Summary
Floresan sensörlerine bağlı yüksek çözünürlüklü respirometri, mitokondriyal oksijen tüketimini ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu belirler. Bu protokol, geçirgenleştirilmiş siyatik sinirde mitokondriyal solunum hızlarını ve ROS üretimini değerlendirmek için bir teknik tanımlamaktadır.
Abstract
Periferik sinirlerdeki mitokondriyal disfonksiyon, otoimmün hastalıklar, diyabet, enfeksiyonlar, kalıtsal bozukluklar ve tümörler dahil olmak üzere birçok nedenden dolayı tetiklenebilen periferik nöropati ile ilişkili çeşitli hastalıklara eşlik eder. Fare periferik sinirlerinde mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi, küçük örneklem büyüklüğü, dokuda bulunan sınırlı sayıda mitokondri ve bir miyelin kılıfının varlığı nedeniyle zor olabilir. Bu çalışmada açıklanan teknik, mitokondrileri dokudan izole etmek yerine siyatik sinir mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek için kas lifleri için kullanılandan uyarlanmış benzersiz bir geçirgenlik protokolü kullanarak bu zorlukları en aza indirir. Amplex Red/Peroksidaz ile florimetrik reaktif tür üretimini ölçerek ve saponin-geçirgenleştirilmiş sinirlerdeki farklı mitokondriyal substratları ve inhibitörleri karşılaştırarak, mitokondriyal solunum durumlarını, reaktif oksijen türlerini (ROS) ve mitokondriyal komplekslerin aktivitesini aynı anda tespit etmek mümkün olmuştur. Bu nedenle, burada sunulan yöntem, mitokondriyal fonksiyonun diğer tekniklerle değerlendirilmesine kıyasla avantajlar sunmaktadır.
Introduction
Mitokondri, hücre canlılığını korumak için gereklidir ve enerji metabolizması (glikoz, amino asit, lipit ve nükleotid metabolizma yolları) gibi çok sayıda hücre fonksiyonunu yerine getirir. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminin birincil yeri olan mitokondri, apoptoz gibi çeşitli hücre sinyal süreçlerinde merkezidir ve demir-kükürt (Fe-S) kümelerinin sentezine, mitokondriyal protein ithalatına ve olgunlaşmasına ve genomlarının ve ribozomlarının korunmasına katılır 1,2,3. Mitokondriyal membran dinamiği ağı, füzyon ve fisyon süreçleri tarafından kontrol edilir ve ayrıca kalite kontrol ve mitofi 4,5,6 için makinelere sahiptir.
Mitokondriyal disfonksiyon, kanser, diyabet ve obezite gibi çeşitli patolojik durumların ortaya çıkmasıyla ilişkilidir7. Mitokondriyal fonksiyondaki bozukluklar, Alzheimer hastalığı8,9, Parkinson hastalığı10,11, amiyotrofik lateral skleroz12,13 ve Huntington hastalığı 14,15'te olduğu gibi, merkezi sinir sistemini etkileyen nörodejeneratif bozukluklarda tespit edilir. . Periferik sinir sisteminde, Guillain-Barré sendromu 16,17 gibi immün nöropatilerde aksonlarda mitokondriyal fonksiyon kaybı gözlenir ve aksonlara yüksek mitokondriyal ROS üretimi ile birlikte, bu olaylar Schwann hücrelerinde MAP Kinaz aktivasyonuna yol açar18. Bu, mitokondriyal fizyolojinin sadece bölgeye özgü bir hücre için değil, tüm doku için gerekli olabileceğini göstermektedir. HIV ile ilişkili distal duyusal polinöropatide (HIV-DSP), mitokondri, transkriptasyon transaktivatörü (HIV-TAT) proteininin HIV'in etkili bir şekilde çoğalmasına izin verdiği mekanizmada ve HIV enfeksiyonu patogenezinde diğer birçok rolde rol oynamaktadır19,20.
Siyatik sinir mitokondriyal fizyolojisinin değerlendirilmesi, nöropatinin araştırılmasında temel bir hedef olarak ortaya çıkmıştır 7,21,22. Diyabetik nöropatide, proteomik ve metabolomik analizler, diyabetteki moleküler değişikliklerin çoğunun siyatik sinir mitokondriyal oksidatif fosforilasyonunu ve lipid metabolizmasını etkilediğini düşündürmektedir7. Bu değişiklikler aynı zamanda obeziteye bağlı diyabetin erken belirtileri gibi görünmektedir21. Kemoterapiye bağlı ağrılı nöropatinin bir fare modelinde, siyatik sinirdeki mitokondriyal bozulma, oksidatif fosforilasyon22'de bir azalma ve mitokondriyal komplekslerin aktivitelerinin, membran potansiyelinin ve ATP içeriğinin azalması olarak tespit edilir23. Bununla birlikte, birkaç grup nöropatilerde mitokondriyal disfonksiyondan bahsetmiş olsa da, bu çalışmalar mitokondriyal membranların korunmadığı, mitokondriyal bütünlüğün değerlendirilmesi veya mitokondriyal ATP üretimi için bir parametre olarak ATP içeriğinin ölçülmemesi ile mitokondriyal komplekslerdeki aktivite ölçümleri ile sınırlıdır. Genel olarak, mitokondriyal oksijen tüketiminin ve ROS üretiminin uygun bir değerlendirmesi, bir perkoll/sakkaroz gradyanında diferansiyel santrifüjleme ile mitokondrinin izolasyonunu gerektirir. Mitokondrinin izolasyonu, ihtiyaç duyulan büyük miktarda doku ve mitokondri kaybı ve bozulması nedeniyle siyatik sinir dokusu için sınırlayıcı bir faktör olabilir.
Bu çalışma, mitokondriyal fizyolojiyi siyatik sinirde mitokondriyal oksijen tüketimi ve ROS üretimi olarak ölçmek, mitokondriyal membranları korumak ve mitokondri izoline ihtiyaç duymadan ölçmek için bir protokol sağlamayı amaçlamaktadır. Bu protokol, geçirgenleştirilmiş kas lifleri24'teki oksijen tüketimi ölçümlerinden yüksek çözünürlüklü respirometri (HRR) ile uyarlanmıştır. Bu prosedürün avantajları, siyatik sinir gibi az miktarda dokuda mitokondrinin değerlendirilmesi ve mitokondriyal parametrelerin in situ olarak değerlendirilmesi, böylece mitokondriyal ortamın, yapının ve biyoenerjetik profilin korunması, fizyolojik olarak güvenilir bir sonuç elde edilmesidir. Mitokondriyal solunum durumları, mitokondriyal membran bütünlüğü için mitokondriyal biyoenerjetik ve sitokrom c katsayısını doğru bir şekilde değerlendirmek için siyatik sinir geçirgenizasyonundan sonra substratlar ve inhibitörler ile belirlendi ve mitokondriyal elektron taşıma sisteminin (ETS) değerlendirilmesi ve temel parametrelerin hesaplanması adımları için bir rehber sağladı. Bu çalışma, periferik nöropatiler gibi siyatik sinir metabolizmasının rol oynadığı patofizyolojik mekanizmalardaki soruları cevaplamak için araçlar sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Araştırmada Hayvanların Kullanımı Etik Komitesi, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri deney hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kılavuzlar tarafından onaylanmıştır. Siyatik sinir, dört aylık erkek C57BL / 6 farelerinden izole edilir ve kurumsal kılavuzlara göre servikal çıkık ile ötenazi yapılır. Protokol adımları, mitokondriyal bozulmayı önlemek için optimize edilmiştir. Bu nedenle bu protokolde polarografik oksijen sensörlerinin kalibrasyonu fare siyatik sinir dokusu diseksiyonu ve geçirgenliği öncesinde gerçekleştirilmiştir.
1. Reaktiflerin hazırlanması
- Doku Koruma Tamponunu (TP Tamponu) hazırlayın.
- Aşağıdaki reaktifleri ultra saf su çözeltisinde hazırlayın: 0.1 μM serbest kalsiyum, 20 mM imidazol, 20 mM taurin, 50 mM K-MES, 0.5 mM DTT, 6.56 mM MgCl2, 5.77 mM ATP, 15 mM fosfokreatin içeren 10 mM Ca-EGTA tamponu (bkz. -20°C'de saklayın.
- Mitokondri Solunum Tamponunu (MR Tamponu) hazırlayın.
- Aşağıdaki reaktifleri ultra saf su çözeltisinde hazırlayın: 0,5 mM K 2 EGTA, 3 mM MgCl 2, 60 mM MES, 20 mM taurin, 10 mM KH2PO 4, 20 mM HEPES, 110 mM D-sakaroz,1 mg / mL BSA (yağ asidi içermeyen) (bkz. Malzeme Tablosu), pH7.4. -20 °C'de saklayın.
- 1 mL TP Tamponunda (adım 1.1) 5 mg saponini (Malzeme Tablosuna bakınız) çözerek saponin stok çözeltisi hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Saponin taze olarak hazırlanır.
- 2 mM'lik bir stok konsantrasyonu elde etmek için tozu DMSO ile yeniden askıya alarak Amplex Red'i hazırlayın (bkz.
NOT: Probun donma ve çözülme yoluyla yıpranmasını önlemek için, 6 aydan daha uzun olmayan depolama için küçük alikotlar yapın25.
2. Yüksek çözünürlüklü respirometri (HRR) için polarografik oksijen sensörlerinin kalibrasyonu
- Cihazın ve şırıngaların HRR odalarını temizleyin (bkz.
- HRR odalarını açın, tepeye kadar damıtılmış suyla doldurun ve 5 dakika 3x karıştırın. Etanol ile tekrarlayın ve sonra tekrar su ile tekrarlayın. Tapaları ve şırıngaları her biri 3 kat su / etanol / su ile yıkayın.
- HRR yazılımında aşağıdaki kalibrasyon ayarlarını uygulayın (bkz.
- HRR yazılım kontrolünde, deneysel sıcaklığı (37 ° C), oksijen sensörü parametrelerini (kazanç, 2; polarizasyon voltajı, 800 mV) ve amperometrik sensör (kazanç, 1000; polarizasyon voltajı, 100 mV) ekleyin.
- Oksijen sensörlerini kalibre edin.
- Her hazneye 2,1 mL MR Arabelleği (adım 1.2) pipetin. Tapalarla kapatın ve bir kabarcık oluşana kadar odaya hava çekin. Kütle başına oksijen akışı sabit olana kadar kalibrasyon modunda 1 saat boyunca 37 °C'de karıştırın.
- Yazılımdaki polarografik oksijen sensörlerinin hava kalibrasyonunu üreticinin protokolüne göre gerçekleştirin24.
NOT: Kalibrasyon adımı bir deneyden önce yalnızca bir kez gerçekleştirilir. Aynı solunum ortamında ve sıcaklığında ek deneyler sadece yıkama odalarından sonra yapılabilir (adım 2.1).
3. Siyatik sinirin diseksiyonu ve geçirgenleşmesi
- Aşağıdaki adımları izleyerek siyatik siniri çıkarın.
- Kafesten çıkarıldıktan sonra servikal çıkık ile hayvanı ötenazi yapın ve bankta dinlenmek için hafifçe kısıtlanır.
- Ötenazi yapılan hayvanda, omurganın yakınından başlayarak ve uyluktan ayağa doğru ilerleyerek alt sırtta makasla bir kesi yapın. Sinire bağlı deri ve kası çıkarın ve ardından tüm siyatik siniri kesin ve çıkarın.
- Dokuyu hemen tartın ve soğuk TB Tamponu (4 ° C) ile dolu bir şişeye yerleştirin. Buz üzerinde 3.2-3.3 arasındaki adımları uygulayın.
NOT: Islak doku ağırlığı, aşağıdaki adımlarda oksijen tüketimini ve ROS üretim akışını normalleştirmek için kullanılır. Doku hemen tartılamazsa, soğuk TB Tamponunda saklayın. İşlem taze dokuda gerçekleştirilir ve mitokondriyal hasarı önlemek için dondurulmamalıdır.
- Doku hazırlığı için, siyatik siniri, örtmek için yeterli TP Tamponu olan bir Petri kabına yerleştirin. Sinirin bir ucunu forsepslerle tutun ve başka bir çift forseps ile sinir demetlerini yatay olarak çekin.
NOT: Doku bozulmasını önlemek için bu prosedürün 10 dakikadan daha kısa sürede yapılması gerekir. Doku, önceki beyaz opak dokunun karşısında, şeffaf sisli tabakalar olarak görselleştirilebildiğinde hazır olacaktır (Şekil 1). - İlk olarak, oynatılmış dokuyu doku geçirgenliği için 1 mL TP Tamponu içeren küçük bir kaba aktarın. Permeabilizasyonu başlatmak için, forsepsli dokuyu 1 mL TP Tamponu ve 10 μL saponin içeren bir kaba aktarın (stok çözeltisinden, adım 1.3).
- Bir mikroplaka çalkalayıcıda 30 dakika boyunca hafifçe çalkalayın, ardından forseps içeren dokuyu MR Tamponu (1 mL) içeren taze bir kaba aktarın ve 10 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Forseps ile dokuyu kalibre edilmiş bir HRR odasına aktarın.
4. Oksijen tüketimi ve ROS üretim tayini
- HRR odalarını 2.1 mL MR Tamponu ile doldurun, 5 μM'lik son konsantrasyona Amplex Red (adım 1.4) ve 2 U / mL'ye peroksidaz ekleyin ve geçirgenleştirilmiş siyatik siniri ekleyin (adım 3).
- Cihazın floresan sensörlerini takın, yazılımın kontrol bölümündeki ışıkları kapatın ve Oksigrafa bağlan düğmesine basın. Yazılımdaki "düzenleme protokolleri" bölümünde, adım 3.1.3'te ölçülen doku ağırlığını girin.
- "Düzen"e gidin, "birim numune başına spesifik akı" seçeneğini belirleyin ve oksijen tüketimi okumasına ve istenirse H2O2 üretimine aynı anda erişmek için Grafikler'i seçin. ~10 dakika bekleyin.
NOT: Bu süre, ilave substrat (bazal) olmadan oksijen tüketiminin bazal akışını stabilize etmek için gereklidir. Daha fazla enjeksiyondan önce, oksijen akışının stabilize edildiğinden emin olun. - Haznede daha sonra kalibrasyon için her biri260μM'lik son konsantrasyona kadar iki adet H2 O 2 darbesi enjekte edin.
- Mitokondriyal elektron taşıma sistemini aktive etmek için bir mitokondriyal kompleks II substratı olan 20 μL süksinat (bakınız Malzeme Tablosu) enjekte edin.
NOT: Bu noktada, mitokondriyal fonksiyonu farklı kompleksler tarafından değerlendirmek için farklı mitokondriyal substratlar eklenebilir. Mitokondriyal kompleksler I ve II için değişen substratlarla temsili sonuçlar Şekil 2 ve Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu noktada, Şekil 3'te eş zamanlı olarakO2 tüketimive H2O2 üretiminde bir artış gözlenmektedir. - Adenozin trifosfat (ATP) sentezini aktive etmek için 20 μL adenozin difosfat (ADP) ekleyin.
NOT: ADP, ATP sentezini uyarır ve membran potansiyelini azaltır. O2 tüketiminde artış ve H2O2 üretiminde azalma26,27 olarak gözlenmesi beklenmektedir. - Sırayla, membran bütünlüğünün bir göstergesi olarak 5 μL sitokrom c ekleyin ( bakınız Malzeme Tablosu).
NOT: Doku iyi hazırlanmış ve geçirgenleştirilmişse, sitokrom c oksijen tüketimini% 15'ten fazla artırmamalıdır. Bu durumda, öneriler için sorun giderme bölümüne bakın. - O2 tüketiminde daha fazla azalma gözlenmeyene kadar 0.2 μg / mL oligomisin alikotları ile titre edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Oligomisin, ATP sentezini inhibe ederekO2 akışında bir azalmaya ve yüksek membran potansiyeli26,27tarafından tercih edilen H2O2 oluşumunda bir artışa yol açarak etki eder. - 0.5 μmol / L karbonil siyanür 4-(triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) alikotları ile titrat ( bakınız Malzeme Tablosu), mitokondriyal uncoupler,O2 tüketiminde daha fazla artış gözlemlemek mümkün olana kadar. Deneyi bitirmek için, 5 μM'lik son konsantrasyona 2 μl antimisin A enjekte edin ve akış stabilizasyonunu bekleyin.
NOT: FCCP enjekte edildikten sonra membran potansiyel dağılımınedeniyle H2O2 üretiminde bir azalma gözlenir. Antimisin A, kompleks III'ü inhibe eder, böylece elektronların akışını önler. Bu nedenle, mitokondriye bağımlı O2 tüketimi bozulur, kütle başına oksijen akışını azaltır ve elektron sızıntısını uyarır, H2 O2üretimini26,27 arttırır. - Komut çubuğuna gidin, yazılımda "multisensory" yi arayın, Kontrol > Dosyayı kaydet ve Bağlantıyı kes'e tıklayın.
NOT: Diğer substratların ve inhibitörlerin eklenmesi, çalışılan soruya göre gerçekleştirilebilir. Temsili sonuçlarda bir örnek açıklanmıştır. H2 O2 kalibrasyonu, üreticinin protokolü28'e göre deneyi bitirdikten sonra gerçekleştirilir. - Kaydedilen dosyayı açın ve deneysel oksijen tüketimi sonuçlarını elde etmek için "Kütle Başına Oksijen Akısı" izini seçin. Shift + Sol fare düğmesine basarak enjeksiyonlar arasındaki pencereyi manuel olarak seçin.
- Her bir substrat/inhibitör/bağlanmamış protokol enjeksiyonunun sonuçlarını görselleştirmek için İşaretler > İstatistikleri'ne gidin. H2O2üretimi için, aynı prosedürü "Amp-Slope" izi ile gerçekleştirin.
NOT: Pencereyi seçerken, oksijenin (veyaH2 O2) daha kararlı ve sabit olduğu bir pencere seçerek hacim enjeksiyonlarının artefaktlarından kaçının. Seçilen pencerelerin örnekleri, temsili sonuçlarda siyah parantezlerle gösterilmiştir (Şekil 2 ve Şekil 3).
- Her bir substrat/inhibitör/bağlanmamış protokol enjeksiyonunun sonuçlarını görselleştirmek için İşaretler > İstatistikleri'ne gidin. H2O2üretimi için, aynı prosedürü "Amp-Slope" izi ile gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Permeabilize siyatik sinir tarafından mitokondriyal oksijen tüketimi Şekil 2'de gösterilmiştir. Kırmızı iz, pmol / s.mg cinsinden birim kütle başınaO2 akısını temsil eder. Endojen substratlarla (rutin solunum) bazal oksijen tüketimini kaydettikten sonra, kompleks II (süksinat dehidrogenaz) güdümlü solunumu kaydetmek için süksinat (SUCC) enjekte edilir ve bu da oksijen tüketim oranında bir artışa neden olur. Sırayla, ATP sentazı aktive eden ve oksidatif fosforilasyonu yönlendiren doygun bir ADP konsantrasyonu eklenir. Bu, fosforilatif bir mitokondriyal solunum durumu ile sonuçlanır. Fosforilatif durum solunumu, ATP sentazın, proton gradyanı tarafından oluşturulan membran potansiyelini ATP26 üretmek için proton yönlendirici bir kuvvet olarak kullanarak ADP + Pi'den (inorganik fosfat) ATP üretebileceği anlamına gelir. ATP sentaz aktivitesi tarafından teşvik edilen membran potansiyelindeki azalma ile oksijen tüketimi hızlanır ve oksijen akışında bir artış gözlenir. Eksojen sitokrom c (CYTC) ilavesi, solunumun sadece minimal uyarılmasını teşvik etti ve bu preparat için mitokondriyal dış membran bütünlüğünü onayladı. Dokuların geçirgenleşmesi membran bütünlüğüne ve sitokrom c kaybına zarar verebilir. %10-%15'ten fazla solunum hızlarında artış, hasarlı mitokondri ve yetersiz doku hazırlığını gösterir28,29. Bu temsili sonuçta, solunum sırasında% 8.7'lik bir artış vardır, bu da doku preparatının kalitesini gösterir (Tablo 1). Oligomisin (OLIGO) ile titrasyon, maksimum kapasite değerlendirmesine müdahale edebilecek bir OLIGO konsantrasyonuna ulaşmamak için minimum dozlarla yapılmalıdır30. ATP sentazın OLIGO tarafından inhibisyonu - veya oligomisin26 ile durum 4 solunumu - oksijen tüketimi akışının azalmasına neden oldu. Bir mitokondriyal uncoupler reaktifi olan FCCP ile titrasyon, mitokondriyal membran potansiyelini dağıtır, solunum akısını uyarır ve elektron transferi için maksimum kapasiteyi (ETS maksimum kapasite) gösterir. Deneyin sonunda, kompleks III'ün bir inhibitörü olan antimisin A (AA), mitokondriyal solunumu inhibe etmek ve mitokondriyal olmayan oksijen tüketimini (artık solunum) kaydetmek için enjekte edilir (Şekil 2). Bu temsili deneyde kaydedilen mutlak oksijen akışları Tablo 1'de hesaplanmıştır.
Mitokondriyal oksijen tüketimini, floresan sensörleri ile Amplex Red tarafından hidrojen peroksit (H2 O2) tespit edilerek belirlenen reaktif oksijen üretimi (ROS) ile aynı anda analiz etme olasılığı, biyoenerjetik bir profil belirlemek için büyük bir avantajdır ve çeşitli patolojilerde mitokondriyal disfonksiyonun tespiti için standart bir araçtır. Mitokondriyal ETS'yi beslemek için farklı kompleksler için farklı substratların eklenmesi, mitokondriyal disfonksiyon için spesifik bölgeler hakkında daha fazla bilgi verebilir. Şekil 3, ETS için yakıt sağlayan farklı substratların varlığında oksijen tüketiminin (Şekil 3A) ve ROS üretiminin (Şekil 3B) eşzamanlı ölçümü ile gösterilmiştir. Bazal solunumu kaydettikten sonra, mitokondriyal kompleks I için bir substrat olarak odaya piruvat + malat (PM) eklenir ve oksijen tüketimi akısını arttırır. Kompleks II'nin substratı olan SUCC'nin eklenmesi de solunumu arttırır, ancak palmitoil-karnitinin (PC) daha fazla eklenmesi, önceki substrat ilavelerine kıyasla oksijen akışını arttırmaz, bu da PM ve SUCC'nin mitokondriyal ubikinon bölgesini veya yağ asitleri oksidasyon eksikliğini zaten doyurmuş olabileceğini düşündürmektedir. Beklendiği gibi, ROS, ETS'den kaçan ve ROS'u oluşturan oksijen sızıntısını temsil eden substratların eklenmesinden sonra da artar (Şekil 3B, yeşil iz). ADP'nin doygunluk konsantrasyonuna eklenmesi oksijen tüketimini arttırır, ATP oluşumunu arttırır (Şekil 3A'da kırmızı iz) ve ROS üretimini azaltır (Şekil 3B, yeşil iz). CYTC ilavesi oksijen akışını sadece% 6.8 arttırır ve mitokondriyal membran bütünlüğünü doğrular. OLIGO ile titrasyon, oksijen tüketimi akışını azaltır (Şekil 3A'da kırmızı iz) ve ROS üretimini arttırır (Şekil 3B'de yeşil iz). ADP ve OLIGO etkileri, bu protokoldeki geçirgenleşmiş siyatik sinirin, oksijen tüketimindeki artışın membran potansiyelinde bir azalmaya yol açtığı ve ROS üretimini önlediği mitokondriyal fizyolojideki standart ilişkiyi çoğaltabileceğini düşündürmektedir31,32.
FCCP'nin eklenmesi, bir uncoupler için beklendiği gibi, oksijen tüketimini maksimum hızına çıkarır ve membran potansiyel dağılımının bir sonucu olarak, ROS üretimi azalır. Kompleks I ve AA'nın bir inhibitörü olan rotenonun eklenmesi, oksijen tüketimini azaltır ve ROS oluşumunu arttırır (Şekil 3A, B), geçirgenleşmiş siyatik sinirdeki mitokondriyal fizyoloji ve biyoenerjetik profilin korunduğunu doğrular. Bu deneyde kaydedilen oksijen akışları için mutlak değerler Tablo 2'de hesaplanmıştır.
Şekil 1: Mitokondrinin geçirgenleşmesi için siyatik sinir hazırlığı. Tüm prosedürlerin buz üzerinde yapılması gerekir. (A) Siyatik sinir ötenazi yapılmış bir fareden çıkarılır ve 4 °C'de doku koruma tamponu içeren bir Petri kabına yerleştirilir. (B) Siyatik sinir demetlerinin forseps ile ayrılması. (C,D) Doku, orijinal beyaz opak boru şeklindeki yapı (A) yerine yarı saydam tutamlara diseke edildiğinde hazırdır. Ölçek çubuğu = 1 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farenin geçirgenleşmiş siyatik sinirindeki mitokondriyal oksijen tüketiminin temsili sonucu. Deney, ötenazi yapılmış bir fareden alınan bir siyatik sinir ekstraktının temsili bir izidir. Siyatik sinir, protokol bölümünde açıklandığı gibi daha önce geçirgenleştirilmişti. Enjeksiyonlar belirli zamanlarda ok olarak gösterilir. SUCC: süksinat; ADP: adenozin difosfat; Cyt c: sitokrom c; OLIGO: oligomisin; FCCP: karbonil siyanür 4-(triflorometoksi) fenilhidrazon; AA: antimisin A. [nmol / mL] (mavi iz) olarak gerçek zamanlı oksijen konsantrasyonu ve birim kütle başına akı olarak oksijen tüketim oranı [pmol / (s.mg)] (kırmızı iz) gösterilmiştir. Siyah diş telleri, her enjeksiyondan sonra sonuçlar için seçilen oksijen tüketim oranlarının pencerelerini temsil eder. Bazal, substrat içermeyen solunuma işaret eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mitokondriyal oksijen tüketiminin sonucu, geçirgenleştirilmiş fare siyatik sinirinde ROS üretimine bağlanmıştır. Ötanize edilmiş bir fareden bir siyatik sinir ekstraktının temsili bir izi gösterilmiştir. Siyatik sinir, protokol bölümünde açıklandığı gibi daha önce geçirgenleştirilmişti. Enjeksiyonlar belirli zamanlarda ok olarak gösterilir. H2 O2: hidrojen peroksit; PM: piruvat / malat; SUCC: süksinat; PC: palmitoil-karnitin; ADP: adenozin difosfat; Cyt c: sitokrom c; OLIGO: oligomisin; FCCP: karbonil siyanür 4-(triflorometoksi) fenilhidrazon; ÇÜRÜKLÜK: rotenon; AA: antimisin A. (A) [nmol / mL] (mavi iz) olarak gerçek zamanlı oksijen konsantrasyonu ve birim kütle başına akı olarak oksijen tüketim oranı [O2 pmol / (s.mg)] (kırmızı iz) gösterilmiştir. (B) ROS üretimi, kalibrasyondan sonra H2 O2 floresan (mor iz) veH2O2üretim eğimi [pmol/(s.mg)] (yeşil iz) olarak gösterilir. Siyah diş telleri, her enjeksiyondan sonra sonuçlar için seçilen oksijen tüketim oranlarının pencerelerini temsil eder. Bazal, substrat içermeyen solunuma işaret eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Substrat | Ekleme | Oksijen Tüketim Oranı |
| Kütle başına akı (pmol/[s.mg]) | ||
| Bazal (ilavesiz) | hiç kimse | 5.9 |
| Süksinat (SUCC) | 10 mM'lik bir ek | 16.9 |
| Adp | 1 μM'lik bir ek | 28.5 |
| Sitokrom c (CYTC) | 10 μM'lik bir ek | 31 |
| Oligomisin A (OLIGO) | 0,2 μg/mL ilavelerle titrasyon | 21.9 |
| FCCP (Mali İşler Sözleşmesi) | 0,5 μM ilavelerle titrasyon | 31.1 |
| Antimisin A (AA) | 5 μM'lik bir ek | 11.3 |
Tablo 1: Substratlar/Uncoupler/İnhibitörler/Titrasyon (SUIT) protokolü ve fare geçirgenleştirilmiş siyatik sinirinde oksijen tüketim oranlarının sonuçları. Oksijen tüketimi, SUIT protokolünün her eklenmesinden sonra [O2pmol/(s.mg)] ile temsil edilir. Sonuçlar, Şekil 2'de işaretlenmiş seçili pencerelerin ortalaması ile elde edilir.
| Substrat | Ekleme | Oksijen Tüketimi (O2 pmol/[s.mg]) | ROS Üretimi (H 2O2 pmol/[s.mg]) |
| Bazal (ilavesiz) | hiç kimse | 5.77 | 0.53 |
| Piruvat + Malat (PM) | 5 mM + 2,5 mM'lik bir darbe | 7.17 | 0.58 |
| Süksinat (SUCC) | 10 mM'lik bir ek | 14.06 | 0.75 |
| Palmitoil karnitin (PC) | 25 μM'lik iki darbe | 14.68 | 0.79 |
| Adp | 1 μM'lik bir ek | 22.9 | 0.25 |
| Sitokrom c (CYTC) | 10 μM'lik bir ek | 24.36 | 0.09 |
| Oligomisin A (OLIGO) | 0,2 μg/mL ilavelerle titrasyon | 17.03 | 0.5 |
| FCCP (Mali İşler Sözleşmesi) | 0,5 μM ilavelerle titrasyon | 23.98 | 0.16 |
| Rotenon (ROT) | Bir adet 1μM ilavesi | 19.75 | 0.48 |
| Antimisin A (AA) | 5 μM'lik bir ek | 4.08 | 0.53 |
Tablo 2: Substratlar/Uncoupler/İnhibitörler/Titrasyon (SUIT) protokolü ve ROS üretiminin sonuçları, fare geçirgenleştirilmiş siyatik sinirinin oksijen tüketim oranlarına bağlanmıştır. Oksijen tüketimi, SUIT protokolünün her eklenmesinden sonra [O2 pmol/(s.mg)] ve ROS üretiminde [H2O2 pmol/(s.mg)] ile temsil edilir. Sonuçlar, Şekil 3'te işaretlenmiş seçili pencerelerin ortalaması ile elde edilir.
| Mitokondriyal Fonksiyon için Parametreler | Oksijen Tüketim Oranlarından Hesaplamalar |
| Bazal Solunum | Bazal Solunum (substrat ilavesi olmadan akı)28 |
| Artık Oksijen Tüketimi (ROX) | [AA eklendikten sonra akı] 28 adet |
| Kompleks I sızıntı solunumu | [PM ilavesinden sonra akı] – [ROX]28,37 |
| Kompleks II sızıntı solunumu | [SUCC eklendikten sonra akı] – [ROX]28,37 |
| Fosforilatif durum ( Oxphos kapasitesi) | [ADP ilavesinden sonra akı] – [ROX]28,43 |
| Non-fosforilatif durum (Sızıntı Solunumu) | [Oligomisin ilavesinden sonra akı] – [ROX]28 |
| Solunum Kontrol Oranı | [Fosforilatif durum / Non-fosforilatif] 28,43 |
| ETS Kapasitesi | [FCCP eklendikten sonra akı] – [ROX]28,37 |
Tablo 3: Fare geçirgenliğine sahip siyatik sinirde mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi için parametrelerin hesaplanması. Mitokondriyal fizyoloji için oksijen tüketim oranlarına göre değerlendirme formülü parametreleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nöropatilere eşlik eden çeşitli hastalıklar veya durumlar risk faktörü olarak mitokondriyal disfonksiyona sahiptir. Periferik sinirlerde mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi, mitokondrinin bu nörodejeneratif koşullarda nasıl davrandığını aydınlatmak için gereklidir. Mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi, izolasyon yönteminin zorluğu ve malzeme kıtlığı nedeniyle zahmetlidir. Bu nedenle, mitokondri izolasyonunu gerektirmeyen doku geçirgenleştirme tekniklerinin geliştirilmesi esastır.
Geçirgenleştirilmiş dokularda mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için, hücre solunumuna müdahale etmeden hücre plazma zarını geçirgenleştirebilecek bir kimyasal seçmek çok önemlidir. Siyatik sinir gibi periferik sinirlerde, miyelin bileşimi yaklaşık% 70 lipittir ve bunların çoğu kolesterol33,34'tür. Kolesterol molekülleri ile etkileşime giren saponin ve digitonin gibi geçirgenleştirici ajanların seçimi, substratın diğer hücresel bölmelere müdahale etmeden mitokondriyal makinelere erişmesine izin veren gözeneklerle sonuçlanır35,36. Bu protokolde, Pesta ve Gnaiger24 tarafından tanımlanan saponin ile kas-lif geçirgenliği için köklü yöntem, siyatik sinirler için uyarlanmıştır. Permeabilizasyon prosedürü, ilgilenilen mitokondriyal parametrelerin kaydedilmesi için gerektiğinde substratlara erişime izin vermek için doku ayrımı ile ilgili bir başka kritik adımı içerir. Bu çalışma adımları açıklamaktadır ve çizimler Şekil 1'de tatmin edici bir doku ayrımı için verilmiştir.
Mitokondriyal solunum hızları kayıtları, mitokondri komplekslerinin arızalanması, oksidatif fosforilasyon bozukluğu veya bozulmuş mitokondri ile ilgili farklılıkları belirlemek için gereklidir. Solunum koşulları ve mitokondriyal parametreler Chance ve Williams26 tarafından tanımlanmıştır. Bu makalede, rutin solunum, eksojen substratların eklenmesi olmadan mitokondriyal oksijen tüketiminin kaydedildiği bazal solunum olarak tanımlanmıştır; kompleksler kapasitesi - karmaşık I veya II için substratlar, sızıntı solunumu olarak da adlandırılan mitokondriyal oksijen tüketimine yakıt eklendiğinde; fosforilatif durum - ADP, komplekslerin substratları dizisine eklendiğinde ve ATP sentezini yönlendirdiğinde; fosforilatif olmayan durum - tüm ADP'ler ATP'ye oluşturulduğunda veya ATP sentaz inhibitörü, oligomisin (veya durum 4) ilavesiyle; ETS maksimum kapasite - mitokondriyal uncoupler FCCP eklendiğinde ve; rotenon ve antimisin A ilavesinden sonra artık oksijen tüketimi (ROX) - oksijen tüketimi mitokondri ile ilişkili olmadığında. HRR ile siyatik sinir dokusunda mitokondriyal fonksiyon değerlendirmesi için bu çalışmada açıklanan teknik, aynı numune içinde çok sayıda solunum durumunun belirlenmesine ve intrinsik mitokondriyal fonksiyonun hesaplanmasına izin verir. Tablo 3'te gösterildiği gibi, solunum kontrol oranlarının/faktörlerinin hesaplanabileceği mitokondriyal fonksiyon parametrelerini türetmek için bir substrat/uncoupled/inhibitörler protokol test sonuçları kullanılabilir. Bu parametrelerin değerlendirilmesi, mutlak sızıntı oranlarını, maksimum mitokondriyal solunum ile birleştiğinde birleştirir ve24,35,36,37,38,39 tanısal değeri için verileri yükseltir.
Periferik sinirlerde mitokondriyal disfonksiyon literatürde belirtilmekle birlikte, bu parametrelerin gösterilmesinde sınırlamalar vardır. Kemoterapiye bağlı nöropati modelinde, kemoterapi ajanı oksaliplatin ile tedavide mitokondriyal membran potansiyelinde bir azalma ve periferik sinirin (safen sinir) duyusal aksonlarında kompleks I, II ve III'ün in vitro aktivitesinde bir azalma gözlenir40,41. Bununla birlikte, membran potansiyelinin komplekslerin aktiviteleri üzerinde uyguladığı kontrol ve mitokondriyal fonksiyon değerlendirmesinde önemli bir parametre olan oksidatif fosforilasyon ile ATP oluşumu hakkında bilgi eksikliği vardır. Ayrıca, digitonin ile geçirgenleştirilmiş Sprague-Dawley sıçanlarından ayrışmış siyatik sinirlerde, oksijen tüketiminin kaydedilmesi sadece fosforile edilmiş durum için gösterilmiştir, ancak bir ATPaz inhibitörü veya bir uncoupler22 varlığında oksijen tüketimi ile karşılaştırılmaz. Bu yöntemde, geçirgenleştirilmiş sinirdeki solunum kontrol oranını, genellikle durum3 / state4 (veya fosforilatif / fosforilatif olmayan durumlardan) hesaplanan izole mitokondrinin solunum kontrol oranı ile karşılaştırıldığında hesaplamak mümkündür (Tablo 3). Bu çalışmada sağlanan yöntemle, karmaşık I, II kapasitelerini - mitokondriyal membran bütünlüğünü korumak - ve akı kontrol oranlarını değerlendirmek ve maksimum kapasite solunumu ve artık oksijen tüketimi elde etmek mümkündür.
Mitokondriyal oksijen tüketiminin değerlendirilmesinde siyatik sinir geçirgenliği için farklı yöntemler literatürde tanımlanmıştır. Siyatik sinir geçirgenliği için bir teknik, saponin tedavisi ve vorteks nabzı ile geçirgenleştirme ile yapılan bir protokolde gösterilmiştir; ancak sadece fosforilatif durum ve maksimal kapasite41 olarak gösterilmiştir. Ek olarak, burada sunulan değerleri aynı parametreler için karşılaştırarak, Cooper ve ark.41 tarafından gözlemlenen oksijen akısı% 70 daha düşüktür ve bu da mitokondriyal membranda ajitasyon yöntemine bağlı hasar olduğunu göstermektedir. Mevcut protokolde, doku ayrımı, sitokrom c ilavesinden sonra oksijen akışındaki küçük artışla doğrulanan mitokondriyal membran bütünlüğünü korur. Bu, tüm mitokondriyal parametrelerin kaydedilmesini sağlayan, mitokondriyal oksidatif fosforilasyon ve fonksiyonun tam bir kaydını sağlayan bir özelliktir. Kollajenaz içeren bir siyatik sinir geçirgenliği yönteminde, oksijen akısı değerleri burada sunulanlarla karşılaştırılabilir olsa da, sitokrom c eklendikten sonra yaklaşık% 20'lik bir artış gözlenir, bu da bir miktar mitokondriyal membran hasarı21'i düşündürür. Bu makalede açıklanan protokolle, sitokrom c ilavesinden sonra oksijen akısının sadece% 6.3-% 8.7'lik bir artışı gözlenerek, mitokondriyal membran bütünlüğünün korunmasında ve oksijen tüketiminin kaydının optimize edilmesinde mevcut yöntemin avantajını doğrulamıştır.
Mitokondri, siyatik sinir dokusunda çeşitli sinyal süreçleri ve nöropatilerde patofizyoloji ile ilgili mekanizmalarla ilişkili reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunun birincil yeridir42,43. Bu protokol, oksijen tüketimi ile aynı anda bir floresan sensörü ile hidrojen peroksit üretimine erişmeyi mümkün kılmıştır. Şekil 3'te gözlemlendiği gibi, ROS üretimi mitokondriyal solunum durumlarındaki değişikliklere duyarlıdır, mitokondriyal bütünlük durumunu doğrular ve mitokondriyal fonksiyon kaydını optimize eder.
Oksijen tüketimini kaydetmek için floresan sensörlerine dayanan hücre dışı akı analizörü (EFA) gibi diğer yöntemler, Schwann hücreleri veya aksonlar gibi kültürlü hücrelerdeki çevre birimi-sinir mitokondriyal fonksiyonunu otomatik bir yüksek verimli tarama cihazında değerlendirebilir. Bununla birlikte, HRR gibi polarografik sensörlerin kullanılmasında, özellikle deneyi gerçek zamanlı olarak takip etme, çoklu substrat / inhibitör enjeksiyonları yapma yeteneği de dahil olmak üzere bazı avantajlar vardır; Böylece, bu, bir deneyde mitokondrideki daha fazla sayıda karmaşık fonksiyonun değerlendirilmesine ve sarf malzemelerinin daha düşük maliyetinin 24,35,38,39'a izin verir. HRR kullanmanın EFA'ya kıyasla bir dezavantajı, ortam asitlenmesi için bir sensörün bulunmaması (glikolitik akının analizi için) ve aynı anda yalnızca iki numunenin kullanılmasına izin veren sınırlı iş akışı yeteneğidir.
HRR için gerekli doku geçirgenliği tekniklerinin sınırlamaları iyi bilinmektedir. Bunlar, ADP sınırlayıcı olduğunda mitokondrinin değerlendirilememesini ve izole edilmiş mitokondriye kıyasla azalmış bağlanmamış solunum hızını içerir. Bununla birlikte, burada açıklanan saponin-siyatik sinir geçirgenlik protokolü - kas-lif geçirgenlik protokolünün Pesta ve Gnaiger24 tarafından uyarlanması olarak - mitokondriyal solunum durumlarının ve mitokondriyal parametrelerin mitokondriyal bütünlüğe zarar vermeden değerlendirilmesine izin verir. Ayrıca, mitokondri izole etmek için kötü şöhretli sınırlamaları olan bir doku olan siyatik sinirde oksijen tüketimini ve ROS üretimini aynı anda kaydetmeye izin verir. Bu nedenle, bu protokol periferik sinirlerde mitokondriyal fonksiyonun daha iyi değerlendirilmesine izin verir ve periferik sinirleri etkileyen patofizyolojik koşullarda mitokondriyal rollerin araştırılmasında araştırmacılara avantajlar sağlayabilir.
Sorun giderme
Oksijen tüketim akısının% 15'inden fazlasına sitokrom c eklendikten sonraO2 tüketiminde bir artış varsa, geçirgenlik prosedürünün çok güçlü olduğunu ve mitokondriyal yapıya zarar verdiğini gösterir. Bu durumda, diseksiyonu daha yumuşak bir sinir ayrımı ile atın ve yeniden başlatın ve adımları tekrarlayın. Enjekte edilen bazı reaktifler mitokondri oksijen tüketiminde veyaH2 O2üretiminde beklenen etkiyi göstermiyorsa, muhtemelen mitokondriyal inhibitörlerle oda kontaminasyonundan kaynaklanmaktadır. Bu durumda, iki işlem yapılabilir: (1) odaları ve şırıngaları yıkadıktan sonra deneyi yeniden başlatın (adım 2.1) veya (2) adım 2.1'i gerçekleştirmeden önce doku yalıtımlı herhangi bir mitokondri veya homojenat örneği ekleyin. Bu örneklerin ilaveleri mitokondriyal inhibitörleri emecek ve temizleme adımını iyileştirecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) ve Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) tarafından finanse edilmiştir. Dr. Antonio Galina Filho, Dr. Monica Montero Lomeli ve Dr. Claudio Masuda'ya laboratuvar tesislerine verdikleri destek için ve Dr. Martha Sorenson'a makalenin geliştirilmesinde nazik ve değerli yorumları için minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
| Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
| DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
| Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
| O2K - Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
| O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
| OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
| Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
| Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
References
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G.
- Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
- Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
- Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
- Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
- Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson's disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
- Winklhofer, K. F., Haass, C.
- Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552 (2021).
- Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737 (2021).
- Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
- Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118 (2021).
- Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and 'plugging' of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61 (2018).
- Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218 (2020).
- Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
- Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373 (2021).
- Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, Elsevier Inc. (2019).
- Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286 (2020).
- Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
- Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58 (2015).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
- Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. 80 (2014).
- Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
- Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
- Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
- Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
- Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300 (2010).
- Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P.
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
- Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
- Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
- Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
- Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
- Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804 (2017).
- Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).
