidorna 6-7.
  4. Datarapport om sammansatta effekter
    1. Analysera den dagliga kroppsvikten med hjälp av upprepade åtgärder (RM) ANOVA.
    2. Använd de dagliga kumulativa anfallsvärdena för en grafisk representation av data. Presentera effektdata (antal djur utan anfall i Racinestadiet 3–5) som antal skyddade/antalet testade i respektive grupp (vanligtvis N = 20). Jämför därför data mellan de vehikel- och läkemedelsbehandlade grupperna för svar (beslag eller icke-beslag) med hjälp av ett exakt Fisher-test.
      OBS: Ett djur anses vara "skyddat" från anfall om det har ett anfall i steg 2 eller mindre och icke-skyddade djur har anfall i steg 3-5.
    3. Analysera tolerabilitetsdata på samma sätt, som antalet djur med beteendestörningar eller toxiska effekter / antalet testade i varje grupp. Notera eventuella biverkningar, inklusive dödsfall.
    4. Om mindre än 50% av mössen som injiceras med fordonet griper akut, ta inte hänsyn till uppgifterna.

Representative Results

Sammansatta effekter på akuta anfall
Beteendemässiga anfall registreras om de inträffar under droginjektion (DI) eller under efterföljande AM / PM-beslagshantering / övervakningssessioner. Beslag som observerats vid hantering av anfall kan presenteras som en värmekarta, som visas i figur 2 för LEV (350 mg/kg). För analysen av anfallsbördan tas genomsnittet av de slutliga (dag 7) kumulativa värdena för anfallsbördan för den vehikelbehandlade gruppen och jämförs med Mann-Whitney U-testet med den grupp som behandlas med föreningar (värdena för anfallsbördan inkluderar de värden som samlats in vid observationen efter injektion). För substanseffekt avgör en Fishers exakta test om det finns en statistisk skillnad i effekt mellan vehikel- och läkemedelsbehandlade grupper. På samma sätt analyseras tolerabilitetsdata med Fishers exakta test. Kroppsviktsanalys utförs genom upprepade mätningar ANOVA för att bestämma förändringar under experimentets gång, liksom skillnader mellan förenings- och vehikelbehandlade möss.

Figure 2
Figur 2: En värmekarta över beteendeanfall efter testning med vehikel (0,5 % metylcellulosa) eller LEV (350 mg/kg). Två gånger dagligen injektioner inträffade 1 h före hantering och beslag observationer. Beteendemässiga anfall registrerades om de inträffade under droginjektion (DI) eller under efterföljande AM/PM-anfallshantering/övervakningssessioner. LEV (350 mg/kg) minskar signifikant antalet anfall som observerats under hanteringssessioner (35,9 % av fordonets anfallsbörda) under observationsperioden på 5 dagar. Värmekartan skapas genom att avbilda anfallssteg 1-3 i grönt, 4 i gult och 5 i orange. Den här nya figuren skapades från en publicerad datauppsättning19. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kronisk epilepsi
Förutom den rapporterade anfallsbördan under den första veckan pi, finns det flera avläsningar som kan vara användbara beroende på studien och hypotesen. Om djur hålls långsiktiga kommer en delmängd av infekterade djur att utveckla spontana epileptiska anfall vid flera veckors pi, vilket inträffar mindre ofta än akuta anfall och därför kräver EEG-registrering. För att registrera EEG från möss måste elektroder implanteras i en stereotaxisk kirurgi24. Figur 3 visar olika epileptiska händelser i den kroniska fasen genom EEG-registrering hos möss infekterade med TMEV8.

Figure 3
Figur 3: Typiska EEG-spår i den kroniska fasen (14 veckor pi) efter DA-virusinfektion hos möss. (A-C) Representativa EEG-händelser där inget beteendemotoriskt korrelat sågs, dvs (A) enstaka spikar, (B) spikkluster, (C) samt ett elektriskt, förmodligen fokalt anfall. (D-F) Representativa EEG-händelser med beteendekorrelat. Musen illustrerad i D hade anfallsliknande händelser med myokloniska ryckningar (indikerad med "M", åtföljd av rörelseartefakter), stereotypa rörelser (indikerad med "huvudpress", när musen pressade huvudet platt på marken) eller beteendestopp; "Scr" beskriver en rörelseartefakt av repor, (E) och (F) visar typiska EEG-förändringar under generaliserade konvulsiva anfall: (E) ett Racine steg 3-anfall med en varaktighet av 22 s och 1 Hz, och (F) ett steg 5-anfall med en varaktighet av 34 s och 5,4 Hz. Denna siffra har publicerats före8 och återges med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Histologi
Eftersom epilepsi och anfall vanligtvis åtföljs av hippocampus patologi hos patienter, som rekapituleras i experimentella modeller, analyserar de flesta laboratorier också hippocampus förändringar eller effekten av en potentiell antiseizure behandling på patologi. Vanligen analyserade parametrar inkluderar hippocampus neurodegeneration och krympning, samt inflammation genom märkning för specifika immuncellpopulationer. För sådana analyser, i slutet av experimentet, bedövas möss djupt tills andningsstopp inträffar och hjärtfrekvensen saktar signifikant ner eller visar arytmi. Blod avlägsnas genom intrakardiell perfusion av PBS följt av 4% paraformaldehyd (PFA)25 för att fixera vävnaden. Vävnaden bearbetas sedan genom kryosektion och (immun-)färgning26, följt av mikroskopiska analyser.

Figure 4
Figur 4: Hippocampus degeneration hos epileptiska TMEV-infekterade möss. (A,B) Cresylviolettfärgade koronala sektioner visar normal cytoarkitektur i en (A) kontrollmus (PBS) och hippocampus degeneration i en (B) TMEV-mus vid 2 månader pi. Obs: Förstorade laterala ventriklar, kollaps av alveus och gallring av det pyramidala cellskiktet. (C) Kvantifiering av denna skada visar en signifikant minskning av hippocampusområdet och en motsvarande ökning av den ventrikulära arean hos TMEV-möss (N = 7) jämfört med PBS-möss (N = 6; data är medelvärde ± SEM; p < 0,001; Elevens t-prov). (D,E) NeuN-märkning illustrerar ytterligare storleken på neuronal cellförlust i sektioner tagna vid 6 månader pi. Pilar indikerar regioner med fullständig pyramidal cellförlust. (E) Dentatgyrusen verkar vara relativt intakt även hos epileptiska möss. Skalstång = (A,B) 2 mm; (D,E) 0,5 mm. Denna siffra har publicerats före6 och återges med tillstånd från Oxford University Press. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Representativa mikrofotografier av olika svårighetsgrad av T-cellsinfiltration på grund av akut encefalit 7 dagar efter infektion. Seriella sektioner innehållande den ipsilaterala dorsala hippocampus färgades med antikroppar mot CD3 för att märka T-lymfocyter. (A, D) En normal hippocampus utan T-cellsinfiltration som den uppträdde hos låtsasinfekterade djur. (B, E) Måttlig T-cellsinfiltration som ses hos majoriteten av TMEV-infekterade möss. (C, F) En allvarlig infiltration av T-lymfocyter, som bara sågs hos några av de infekterade mössen. Denna siffra har publicerats före8 och återges med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande fil 1: Den kompletterande filen består av formuläret som används för sammansatt testning i TMEV-modellen. Sidan 1 ger en översikt över experimentupplägget. Information om beredningar av förening, vehikel och föreningslösning registreras på sidorna 1-2. Sammansatt ansökan registreras på sidan 3. Poängsättningsbladen på sidorna 4-5 används för att registrera de anfall som observerats och kvantifierats av den experimentella som utför den sammansatta injektionen. På sidan 4 kan data samlas in för burar 1-4 av 5 möss vardera, och på sidan 5 kan burar 5-8 registreras, vilket är standardantalet djur för sammansatt testning i våra händer. Poängsättningsbladen på sidorna 6-7 används av den blindade observatören som utför observation, hantering och försiktig burskakning 1 timme efter varje sammansatt injektion. Återigen kan anfallspoäng noteras för totalt åtta burar på dessa exemplariska poängblad. Den sista sidan 8 kan användas för att registrera andra observationer eller anteckningar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Detta är den första infektionsbaserade gnagarmodellen för epilepsi som möjliggör utredning av akut och kronisk anfallsutveckling. Det kommer att bidra till att identifiera läkemedelsmål och nya föreningar för förebyggande eller modifiering av sjukdomar för en av de vanligaste etiologierna för epilepsi.

Som beskrivits ovan kan det vara nödvändigt att noggrant överväga sats och virustiter för att säkerställa att en tillräcklig andel TMEV-behandlade möss uppvisar hanteringsinducerade anfall. Om djur har färre anfall än vanligt, använd en sats N = 20 djur för att verifiera virusets effektivitet. Om dess aktivitet minskar (mindre än 50%) är det dags att göra nya alikvoter och testa dem med N = 20 djur. Om de nya alikvoterna inte är effektivare bör en ny sats av viruset renas. För vissa transgena muslinjer kan det vara nödvändigt att använda en lägre viral titer; Därför bör virustitern spädas efter behov efter preliminära experiment. De flesta tillgängliga data om B6-möss härstammar från Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA eller Charles River, Sulzfeld, Tyskland); Liknande anfallsfrekvenser hos B6-möss från Harlan (Eystrup, Tyskland) har dock bekräftats8. Anfallsfrekvensen hos transgena djur med B6-bakgrund är jämförbar med vildtyp B6-möss men kan skilja sig om de genetiska förändringarna påverkar virusinvasion, inflammatoriskt svar eller neurodegeneration21. Akuta anfall observeras spontant men utlöses av hantering och buller, så det är av yttersta vikt att hantera alla djur på ett likartat sätt när anfallsfrekvensen jämförs. Behandlingssessioner två gånger dagligen har tidigare gett en hög anfallsbörda och en större andel möss som uppvisar anfall under dag 3-7 efter infektion 6,8,19. Ytterligare hanteringssessioner (dag 1 och dag 2) kan också användas för att öka anfallsbördan. Vidare kan djur observeras före varje hanteringssession för att säkerställa att spontana anfall inte uppstår. En högljudd laboratoriemiljö kan till exempel producera anfall, vilket i sin tur kan göra djur eldfasta mot hanteringsinducerade anfall under testtider.

Medan TMEV-infektion ger hanteringsinducerade anfall hos majoriteten av möss, är det okänt varför vissa djur är resistenta mot denna behandling. Som beskrivits ovan kan det vara så att elektrografiska anfall (med minimala eller inga associerade beteenden) inträffar och normalt inte kvantifieras utan samtidig EEG-registrering. Det kan också vara så att små skillnader i injektionsställe underlättar minskad viral effekt i hjärnan; Kramper har dock rapporterats efter kortikal och striatal infektion 5,6,8,9 på grund av tropism av viruset till hippocampus. För läkemedelsscreeningstudier i denna modell, för att identifiera en minskning av anfall (t.ex. en 50% minskning av anfallsbördan), krävs ett större antal djur för varje grupp (t.ex. N = 20). Dessutom kräver variationen i anfallsbeteenden i denna modell större skillnader i läkemedels- kontra fordonseffekter för att identifiera en signifikant anfallsminskning. Därför är en begränsning med denna modell kravet på större gruppstorlekar. Icke desto mindre möjliggör tillräckliga gruppstorlekar också identifiering av anti-anfall och antiinflammatoriska effekter i denna modell19.

De allra flesta observerbara anfall i denna modell inträffar under den akuta infektionsperioden. Trots förekomsten av hippocampus degeneration, immuncellsaktivering och kognitiva underskott observerade hos möss behandlade med TMEV, utvecklar endast en liten del av de behandlade djuren så småningom kroniska, spontana anfall. Denna låga totala anfallsbörda skulle kräva ett stort antal infekterade möss för att korrekt studera spontana anfall i denna modell, vilket ligger utanför omfattningen och förmågan hos många projekt. Djupelektrodimplantation och EEG-övervakning skulle också öka belastningen på försöksdjuren. Medan djupelektroder kan hjälpa till att identifiera spontan anfallsaktivitet, kan förändringar i hippocampus anatomi efter infektion göra konsekvent elektrodplacering till en utmaning.

Det akuta behovet av att identifiera nya behandlingar för epilepsi kräver utveckling av modeller som kan användas som en snabb screeningmetod för anfallseffekt. Den här modellen innehåller funktioner för att hantera denna brådskande begäran. Dessutom gör det faktum att det inte kräver någon stereotaktisk kirurgi det till en lämplig och lätt att utföra modell för undersökning av antibeslagsföreningar.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

SB stöds av ett startbidrag från FU Berlin. KSW stöds av R37 NS065434 och ALSAM Foundation. LAB stöds av en D-SPAN-utmärkelse 1F99NS125773-01. Vi tackar Robert Fujinami, Ph.D. för att ge oss Theiler-viruset och University of Utah Cell Imaging Core Facility för mikroskopistöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbent paper - - any
Analytical balance Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.) 30216542 0. 1 mg–220 g 
Animal balance Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.) STX2202 0.01 g–2200 g 
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes BD (Mississauga, ON, Canada)  BD329461 Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle - 1 mL
Daniel's strain of TMEV kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah) - 3 x 105 plaque-forming units aliquot(s)
Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany - Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol
Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7  Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) 22-363-750
Fluriso VETone (Boise, ID, U.S.A) 502017 Isoflurane 250 mL, 2%–5%
Fume absorber  Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.) - -
General Protection Disposable SMS White Lab Coats   Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) 17-100-810A
GraphPad Prism version 9  (La Jolla, CA, U.S.A.)
Ice bucket - - any
Microsoft Excel Microsoft  (Redmond, WA, U.S.A.)
Microsoft Word Microsoft  (Redmond, WA, U.S.A.)
Mouse cage - - any mouse cage holding at least 5 mice
PrecisionGlide needles  BD (Mississauga, ON, Canada) 329652 BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes - 26 G x 3/8 - 0.45 mm x 10 mm
Self-Sealing Sterilizing Pouch  Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.) NC9241087  12.6 x 25.5 cm
Small glass flask - - any, volume 25 mL
sterile PBS Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) 10010056
Stir bar Carl Roth GmbH & CO. KG X171.1 size according to volume of solution
Stir plate Carl Roth GmbH & CO. KG AAN2.1
Syringe Luer-Lok BD (Mississauga, ON, Canada) 309628 1 mL syringe only
Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.) EW-08895-23 Bath sonicator - 0.5 gal, 115 V
Vehicle solution - - depending on compound vehicle
Vortex REAX  Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Germany 541-10000-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Getts, D. R., Balcar, V. J., Matsumoto, I., Müller, M., King, N. J. Viruses and the immune system: their roles in seizure cascade development. Journal of Neurochemistry. 104 (5), 1167-1176 (2008).
  2. Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Neurotropic viral infections leading to epilepsy: Focus on Theiler's murine encephalomyelitis virus. Future Virology. 6 (11), 1339-1350 (2011).
  3. Vezzani, A., et al. Infections, inflammation and epilepsy. Acta Neuropathologica. 131 (2), 211-234 (2016).
  4. Misra, U. K., Tan, C. T., Kalita, J. Viral encephalitis and epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 6 13-18 (2008).
  5. Libbey, J. E., et al. Seizures following picornavirus infection). Epilepsia. 49 (6), 1066-1074 (2008).
  6. Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Development of postinfection epilepsy after Theiler's virus infection of C57BL/6 mice. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (12), 1210-1219 (2010).
  7. Stewart, A. M., et al. Perspectives of zebrafish models of epilepsy: What, how and where next. Brain Research Bulletin. 87 (2-3), 135-143 (2012).
  8. Bröer, S., et al. Brain inflammation, neurodegeneration and seizure development following picornavirus infection markedly differ among virus and mouse strains and substrains. Experimental Neurology. 279, 57-74 (2016).
  9. Bröer, S., et al. Viral mouse models of multiple sclerosis and epilepsy: Marked differences in neuropathogenesis following infection with two naturally occurring variants of Theiler's virus BeAn strain. Neurobiology of Disease. 99, 121-132 (2017).
  10. Loewen, J. L., Barker-Haliski, M. L., Dahle, E. J., White, H. S., Wilcox, K. S. Neuronal Injury, gliosis, and glial proliferation in two models of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 75 (4), 366-378 (2016).
  11. Bell, L. A., Wallis, G. J., Wilcox, K. S. Reactivity and increased proliferation of NG2 cells following central nervous system infection with Theiler's murine encephalomyelitis virus. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 369 (2020).
  12. Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Theiler's virus infection chronically alters seizure susceptibility. Epilepsia. 51 (8), 1418-1428 (2010).
  13. Buenz, E. J., Rodriguez, M., Howe, C. L. Disrupted spatial memory is a consequence of picornavirus infection. Neurobiology of Disease. 24 (2), 266-273 (2006).
  14. Tramoni-Negre, E., Lambert, I., Bartolomei, F., Felician, O. Long-term memory deficits in temporal lobe epilepsy. Revue Neurologique. 173 (7-8), 490-497 (2017).
  15. Ponds, R. W., Hendriks, M. Cognitive rehabilitation of memory problems in patients with epilepsy. Seizure. 15 (4), 267-273 (2006).
  16. Sloviter, R. S. Experimental status epilepticus in animals: What are we modeling. Epilepsia. 12, 11-13 (2009).
  17. Löscher, W. Animal models of seizures and epilepsy: Past, present, and future role for the discovery of antiseizure drugs. Neurochemical Research. 42 (7), 1873-1888 (2017).
  18. Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
  19. Metcalf, C. S., et al. Screening of prototype antiseizure and anti-inflammatory compounds in the Theiler's murine encephalomyelitis virus model of epilepsy. Epilepsia Open. 7 (1), 46-58 (2021).
  20. Daniels, J. B., Pappenheimer, A. M., Richardson, S. Observations on encephalomyelitis of mice (DA strain). Journal of Experimental Medicine. 96 (6), 517-530 (1952).
  21. Käufer, C., et al. Chemokine receptors CCR2 and CX3CR1 regulate viral encephalitis-induced hippocampal damage but not seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8929-8938 (2018).
  22. Libbey, J. E., et al. The effects of diet on the severity of central nervous system disease: One part of lab-to-lab variability. Nutrition. 32 (7-8), 877-883 (2016).
  23. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
  24. Kim, J. E., Cho, K. O. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy and EEG monitoring using radiotelemetry system in mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
  25. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  26. Tu, L., et al. Free-floating immunostaining of mouse brains. Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).

Tags

Neurovetenskap nummer 184
En modell för epilepsi av infektiös etiologi med Theilers murina encefalomyelitvirus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Batot, G., Metcalf, C. S., Bell, L.… More

Batot, G., Metcalf, C. S., Bell, L. A., Pauletti, A., Wilcox, K. S., Bröer, S. A Model for Epilepsy of Infectious Etiology using Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus. J. Vis. Exp. (184), e63673, doi:10.3791/63673 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter