Summary
Högupplöst respirometri kopplad till fluorescenssensorer bestämmer mitokondriell syreförbrukning och generering av reaktiva syrearter (ROS). Det nuvarande protokollet beskriver en teknik för att bedöma mitokondriella andningsfrekvenser och ROS-produktion i den permeabiliserade ischiasnerven.
Abstract
Mitokondriell dysfunktion i perifera nerver åtföljer flera sjukdomar associerade med perifer neuropati, som kan utlösas av flera orsaker, inklusive autoimmuna sjukdomar, diabetes, infektioner, ärftliga störningar och tumörer. Att bedöma mitokondriell funktion i musperifera nerver kan vara utmanande på grund av den lilla provstorleken, ett begränsat antal mitokondrier som finns i vävnaden och närvaron av en myelinmantel. Tekniken som beskrivs i detta arbete minimerar dessa utmaningar genom att använda ett unikt permeabiliseringsprotokoll anpassat från ett som används för muskelfibrer, för att bedöma ischiasnervens mitokondriella funktion istället för att isolera mitokondrierna från vävnaden. Genom att mäta fluorimetrisk reaktiv artproduktion med Amplex Red/Peroxidas och jämföra olika mitokondriella substrat och hämmare i saponinpermeabiliserade nerver var det möjligt att detektera mitokondriella andningstillstånd, reaktiva syrearter (ROS) och aktiviteten hos mitokondriella komplex samtidigt. Därför erbjuder metoden som presenteras här fördelar jämfört med bedömningen av mitokondriell funktion med andra tekniker.
Introduction
Mitokondrier är viktiga för att upprätthålla cellviabilitet och utföra många cellfunktioner såsom energimetabolism (glukos, aminosyra, lipid och nukleotidmetabolismvägar). Som den primära platsen för produktion av reaktiva syrearter (ROS) är mitokondrier centrala i flera cellsignaleringsprocesser såsom apoptos och deltar i syntesen av järn-svavel (Fe-S) kluster, mitokondriell proteinimport och mognad och underhåll av deras genom och ribosomer 1,2,3. Mitokondriella membrandynamiknätverket styrs av fusions- och fissionsprocesser, och de har också maskiner för kvalitetskontroll och mitophagy 4,5,6.
Mitokondriell dysfunktion är förknippad med uppkomsten av flera patologiska tillstånd som cancer, diabetes och fetma7. Störningar i mitokondriell funktion detekteras vid neurodegenerativa störningar som påverkar centrala nervsystemet, som vid Alzheimers sjukdom 8,9, Parkinsons sjukdom10,11, amyotrofisk lateralskleros12,13 och Huntingtons sjukdom14,15 . I det perifera nervsystemet observeras förlust av mitokondriell funktion i axoner i immunneuropati, såsom Guillain-Barré syndrom16,17, och i samband med hög mitokondriell ROS-produktion i axoner leder dessa händelser till MAP Kinase-aktivering i Schwann-celler18. Detta visar att mitokondriell fysiologi kan vara avgörande inte bara för en platsspecifik cell utan för en hel vävnad. I HIV-associerad distal sensorisk polyneuropati (HIV-DSP) har mitokondrier en roll i mekanismen genom vilken transaktivatorn för transkriptionsprotein (HIV-TAT) tillåter HIV att replikera effektivt, liksom flera andra roller i HIV-infektionspatogenes19,20.
Utvärdering av mitokondriell fysiologi i ischiasnerven har framstått som ett viktigt mål för att undersöka neuropati 7,21,22. Vid diabetisk neuropati tyder proteomiska och metabolomiska analyser på att de flesta molekylära förändringar vid diabetes påverkar mitokondriell oxidativ fosforylering och lipidmetabolism7. Dessa förändringar verkar också vara tidiga tecken på fetma-inducerad diabetes21. I en musmodell av kemoterapiinducerad smärtsam neuropati detekteras mitokondriell försämring i ischiasnerven som en minskning av oxidativ fosforylering22 och en minskning av mitokondriella komplexaktiviteter, membranpotential och ATP-innehåll23. Men även om flera grupper har citerat mitokondriell dysfunktion i neuropatier, är dessa studier begränsade till mätningar av aktivitet i mitokondriella komplex utan bevarande av mitokondriella membran, utan utvärdering av mitokondriell integritet eller mätningar av ATP-innehåll som en parameter för mitokondriell ATP-produktion. I allmänhet kräver en korrekt bedömning av mitokondriell syreförbrukning och ROS-produktion isolering av mitokondrier genom differentiell centrifugering i en percoll / sackarosgradient. Isolering av mitokondrier kan också vara en begränsande faktor för ischiasnervvävnad på grund av den stora mängd vävnad som behövs och mitokondriförlust och störningar.
Den aktuella studien syftar till att tillhandahålla ett protokoll för att mäta mitokondriell fysiologi som mitokondriell syreförbrukning och ROS-produktion i ischiasnerven, bevara mitokondriella membran och utan behov av isolerande mitokondrier. Detta protokoll är anpassat från syreförbrukningsmätningar i permeabiliserade muskelfibrer24 med högupplöst respirometri (HRR). Fördelarna med denna procedur är möjligheten att utvärdera mitokondrier i små mängder vävnad såsom ischiasnerven och utvärdera mitokondriella parametrar in situ och därigenom bevara mitokondriell miljö, struktur och bioenergetisk profil för att erhålla ett fysiologiskt tillförlitligt resultat. De mitokondriella andningstillstånden bestämdes med substrat och hämmare efter ischiasnervpermeabilisering för att korrekt bedöma mitokondriell bioenergetik och cytokrom c-koefficient för mitokondriell membranintegritet, vilket ger en guide för steg i mitokondriell elektrontransportsystem (ETS) utvärdering och beräkning av väsentliga parametrar. Denna studie kan ge verktyg för att svara på frågor i patofysiologiska mekanismer där ischiasnervmetabolism är inblandad, såsom perifera neuropatier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll är godkänt av etikkommittén för användning av djur i forskning, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) och National Institutes of Health riktlinjer för vård och användning av försöksdjur. Ischiasnerven är isolerad från fyra månader gamla manliga C57BL/6-möss, avlivad genom cervikal dislokation enligt de institutionella riktlinjerna. Protokollstegen är optimerade för att undvika mitokondriell försämring. Därför utfördes i detta protokoll kalibrering av polarografiska syresensorer före mussciatisk nervvävnadsdissektion och permeabilisering.
1. Beredning av reagenser
- Förbered vävnadsbevarande buffert (TP-buffert).
- Förbered följande reagenser i ultraren vattenlösning: 10 mM Ca-EGTA-buffert med 0,1 μM fritt kalcium, 20 mM imidazol, 20 mM taurin, 50 mM K-MES, 0,5 mM DTT, 6,56 mM MgCl2, 5,77 mM ATP, 15 mM fosfokreatin (se materialtabell), pH 7,1. Förvaras vid -20°C.
- Förbered mitokondriernas andningsbuffert (MR-buffert).
- Bered följande reagenser i ultraren vattenlösning: 0,5 mM K2EGTA, 3 mM MgCl2, 60 mM MES, 20 mM taurin, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM D-sackaros, 1 mg/ml BSA (fettsyrafri) (se materialtabell), pH 7,4. Förvaras vid -20 °C.
- Förbered saponin stamlösning genom att lösa upp 5 mg saponin (se materialtabell) i 1 ml TP-buffert (steg 1.1) och förvara den på is. Saponin tillagas nyligen.
- Förbered Amplex Red genom att återsusponera pulvret (se materialtabell) med DMSO för att erhålla en stamkoncentration på 2 mM och förvara vid -20 °C i en injektionsflaska skyddad mot ljus.
OBS: För att undvika att slita ut sonden genom att frysa och tina, gör små alikvoter för förvaring inte längre än 6 månader25.
2. Kalibrering av polarografiska syresensorer för högupplöst respirometri (HRR)
- Rengör instrumentets och sprutornas HRR-kammare (se materialtabell).
- Öppna HRR-kamrarna, fyll med destillerat vatten upp till toppen och rör om i 5 min 3x. Upprepa med etanol och sedan igen med vatten. Tvätta proppar och sprutor med vatten/etanol/vatten 3x vardera.
- Tillämpa följande kalibreringsinställningar i HRR-programvaran (se materialtabell).
- I HRR-programvarustyrning, lägg till experimentell temperatur (37 ° C), parametrarna för syresensor (förstärkning, 2; polarisationsspänning, 800 mV) och för amperometrisk sensor (förstärkning, 1000; polarisationsspänning, 100 mV).
- Kalibrera syresensorerna.
- Pipettera 2,1 ml MR-buffert (steg 1.2) i varje kammare. Stäng med propparna och dra luft in i kammaren tills en bubbla bildas. Rör om vid 37 °C i 1 timme i kalibreringsläge tills syreflödet per massa är stabilt.
- Utför en luftkalibrering av de polarografiska syresensorerna i programvaran enligt tillverkarens protokoll24.
OBS: Kalibreringssteget utförs bara en gång före ett experiment. Ytterligare experiment i samma andningsmedium och temperatur kan utföras efter enbart tvättkammare (steg 2.1).
3. Dissektion och permeabilisering av ischiasnerven
- Ta bort ischiasnerven enligt stegen nedan.
- Avliva djuret genom cervikal dislokation efter att ha tagits bort från buret och försiktigt fasthållits för att vila på bänken.
- I det avlivade djuret gör du ett snitt med sax i korsryggen, börjar nära ryggraden och fortsätter ner på låret mot foten. Ta bort hud och muskler som är fästa vid nerven och skär sedan och ta bort hela ischiasnerven.
- Väg vävnaden omedelbart och placera den i en injektionsflaska fylld med kall TB-buffert (4 °C). Utför steg 3.2-3.3 på is.
OBS: Våtvävnadsvikten används för att normalisera syreförbrukningen och ROS-produktionsflödet i följande steg. Om vävnaden inte kan vägas omedelbart, spara den i kall TB-buffert. Ingreppet utförs i färsk vävnad och får inte frysas för att undvika mitokondriell skada.
- För vävnadsberedningen, placera ischiasnerven i en petriskål med tillräckligt med TP-buffert för att täcka den. Håll ena änden av nerven med pincett, och med ett annat par pincett, dra ut nervbuntarna horisontellt.
OBS: Denna procedur måste göras på mindre än 10 minuter för att undvika vävnadsförsämring. Vävnaden kommer att vara klar när den kan visualiseras som transparenta dimmiga lager, mittemot den tidigare vita ogenomskinliga vävnaden (Figur 1). - Överför först den spelade vävnaden till en liten skål som innehåller 1 ml TP-buffert för vävnadspermeabilisering. För att starta permeabilisering, överför vävnaden med pincett till en skål som innehåller 1 ml TP-buffert och 10 μl saponin (från stamlösning, steg 1.3).
- Skaka försiktigt i en mikroplattskakare i 30 minuter, överför sedan vävnaden med pincett till en ny skål som innehåller MR Buffer (1 ml) och skaka försiktigt i 10 minuter. Överför vävnaden med pincett till en kalibrerad HRR-kammare.
4. Syreförbrukning och rosproduktionsbestämning
- Fyll HRR-kamrarna med 2,1 ml MR-buffert, tillsätt Amplex Red (steg 1.4) till en slutlig koncentration på 5 μM och peroxidas till 2 U/ml och tillsätt den permeabiliserade ischiasnerven (steg 3).
- Fäst instrumentets fluorescenssensorer, stäng av lamporna i kontrolldelen av programvaran och tryck på Anslut till oxygraf. I "redigera protokoll" i programvaran, sätt in vävnadsvikten mätt i steg 3.1.3.
- Gå till "layout", välj alternativet "specifikt flöde per enhet prov" och välj Plottar för att samtidigt komma åt syreförbrukningsavläsningen och, om så önskas,H2O2-produktionen. Vänta ~10 min.
OBS: Denna tid krävs för att stabilisera det basala flödet av syreförbrukning utan tillsatt substrat (basal). Innan ytterligare injektioner, se till att syreflödet stabiliseras. - Injicera två pulser avH2O2, var och en till en slutlig koncentration av 260 μM, för senare kalibrering i kammaren.
- Injicera 20 μL succinat (se materialtabell), ett mitokondriellt komplex II-substrat, för att aktivera det mitokondriella elektrontransportsystemet.
OBS: Olika mitokondriella substrat kan tillsättas vid denna tidpunkt för att utvärdera mitokondriell funktion av olika komplex. Representativa resultat med varierande substrat för mitokondriella komplex I och II visas i figur 2 och figur 3. Vid denna tidpunkt observeras en ökning avO2-förbrukningen ochH2O2-produktionen samtidigt i figur 3. - Tillsätt 20 μl adenosindifosfat (ADP) för att aktivera adenosintrifosfat (ATP) syntes.
OBS: ADP stimulerar ATP-syntes och minskar membranpotentialen. En ökning avO2-förbrukningen och en minskning av produktionen avH2O2förväntas observeras26,27. - Tillsätt i följd 5 μl cytokrom c (se materialtabell) som en indikator på membranintegritet.
OBS: Om vävnaden är väl förberedd och permeabiliserad bör cytokrom c inte öka syreförbrukningen med mer än 15%. Om det inträffar, kontrollera felsökningsavsnittet för rekommendationer. - Titrera med alikvoter på 0,2 μg/ml oligomycin (se materialtabell) tills ingen ytterligare minskning avO2-förbrukningen observeras.
OBS: Oligomycin verkar genom att hämma ATP-syntesen vilket leder till en minskning avO2-flödet och en förbättring avH2O2-bildningensom gynnas av den höga membranpotentialen 26,27. - Titrera med alikvoter på 0,5 μmol/l karbonylcyanid 4-(trifluormetoxi)fenylhydrazon (SE materialtabell), mitokondriell uncoupler, tills det är möjligt att inte observera någon ytterligare ökning avO2-förbrukningen . För att avsluta experimentet, injicera 2 μl antimycin A till en slutlig koncentration av 5 μM och vänta på flödesstabilisering.
OBS: En minskning avH2O2-produktionenobserveras på grund av membranpotentialens avledning efter injektion av FCCP. Antimycin A hämmar komplex III, vilket förhindrar flödet av elektroner. Därför försämras mitokondriberoendeO2-förbrukningen, vilket minskar syreflödet per massa och stimulerar elektronläckage, vilket ökarH2O2-produktionen 26,27. - Gå till kommandofältet, sök efter "multisensory" i programvaran, klicka på Control > Spara fil och Koppla bort.
OBS: Tillsatsen av andra substrat och hämmare kan utföras enligt frågan som studeras. Ett exempel beskrivs i de representativa resultaten. H2O2-kalibrering utförs efter avslutad experiment, enligt tillverkarens protokoll28. - Öppna den sparade filen och välj spåret "Syreflöde per massa" för att få de experimentella syreförbrukningsresultaten. Välj fönstret manuellt mellan injektionerna genom att trycka på Skift + Vänster musknapp.
- Gå till Marks > Statistics för att visualisera resultaten för varje injektion av substrat/hämmare/frikopplat protokoll. FörH2O2-produktion, utför samma procedur med "Amp-Slope" -spåret.
OBS: När du väljer fönstret, undvik artefakter av volyminjektioner genom att välja ett fönster där syre (eller H2O2) är mer stabilt och konstant. Exempel på valda fönster representeras av svarta hängslen i de representativa resultaten (figur 2 och figur 3).
- Gå till Marks > Statistics för att visualisera resultaten för varje injektion av substrat/hämmare/frikopplat protokoll. FörH2O2-produktion, utför samma procedur med "Amp-Slope" -spåret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den mitokondriella syreförbrukningen av den permeabiliserade ischiasnerven representeras i figur 2. Det röda spåret representerarO2-flödet per massenhet i pmol / s.mg. Efter registrering av en basal syreförbrukning med endogena substrat (rutinmässig andning) injiceras succinat (SUCC) för att registrera komplex II (succinatdehydrogenas) -driven andning, vilket resulterar i en ökning av syreförbrukningshastigheten. I följd tillsätts en mättande koncentration av ADP, vilket aktiverar ATP-syntas och driver oxidativ fosforylering. Detta resulterar i ett fosforylativt tillstånd av mitokondriell andning. Fosforylativ tillståndsandning innebär att ATP-syntas kan producera ATP från ADP + Pi (oorganiskt fosfat) med hjälp av membranpotentialen som bildas av protongradienten som en protonmotivkraft för att generera ATP26. Med minskningen av membranpotentialen som främjas av ATP-syntasaktivitet accelereras syreförbrukningen och en ökning av syreflödet observeras. Tillsatsen av exogent cytokrom c (CYTC) främjade endast minimal stimulering av andning, vilket intygar mitokondriell yttre membranintegritet för detta preparat. Permeabilisering av vävnader kan skada membranintegritet och förlust av cytokrom c. Ökad andningsfrekvens på mer än 10%-15% indikerar skadade mitokondrier och otillräcklig vävnadsberedning28,29. I detta representativa resultat är det en ökning med 8,7% i andning, vilket indikerar god kvalitet på vävnadspreparatet (tabell 1). Titreringen med oligomycin (OLIGO) måste göras med minimala doser för att undvika att nå en koncentration av OLIGO som kan störa maximal kapacitetsutvärdering30. Hämning av ATP-syntas av OLIGO - eller tillstånd 4 andning av oligomycin26 - resulterade i minskat syreförbrukningsflöde. Titrering med FCCP, ett mitokondriellt oupplösligt reagens, sprider mitokondriell membranpotential, stimulerar andningsflödet och visar maximal kapacitet för elektronöverföring (ETS maximal kapacitet). I slutet av experimentet injiceras antimycin A (AA), en hämmare av komplex III, för att hämma mitokondriell andning och för att registrera icke-mitokondriell syreförbrukning (återstående andning) (Figur 2). Absoluta syreflöden som registrerats i detta representativa experiment beräknas i tabell 1.
Möjligheten att analysera mitokondriell syreförbrukning samtidigt med reaktiv syreproduktion (ROS) - bestämd genom att detektera väteperoxid (H2O2) av Amplex Red med fluorescenssensorer - är en stor fördel för att bestämma en bioenergetisk profil och ett standardverktyg för detektering av mitokondriell dysfunktion i olika patologier. Tillägget av olika substrat för olika komplex för att driva mitokondriell ETS kan också ge mer information om de specifika platserna för mitokondriell dysfunktion. Figur 3 visas med samtidig mätning av syreförbrukning (figur 3A) och ROS-produktion (figur 3B) i närvaro av olika substrat som ger bränsle för ETS. Efter inspelning av basal andning tillsätts pyruvat + malat (PM) till kammaren som ett substrat för mitokondriellt komplex I, vilket ökar syreförbrukningsflödet. Tillsatsen av SUCC, substratet av komplex II, ökar också andningen, men ytterligare tillsats av palmitoylkarnitin (PC) ökar inte syreflödet jämfört med de tidigare substrattillsatserna, vilket tyder på att PM och SUCC redan kan ha mättat mitokondriell ubikinonplats eller brist på oxidation av fettsyror. Som förväntat ökar ROS-produktionen också efter tillsats av substrat, vilket representerar läckage av syre som flyr från ETS och bildar ROS (figur 3B, grönt spår). Tillsatsen av ADP i mättande koncentration ökar syreförbrukningen, driver ATP-bildning (rött spår i figur 3A) och minskar ROS-produktionen (figur 3B, grönt spår). Tillsatsen av CYTC ökar endast syreflödet med 6,8%, vilket bekräftar mitokondriell membranintegritet. Titrering med OLIGO minskar syreförbrukningsflödet (rött spår i figur 3A) och ökar ROS-produktionen (grönt spår i figur 3B). ADP- och OLIGO-effekter tyder på att permeabiliserad ischiasnerv i detta protokoll kan replikera standardrelationen i mitokondriell fysiologi, där en ökning av syreförbrukningen leder till en minskning av membranpotentialen och förhindrar ROS-produktion31,32.
Tillsatsen av FCCP, som förväntat för en uncoupler, ökar syreförbrukningen till sin maximala hastighet, och som ett resultat av membranpotentialavledning minskar ROS-produktionen. Tillsatsen av rotenon, en hämmare av komplex I och AA, minskar syreförbrukningen och ökar ROS-bildningen (figur 3A,B), vilket bekräftar att mitokondriell fysiologi och bioenergetisk profil i den permeabiliserade ischiasnerven bevaras. Absoluta värden för syreflöden som registrerats i detta experiment beräknas i tabell 2.
Figur 1: Ischiasnervpreparat för permeabilisering av mitokondrier. Alla procedurer måste utföras på is. (A) Ischiasnerven extraheras från en avlivad mus och placeras i en petriskål som innehåller vävnadskonserveringsbuffert vid 4 °C. (B) Separation av ischiasnervbuntar med pincett. (C,D) Vävnaden är klar när den dissekeras i genomskinliga tufts, snarare än den ursprungliga vita ogenomskinliga rörformiga strukturen (A). Skalstreck = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativt resultat av mitokondriell syreförbrukning i musens permeabiliserade ischiasnerv. Experimentet är ett representativt spår av ett ischiasnervextrakt från en avlivad mus. Ischiasnerven var permeabiliserad tidigare, som beskrivs i protokollavsnittet. Injektioner anges som pilar vid specifika tidpunkter. SUCC: succinat; ADP: adenosindifosfat; Cyt c: cytokrom c; OLIGO: oligomycin; FCCP: karbonylcyanid 4-(trifluormetoxi)fenylhydrazon; AA: antimycin A. Syrekoncentration i realtid som [nmol / ml] (blått spår) och syreförbrukningshastighet som flöde per massenhet [pmol / (s.mg)] (rött spår) visas. Svarta hängslen representerar fönster med syreförbrukningshastigheter som valts för resultat efter varje injektion. Basal hänvisar till andning utan substrat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Resultatet av mitokondriell syreförbrukning kopplad till ROS-produktion i den permeabiliserade muschiasnerven. Ett representativt spår av ett ischiasnervextrakt från en avlivad mus visas. Ischiasnerven var permeabiliserad tidigare, som beskrivs i protokollavsnittet. Injektioner anges som pilar vid specifika tidpunkter. H2O2: väteperoxid; PM: pyruvat/malat; SUCC: succinat; PC: palmitoyl-karnitin; ADP: adenosindifosfat; Cyt c: cytokrom c; OLIGO: oligomycin; FCCP: karbonylcyanid 4-(trifluormetoxi)fenylhydrazon; ROT: rotenon; AA: antimycin A. (A) Syrekoncentration i realtid som [nmol / ml] (blått spår) och syreförbrukningshastighet som flöde per massenhet [O2 pmol / (s.mg)] (rött spår) visas. (B) Ros-produktion demonstreras som H2O2-fluorescens (lila spår) och H2O2-produktionsluttning [pmol/(s.mg)] (grönt spår), efter kalibrering. Svarta hängslen representerar fönster med syreförbrukningshastigheter som valts för resultat efter varje injektion. Basal hänvisar till andning utan substrat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Substrat | Tillägg | Syreförbrukningshastighet |
| Flöde per massa (pmol/[s.mg]) | ||
| Basal (inget tillägg) | ingen | 5.9 |
| Succinat (SUCC) | Ett tillägg på 10 mM | 16.9 |
| Adp | Ett tillägg på 1 μM | 28.5 |
| Cytokrom c (CYTC) | Ett tillägg på 10 μM | 31 |
| Oligomycin A (OLIGO) | Titrering med tillägg av 0,2 μg/ml | 21.9 |
| Fccp | Titrering med tillägg av 0,5 μM | 31.1 |
| Antimycin A (AA) | Ett tillägg på 5 μM | 11.3 |
Tabell 1: Protokoll för substrat/uncoupler/inhibitorer/titrering (SUIT) och resultat av syreförbrukningshastigheter i muspermeabiliserad ischiasnerv. Syreförbrukningen representeras i [O2pmol / (s.mg)], efter varje tillsats av SUIT-protokollet. Resultaten erhålls med genomsnittet av valda fönster markerade i figur 2.
| Substrat | Tillägg | Syreförbrukning (O2 pmol / [s.mg]) | ROS-produktion (H2O2pmol/[s.mg]) |
| Basal (inget tillägg) | ingen | 5.77 | 0.53 |
| Pyruvat + malat (PM) | En puls på 5 mM + 2,5 mM | 7.17 | 0.58 |
| Succinat (SUCC) | Ett tillägg på 10 mM | 14.06 | 0.75 |
| Palmitoylkarnitin (PC) | Två pulser på 25 μM | 14.68 | 0.79 |
| Adp | Ett tillägg på 1 μM | 22.9 | 0.25 |
| Cytokrom c (CYTC) | Ett tillägg på 10 μM | 24.36 | 0.09 |
| Oligomycin A (OLIGO) | Titrering med tillägg av 0,2 μg/ml | 17.03 | 0.5 |
| Fccp | Titrering med tillägg av 0,5 μM | 23.98 | 0.16 |
| Rotenon (ROT) | Ett tillägg på 1 μM | 19.75 | 0.48 |
| Antimycin A (AA) | Ett tillägg på 5 μM | 4.08 | 0.53 |
Tabell 2: Protokoll för substrat /uncoupler / inhibitorer / titrering (SUIT) och resultat av ROS-produktion kopplad till syreförbrukningshastigheter muspermeabiliserad ischiasnerv. Syreförbrukningen representeras i [O2 pmol /(s.mg)] och ROS-produktion av [H2O2pmol / (s.mg)] efter varje tillsats av SUIT-protokoll. Resultaten erhålls med genomsnittet av valda fönster markerade i figur 3.
| Parametrar för mitokondriell funktion | Beräkningar från syreförbrukningshastigheter |
| Basal andning | Basal andning (flöde utan tillsats av substrat)28 |
| Återstående syreförbrukning (ROX) | [Flöde efter tillsats av AA] 28 |
| Komplex I läcker andning | [Flöde efter tillsats av PM] - [ROX] 28,37 |
| Komplex II läckage andning | [Flöde efter tillägg av SUCC] - [ROX] 28,37 |
| Fosforylativt tillstånd (Oxfos kapacitet) | [Flöde efter tillsats av ADP] - [ROX] 28,43 |
| Icke -fosforylativt tillstånd (läckageandning) | [Flöde efter tillsats av oligomycin] – [ROX]28 |
| Förhållande för andningskontroll | [Fosforylativt tillstånd / Icke-fosforylativt] 28,43 |
| ETS-kapacitet | [Flöde efter tillägg av FCCP] - [ROX] 28,37 |
Tabell 3: Parameterberäkning för utvärdering av mitokondriell funktion i muspermeabiliserad ischiasnerv. Parametrar för mitokondriell fysiologi utvärderingsformel med syreförbrukningshastigheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera sjukdomar eller tillstånd som åtföljer neuropatier har mitokondriell dysfunktion som en riskfaktor. Utvärderingen av mitokondriell funktion i perifera nerver är avgörande för att belysa hur mitokondrierna verkar vid dessa neurodegenerativa tillstånd. Bedömningen av mitokondriell funktion är mödosam på grund av svårigheten med isoleringsmetoden och bristen på material. Således är utvecklingen av vävnadspermeabiliseringstekniker som inte kräver isolering av mitokondrier väsentlig.
För att utvärdera mitokondriell funktion i permeabiliserade vävnader är det viktigt att välja en kemikalie som kan permeabilisera cellplasmamembranet utan att störa cellandningen. I perifera nerver som ischiasnerven är myelinkompositionen cirka 70% lipid, varav de flesta är kolesterol 33,34. Valet av permeabiliserande medel som saponin och digitonin som interagerar med kolesterolmolekyler resulterar i porer som tillåter substratåtkomst till mitokondriella maskiner utan att störa andra cellulära fack35,36. I detta protokoll är den väletablerade metoden för muskelfiberpermeabilisering av saponin som beskrivs av Pesta och Gnaiger24 anpassad för ischiasnerverna. Permeabiliseringsförfarandet inkluderar ytterligare ett kritiskt steg angående vävnadsseparation för att möjliggöra åtkomst av substrat som krävs för registrering av mitokondriella parametrar av intresse. Det aktuella arbetet beskriver stegen, och illustrationerna tillhandahålls för en tillfredsställande vävnadsseparation i figur 1.
Mitokondriella andningsfrekvenser är viktiga för att fastställa skillnader angående mitokondrikomplexfel, oxidativ fosforyleringsstörning eller störda mitokondrier. Andningsförhållanden och mitokondriella parametrar definieras av Chance och Williams26. I denna artikel definieras den rutinmässiga andningen som basal andning när mitokondriell syreförbrukning registreras utan tillsats av exogena substrat; komplexkapacitet - när substrat för komplex I eller II tillsätts till bränsle mitokondriell syreförbrukning, även kallad läckageandning; fosforylativt tillstånd - när ADP tillsätts i sekvensen av komplex substrat och driver ATP-syntes; icke-fosforylativt tillstånd - när all ADP bildas till ATP eller med tillsats av ATP-syntashämmare, oligomycin (eller tillstånd 4); ETS maximal kapacitet - när mitokondriell uncoupler FCCP läggs till och; återstående syreförbrukning (ROX) efter tillsats av rotenon och antimycin A - när syreförbrukningen inte är relaterad till mitokondrier. Tekniken som beskrivs i detta arbete för mitokondriell funktionsutvärdering i ischiasnervvävnad med HRR gör det möjligt att bestämma många andningstillstånd och beräkning av inneboende mitokondriell funktion inom samma prov. Testresultat från ett substrat/frikopplat/inhibitorprotokoll kan användas för att härleda parametrar för mitokondriell funktion från vilka andningskontrollförhållanden/faktorer kan beräknas37, vilket visas i tabell 3. Utvärdering av dessa parametrar kombinerar absoluta läckagehastigheter, i kombination med maximal mitokondriell andning, och höjer data för ett diagnostiskt värde 24,35,36,37,38,39.
Även om mitokondriell dysfunktion i perifera nerver citeras i litteraturen, finns det begränsningar i att demonstrera dessa parametrar. I en kemoterapiinducerad neuropatimodell observeras en minskning av mitokondriell membranpotential vid behandling med kemoterapimedlet oxaliplatin och en minskning av in vitro-aktiviteten hos komplex I, II och III i sensoriska axoner i den perifera nerven (saphenös nerv)40,41. Det saknas emellertid information om den kontroll som utövas av membranpotentialen på komplexens aktiviteter och bildandet av ATP genom oxidativ fosforylering, en väsentlig parameter vid utvärdering av mitokondriell funktion. I dissocierade ischiasnerver från Sprague-Dawley-råttor permeabiliserade med digitonin demonstreras registreringen av syreförbrukning endast för fosforylerat tillstånd, men jämförs inte med syreförbrukning i närvaro av en ATPas-hämmare eller en uncoupler22. I den nuvarande metoden är det möjligt att beräkna andningskontrollförhållandet i den permeabiliserade nerven (tabell 3) jämfört med andningskontrollförhållandet för isolerade mitokondrier, vanligtvis beräknat från tillstånd3 / tillstånd4 (eller fosforylativa / icke-fosforylativa tillstånd). Med den metod som tillhandahålls i detta arbete är det möjligt att bedöma komplexa I, II-kapaciteter - upprätthålla mitokondriell membranintegritet - och flödeskontrollförhållanden och uppnå maximal kapacitetsandning och kvarvarande syreförbrukning.
Olika metoder för ischiasnervpermeabilisering för utvärdering av mitokondriell syreförbrukning beskrivs i litteraturen. En teknik för ischiasnervpermeabilisering demonstreras i ett protokoll med saponinbehandling och permeabilisering med virvelpuls; emellertid demonstrerades endast fosforylativt tillstånd och maximal kapacitet41. Dessutom, genom att jämföra de värden som presenteras här för samma parametrar, är syreflödet observerat av Cooper et al.41 70% lägre, vilket visar att det finns skador på mitokondriellt membran relaterat till agitationsmetoden. I det nuvarande protokollet bevarar vävnadsseparationen mitokondriell membranintegritet, bekräftad av den lilla ökningen av syreflödet efter tillsats av cytokrom c. Detta är en funktion som gör att alla mitokondriella parametrar kan registreras, vilket ger en fullständig registrering av mitokondriell oxidativ fosforylering och funktion. Även om syreflödesvärdena i en ischiasnervpermeabiliseringsmetod med kollagenas är jämförbara med de som presenteras här, observeras en ökning med nästan 20% efter tillsats av cytokrom c, vilket tyder på en viss nivå av mitokondriell membranskada21. Med protokollet som beskrivs i denna artikel observerades en ökning med endast 6,3% -8,7% syreflöde efter cytokrom c-tillsats, vilket bekräftar fördelen med den nuvarande metoden för att bevara mitokondriell membranintegritet och optimera syreförbrukningsregistrering.
Mitokondrier är den primära platsen för generering av reaktiva syrearter (ROS) associerade med olika signalprocesser i ischiasnervvävnad och mekanismer relaterade till patofysiologi i neuropatier42,43. Detta protokoll gjorde det möjligt att få tillgång till väteperoxidgenerering med en fluorescenssensor samtidigt med syreförbrukningen. Som observerats i figur 3 är ROS-produktionen känslig för förändringar av mitokondriella andningstillstånd, vilket bekräftar mitokondriell integritetsstatus och optimerar mitokondriell funktionsregistrering.
Andra metoder som extracellulär flödesanalysator (EFA), baserad på fluorescenssensorer för att registrera syreförbrukning, kan utvärdera perifer nerv mitokondriell funktion i odlade celler - såsom Schwann-celler eller axoner - i en automatiserad screeninganordning med hög genomströmning. Det finns dock vissa fördelar med att använda polarografiska sensorer som HRR, inklusive i synnerhet förmågan att följa experimentet i realtid, för att göra flera injektioner av substrat / hämmare; därmed möjliggör detta utvärdering av ett större antal komplexa funktioner i mitokondrier i ett experiment och den lägre kostnaden för förbrukningsvaror 24,35,38,39. En nackdel med att använda HRR jämfört med EFA är frånvaron av en sensor för medieförsurning (för analys av glykolytiskt flöde) och den begränsade arbetsflödesförmågan, vilket möjliggör användning av endast två prover åt gången.
Begränsningar av vävnadspermeabiliseringstekniker som krävs för HRR är välkända. De inkluderar oförmågan att utvärdera mitokondrier när ADP är begränsande och en minskad frikopplad andningsfrekvens jämfört med isolerade mitokondrier. Det saponin-ischiatiska nervpermeabiliseringsprotokollet som beskrivs här - som en anpassning av muskelfiberpermeabiliseringsprotokollet av Pesta och Gnaiger24 - möjliggör emellertid bedömning av mitokondriella andningstillstånd och mitokondriella parametrar utan att skada mitokondriell integritet. Det gör det också möjligt att samtidigt registrera syreförbrukning och ROS-produktion i ischiasnerven, en vävnad med ökända begränsningar för att isolera mitokondrier. Således möjliggör detta protokoll en bättre bedömning av mitokondriell funktion i perifera nerver och kan ge fördelar för forskare vid undersökning av mitokondriella roller i patofysiologiska tillstånd som drabbar perifera nerver.
Felsökning
Om det finns en ökning avO2-förbrukningen efter tillsats av cytokrom c till mer än 15% syreförbrukningsflöde, indikerar det att permeabiliseringsproceduren var mycket stark och orsakade skador på mitokondriell struktur. Om så är fallet, kassera och återuppta dissektionen med en mildare nerlandseparation och upprepa stegen. Om vissa reagenser som injiceras inte visar den förväntade effekten i mitokondriernas syreförbrukning ellerH2O2-produktion, beror det troligen på kammarkontaminering med mitokondriella hämmare. I detta fall kan två åtgärder vidtas: (1) starta om experimentet efter tvättning av kamrarna och sprutorna (steg 2.1) eller (2) tillsätt ett prov av eventuella vävnadsisolerade mitokondrier eller homogenat innan du utför steg 2.1. Tilläggen av dessa prover kommer att absorbera mitokondriella hämmare och förbättra rengöringssteget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie finansierades av Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) och Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Vi är tacksamma mot Dr Antonio Galina Filho, Dr Monica Montero Lomeli och Dr. Claudio Masuda för stödet med laboratoriefaciliteter och Dr. Martha Sorenson för vänliga och värdefulla kommentarer för att förbättra artikeln.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
| Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
| DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
| Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
| O2K - Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
| O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
| OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
| Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
| Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
References
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G.
- Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
- Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
- Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
- Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
- Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson's disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
- Winklhofer, K. F., Haass, C.
- Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552 (2021).
- Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737 (2021).
- Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
- Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118 (2021).
- Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and 'plugging' of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61 (2018).
- Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218 (2020).
- Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
- Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373 (2021).
- Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, Elsevier Inc. (2019).
- Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286 (2020).
- Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
- Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58 (2015).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
- Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. 80 (2014).
- Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
- Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
- Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
- Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
- Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300 (2010).
- Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P.
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
- Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
- Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
- Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
- Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
- Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804 (2017).
- Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).
