Summary
蛍光センサーと組み合わせた高解像度の呼吸法は、ミトコンドリアの酸素消費量と活性酸素種(ROS)の生成を決定します。本プロトコールは、透過処理された坐骨神経におけるミトコンドリア呼吸数およびROS産生を評価する技術を記載する。
Abstract
末梢神経のミトコンドリア機能障害は、末梢神経障害に関連するいくつかの疾患を伴い、自己免疫疾患、糖尿病、感染症、遺伝性疾患、および腫瘍を含む複数の原因によって引き起こされる可能性がある。マウス末梢神経におけるミトコンドリア機能の評価は、サンプルサイズが小さいこと、組織内に存在するミトコンドリアの数が限られていること、およびミエリン鞘が存在するため、困難な場合があります。この研究で説明した技術は、ミトコンドリアを組織から単離する代わりに、筋線維に使用されるものから適応した独自の透過処理プロトコルを使用して、坐骨神経ミトコンドリア機能を評価することによって、これらの課題を最小限に抑えます。Amplex Red/Peroxidaseで蛍光反応種産生を測定し、サポニン透過神経における異なるミトコンドリア基質および阻害剤を比較することにより、ミトコンドリア呼吸状態、活性酸素種(ROS)、およびミトコンドリア複合体の活性を同時に検出することができました。したがって、ここで提示する方法は、他の技術によるミトコンドリア機能の評価と比較して利点を提供する。
Introduction
ミトコンドリアは、細胞の生存率を維持するために不可欠であり、エネルギー代謝(グルコース、アミノ酸、脂質、ヌクレオチド代謝経路)などの多数の細胞機能を実行します。活性酸素種(ROS)産生の主要な部位として、ミトコンドリアはアポトーシスなどのいくつかの細胞シグナル伝達プロセスの中心であり、鉄硫黄(Fe-S)クラスターの合成、ミトコンドリアタンパク質の輸入と成熟、およびそれらのゲノムとリボソームの維持に関与しています1,2,3。ミトコンドリア膜ダイナミクスネットワークは、融合および核分裂プロセスによって制御され、彼らはまた、品質管理およびマイトファジー4,5,6のための機械を有する。
ミトコンドリア機能障害は、癌、糖尿病、および肥満などのいくつかの病理学的状態の出現と関連している7。ミトコンドリア機能の障害は、アルツハイマー病8,9、パーキンソン病10,11、筋萎縮性側索硬化症12,13、およびハンチントン病14,15のように、中枢神経系に影響を及ぼす神経変性障害において検出される。.末梢神経系において、軸索におけるミトコンドリア機能の喪失は、ギラン・バレー症候群16、17などの免疫神経障害において観察され、軸索における高いミトコンドリアROS産生と関連して、これらの事象はシュワン細胞18におけるMAPキナーゼ活性化をもたらす。これは、ミトコンドリア生理学が部位特異的細胞だけでなく、組織全体にとって不可欠である可能性があることを示しています。HIV関連遠位感覚多発ニューロパチー(HIV-DSP)において、ミトコンドリアは、転写のトランスアクチベーター(HIV-TAT)タンパク質がHIVを効率的に複製することを可能にするメカニズムにおける役割、ならびにHIV感染の病因における他のいくつかの役割を有する19,20。
坐骨神経ミトコンドリア生理学の評価は、神経障害を調査するための必須の標的として浮上している7、21、22。糖尿病性神経障害において、プロテオミクスおよびメタボローム解析は、糖尿病におけるほとんどの分子変化が坐骨神経ミトコンドリア酸化的リン酸化的リン酸化および脂質代謝に影響を及ぼすことを示唆している7。これらの変化はまた、肥満誘発性糖尿病の初期の徴候であるように思われる21。化学療法誘発性疼痛性神経障害のマウスモデルにおいて、坐骨神経におけるミトコンドリア障害は、酸化的リン酸化22の減少、およびミトコンドリア複合体活性、膜電位、およびATP含量の減少として検出される23。しかし、いくつかのグループが神経障害におけるミトコンドリア機能障害を挙げているが、これらの研究は、ミトコンドリア膜の保存のないミトコンドリア複合体における活性の測定に限定されており、ミトコンドリア完全性の評価またはミトコンドリアATP産生のパラメータとしてのATP含量の測定を欠いている。一般に、ミトコンドリアの酸素消費量とROS産生を適切に評価するには、パーコール/スクロース勾配での微分遠心分離によるミトコンドリアの単離が必要です。ミトコンドリアの単離はまた、大量の組織が必要であり、ミトコンドリアの喪失および破壊のために、坐骨神経組織の制限因子となり得る。
本研究は、ミトコンドリアの酸素消費と坐骨神経におけるROS産生としてミトコンドリア生理学を測定し、ミトコンドリア膜を保存し、ミトコンドリアを単離する必要なしに測定するプロトコルを提供することを目的とする。このプロトコルは、高分解能呼吸法(HRR)による透過処理筋線維24 における酸素消費測定値から適合される。この手順の利点は、坐骨神経などの少量の組織におけるミトコンドリアを評価し、その 場でミトコンドリアパラメータを評価し、それによってミトコンドリア環境、構造、および生体エネルギープロファイルを保存し、生理学的に信頼できる結果を得る可能性である。ミトコンドリアの呼吸状態は、ミトコンドリアの生体エネルギー学およびミトコンドリア膜完全性のためのシトクロムc係数を適切に評価するために、坐骨神経透過後の基質および阻害剤を用いて決定され、ミトコンドリア電子輸送系(ETS)の評価および必須パラメータの計算のステップのガイドを提供する。この研究は、末梢神経障害など、坐骨神経代謝が関与する病態生理学的メカニズムの質問に答えるためのツールを提供することができる。
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Protocol
現在のプロトコルは、研究における動物の使用に関する倫理委員会、CCS/UFRJ(CEUA-101/19)、および実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所のガイドラインによって承認されています。坐骨神経は生後4ヶ月の雄性C57BL/6マウスから単離され、施設ガイドラインに従って子宮頸部脱臼によって安楽死する。プロトコルのステップは、ミトコンドリアの劣化を避けるために最適化されています。したがって、このプロトコールでは、マウス坐骨神経組織郭清および透過処理の前に、ポラログラフィック酸素センサの較正を実施した。
1. 試薬の調製
- 組織保存バッファー(TPバッファー)を調製する。
- 10 mM の Ca-EGTA バッファーと 0.1 μM の遊離カルシウム、20 mM のイミダゾール、20 mM のタウリン、50 mM の K-MES、0.5 mM の DTT、6.56 mM の MgCl2、5.77 mM の ATP、15 mM のホスホクレアチン ( 材料表を参照)、pH 7.1。-20°Cで保管してください。
- ミトコンドリア呼吸バッファー(MRバッファー)を用意する。
- 0.5 mM のK2EGTA、3 mM の MgCl2、60 mM の MES、20 mM のタウリン、10 mM の KH2PO 4、20 mM の HEPES、110 mM の D-スクロース、1 mg/mL の BSA (脂肪酸フリー)(材料表を参照)、pH 7.4。-20°Cで保存してください。
- 5mgのサポニン( 材料表を参照)を1mLのTP緩衝液に溶解してサポニン原液を調製し(ステップ1.1)、氷上に保管する。サポニンは新しく調製されています。
- 粉末( 材料表を参照)をDMSOで再懸濁してAmplex Redを調製し、2mMのストック濃度を得て、光から保護されたバイアル中で-20°Cで保存する。
注:凍結および融解によるプローブの摩耗を避けるために、6ヶ月25以内の保管のために小さなアリコートを作成してください。
2. 高解像度呼吸法(HRR)用のポラログラフィック酸素センサーの校正
- 器具とシリンジのHRRチャンバーを清掃します( 材料表を参照)。
- HRRチャンバーを開き、上部まで蒸留水で満たし、5分間3倍にかき混ぜる。エタノールで繰り返し、次に水でもう一度繰り返します。ストッパーとシリンジを水/エタノール/水でそれぞれ3倍ずつ洗浄します。
- HRRソフトウェアで次のキャリブレーション設定を適用します( 材料表を参照)。
- HRRソフトウェア制御では、実験温度(37°C)、酸素センサー(ゲイン、2、分極電圧、800mV)、アンペロメトリックセンサー(ゲイン、1000、分極電圧、100mV)のパラメータを追加します。
- 酸素センサーを校正します。
- 2.1 mLのMRバッファーをピペット(ステップ1.2)各チャンバーに入れます。ストッパーで閉じ、気泡が形成されるまでチャンバーに空気を吸い込みます。質量あたりの酸素流束が安定するまで、校正モードで37°Cで1時間攪拌します。
- ソフトウェア内のポラログラフィック酸素センサの空気較正を、製造元のプロトコル24に従って実行する。
メモ: キャリブレーション手順は、実験の前に 1 回だけ実行されます。追加の実験は、同じ呼吸媒体および温度で、単にチャンバを洗浄した後に行うことができる(ステップ2.1)。
3. 坐骨神経の解剖と透過
- 以下の手順に従って坐骨神経を取り外します。
- ケージから取り出した後、頸部脱臼によって動物を安楽死させ、ベンチで休むように穏やかに拘束する。
- 安楽死させた動物では、背骨の近くから始めて、太ももを足に向かって進み、腰のはさみで切開します。神経に付着した皮膚や筋肉を取り除き、坐骨神経全体を切断して取り除きます。
- 直ちに組織を秤量し、冷たいTBバッファー(4°C)で満たされたバイアルに入れます。氷上で手順 3.2 ~ 3.3 を実行します。
注:ウェットティッシュ重量は、次の手順で酸素消費量とROS生産フローを正規化するために使用されます。組織をすぐに計量できない場合は、冷たいTBバッファーで保存してください。この手順は新鮮な組織で行われ、ミトコンドリアの損傷を避けるために凍結してはなりません。
- 組織の準備のために、坐骨神経をそれを覆うのに十分なTPバッファーでペトリ皿に入れます。神経の一端を鉗子で持ち、もう一対の鉗子で神経束を水平に引き抜きます。
メモ:この手順は、組織の劣化を避けるために10分以内に行う必要があります。組織は、以前の白い不透明な組織とは反対側の透明な霧の層として視覚化できると、準備が整います(図1)。 - まず、組織透過処理のために1mLのTPバッファーを含む小さな皿にスプレイ組織を移します。透過処理を開始するには、1 mLのTP Bufferと10 μLのサポニンを含むディッシュに鉗子で組織を移します(原液から、ステップ1.3)。
- マイクロプレートシェーカーで30分間静かに振とうした後、鉗子で組織をMRバッファー(1mL)を含む新鮮な皿に移し、10分間静かに振盪する。鉗子で組織を較正されたHRRチャンバーに移す。
4. 酸素消費量とROS生産量測定
- HRRチャンバーを2.1 mLのMRバッファーで満たし、Amplex Red(ステップ1.4)を終濃度5 μM、ペルオキシダーゼを2 U/mLに加え、透過処理した坐骨神経を追加します(ステップ3)。
- 機器の蛍光センサーを接続し、ソフトウェアのコントロールセクションのライトをオフにして、 オキシグラフへの接続を押します。ソフトウェアの「編集プロトコル」に、ステップ3.1.3で測定した組織重量を挿入します。
- 「レイアウト」に移動し、「単位サンプルあたりの特定のフラックス」オプションを選択し、プロットを選択して酸素消費量の読み出しと、必要に応じてH2O2生産に同時にアクセスします。約10分待ちます。
注:この時間は、基質(基礎)を追加せずに酸素消費の基礎流れを安定させるために必要です。さらに注入する前に、酸素の流れが安定していることを確認してください。 - H2O2の2つのパルスを、それぞれ1つずつ最終濃度260μMに注入し、チャンバ内で後で較正する。
- ミトコンドリア複合体II基質であるコハク酸塩20μL( 材料表参照)を注入し、ミトコンドリア電子伝達系を活性化する。
注:この時点で異なるミトコンドリア基質を添加して、異なる複合体によるミトコンドリア機能を評価することができる。ミトコンドリア複合体IおよびIIの基質を変化させた代表的な結果を、図2および図3に示す。この時点で、O2消費量とH2O2生成の増加が、同時に、図3に観察される。 - 20 μLのアデノシン二リン酸(ADP)を加えて、アデノシン三リン酸(ATP)合成を活性化する。
注:ADPはATP合成を刺激し、膜電位を低下させます。O2消費量の増加およびH2O2の生成の減少が観察されると予想されている26,27。 - 順番に、膜完全性の指標として5μLのシトクロムc( 材料表を参照)を加える。
注:組織がよく調製され、透過処理されている場合、シトクロムcは酸素消費量を15%以上増加させてはならない。この問題が発生した場合は、トラブルシューティングのセクションを参照して推奨事項を確認してください。 - O2消費量のさらなる減少が観察されなくなるまで、0.2μg/mLのオリゴマイシンのアリコート(材料表を参照)で滴定する。
注:オリゴマイシンは、ATP合成を阻害することによって作用し、O2の流れの減少および高い膜電位26,27によって好まれるH2O2形成の増強をもたらす。 - 0.5 μmol/Lのシアン化カルボニル4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)( 材料表を参照)のアリコートで滴定し、ミトコンドリアアンカプラを、O2 消費量のさらなる増加を観察できないまで滴定する。実験を終了するには、2 μlのアンチマイシンAを終濃度5 μMに注入し、流れ安定化を待ちます。
注:FCCP注入後の膜電位散逸により、H2O2産生の減少が観察される。アンチマイシンAは複合体IIIを阻害し、それによって電子の流れを防止する。したがって、ミトコンドリア依存性O2消費が損なわれ、質量当たりの酸素流束を減少させ、電子漏れを刺激し、H2O2産生を増加させる26、27。 - コマンドバーに移動し、ソフトウェアで「多感覚」を検索し、 コントロールをクリックしてファイルを保存し、切断>します。
注:他の基質および阻害剤の添加は、研究中の質問に従って行うことができる。代表的な結果に例を記載する。H2O2較正は、実験を終えた後に、製造業者のプロトコル28に従って行われる。 - 保存したファイルを開き、「質量あたりの酸素フラックス」トレースを選択して、実験的な酸素消費結果を取得します。 Shift + マウスの左ボタンを押して、注射間のウィンドウを手動で選択します。
- マークス>統計に移動して、基質/阻害剤/非結合プロトコルの各注入の結果を視覚化します。H2O2製造の場合、「アンプスロープ」トレースで同じ手順を実行します。
メモ: ウィンドウを選択するときは、酸素(またはH2O2)がより安定して一定であるウィンドウを選択することで、ボリュームインジェクションのアーチファクトを回避してください。選択されたウィンドウの例は、代表的な結果(図2および図3)の黒い中括弧で表されます。
- マークス>統計に移動して、基質/阻害剤/非結合プロトコルの各注入の結果を視覚化します。H2O2製造の場合、「アンプスロープ」トレースで同じ手順を実行します。
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Representative Results
透過処理された坐骨神経によるミトコンドリア酸素消費量を図2に表す。赤色のトレースは、単位質量あたりのO2フラックスをpmol/s.mgで表します。内因性基質(日常的な呼吸)で基礎酸素消費を記録した後、コハク酸塩(SUCC)を注入して複合体II(コハク酸デヒドロゲナーゼ)駆動呼吸を記録し、酸素消費率の増加をもたらす。順番に、飽和濃度のADPが添加され、ATP合成酵素を活性化し、酸化的リン酸化を駆動する。これは、ミトコンドリア呼吸のリン酸化状態をもたらす。リン酸化状態呼吸とは、ATP合成酵素がATP26を生成するためのプロトン原動力としてプロトン勾配によって形成される膜電位を用いて、ADP+Pi(無機リン酸)からATPを生成できることを意味する。ATP合成酵素活性によって促進される膜電位の低下に伴い、酸素消費が促進され、酸素流の増加が観察される。外因性シトクロムc(CYTC)の添加は、呼吸の最小限の刺激のみを促進し、この調製物のミトコンドリア外膜完全性を認定した。組織の透過化は、膜の完全性およびシトクロムcの喪失を損傷する可能性がある。10%〜15%を超える呼吸数の増加は、ミトコンドリアの損傷および不十分な組織調製を示す28,29。この代表的な結果では、呼吸数が8.7%増加し、組織標品の良質を示している(表1)。オリゴマイシン(OLIGO)による滴定は、最大容量評価30を妨げる可能性のあるオリゴの濃度に達するのを避けるために、最小限の用量で行う必要がある。オリゴによるATP合成酵素の阻害−またはオリゴマイシン26による呼吸の状態4−は、酸素消費流の減少をもたらした。ミトコンドリアアンカプラ試薬であるFCCPによる滴定は、ミトコンドリア膜電位を消散させ、呼吸流束を刺激し、電子移動の最大容量(ETS最大容量)を表示します。実験の最後に、複合体IIIの阻害剤である抗マイシンA(AA)を注入して、ミトコンドリア呼吸を阻害し、非ミトコンドリア酸素消費(残留呼吸)を記録する(図2)。この代表的な実験で記録された絶対酸素流は、表1に計算される。
Amplex Redによる過酸化水素(H2O2)を蛍光センサーで検出することによって決定される活性酸素産生(ROS)と同時にミトコンドリア酸素消費量を分析する可能性は、生体エネルギープロファイルを決定するための大きな利点であり、多様な病状におけるミトコンドリア機能障害を検出するための標準的なツールです。ミトコンドリアETSに燃料を供給するために異なる複合体に異なる基質を添加することも、ミトコンドリア機能障害の特定の部位に関するより多くの情報をもたらすことができる。図3は、ETSに燃料を供給する異なる基質の存在下での酸素消費量(図3A)とROS生産(図3B)の同時測定で示されている。基礎呼吸を記録した後、ピルビン酸+リンゴ酸(PM)がミトコンドリア複合体Iの基質としてチャンバーに添加され、酸素消費フラックスが増加する。複合体IIの基質であるSUCCの添加も呼吸を増加させるが、パルミトイルカルニチン(PC)のさらなる添加は、以前の基質添加と比較して酸素流を増加させず、PMおよびSUCCがすでにミトコンドリアユビキノン部位を飽和させたか、または脂肪酸酸化の欠如を有する可能性があることを示唆している。予想通り、基質添加後にROS生産量も増加し、ETSから逃げてROSを形成する酸素の漏れを表しています(図3B、緑色の痕跡)。飽和濃度にADPを添加すると、酸素消費量が増加し、ATP形成が促進され(図3Aの赤色の痕跡)、ROS産生が減少する(図3B、緑色の痕跡)。CYTCの添加は酸素流量を6.8%増加させるだけで、ミトコンドリア膜の完全性を確認する。オリゴによる滴定は、酸素消費の流れを減少させ(図3Aの赤色の痕跡)、ROS産生を増加させる(図3Bの緑色の痕跡)。ADPおよびORIGOの効果は、このプロトコルにおける透過化された坐骨神経が、酸素消費の増加が膜電位の低下をもたらし、ROS産生を妨げるミトコンドリア生理学における標準的な関係を再現できることを示唆している31,32。
アンカプラに期待されるように、FCCPを添加すると、酸素消費量が最大速度まで増加し、膜電位散逸の結果としてROS産生が減少する。複合体IおよびAAの阻害剤であるロテノンの添加は、酸素消費を減少させ、ROS形成を増加させ(図3A、B)、透過化された坐骨神経におけるミトコンドリア生理学および生体エネルギープロファイルが保存されることを確認する。この実験で記録された酸素流の絶対値は、 表2に計算される。
図1:ミトコンドリアの透過処理のための坐骨神経の準備。すべての手順は氷上で実行する必要があります。(A)安楽死マウスから坐骨神経を抽出し、組織保存バッファーを入れたシャーレに4°Cで入れる。(C,D)組織は、元の白色不透明な管状構造(A)ではなく、半透明の房に解剖されると準備ができている。スケール バー = 1 cm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウスの透過坐骨神経におけるミトコンドリア酸素消費の代表的な結果。 この実験は、安楽死マウスからの1つの坐骨神経抽出物の代表的な痕跡である。坐骨神経は、プロトコルのセクションで説明したように、以前に透過処理されました。注射は、特定の時間に矢印として示される。SUCC:コハク酸;ADP:アデノシン二リン酸;Cyt c:シトクロムc;オリゴ:オリゴマイシン;FCCP:カルボニルシアン化物4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン;AA:アンチマイシンA.リアルタイム酸素濃度を[nmol/mL](青色のトレース)として、酸素消費速度を単位質量あたりのフラックス[pmol/(s.mg)](赤色のトレース)として示します。黒い中括弧は、各注射後の結果のために選択された酸素消費率の窓を表す。基底は基質のない呼吸を指す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:透過処理マウス坐骨神経におけるROS産生に結合したミトコンドリア酸素消費の結果。安楽死マウスからの1つの坐骨神経抽出物の代表的な痕跡が示されている。坐骨神経は、プロトコルのセクションで説明したように、以前に透過処理されました。注射は、特定の時間に矢印として示される。H2O2:過酸化水素;PM:ピルビン酸/リンゴ酸;SUCC:コハク酸;PC:パルミトイル - カルニチン;ADP:アデノシン二リン酸;Cyt c:シトクロムc;オリゴ:オリゴマイシン;FCCP:カルボニルシアン化物4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン;腐敗: ロテノン;AA:アンチマイシンA.(A)のリアルタイム酸素濃度を[nmol/mL](青色のトレース)として、単位質量あたりのフラックスとしての酸素消費速度[O2pmol/(s.mg)](赤色のトレース)を示す。(B)ROS産生は、較正後のH2O2蛍光(紫色の痕跡)およびH2O2の生成傾き[pmol/(s.mg)](緑色の痕跡)として実証される。黒い中括弧は、各注射後の結果のために選択された酸素消費率の窓を表す。基底は基質のない呼吸を指す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 基板 | 追加 | 酸素消費率 |
| 質量あたりのフラックス(pmol/[s.mg]) | ||
| 基礎(追加なし) | 何一つ | 5.9 |
| コハク酸 (SUCC) | 10mMの1回追加 | 16.9 |
| ティッカー | 1 μM の 1 回の添加 | 28.5 |
| シトクロムc (CYTC) | 10μMの1回添加 | 31 |
| オリゴマイシンA(オリゴ) | 0.2 μg/mL の添加による滴定 | 21.9 |
| ティッカー | 0.5 μM の添加による滴定 | 31.1 |
| アンチマイシンA(AA) | 5 μM の 1 回の添加 | 11.3 |
表1:基質/アンカプラー/インヒビター/滴定(SUIT)プロトコルおよびマウス透過坐骨神経における酸素消費率の結果。 酸素消費量は、SUITプロトコルの各添加後の[O2pmol/(s.mg)]で表される。結果は、 図 2 にマークされた選択したウィンドウの平均によって得られます。
| 基板 | 追加 | 酸素消費量 (O2 pmol/[s.mg]) | ROS生産 (H2O2 pmol/[s.mg]) |
| 基礎(追加なし) | 何一つ | 5.77 | 0.53 |
| ピルビン酸+リンゴ酸(PM) | 5 mM + 2.5 mM の 1 パルス | 7.17 | 0.58 |
| コハク酸 (SUCC) | 10mMの1回追加 | 14.06 | 0.75 |
| パルミトイルカルニチン(PC) | 25 μM の 2 つのパルス | 14.68 | 0.79 |
| ティッカー | 1 μM の 1 回の添加 | 22.9 | 0.25 |
| シトクロムc (CYTC) | 10μMの1回添加 | 24.36 | 0.09 |
| オリゴマイシンA(オリゴ) | 0.2 μg/mL の添加による滴定 | 17.03 | 0.5 |
| ティッカー | 0.5 μM の添加による滴定 | 23.98 | 0.16 |
| ロテノン (ROT) | 1μMの1回添加 | 19.75 | 0.48 |
| アンチマイシンA(AA) | 5 μM の 1 回の添加 | 4.08 | 0.53 |
表2:基質/アンカプラ/インヒビター/滴定(SUIT)プロトコルと酸素消費率に結合したROS産生の結果マウス透過化坐骨神経。酸素消費量は、SUITプロトコールの各添加後の[O2pmol/(s.mg)]および[H2O2pmol/(s.mg)]によるROS生成で表される。結果は、図 3 にマークされた選択したウィンドウの平均によって得られます。
| ミトコンドリア機能のパラメータ | 酸素消費率からの計算 |
| 基礎呼吸 | 基礎呼吸(基質を添加しないフラックス)28 |
| 残留酸素消費量(ROX) | [AA添加後のフラックス]28名 |
| 複雑なIリーク呼吸 | [PM添加後のフラックス] – [ROX]28,37 |
| 複雑なIIリーク呼吸 | [SUCC添加後のフラックス] – [ROX]28,37 |
| リン酸化状態(オックスフォス容量) | [ADP添加後のフラックス] – [ROX]28,43 |
| 非-リン酸化状態(リーク呼吸) | [オリゴマイシン添加後のフラックス] – [ROX]28 |
| 呼吸制御比 | [リン酸化状態/非リン酸化状態]28,43の |
| ETS の容量 | [FCCP添加後のフラックス] – [ROX]28,37 |
表3:マウス透過処理坐骨神経におけるミトコンドリア機能の評価のためのパラメータ計算。 酸素消費率によるミトコンドリア生理評価式のパラメータ。
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Discussion
神経障害に伴ういくつかの疾患または状態は、危険因子としてミトコンドリア機能障害を有する。末梢神経のミトコンドリア機能の評価は、これらの神経変性状態でミトコンドリアがどのように作用するかを解明するために不可欠です。ミトコンドリア機能の評価は、単離方法の難しさおよび材料の不足のために面倒である。従って、ミトコンドリアの単離を必要としない組織透過技術の開発が不可欠である。
透過組織におけるミトコンドリア機能を評価するには、細胞呼吸を妨げることなく細胞原形質膜を透過できる化学物質を選択することが重要です。坐骨神経などの末梢神経において、ミエリン組成は約70%が脂質であり、そのほとんどはコレステロール33,34である。コレステロール分子と相互作用するサポニンおよびジジトニンなどの透過剤の選択は、他の細胞区画に干渉することなくミトコンドリア機構への基質アクセスを可能にする細孔をもたらす35、36。このプロトコールでは、Pesta and Gnaiger24によって記載されたサポニンによる筋線維透過処理のための十分に確立された方法が坐骨神経に適合している。透過処理手順は、目的のミトコンドリアパラメータを記録するために必要な基質へのアクセスを可能にするために、組織分離に関する別の重要なステップを含む。本研究は、ステップを説明し、図1に満足のいく組織分離のためのイラストが提供される。
ミトコンドリア呼吸数記録は、ミトコンドリア複合体の機能不全、酸化的リン酸化障害、またはミトコンドリアの破壊に関する違いを確立するために不可欠である。呼吸状態およびミトコンドリアパラメータは、ChanceおよびWilliams26によって定義される。この記事では、日常的な呼吸は、ミトコンドリアの酸素消費が外因性基質を加えずに記録された場合の基礎呼吸として定義されます。複合体容量 - 複合体IまたはIIの基質が燃料ミトコンドリア酸素消費に添加されるとき、漏れ呼吸としても命名される。リン酸化状態 - ADPが複合体基質の配列に付加され、ATP合成を駆動する場合;非リン酸化状態 - すべてのADPがATPに形成されるか、またはATP合成酵素阻害剤、オリゴマイシン(または状態4);ETS最大容量 - ミトコンドリアアンカプラFCCPが追加されたとき;ロテノンおよび抗マイシンAの添加後の残留酸素消費量(ROX) - 酸素消費量がミトコンドリアに関連しない場合。HRRによる坐骨神経組織におけるミトコンドリア機能評価のためのこの研究で記載された技術は、多数の呼吸状態を決定し、同じサンプル内の固有のミトコンドリア機能を計算することを可能にする。基質/非結合/阻害剤プロトコル試験結果を使用して、表3に示すように、呼吸制御比/因子を37計算できるミトコンドリア機能のパラメータを導出することができる。これらのパラメータの評価は、絶対漏出率と最大ミトコンドリア呼吸とを組み合わせ、診断値24、35、36、37、38、39のデータを上げる。
末梢神経におけるミトコンドリア機能障害が文献に引用されているが、これらのパラメータを実証することには限界がある。化学療法誘発性神経障害モデルでは、化学療法剤オキサリプラチンによる治療におけるミトコンドリア膜電位の低下、および複合体I、II、およびIIIのin vitro活性の低下が末梢神経(伏在神経)の感覚軸索において観察される40、41。しかし、膜電位が複合体の活性に及ぼす制御や、ミトコンドリア機能評価に必須のパラメータである酸化的リン酸化によるATPの形成に関する情報が不足している。また、ジギトニンで透過したSprague-Dawleyラットから解離した坐骨神経では、酸素消費の記録はリン酸化状態についてのみ実証されるが、ATPase阻害剤またはアンカプラー22の存在下での酸素消費とは比較されない。本方法では、通常state3/state4(またはリン酸化/非リン酸化状態)から算出される単離ミトコンドリアの呼吸制御比と比較して、透過神経の呼吸制御比(表3)を算出することができる。この研究で提供された方法を用いて、複雑なI、II容量(ミトコンドリア膜の完全性の維持)およびフラックス制御比を評価し、最大容量呼吸および残留酸素消費を達成することが可能である。
ミトコンドリア酸素消費評価のための坐骨神経透過のための異なる方法が文献に記載されている。坐骨神経透過化のための技術は、サポニン治療および渦パルスによる透過化を伴うプロトコルにおいて実証される。しかし、リン酸化状態と最大容量のみが実証された41。さらに、同じパラメータについてここに提示された値を比較すると、Cooperらによって観察された酸素流束は 70%低く、攪拌法に関連するミトコンドリア膜に損傷があることを実証した。本プロトコールにおいて、組織分離は、ミトコンドリア膜完全性を維持し、シトクロムcの添加後の酸素流束のわずかな増加によって確認される。これは、すべてのミトコンドリアパラメータを記録することを可能にする特徴であり、ミトコンドリア酸化的リン酸化および機能の完全な記録を提供する。コラゲナーゼを用いた坐骨神経透過法では、酸素フラックス値はここに提示されたものに匹敵するが、シトクロムcを添加した後に20%近くの増加が観察され、ある程度のミトコンドリア膜損傷を示唆している21。この記事に記載されているプロトコルでは、シトクロムc添加後の酸素フラックスの6.3%〜8.7%の増加のみが観察され、ミトコンドリア膜の完全性を維持し、酸素消費記録を最適化する上での本方法の利点が確認された。
ミトコンドリアは、坐骨神経組織における多様なシグナル伝達プロセスおよび神経障害における病態生理学に関連するメカニズムに関連する活性酸素種(ROS)発生の主要な部位である42,43。このプロトコルにより、酸素消費と同時に蛍光センサーで過酸化水素生成にアクセスすることができました。図3で観察されるように、ROS産生はミトコンドリア呼吸状態の変化に敏感であり、ミトコンドリア完全性状態を確認し、ミトコンドリア機能記録を最適化する。
細胞外フラックスアナライザー(EFA)などの他の方法は、酸素消費量を記録する蛍光センサーに基づいて、自動ハイスループットスクリーニング装置で培養細胞(シュワン細胞や軸索など)の末梢神経ミトコンドリア機能を評価できます。しかし、HRRなどのポラログラフィックセンサーを使用することには、特にリアルタイムで実験を追跡し、基質/阻害剤を複数回注射する能力など、いくつかの利点があります。これにより、これは、1回の実験におけるミトコンドリアにおけるより多くの複雑な機能の評価を可能にし、かつ消耗品24、35、38、39の低コスト化を可能にする。EFAと比較してHRRを使用することの欠点は、培地酸性化(解糖系フラックスの分析用)用のセンサーがなく、ワークフロー能力が限られているため、一度に2つのサンプルしか使用できないことです。
HRRに必要な組織透過化技術の限界は周知である。それらには、ADPが制限されているときにミトコンドリアを評価できないこと、および単離されたミトコンドリアと比較して非結合呼吸数が低下することが含まれる。しかし、ここで説明するサポニン - 坐骨神経透過プロトコル - Pesta and Gnaiger24 による筋線維透過プロトコルの適応として - は、ミトコンドリアの完全性を損なうことなく、ミトコンドリア呼吸状態およびミトコンドリアパラメータの評価を可能にする。また、ミトコンドリアを単離するための悪名高い制限を持つ組織である坐骨神経における酸素消費とROS産生を同時に記録することを可能にする。したがって、このプロトコルは、末梢神経におけるミトコンドリア機能のより良い評価を可能にし、末梢神経を苦しめる病態生理学的状態におけるミトコンドリアの役割の調査において研究者に利点を提供することができる。
トラブルシューティング
酸素消費フラックスの15%以上にシトクロムcを添加した後にO2消費量が増加する場合、透過処理手順が非常に強く、ミトコンドリア構造に損傷を与えたことを示す。その場合は、捨てて、より穏やかな神経分離で解剖を再開し、手順を繰り返します。注入されたいくつかの試薬がミトコンドリアの酸素消費またはH2O2産生において期待される効果を示さない場合、それはおそらくミトコンドリア阻害剤によるチャンバー汚染によるものである。この場合、(1)チャンバーおよびシリンジを洗浄した後に実験を再開する(ステップ2.1)か、(2)ステップ2.1を実行する前に組織単離ミトコンドリアまたはホモジネートのサンプルを追加する。これらのサンプルの添加は、ミトコンドリア阻害剤を吸収し、洗浄工程を改善する。
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Disclosures
著者らには開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、Instituto Serrapilheira、Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)、Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)、Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil(CAPES)の資金提供を受けた。アントニオ・ガリーナ・フィーリョ博士、モニカ・モンテロ・ロメリ博士、クラウディオ・増田博士の研究室施設への支援、マーサ・ソレンソン博士の論文改善のための親切で貴重なコメントに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
| Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
| DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
| Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
| O2K - Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
| O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
| OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
| Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
| Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
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