Summary
MALDI-TOF foi utilizado para caracterizar fragmentos obtidos a partir da reatividade entre o RNA oxidado e o exoribonuclease Xrn-1. O presente protocolo descreve uma metodologia que pode ser aplicada a outros processos envolvendo RNA e/ou DNA.
Abstract
O RNA é um biopolímero presente em todos os domínios da vida, e suas interações com outras moléculas e/ou espécies reativas, por exemplo, DNA, proteínas, íons, drogas e radicais livres, são onipresentes. Como resultado, o RNA sofre várias reações que incluem seu decote, degradação ou modificação, levando a espécies biologicamente relevantes com funções e implicações distintas. Um exemplo é a oxidação da guanina para 7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxoG), que pode ocorrer na presença de espécies reativas de oxigênio (ROS). No geral, procedimentos que caracterizam tais produtos e transformações são em grande parte valiosos para a comunidade científica. Para isso, a espectrometria de massa de desorpização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF) é um método amplamente utilizado. O presente protocolo descreve como caracterizar fragmentos de RNA formados após o tratamento enzimático. O modelo escolhido usa uma reação entre o RNA e o exoribonuclease Xrn-1, onde a digestão enzimática é interrompida em locais oxidados. Duas sequências de RNA longa de 20 nucleotídeos [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] e [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] foram obtidas através de síntese de fase sólida, quantificado por espectroscopia UV-vis, e caracterizado via MALDI-TOF. Os fios obtidos foram então (1) 5'-fosforilados e caracterizados via MALDI-TOF; (2) tratado com Xrn-1; (3) filtrado e desálhado; (4) analisado via MALDI-TOF. Esta configuração experimental levou à identificação inequívoca dos fragmentos associados à paralisação de Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], e [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Os experimentos descritos foram realizados com 200 picomols de RNA (20 pmol utilizados para análises MALDI); no entanto, quantidades mais baixas podem resultar em picos detectáveis com espectrômetros usando fontes laser com mais potência do que a usada neste trabalho. É importante ressaltar que a metodologia descrita pode ser generalizada e potencialmente estendida à identificação do produto para outros processos envolvendo RNA e DNA, podendo auxiliar na caracterização/elucidação de outras vias bioquímicas.
Introduction
MALDI-TOF 1,2,3 é uma técnica amplamente utilizada para a caracterização e/ou detecção de moléculas de tamanhos e características variados. Alguns de seus usos incluem diversas aplicações como a detecção de taninos a partir de recursos naturais4, metabólitos por imagem em alimentos5, descoberta ou monitoramento de alvos ou marcadores de drogas celulares6, e diagnóstico clínico7, para citar alguns. De relevância para o presente trabalho é o uso de MALDI-TOF com DNA ou RNA, com seu uso em oligonucleotídeos datando de mais de três décadas8, onde várias limitações foram observadas. Esta técnica evoluiu agora para um meio confiável e comumente utilizado para caracterizar tanto biopolímeros9 quanto identificar/entender reações químicas e bioquímicas, por exemplo, caracterização de locais platinados no RNA10, identificação de fragmentos de RNA após o decotedo fio 11,12, ou formação de ligações cruzadas proteína-DNA13 . Assim, é valioso ilustrar e destacar aspectos importantes do uso dessa técnica. Os fundamentos do MALDI-TOF foram descritos em formato de vídeo, bem como14 e não serão mais elaborados aqui. Além disso, sua aplicação em um contexto de DNA ou proteína foi previamente descrita e ilustrada no referido formato 15,16,17.
O protocolo de detecção de fragmentos de RNA formados após hidrólise enzimática é relatado aqui. O modelo experimental foi escolhido com base em um achado recente publicado pelo nosso grupo18, onde o MALDI-TOF foi usado para determinar a reatividade única entre o exoribonuclease Xrn-1 e os oligonucleotídeos do RNA contendo a lesão oxidativa 8-oxoG. Os fios longos de 20 nucleotídeos foram obtidos através da síntese em fase sólida19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] e [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], enquanto Xrn-1 foi expresso e purificado após o relatório descrito anteriormente20. Resumindo, Xrn-121 é uma exorapenasnucleação de 5'3' com vários papéis biológicos importantes que degradam vários tipos de RNA, incluindo RNAoxidado 22. Verificou-se que a processividade da enzima para ao encontrar 8-oxoG, o que levou a fragmentos de RNA contendo extremidades fosfoiladas de 5'-phosphoiladas [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], e [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Por fim, é importante notar que a espectrometria de massa é um método poderoso que, através de várias metodologias, pode ser adaptado para outros propósitos23,24; assim, escolher o método de ionização certo, bem como outras configurações experimentais é de extrema importância.
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Protocol
A água ultra pura sem rnase (Tabela 1) foi utilizada para o presente estudo.
1. Determinação de concentração da solução RNA
- Prepare a amostra de RNA seguindo os passos abaixo.
- Use um tubo de microcentrifuge (0,6 mL) para preparar uma solução de RNA diluindo 1 μL de solução de estoque (obtida através de síntese em fase sólida)19 em 159 μL de H2O. Livre de RNase misture a solução pipetando a mistura para cima e para baixo repetidamente (10x).
NOTA: Uma vez que uma ampla gama de cuvetas estão disponíveis comercialmente, os volumes necessários podem diferir. Foram utilizadas cuvetas com comprimento de 1 cm e volume reduzido (150 μL). - Enxágüe o cuvette UV-vis com metanol (2x), seguido de água (ultrapure H2O, 3x, ver Tabela de Materiais). Use um fluxo de gás nitrogênio para secar completamente a cuvette.
- Use uma pipeta para transferir a solução (passo 1.1.1) para o cuvette, garantindo que não haja bolhas de ar. Tampe a cuvette e coloque-a para o lado até que seja necessário.
- Use um tubo de microcentrifuge (0,6 mL) para preparar uma solução de RNA diluindo 1 μL de solução de estoque (obtida através de síntese em fase sólida)19 em 159 μL de H2O. Livre de RNase misture a solução pipetando a mistura para cima e para baixo repetidamente (10x).
- Determine a concentração da solução RNA preparada usando UV-vis Spectrophotometer.
- Ligue o espectrômetro UV-Vis invertendo o interruptor localizado na parte de trás do instrumento. Permita que o instrumento complete o procedimento de inicialização e clique no ícone UV WinLab para abrir a janela de operação/controle do instrumento.
- Ligue o espectrômetro do Controlador de Temperatura Peltier usando o interruptor localizado à direita do instrumento.
- Em Métodos Básicos, clique em Scan - Lambda 365. Outra tela abrirá e solicitará ao usuário que garanta que os suportes de celular estejam vazios. Clique em OK e permita que o instrumento realize suas verificações de sistema. Em seguida, o sistema exibirá uma lista de verificações, garantirá que todos "Passe" e clique em OK.
NOTA: Recomenda-se seguir as etapas 1.2.1-1.2.3 na ordem fornecida; alterar essa sequência de eventos pode levar ao mau funcionamento do software. - Ajuste os parâmetros de digitalização selecionando a Coleta de Dados. Na nova janela em Configurações de varredura , altere o Iniciar para 350 nm e o Final para 215 nm.
- Ative o Peltier selecionando o + à esquerda do Acessório. Clique em Multiple Cell Peltier, altere a temperatura °C para 25 e clique em Peltier On.
- Navegue até a guia Informações de amostra e digite o número de amostras, nomes e posição celular conforme desejado.
- Clique em Autozero e insira a cuvette contendo a solução de fundo. Certifique-se de posicionar esta cuvette no mesmo slot onde as medidas serão realizadas.
- Clique em Iniciar e insira o cuvette (passo 1.1.3) na célula desejada. Certifique-se de que a janela cuvette esteja orientada paralelamente à face frontal do instrumento. Clique em OK para iniciar a primeira varredura a 25 °C.
- Para medições em temperaturas mais altas, repita as etapas 1.2.5-1.2.8 e altere a temperatura para a temperatura amostral desejada (90 °C no presente caso).
- Clique em Arquivo > Exportar e escolha o local do arquivo desejado. Selecione XY Data para obter um arquivo .txt.
NOTA: Um auxílio ilustrativo da etapa 1.2 pode ser encontrado no Arquivo Suplementar 1 (S1-S7).
- Realizar aquisição de dados para determinar a concentração de RNA.
- Encontre o arquivo de cada espectro na guia Resultados . Para obter a absorvância, passe o mouse sobre a linha, navegue até 260 nm e regisse as absorvâncias exibidas. Alternativamente, através da cascata de > de arquivos export , exporte os dados como um arquivo .txt para análises gráficas adicionais usando outro software de plotagem.
NOTA: Se 0,1 < A ≥ 1, será necessário diluir ou aumentar a concentração da amostra de RNA preparada na etapa 1.1.1. - Use a lei Beer-Lambert para calcular a concentração da solução.
NOTA: Lei da Cerveja: A = εcl, onde:
R: Absorvância (a 260 nm neste caso, a partir da etapa 1.3.1)
ε: Coeficiente de extinção. Para a sequência utilizada aqui, 208.000 L mol-1 cm-1 é o valor obtido a partir de uma ferramenta OligoAnalyzer.
l: Comprimento do caminho, 1 cm
c: concentração da amostra - Use esses cálculos para preparar a solução desejada do RNA para ser usado para experimentos subsequentes. Foram utilizadas soluções com [RNA] = 200 μM no presente estudo.
- Encontre o arquivo de cada espectro na guia Resultados . Para obter a absorvância, passe o mouse sobre a linha, navegue até 260 nm e regisse as absorvâncias exibidas. Alternativamente, através da cascata de > de arquivos export , exporte os dados como um arquivo .txt para análises gráficas adicionais usando outro software de plotagem.
2. Hidrólise de oligonucleotídeos de RNA por Xrn-1
- Realize a fosforilação de 5' do RNA seguindo as etapas abaixo.
- Use um tubo de microcentrifuge de 0,6 mL para preparar a seguinte solução (volume total de 50 μL).
- Adicionar H2O sem RNase (33,5 μL); os volumes podem variar dependendo do [RNA].
- Em seguida, adicione a solução A (5 L, Tabela 1).
- Adicione uma solução aquosa de triptofato de adenosina (ATP, ver Tabela de Materiais) (6 L, 10 mM, 60 nmol).
- Adicionar solução aquosa RNA (1 μL, 200 μM, 200 pmol).
- Adicione a solução de quinase de polinucleotídeo (enzima PNK, ver Tabela de Materiais) (4,5 L, 45 unidades). Misture suavemente ao pipetar a mistura para cima e para baixo (10x).
- Incubar a mistura de reação a 37 °C por 45 min colocando-a em um banho de água.
- Inativar a enzima colocando o tubo de reação em um bloco de calor pré-aquecido (65 °C) e incubando a solução por 10 minutos.
- Permitir que a solução esfrie à temperatura ambiente (a fosforilação do RNA foi caracterizada através da análise MALDI-TOF, ver Resultados Representativos) para produzir uma solução final de RNA de 5'-fosforilado (4 μM, 50 μL).
- Use um tubo de microcentrifuge de 0,6 mL para preparar a seguinte solução (volume total de 50 μL).
- Execute a hidrólise de RNA por Xrn-1 seguindo os passos abaixo.
- Utilizando a solução (50 μL) a partir da etapa 2.1.4, realize as seguintes etapas.
- Adicionar a solução B (5 L, Tabela 1).
- Adicione uma solução de Xrn-1 (0,5 L, 1 ng, 30 fmol). Misture a solução gentilmente tubondo para cima e para baixo (10x).
- Incubar o tubo de reação à temperatura ambiente por 2 h.
- Transfira a mistura de reação (passo 2.2.1.3) em um dispositivo centrífugo do tamanho de um poro de 10 kDa (ver Tabela de Materiais) e filtre as enzimas por centrifugação (700 x g por 10 min a temperatura ambiente).
- Transfira o filtrado para um tubo centrífuga de 0,6 mL.
- Lave o RNA residual no tubo centrífugo (passo 2.2.2.2.) adicionando H 2 O (20L) livre de RNase, seguido de centrifugação (700 x g por 10 min a temperatura ambiente).
- Combine o filtrado com o obtido a partir da etapa 2.2.3.
- Armazene o tubo contendo a solução resultante em um congelador (0 °C) ou navio para análise.
- Utilizando a solução (50 μL) a partir da etapa 2.1.4, realize as seguintes etapas.
3. Desalting da solução RNA, mancha de placa MALDI-TOF
- Desaltar e concentrar a amostra usando dicas de pipeta C18 de troca de cás disponíveis comercialmente (ver Tabela de Materiais).
- Posicione uma ponta de pipeta 10 L C18 (ponta de pipeta carregada com uma cama de mídia cromatografia C18 fixada no final) em uma pipeta de 10 μL e, em seguida, continue com o seguinte:
- Lave a ponta C18 com 50% de acetonitrila aquosa (10 μL) solução duas vezes. Descarte os volumes usados em um tubo de resíduo separado a cada vez.
- Equilibre a ponta C18 com uma solução aquosa de ácido trifluoroacético (0,1% TFA, 10 μL) duas vezes. Descarte os volumes usados em um tubo de resíduo separado a cada vez.
- Remova manualmente a ponta C18 da pipeta e fixe-a em uma pipeta de 200 μL contendo uma ponta de pipeta P200 (a ponta C18 agora será anexada à ponta da pipeta P200).
- Mergulhe a ponta C18 na solução (passo 2.2.6), e aplaque a solução através da ponta C18 dez vezes.
NOTA: A amostra de RNA fica ligada à resina de troca de cation dentro da ponta. - Retire a ponta C18 da pipeta P200 e posicione-a sobre uma pipeta de 10 μL.
- Lave a ponta C18 usando uma solução aquosa de 0,1% TFA (10 μL) duas vezes. Descarte os volumes usados em um tubo de resíduo separado a cada vez.
- Lave a ponta C18 com água sem RNase (10 μL) duas vezes. Descarte os volumes usados em um tubo de resíduo separado a cada vez.
- Posicione uma ponta de pipeta 10 L C18 (ponta de pipeta carregada com uma cama de mídia cromatografia C18 fixada no final) em uma pipeta de 10 μL e, em seguida, continue com o seguinte:
- Coloque na placa MALDI seguindo os passos abaixo.
- Elute o oligonucleotídeo RNA da ponta C18 (passo 3.1.1.7) imergindo a amostra na matriz desejada (10 μL, solução 1:1 de C e D, Tabela 1), seguido pela distribuição da solução de volta para o tubo. Repita este processo dez vezes.
- Pipeta a solução de 3.2.1 em dois pontos separados na placa (1 μL cada, 20 pmol). Deixe as manchas secarem o ar (Figura 1A e Vídeo 1).
NOTA: Este processo pode ser repetido no mesmo local para aumentar a concentração amostral em cada ponto. - Pipeta desejava calibrante (1 L) em dois pontos separados fisicamente perto do local da amostra e permitia secar o ar.
NOTA: O padrão de teste utilizado no presente estudo foi obtido a partir de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais). - Sobre-coloque o calibrante [totalmente seco] com a matriz desejada (1 L). Deixe secar o ar.
NOTA: É importante rastrear a posição onde as amostras e calibrantes são detectados antes da inserção no instrumento. Anote isso usando o sistema de coordenadas da placa, por exemplo, a amostra 1 está localizada na posição (C,3)
4. Aquisição e processamento de dados
NOTA: Em geral, o THAP requer maior potência laser para alcançar a ionização. Além disso, os oligos podem ser difíceis de ionizar sem fragmentar. Assim, geralmente é necessário usar o menor poder laser possível e aumentar os ganhos do detector e/ou menor frequência de laser para maximizar a detecção e minimizar a fragmentação.
- Realize a aquisição de dados seguindo as etapas abaixo.
NOTA: As medidas de peso molecular foram realizadas utilizando-se um espectrômetro de massa (ver Tabela de Materiais), em íon positivo, modo linear com tensão de origem íon de 20 kV, ganho de detector de ~2,8 kV, e uma frequência laser de 20 Hz. As faixas de varredura foram definidas com base no peso molecular esperado( s). Estes foram calculados e expressos em massa sobre carga (m/z), onde a carga foi de 1. A calibração externa foi realizada usando uma mistura de calibração proteica (Padrão de Teste Bacteriano, veja Tabela de Materiais), em um local adjacente à amostra. Os dados brutos foram então processados no software flexAnalysis (ver Tabela de materiais).- Abra o "software Flexcontrol" para operação. Pressione o botão verde de dentro/para fora do instrumento, aguarde que o estágio alvo se mova e aspire para ventilar. Abra a tampa, coloque a placa alvo totalmente seca no instrumento. Certifique-se de alinhar na orientação certa (Figura 1B).
- Abaixe suavemente a tampa e pressione o botão verde de dentro/para fora . Aguarde que a placa seja retraída e o instrumento volte a bombear para baixo. Uma vez que a barra de status (canto inferior direito da janela de software) reflita 'Pronto', proceda com calibração.
- Para calibrar os instrumentos usando o software, realize o seguinte.
- Selecione o método desejado clicando no Método de seleção de arquivos > ou pressionando o botão Selecionar adjacente ao método carregado. Clique na Coordenada para o ponto calibrante. Navegue até a guia Calibração e confirme se o calibrador correto está selecionado. Certifique-se de que a caminhada aleatória está desatrada (na guia Portadora de amostras ).
- Pressione Start e direcione manualmente o laser ao longo de um cristal (clicando na seta do mouse no local desejado na visão da câmera). Ajuste a potência do laser, se necessário. Uma vez satisfeito com as configurações, pressione Comece a coletar espectros e adicione-os ao buffer de soma.
- Adicione espectros à soma até que a intensidade suficiente seja alcançada. Alterne para ver apenas o buffer de soma, subtraia a linha de base e suave. Em seguida, clique em Atribuir Automático. Verifique cada pico atribuído e observe o erro ppm. Se estiver satisfeito com atribuições e erros, clique em Aplicar.
- Limpe o buffer de soma e navegue até a posição da primeira amostra.
- Confirme o intervalo de varredura desejado (guia 'Detecção'). Ajuste as barras na "Faixa de Massa" para que a região verde represente a massa esperada(es).
- Clique diretamente na janela de ampliação para que as miras sejam orientadas para o fragmento cristalizado desejado (cristais maiores geralmente produzem os melhores resultados, Figura 2).
- Colete alguns espectros ao longo dos cristais grandes, ajustando a potência do laser conforme necessário. A configuração adequada é 5%-10% acima da potência em que os picos aparecem.
- Para obter espectros, realize o seguinte.
- Clique em Iniciar para observar o flash laser em conjunto com o aumento da intensidade espectral (mostrada na janela no canto superior direito). Mova o laser ao longo do comprimento do cristal clicando na seta do mouse para cima e para baixo do cristal (Vídeo 2).
- Clique em Adicionar diretamente abaixo Iniciar.
- Repita isso várias vezes até que a intensidade/número de tiros desejados seja atingida (refletida no eixo y da janela espectral)
- Ajuste a potência do laser e/ou velocidade e/ou detector ganhos se as varreduras iniciais forem insatisfatórias. Repetição de passos 4.1.4.1-4.1.4.3 conforme necessário.
- Se estiver satisfeito com o espectro, clique em Salvar Como salvar o espectro sob um nome especificado. Em seguida, se forem necessárias outras amostras, clique em Clear Sum e repita etapas sob a etapa 4.1.4.
- Executar o processamento de dados.
NOTA: O passo 4.2 descreve uma maneira de analisar os dados usando o software flexAnalysis.- Abra o software desejado. Em seguida, abra espectro (a) selecionando Arquivo. No menu suspenso, selecione Abrir.
- Uma nova janela será exibida. Clique em Procurar para localizar os arquivos salvos da etapa 4.1.4. Verifique as caixas para os arquivos desejados e clique em Abrir à esquerda. Se apenas um único espectro exigir análise, basta arrastar e soltar o arquivo na janela do software.
- Destaque o arquivo carregado para análise em massa. Navegue até a guia Processo na barra de ferramentas. Na linha de base do espectro de massa subtraída.
NOTA: O algoritmo utilizado para a subtração será determinado pelo método selecionado na etapa 4.1.3. - Navegue até a guia Processo na barra de ferramentas. No dropdown, selecione Smooth Mass Spectrum.
NOTA: O algoritmo utilizado para a suavização será determinado pelo método selecionado na etapa 4.1.3. - Clique na guia Lista de massas ; no dropdown, selecione Encontrar. Este comando rotula automaticamente picos com suas massas; uma lista das massas será exibida na tela à direita.
- Para adicionar ou excluir picos, prossiga para a guia Lista de massa . No dropdown, clique em Editar.
- Paire sobre o eixo x do espectro; uma linha vertical representa a localização do espectro onde o cursor está ligado.
NOTA: Um ícone com um gráfico e um cursor aparecerá quando uma nova massa pode ser adicionada clicando. Este ícone aparecerá ao pairar sobre picos que podem ser excluídos clicando (ver etapa 4.2.7 em Arquivo Suplementar 1). - Repetir as etapas 4.1.3-4.1.7 para espectros adicionais. Exporte a lista de massa para todos os espectros clicando e arrastando para destacar os arquivos à esquerda e execute a seguinte cascata de arquivos > exporte > lista de massa para Excel.
- Para exportar espectros como mostrado na tela, faça uma captura de tela ou exporte-a como um relatório. Para este último, navegue até o menu Relatório . No dropdown, selecione Salvar como PDF.
NOTA: Pode-se alterar a forma como os espectros são exibidos usando as três guias abaixo do espectro e/ou variando os arquivos destacados. Uma tela vai aparecer. Nomeie o documento PDF conforme desejado, ajuste as configurações/layout e clique em Salvar para gerar uma imagem do espectro. - A imagem gerada refletirá a visão espectral no programa de software. Para manipular a visão, execute o seguinte.
- Ampliação: Clique no botão Zoom In na barra de ferramentas.
- Passe o mouse sobre o eixo x e clique até que a faixa desejada seja alcançada.
- Zoom out/desfaz: Clique no botão Zoom Out e clique em qualquer lugar do espectro para retornar à visão completa.
NOTA: Um auxílio ilustrativo para as etapas 4.1 e 4.2 pode ser encontrado nos Arquivos Suplementares 1 (pp S8-S23 e S24-S30, respectivamente).
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Representative Results
Os oligonucleotídeos utilizados neste trabalho foram sintetizados, caracterizados e quantificados antes do uso. A concentração de todos os oligonucleotídeos foi determinada através de espectroscopia UV-vis registrada a 90 °C para evitar leituras errôneas decorrentes da formação potencial das estruturas secundárias. A Figura 3 exibe os espectros do modelo oligonucleotídeos de RNA utilizados neste trabalho, tomados à temperatura ambiente e após a aplicação do calor.
O procedimento geral, juntamente com a estrutura da lesão oxidativa que causa a paralisação de Xrn-1, é ilustrado na Figura 4. Oligonucleotídeo (1) contém um 8-oxoG na posição-11 e é onde a atividade Xrn-1 é bloqueada, resultando em hidrólise parada da cadeia de RNA. É importante ressaltar que os resultados retratados nesta figura correspondem a experimentos realizados utilizando soluções contendo 200 pmol da cadeia dos pais (1), embora apenas 20 pmol tenham sido detectados na placa. É importante notar que a massa média foi utilizada em todos os cálculos e que foram observadas discrepâncias variando entre 1-3 unidades de massa atômica (amu). A figura apresenta dois processos, (1) a eficiente fosforilação de RNA, evidenciada pelo aparecimento de apenas um pico (1') correspondente ao produto esperado, e (2) o fragmento de paralisação decorrente do tratamento da mistura amostral com Xrn-1. Experimentos de controle onde a vertente pai foi tratada sob as mesmas condições, na ausência da quinase (PNK), e a ribonuclease (Xrn-1) não apresentou diferenças em relação às mostradas na Figura 4 (fio RNA 1).
Os mesmos resultados foram obtidos utilizando-se uma sequência diferente (3) que continha duas lesões oxidativas (Figura 5). A fosforilação correspondente e a degradação enzimática produziram dois produtos principais que sugeriram que a enzima para sucessivamente em ambos os locais contendo 8-oxoG. Como descrito no espectro de massa correspondente aos fragmentos de interesse, observou-se uma discrepância sobre a aquisição de MALDI-TOF ao tomar espectros do mesmo oligonucleotídeo em dias diferentes. Isto é ilustrado na Figura 4, onde duas unidades atômicas adicionais foram observadas. Os resultados retratados nesta figura correspondem a experimentos realizados com 100 pmol da cadeia dos pais (3). É importante observar que os dados quantitativos podem ser obtidos para avaliar a eficiência global do processo bioquímico (e o rastreamento completo via MALDI-TOF) introduzindo um padrão interno em amostras antes e depois da degradação enzimática.
Figura 1: Mancha da solução RNA. (A) Manchas na placa MALDI. (B) Ilustração da colocação da placa MALDI no espectrômetro MALDI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A câmera da câmera ilustra a formação da amostra: cristais de matriz vistos na placa. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Espectros UV-vis de oligonucleotídeos (1) e (3) registrados a 25 °C e 90 °C, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Processo experimental para preparação de oligonucleotídeos e espectros de massa para cada etapa. (A) São ilustradas etapas gerais usando oligonucleotídeo (1). A sequência de eventos corresponde à (B) 5'-phosphorylation na presença de cintério polinucleotídeo (PNK), seguida de (C) hidrólise enzimática na presença de Xrn-1. Os espectros MALDI-TOF obtidos antes e depois de ambos os processos bioquímicos são exibidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Espectro MALDI-TOF, usando oligonucleotídeo (3), obtido antes (esquerda)/depois (direita) tratamento com Xrn-1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução | Composição | ||
| Um | Tris-HCl (700 mM), DTT (50 mM), pH 7.6, tampão de quinase de polinucleotídeo T4 | ||
| B | NaCl (1 M), Tris-HCl (0,5 M), MgCl2 (0,1 M), DTT (10 mM), pH 7.9 | ||
| C | 2,4,6-Tihidroxyacetophenone monohidrato (THAP, 25 mM), citrato de amônio (10 mM) | ||
| D | Flúor de amônio (300 mM em 50 % aq. Acetonitrile) | ||
| H2O sem rnase | A água ultra-pura foi tratada com pirocarbonato de dietil (DEPC, 1 mL por litro de água), incubada a 37 °C (12 h) e autoclavada (1h) | ||
Tabela 1: Composições de solução utilizadas no estudo.
Vídeo 1: Demonstração para manchas na placa MALDI. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: Demonstração delineando as análises de dados. Clique aqui para baixar este vídeo.
Arquivo complementar 1: Ilustração passo a passo para o manuseio do software UV-vis (etapa 1.2), aquisição de dados MS (etapa 4.1) e processamento de dados MS (etapa 4.2). Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
O principal desafio nesse fluxo de trabalho surgiu entre finalizar os experimentos e realizar as análises espectrométricas em massa. Experimentos foram realizados e concluídos na Universidade do Colorado Denver e enviados (durante a noite) para as instalações da Universidade estadual do Colorado. A aquisição de dados foi realizada mediante recebimento, conforme conveniência. Várias circunstâncias inesperadas levaram a atrasos de tempo no processo. Em um caso, defeitos inesperados de instrumentos exigiram que as amostras fossem congeladas (uma vez por 21 dias) antes da agem e aquisição; no entanto, esse atraso de tempo não parece afetar o resultado experimental, embora a degradação do RNA (levando à diminuição da intensidade do sinal) não possa ser descartada.
A limitação dos experimentos descritos, em termos de concentração de RNA, foi que os experimentos foram realizados com [RNA] superior ao que pode ser obtido in vivo, para uma única sequênciade RNA 23,24. Verificou-se que quando os experimentos foram realizados com 20 pmol de RNA (2 pmol avistados na placa), ou quantidades menores, os picos esperados não foram observados. O uso de espectrômetros com maior potência laser pode provavelmente levar a um sinal aprimorado e a limites de detecção mais baixos.
Espera-se que o passo onde as enzimas são filtradas (usando um dispositivo filtrante de 10 kDa) para separar as enzimas possa ser evitado. Experimentos realizados sem essa etapa levaram a resultados semelhantes. No entanto, recomenda-se a etapa de filtragem se as amostras forem enviadas ou armazenadas por um tempo.
As etapas fornecidas podem ser favoráveis à caracterização e compreensão de diversos processos bioquímicos. Exemplos podem incluir a caracterização de processos envolvendo DNA danificado25, peptídeos26,27 ou RNA conjugados28, entre muitos outros. Em geral, especulamos que o processo aqui ilustrado pode ser aplicável a várias configurações experimentais envolvendo ácidos nucleicos, proteínas, biomateriais e/ou outros biopolímeros. Além disso, o desenvolvimento de espectrômetros aprimorados levará a resultados aprimorados e descobertas importantes, em áreas que envolvem as biomoléculas acima mencionadas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
É importante ressaltar que este trabalho foi um esforço colaborativo entre três instituições, dois grupos de pesquisa e uma instalação central. A distribuição e a carga de trabalho foram realizadas da seguinte forma: Expressão proteica (Xrn-1) foi realizada na Universidade de Denver (Denver, CO). A síntese de oligonucleotídeos, quantificação e experimentação (principalmente degradação enzimática) foram conduzidas na Universidade do Colorado Denver (Denver, CO). Também foi realizada otimização lá. As manchas, aquisições e análises maldi-TOF foram realizadas no Centro de Recursos Analíticos da Universidade estadual do Colorado. (Fort Collins, CO). A SS gostaria de reconhecer um prêmio UROP Award (CU Denver) e bolsas Eureca (CU Denver) para apoio. E. G.C. reconhece o suporte da NIGMS, via R00GM115757. A MJER reconhece o suporte da NIGMS, via 1R15GM132816. K.B. reconhece iD de recursos: SCR_021758. O trabalho também foi apoiado por um Prêmio Professor-Acadêmico (MJER), TH-21-028, da Fundação Henry Dreyfus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
References
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