Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

זיהוי שברי RNA כתוצאה מהשפלה אנזימטית באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF

Published: April 11, 2022 doi: 10.3791/63720
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1
1Department of Chemistry, University of Colorado, Denver, 2Department of Chemistry & Biochemistry, University of Denver, 3Analytical Resources Core Bioanalysis & Omics, Colorado State University

Summary

MALDI-TOF שימש לאפיון שברים שהתקבלו מהתגובתיות בין RNA מחומצן לבין exoribonuclease Xrn-1. הפרוטוקול הנוכחי מתאר מתודולוגיה שניתן ליישם על תהליכים אחרים המערבים רנ"א ו/או דנ"א.

Abstract

רנ"א הוא ביופולימר הנמצא בכל תחומי החיים, והאינטראקציות שלו עם מולקולות אחרות ו/או מינים תגובתיים אחרים, למשל דנ"א, חלבונים, יונים, תרופות ורדיקלים חופשיים, נמצאות בכל מקום. כתוצאה מכך, הרנ"א עובר תגובות שונות הכוללות את הבקיעה, ההתפרקות או השינוי שלו, מה שמוביל למינים רלוונטיים מבחינה ביולוגית עם פונקציות והשלכות שונות. דוגמה אחת היא חמצון של גואנין ל-7,8-דיהידרו-8-אוקסוגואנין (8-oxoG), שעשוי להתרחש בנוכחות מיני חמצן תגובתי (ROS). באופן כללי, נהלים המאפיינים מוצרים ותמורות כאלה הם בעלי ערך רב לקהילה המדעית. לשם כך, ספקטרומטריית מסה של יינון יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI-TOF) היא שיטה נפוצה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לאפיין שברי RNA שנוצרו לאחר טיפול אנזימטי. המודל שנבחר משתמש בתגובה בין RNA לבין exoribonuclease Xrn-1, שבו העיכול האנזימטי נעצר באתרים מחומצנים. שני רצפי RNA באורך 20 נוקלאוטידים [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] ו-[5'-CAU GAA ACA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] התקבלו באמצעות סינתזה של פאזה מוצקה, כומתו על ידי ספקטרוסקופיית UV-vis, ואופיינו באמצעות MALDI-TOF. הגדילים שהתקבלו היו אז (1) 5'-זרחן ואופיינו באמצעות MALDI-TOF; (2) מטופל ב-Xrn-1; (3) מסונן ומתופל; (4) נותח באמצעות MALDI-TOF. מערך ניסוי זה הוביל לזיהוי חד משמעי של השברים הקשורים לעיכוב של Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], ו-[5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. הניסויים המתוארים בוצעו עם 200 פיקומולים של RNA (20 pmol המשמשים לניתוחי MALDI); עם זאת, כמויות נמוכות יותר עשויות לגרום לשיאים הניתנים לזיהוי עם ספקטרומטרים המשתמשים במקורות לייזר עם יותר כוח מזה המשמש בעבודה זו. חשוב לציין כי ניתן להכליל את המתודולוגיה המתוארת ולהרחיב אותה באופן פוטנציאלי לזיהוי מוצרים עבור תהליכים אחרים המערבים רנ"א ודנ"א, ועשויה לסייע באפיון/הבהרה של מסלולים ביוכימיים אחרים.

Introduction

MALDI-TOF 1,2,3 היא טכניקה נפוצה לאפיון ו/או זיהוי של מולקולות בגדלים ומאפיינים שונים. חלק מהשימושים בו כוללים יישומים מגוונים כגון איתור טאנינים ממשאבי טבע4, מטבוליטים של הדמיה במזון5, גילוי או ניטור של מטרות או סמנים של תרופות תאיות6, ואבחון קליני7, אם להזכיר כמה. הרלוונטיות לעבודה הנוכחית היא השימוש ב-MALDI-TOF עם DNA או RNA, כאשר השימוש בו על אוליגונוקלאוטידים מתוארך ליותר משלושה עשורים8, שם צוינו מספר מגבלות. טכניקה זו התפתחה כעת לאמצעי אמין ונפוץ לאפיון שני הביופולימרים9 ולזיהוי/הבנה של תגובות כימיות וביוכימיות, למשל, אפיון של אתרים מוקפים ברנ"א10, זיהוי שברי RNA בעקבות ביקוע גדיל 11,12, או יצירת קשרים צולבים בין חלבון לדנ"א13 . לפיכך, חשוב להמחיש ולהדגיש היבטים חשובים של שימוש בטכניקה זו. היסודות של MALDI-TOF תוארו בפורמט וידאו גםכן 14 ולא יפורטו עוד יותר כאן. יתר על כן, היישום שלו בהקשר של דנ"א או חלבון תואר בעבר והודגם בפורמט האמור 15,16,17.

הפרוטוקול לאיתור מקטעי RNA שנוצרו לאחר הידרוליזה אנזימטית מדווח כאן. המודל הניסיוני נבחר על סמך ממצא שפורסם לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו18, שבו MALDI-TOF שימש כדי לקבוע את התגובתיות הייחודית בין exoribonuclease Xrn-1 לבין oligonucleotides של RNA המכיל את הנגע החמצוני 8-oxoG. גדילי 20 הנוקלאוטידים הארוכים התקבלו באמצעות סינתזה של פאזה מוצקה19, [5'-CAU GAA ACA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] ו-[5'-CAU GAA ACA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], בעוד ש-Xrn-1 הובטא וטוהר בעקבות דו"ח20 שתואר קודם לכן. בקצרה, Xrn-121 הוא אקסוריבונוקלאז 5'-3' עם תפקידים ביולוגיים מרכזיים שונים המפרקים סוגים רבים של RNA, כולל RNA22 מחומצן. נמצא כי התהליכיות של האנזים מתעכבת כאשר נתקלים ב-8-oxoG, מה שהוביל למקטעי RNA המכילים 5'-קצוות זרחניים [5'-H 2 PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], ו-[5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.

לבסוף, חשוב לציין כי ספקטרומטריית מסות היא שיטה רבת עוצמה, שבאמצעות מתודולוגיות שונות, ניתן להתאים אותה למטרות אחרות23,24; לפיכך, בחירת שיטת היינון הנכונה, כמו גם מערך ניסיוני אחר, היא בעלת חשיבות עליונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מים טהורים במיוחד ללא RNase (טבלה 1) שימשו למחקר הנוכחי.

1. קביעת ריכוז של תמיסת RNA

  1. הכן את דגימת ה- RNA בהתאם לשלבים הבאים.
    1. השתמש בצינור microcentrifuge (0.6 מ"ל) כדי להכין תמיסה של RNA על ידי דילול 1 μL של תמיסת מלאי (המתקבלת באמצעות סינתזה בפאזה מוצקה)19 לתוך 159 μL של H2O ללא RNase. ערבב את התמיסה על ידי צנרת התערובת למעלה ולמטה שוב ושוב (10x).
      הערה: מכיוון שמגוון רחב של cuvettes זמינים באופן מסחרי, הכרכים הדרושים עשויים להיות שונים. בעבודה זו נעשה שימוש בקובטות עם אורך נתיב של 1 ס"מ ונפח מופחת (150 μL).
    2. יש לשטוף את ה-UV-vis cuvette עם מתנול (2x), ולאחר מכן מים (ultrapure H2O, 3x, ראו טבלת חומרים). השתמשו בזרימה של גז חנקן כדי לייבש את הקובט ביסודיות.
    3. השתמש בפיפטה כדי להעביר את הפתרון (שלב 1.1.1) לתוך הקובט, ולהבטיח שאין בועות אוויר. מכסים את הקובט ומניחים אותה בצד עד הצורך.
  2. קבע את הריכוז של תמיסת הרנ"א המוכנה באמצעות ספקטרופוטומטר UV-vis.
    1. הפעל את הספקטרופוטומטר UV-Vis על ידי היפוך המתג הממוקם בחלק האחורי של המכשיר. אפשר למכשיר להשלים את הליך ההפעלה ולחץ על סמל UV WinLab כדי לפתוח את חלון ההפעלה/בקרה של המכשיר.
    2. הפעל את הספקטרופוטומטר של בקר הטמפרטורה Peltier באמצעות המתג הממוקם מימינו של המכשיר.
    3. תחת שיטות בסיס, לחץ על סריקה - למבדה 365. מסך נוסף ייפתח ויבקש מהמשתמש לוודא שמחזיקי התאים ריקים. לחץ על אישור ואפשר למכשיר לבצע את בדיקות המערכת שלו. לאחר מכן המערכת תציג רשימה של בדיקות, תבטיח שכל "העבר" ותלחץ על אישור.
      הערה: מומלץ לבצע את השלבים 1.2.1-1.2.3 בהזמנה שסופקה; שינוי רצף אירועים זה עלול להוביל לתקלה בתוכנה.
    4. התאם את פרמטרי הסריקה על-ידי בחירה באיסוף נתונים. בחלון החדש תחת הגדרות סריקה שנה את ההתחלה ל - 350 ננומטר ואת הסיום ל - 215 ננומטר.
    5. הפעל את ה- Peltier על-ידי בחירת ה- + משמאל לאביזר. לחץ על Multi Cell Peltier, שנה את הטמפרטורה °C ל - 25 ולחץ על Peltier On.
    6. נווט אל הכרטיסיה 'מידע לדוגמה ' והזן את מספר הדוגמאות, השמות ומיקום התא לפי הצורך.
    7. לחץ על Autozero והוסף את הקובט המכיל את פתרון הרקע. הקפידו למקם את הקובטה הזו באותו חריץ שבו יבוצעו המדידות.
    8. לחץ על התחל והוסף את ה- cuvette (שלב 1.1.3) בתא הרצוי. ודא שחלון הקובט מכוון במקביל לפנים הקדמיות של המכשיר. לחץ על אישור כדי להתחיל את הסריקה הראשונה ב 25 °C (76 °F).
    9. למדידות בטמפרטורות גבוהות יותר, חזור על שלבים 1.2.5-1.2.8 ושנה את הטמפרטורה לטמפרטורת הדגימה הרצויה (90 מעלות צלזיוס במקרה הנוכחי).
    10. לחץ על קובץ > ייצוא ובחר את מיקום הקובץ הרצוי. בחר XY Data כדי לקבל קובץ .txt.
      הערה: כלי עזר להמחשה של שלב 1.2 ניתן למצוא בקובץ משלים 1 (S1-S7).
  3. בצע איסוף נתונים לקביעת ריכוז הרנ"א.
    1. מצא את הקובץ עבור כל ספקטרום תחת הכרטיסיה תוצאות . כדי להשיג את הספיגה, רחף מעל הקו, נווט ל- 260 ננומטר ותעד את הבולטות המוצגות. לחלופין, באמצעות מפל הייצוא של קובץ > , ייצא את הנתונים כקובץ .txt לניתוח גרפי נוסף באמצעות תוכנות התוויה אחרות.
      הערה: אם 0.1 < A ≥ 1, יהיה צורך לדלל או להגדיל את ריכוז דגימת הרנ"א שהוכנה בשלב 1.1.1.
    2. השתמש בחוק באר-למברט כדי לחשב את ריכוז התמיסה.
      הערה: חוק הבירה: A = εcl, כאשר:
      ת: ספיגה (ב-260 ננומטר במקרה זה, משלב 1.3.1)
      ε: מקדם הכחדה. עבור הרצף המשמש כאן, 208,000 L mol-1 cm-1 הוא הערך המתקבל מכלי OligoAnalyzer.
      l: אורך הנתיב, 1 ס"מ
      ג: ריכוז המדגם
    3. השתמש בחישובים אלה כדי להכין את הפתרון הרצוי של RNA שישמש לניסויים הבאים. פתרונות עם [RNA] = 200 μM שימשו במחקר הנוכחי.

2. הידרוליזה של אוליגונוקלאוטידים של RNA על ידי Xrn-1

  1. בצע זרחון 5' של RNA בהתאם לשלבים הבאים.
    1. השתמש בצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.6 מ"ל כדי להכין את הפתרון הבא (נפח כולל של 50 μL).
      1. הוסף H2O ללא RNase (33.5 μL); הנפחים עשויים להשתנות בהתאם ל-[RNA].
      2. לאחר מכן, הוסף פתרון A (5 L, טבלה 1).
      3. הוסף תמיסה מימית של אדנוזין טריפוספט (ATP, ראה טבלת חומרים) (6 L, 10 mM, 60 ננומול).
      4. הוסף תמיסה מימית RNA (1 μL, 200 μM, 200 pmol).
      5. הוסיפו תמיסת פולינוקלאוטיד קינאז (אנזים PNK, ראו טבלת חומרים) (4.5 ליטר, 45 יחידות). מערבבים בעדינות על ידי צנרת התערובת למעלה ולמטה (פי 10).
    2. דגירה של תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות על ידי הנחתה באמבטיית מים.
    3. השביתו את האנזים על ידי הצבת צינור התגובה בבלוק חום מחומם מראש (65 מעלות צלזיוס) ודגירה של התמיסה למשך 10 דקות.
    4. אפשר לתמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר (זרחון RNA אופיין באמצעות ניתוח MALDI-TOF, ראה תוצאות מייצגות) כדי להניב תמיסת RNA סופית של 5'-phosphorylated (4 μM, 50 μL).
  2. בצע הידרוליזה של RNA על ידי Xrn-1 לאחר השלבים הבאים.
    1. באמצעות הפתרון (50 μL) משלב 2.1.4, בצע את השלבים הבאים.
      1. הוסף פתרון B (5 L, טבלה 1).
      2. הוסף פתרון של Xrn-1 (0.5 L, 1 ng, 30 fmol). ערבבו את התמיסה על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה (פי 10).
      3. דגירה של צינור התגובה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
    2. העבירו את תערובת התגובה (שלב 2.2.1.3) למכשיר צנטריפוגלי בגודל נקבובית של 10 קילו-דדה (ראו טבלת חומרים), וסננו את האנזימים על-ידי צנטריפוגה (700 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר).
    3. העבר את התסיס לתוך צינור צנטריפוגה 0.6 מ"ל.
    4. שטפו את שאריות הרנ"א בצינור הצנטריפוגלי (שלב 2.2.2.2)על ידי הוספת H2O ללא RNase (20 ליטר), ולאחר מכן צנטריפוגה (700 x g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר).
    5. שלבו את התסנין עם זה שהתקבל משלב 2.2.3.
    6. אחסן את הצינור המכיל את התמיסה המתקבלת במקפיא (0 °C) או שלח לניתוח.

3. התפלת תמיסת RNA, איתור צלחת MALDI-TOF

  1. התפלה ותרכזו את הדגימה באמצעות טיפים זמינים מסחרית להחלפת קטיונים C18 פיפטה (ראו טבלת חומרים).
    1. מקם קצה פיפטה 10 L C18 (קצה פיפטה טעון במצע של מדיית כרומטוגרפיה C18 קבועה בקצהו) על פיפטה של 10 μL, ולאחר מכן המשך עם הדברים הבאים:
      1. שטפו את קצה C18 בתמיסת אצטוניטריל מימית (10 μL) של 50% פעמיים. יש להשליך את אמצעי האחסון המשומשים לצינור פסולת נפרד בכל פעם.
      2. יש לאזן את קצה C18 עם תמיסת חומצה תלת-פלואורואצטית מימית (0.1% TFA, 10 μL) פעמיים. יש להשליך את אמצעי האחסון המשומשים לצינור פסולת נפרד בכל פעם.
      3. הסר באופן ידני את קצה ה-C18 מהפיפטה והצמד אותו לפיפטה של 200 μL המכילה קצה פיפטה P200 (קצה ה-C18 יחובר כעת לקצה הפיפטה P200).
      4. טבלו את קצה C18 לתוך הפתרון (שלב 2.2.6), ושחררו את הפתרון דרך קצה C18 עשר פעמים.
        הערה: דגימת הרנ"א נקשרת לשרף חילופי הקטיונים בתוך הקצה.
      5. נתקו את קצה ה-C18 מהפיפטה P200 והניחו אותו על פיפטה של 10 מיקרול'.
      6. שטפו את קצה C18 באמצעות תמיסה מימית של 0.1% TFA (10 μL) פעמיים. יש להשליך את אמצעי האחסון המשומשים לצינור פסולת נפרד בכל פעם.
      7. שטפו את קצה C18 במים ללא RNase (10 μL) פעמיים. יש להשליך את אמצעי האחסון המשומשים לצינור פסולת נפרד בכל פעם.
  2. זהרו על צלחת ה-MALDI בהתאם לשלבים הבאים.
    1. יש לטהר את ה-RNA אוליגונוקלאוטיד מקצה C18 (שלב 3.1.1.7) על ידי טבילת הדגימה לתוך המטריצה הרצויה (10 μL, תמיסת 1:1 של C ו-D, טבלה 1), ולאחר מכן חלוקת התמיסה בחזרה לתוך הצינור. חזור על תהליך זה עשר פעמים.
    2. פיפט את התמיסה מ-3.2.1 לשני כתמים נפרדים על הצלחת (1 μL כל אחד, 20 pmol). אפשרו לכתמים להתייבש באוויר (איור 1A ווידאו 1).
      הערה: ניתן לחזור על תהליך זה באותה נקודה כדי להגדיל את ריכוז הדגימה בכל נקודה.
    3. פיפט רצתה קליברנט (1 L) בשני כתמים נפרדים הקרובים פיזית למיקום הדגימה ומאפשרים ייבוש באוויר.
      הערה: תקן הבדיקה ששימש במחקר הנוכחי התקבל ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).
    4. הניחו יתר על המידה את הקליברנט [המיובש במלואו] עם המטריצה הרצויה (1 L). אפשרו לייבש את האוויר.
      הערה: חשוב לעקוב אחר המיקום שבו הדגימות והקליברנטים מזוהים לפני ההחדרה למכשיר. רשום זאת באמצעות מערכת הקואורדינטות של הלוח, למשל, מדגם 1 ממוקם במיקום (C,3)

4. איסוף ועיבוד נתונים

הערה: באופן כללי, THAP דורש הספק לייזר גבוה יותר כדי להשיג יינון. בנוסף, אוליגוס יכול להיות קשה ליינן ללא פיצול. לכן, בדרך כלל יש צורך להשתמש בהספק לייזר נמוך ככל האפשר ולהעלות את רווחי הגלאים ו/או את תדר הלייזר הנמוך יותר כדי למקסם את הגילוי ולמזער את הפיצול.

  1. בצע רכישת נתונים בהתאם לשלבים הבאים.
    הערה: מדידות משקל מולקולריות בוצעו באמצעות ספקטרומטר מסה (ראה טבלת חומרים) ביון חיובי, במצב ליניארי עם מתח מקור יונים של 20 kV, רווח גלאי של ~ 2.8 kV, ותדר לייזר של 20 הרץ. אלה חושבו והתבטאו כמסה מעל מטען (m/z), כאשר המטען היה 1. הכיול החיצוני בוצע באמצעות תערובת כיול חלבונים (תקן בדיקת חיידקים, ראו טבלת חומרים) על נקודה הסמוכה לדוגמה. הנתונים הגולמיים עובדו לאחר מכן בתוכנת flexAnalysis (ראו טבלת חומרים).
    1. פתח את "תוכנת Flexcontrol" להפעלה. לחצו על כפתור הכניסה/יציאה הירוק של המכשיר, המתינו עד ששלב היעד יזוז ושואב אבק כדי לפרוק את האוורור. פתחו את המכסה, הכניסו את צלחת המטרה המיובשת במלואה לתוך המכשיר. הקפידו ליישר בכיוון הנכון (איור 1B).
    2. הורידו בעדינות את המכסה ולאחר מכן לחצו על כפתור הכניסה/יציאה הירוק. המתן עד שהצלחת תיסוג והמכשיר ישאב בחזרה למטה. ברגע ששורת המצב (בפינה הימנית התחתונה של חלון התוכנה) משקפת את 'מוכן', המשך בכיול.
    3. כדי לכייל את המכשירים באמצעות התוכנה, בצע את הדברים הבאים.
      1. בחר את השיטה הרצויה על-ידי לחיצה על קובץ > בחר שיטה או לחיצה על לחצן בחר הסמוך לשיטה שנטענה. לחץ על הקואורדינטות עבור נקודת הקליברנט. נווט אל הכרטיסייה כיול וודא שהקליברנט הנכון נבחר. ודא שהליכה אקראית כבויה (בכרטיסיה ספק לדוגמה ).
      2. לחץ על התחל והפנה ידנית את הלייזר לאורך גביש (לחיצה על חץ העכבר במיקום הרצוי בתצוגת המצלמה). התאם את כוח הלייזר, במידת הצורך. לאחר הסתפקות בהגדרות, הקש התחל כדי לאסוף ספקטרה והוסף אותן למאגר הסכום.
      3. הוסף ספקטרה לסכום עד שתגיע לעוצמה מספקת. החלף כדי להציג רק את מאגר הסכום, הפחת את קו הבסיס והחליק. לאחר מכן לחץ על הקצאה אוטומטית. בדוק כל שיא שהוקצה וציין את השגיאה ב- ppm. אם אתה מרוצה מהקצאות ושגיאות, לחץ על החל.
      4. נקה את מאגר הסכום ונווט למיקום של המדגם הראשון.
      5. אשר את טווח הסריקה הרצוי (הכרטיסיה 'זיהוי'). התאם את הפסים ב"טווח המסה" כך שהאזור הירוק ייצג את המסה(ות) הצפויה.
      6. לחצו ישירות על חלון ההגדלה כך שהכוונת מכוונת אל השבר המגובש הרצוי (גבישים גדולים יותר מניבים לעתים קרובות את התוצאות הטובות ביותר, איור 2).
      7. אספו כמה ספקטרום לאורך הגבישים הגדולים, והתאימו את כוח הלייזר לפי הצורך. ההגדרה הנכונה היא 5%-10% מעל ההספק שבו מופיעים פסגות.
    4. כדי לקבל ספקטרה, בצע את הפעולות הבאות.
      1. לחץ על התחל כדי לצפות בהבזק הלייזר במקביל לעוצמה הספקטרלית הגוברת (מוצג בחלון בפינה הימנית העליונה). הזז את הלייזר לאורך הגביש על ידי לחיצה על חץ העכבר למעלה ולמטה בגביש (וידאו 2).
      2. לחץ על הוסף ישירות מתחת ל'התחל'.
      3. חזור על כך מספר פעמים עד שתגיע לעוצמה הרצויה / מספר הצילומים (משתקף בציר y של החלון הספקטרלי)
      4. התאם את כוח הלייזר ו/או את המהירות ו/או את רווחי הגלאי אם הסריקות הראשוניות אינן מספקות. חזור על שלבים 4.1.4.1-4.1.4.3 לפי הצורך.
      5. אם אתה מרוצה מהספקטרום, לחץ על שמור בשם כדי לשמור את הספקטרום תחת שם שצוין. לאחר מכן, אם יש צורך בדוגמאות אחרות, לחץ על נקה סכום וחזור על שלבים תחת שלב 4.1.4.
  2. בצע עיבוד נתונים.
    הערה: שלב 4.2 מתאר דרך אחת לנתח את הנתונים באמצעות תוכנת flexAnalysis.
    1. פתח את התוכנה הרצויה. לאחר מכן, פתח ספקטרום (a) על-ידי בחירת קובץ. מהתפריט הנפתח, בחר פתח.
    2. חלון חדש יוצג. לחץ על עיון כדי לאתר את הקבצים שנשמרו משלב 4.1.4. סמן את התיבות עבור הקבצים הרצויים ולאחר מכן לחץ על פתח בצד שמאל. אם רק ספקטרום יחיד דורש ניתוח, פשוט גרור ושחרר את הקובץ לחלון התוכנה.
    3. סמן את הקבצים שנטענו לניתוח בצובר. נווט אל הכרטיסיה תהליך בסרגל הכלים. בתפריט הנפתח, בחר הפחת את בסיס בסיס ספקטרום המסה.
      הערה: האלגוריתם המשמש לחיסור ייקבע על ידי השיטה שנבחרה בשלב 4.1.3.
    4. נווט אל הכרטיסיה תהליך בסרגל הכלים. בתפריט הנפתח, בחר ספקטרום מסה חלק.
      הערה: האלגוריתם המשמש להחלקה ייקבע על ידי השיטה שנבחרה בשלב 4.1.3.
    5. לחץ על הכרטיסיה רשימת המונים ; בתפריט הנפתח, בחר חיפוש. פקודה זו מתייגת באופן אוטומטי שיאים עם המסות שלהם; רשימה של ההמונים תוצג על המסך מימין.
    6. כדי להוסיף או למחוק פסגות, המשך לכרטיסיה רשימת המונים . בתפריט הנפתח, לחץ על ערוך.
    7. רחף מעל ציר ה-x של הספקטרום; קו אנכי מייצג את מיקום הספקטרום שבו הסמן נמצא.
      הערה: סמל עם גרף וסמן יופיע כאשר ניתן להוסיף מסה חדשה על ידי לחיצה. סמל זה יופיע בעת ריחוף מעל פסגות שניתן למחוק על-ידי לחיצה (ראה שלב 4.2.7 בקובץ משלים 1).
    8. חזור על שלבים 4.1.3-4.1.7 לקבלת ספקטרה נוספת. ייצא את רשימת ההמונים עבור כל הספקטרום על-ידי לחיצה וגרירה להדגשת הקבצים בצד ימין והפעל את תפריט Cascade הקובץ הבא > ייצוא > רשימת מסות ל- Excel.
    9. כדי לייצא ספקטרה כפי שמוצגת על המסך, צלם צילום מסך או ייצא אותו כדוח. עבור האחרון, נווט אל תפריט הדוח . בתפריט הנפתח, בחר שמור כ- PDF.
      הערה: ניתן לשנות את אופן הצגת הספקטרום באמצעות שלוש הכרטיסיות שמתחת לספקטרה ו/או לשנות את הקבצים המסומנים. מסך יופיע. תן שם למסמך PDF כרצוי, התאם את ההגדרות/הפריסה ולחץ על שמור כדי ליצור תמונה של הספקטרום.
    10. התמונה שתיווצר תשקף את התצוגה הספקטרלית בתוכנה. כדי לתפעל את התצוגה, בצע את הפעולות הבאות.
      1. התקרבות: לחץ על לחצן זום אין בסרגל הכלים.
      2. רחף מעל ציר ה- x ולחץ עד להשגת הטווח הרצוי.
      3. התרחקות/ביטול: לחץ על לחצן זום אאוט ולחץ על מקום כלשהו בספקטרום כדי לחזור לתצוגה מלאה.
        הערה: כלי עזר להמחשה עבור שלבים 4.1 ו- 4.2 ניתן למצוא בקובץ משלים 1 (עמ ' S8-S23 ו- S24-S30, בהתאמה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

האוליגונוקלאוטידים ששימשו בעבודה זו סונתזו, אופיינו וכימתו לפני השימוש. הריכוז של כל האוליגונוקלאוטידים נקבע באמצעות ספקטרוסקופיה UV-vis שנרשמה ב-90 מעלות צלזיוס כדי למנוע קריאות שגויות הנובעות מההיווצרות הפוטנציאלית של המבנים המשניים. איור 3 מציג את הספקטרום של המודל אוליגונוקלאוטידים של רנ"א המשמשים בעבודה זו, שצולמו בטמפרטורת החדר ולאחר הפעלת חום.

ההליך הכולל, יחד עם המבנה של הנגע החמצוני שגורם לעיכוב Xrn-1, מודגם באיור 4. אוליגונוקלאוטיד (1) מכיל 8-oxoG אחד בעמדה-11 והוא המקום שבו פעילות Xrn-1 נחסמת, וכתוצאה מכך הידרוליזה עצורה של גדיל הרנ"א. חשוב לציין שהתוצאות המתוארות באיור זה תואמות לניסויים שבוצעו באמצעות תמיסות המכילות 200 pmol של גדיל האב (1), אם כי רק 20 pmol נצפו על הצלחת. חשוב לציין כי המסה הממוצעת שימשה בכל החישובים וכי נצפו פערים הנעים בין 1-3 יחידות מסה אטומית (amu). האיור מציג שני תהליכים, (1) זרחון יעיל של 5'-פוספורילציה של רנ"א, עדות להופעת שיא אחד בלבד (1') המתאים לתוצר הצפוי, ו-(2) מקטע ההשהיה הנובע מהטיפול בתערובת הדגימה עם Xrn-1. ניסויי בקרה שבהם גדיל האב טופל באותם תנאים, בהיעדר קינאז (PNK), והריבונוקלאז (Xrn-1) לא הציג הבדלים מאלה המוצגים באיור 4 (גדיל RNA 1).

אותן תוצאות התקבלו באמצעות רצף שונה (3) שהכיל שני נגעים חמצוניים (איור 5). הזרחון המקביל וההתפרקות האנזימטית הניבו שני תוצרים עיקריים שהציעו כי האנזים נתקע ברצף בשני האתרים המכילים 8-oxoG. כפי שמתואר בספקטרום המסה המתאים לשברי העניין, נצפתה אי התאמה ברכישת MALDI-TOF כאשר לוקחים ספקטרה של אותו אוליגונוקלאוטיד בימים שונים. הדבר מודגם באיור 4, שם נצפו שתי יחידות אטומיות נוספות. התוצאות המתוארות באיור זה תואמות לניסויים שבוצעו עם 100 pmol של גדיל האב (3). חשוב לציין כי ניתן לקבל נתונים כמותיים כדי להעריך את היעילות הכוללת של התהליך הביוכימי (ומעקב מלא באמצעות MALDI-TOF) על ידי הכנסת תקן פנימי על דגימות לפני ואחרי השפלה אנזימטית.

Figure 1
איור 1: איתור של תמיסת RNA. (A) תצפית על לוחית ה-MALDI. (B) המחשה של מיקום לוחית MALDI על הספקטרומטר MALDI. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: צילום המצלמה הממחיש את היווצרות הדגימה: גבישי מטריצה שזוהו על הלוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ספקטרום UV-vis של אוליגונוקלאוטידים (1) ו-(3) שתועדו ב-25 °C ו-90 °C,בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: תהליך ניסיוני להכנת אוליגונוקלאוטידים וספקטרום מסה עבור כל שלב. רצף האירועים מתאים ל-(B) 5'-פוספורילציה בנוכחות קינאז פולינוקלאוטיד (PNK), ואחריו (C) הידרוליזה אנזימטית בנוכחות Xrn-1. ספקטרום MALDI-TOF המתקבל לפני ואחרי שני התהליכים הביוכימיים מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: ספקטרום MALDI-TOF, באמצעות אוליגונוקלאוטיד (3), שהושג לפני טיפול (משמאל)/אחרי (מימין) עם Xrn-1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תמיסה הרכב
A Tris-HCl (700 mM), DTT (50 mM), pH 7.6, T4 חיץ פולינוקלאוטיד קינאז
B NaCl (1 M), Tris-HCl (0.5 M), MgCl2 (0.1 M), DTT (10 mM), pH 7.9
C 2,4,6-טיהידרוקסיאצטופנון מונוהידרט (THAP, 25 mM), אמוניום ציטראט (10 mM)
D אמוניום פלואוריד (300 mM ב-50% aq. Acetonitrile)
RNase ללא H2O מים טהורים במיוחד טופלו בדתיל פירוקרבונט (DEPC, 1 מ"ל לליטר מים), דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (12 שעות) ואוטוקלבים (1 שעות)

טבלה 1: הרכבי פתרונות ששימשו במחקר.

סרטון 1: הדגמה לאיתור על צלחת ה-MALDI. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

סרטון 2: הדגמה המתארת את ניתוחי הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

קובץ משלים 1: איור שלב אחר שלב לטיפול בתוכנת UV-vis (שלב 1.2), רכישת נתוני MS (שלב 4.1) ועיבוד נתונים של MS (שלב 4.2). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

האתגר העיקרי בתהליך עבודה זה התעורר בין השלמת הניסויים לבין ביצוע הניתוחים הספקטרומטריים של המסות. הניסויים בוצעו והושלמו באוניברסיטת קולורדו דנבר ונשלחו (בן לילה) למתקני אוניברסיטת המדינה של קולורדו. איסוף הנתונים בוצע עם קבלתו, לפי הנוחות. מספר נסיבות בלתי צפויות הובילו לעיכובים בזמן בתהליך. במקרה אחד, תקלות בלתי צפויות במכשירים דרשו את הקפאת הדגימות (חד פעמית למשך 21 יום) לפני איתור ורכישה; עם זאת, נראה כי העיכוב הפעם לא השפיע על תוצאת הניסוי, אם כי לא ניתן לשלול השפלה של הרנ"א (מה שהוביל לירידה בעוצמות האות).

המגבלה של הניסויים המתוארים, במונחים של ריכוז RNA, הייתה שהניסויים בוצעו עם [RNA] גבוה יותר ממה שניתן להשיג ב-vivo, עבור רצף RNA יחיד23,24. מצאנו שכאשר נערכו ניסויים עם 20 pmol של RNA (2 pmol זוהו על הצלחת), או כמויות נמוכות יותר, השיאים הצפויים לא נצפו. השימוש בספקטרומטרים עם עוצמת לייזר משופרת עשוי להוביל ככל הנראה לאות משופר ולמגבלות זיהוי נמוכות יותר.

צפוי כי ניתן להימנע מהשלב שבו מסוננים האנזימים (באמצעות מכשיר סינון של 10 kDa) להפרדת האנזימים. ניסויים שבוצעו ללא שלב זה הובילו לתוצאות דומות. עם זאת, שלב הסינון מומלץ אם יש לשלוח דגימות או לאחסן אותן למשך זמן מה.

הצעדים המסופקים עשויים להיות נוחים לאפיון והבנה של מספר תהליכים ביוכימיים. דוגמאות לכך עשויות לכלול אפיון של תהליכים הכוללים דנ"א פגום25, פפטידים26,27, או RNA מצומד28, בין רבים אחרים. באופן כללי, אנו משערים כי התהליך המתואר כאן עשוי להיות ישים לתצורות ניסיוניות שונות המערבות חומצות גרעין, חלבונים, ביו-חומרים ו/או ביופולימרים אחרים. יתר על כן, פיתוח ספקטרומטרים משופרים יוביל לתוצאות משופרות, ולתגליות חשובות, באזורים המערבים את הביומולקולות הנ"ל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

חשוב לציין שעבודה זו הייתה מאמץ משותף בין שלושה מוסדות, שתי קבוצות מחקר ומתקן ליבה אחד. ההפצה ועומס העבודה בוצעו כדלקמן: ביטוי חלבון (Xrn-1) בוצע באוניברסיטת דנבר (דנבר, קולורדו). סינתזה, כימות וניסויים של אוליגונוקלאוטידים (בעיקר השפלה אנזימטית) נערכו באוניברסיטת קולורדו דנבר (דנבר, קולורדו). כמו כן בוצע שם אופטימיזציה. איתור, רכישה וניתוח של MALDI-TOF בוצעו במתקן הליבה של המשאבים האנליטיים באוניברסיטת המדינה של קולורדו. (פורט קולינס, קולורדו). SS רוצה להודות על פרס UROP (CU דנבר) ומענקי Eureca (CU דנבר) לתמיכה. E. G.C. מכיר בתמיכה של NIGMS, באמצעות R00GM115757. MJER מאשרת תמיכה מ- NIGMS, באמצעות 1R15GM132816. K.B. מכיר במזהה משאב: SCR_021758. העבודה נתמכה גם על ידי פרס מורה-חוקר (MJER), TH-21-028, מטעם קרן הנרי דרייפוס.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6 mL MCT Graduated Violet Fisher Scientific 05-408-127
6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% Sigma Aldrich 480-66-0
Acetonitrile 99.9%, HPLC grade Fisher Scientific 75-05-8
Adenosine triphosphate, 10 mM New Englang Bioscience P0756S
Ammonium citrate, dibasic 98% Sigma Aldrich 3012-65-5
Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade Alfa Aesar 12125-01-8
Bruker bacterial test standard Bruker Daltonics 8255343
Commercial source of Xrn-1 New England BioLabs M0338S
Diethyl pyrocarbonate, 97% ACROS Organics A0368487
Flex analysis software Bruker daltonics FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics
Lambda 365 UV-vis spectrophotometer Perkin Elmer
MALDI plate: MSP 96 ground steel target Bruker Daltonics 280799
Mass Spectrometer Bruker Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA)
Mili-Q IQ 7000 Milipore Sigma A Mili-Q system was used to purify all water used in this work
Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) Pall Corporation OD010C33 filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size
NEBuffer 3 New England Biolabs B7003S This is solution B
Oligo Analyzer tool IDT-DNA https://www.idtdna.com/calc/analyzer
Pipette tips P10 Fisher Scientific 02-707-441
Pipette tips P200 Fisher Scientific 02-707-419
RNase Away Molecular BioProducts 7005-11
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer New England BioLabs B0201S This is solution A
Triflouroacetic Acid Alfa Aesar 76-05-1
Xrn-1 exoribonuclease Expressed in house See ref. 20
ZipTip Pipette Tips for Sample preparation Millipore ZTC 18S 096 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  2. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  3. Zenobi, R. Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry. Chimia. 57, 73 (2003).
  4. Aristri, M. A., et al. Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application. Forests. 12 (11), 1516 (2021).
  5. Pedrazzani, C., et al. 5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).
  6. Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).
  7. Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).
  8. Kaufmann, R. Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology. Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).
  9. Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer. ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).
  10. Chapman, E. G., DeRose, V. J. Enzymatic processing of platinated RNAs. Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).
  11. Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical. Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).
  12. Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry. Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).
  13. Ghodke, P. P., Guengerich, P. DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides. Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).
  14. JoVE. JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2021).
  15. Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).
  16. Su, K. -Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).
  17. Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).
  18. Phillips, C. N., et al. Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).
  19. Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).
  20. Langeberg, C. J., et al. Biochemical characterization of yeast Xrn1. Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).
  21. Stevens, A. Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis. Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).
  22. Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control. Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).
  23. Fasnacht, M., et al. Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress. Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).
  24. Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).
  25. Tomar, R., et al. DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct. Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).
  26. Gaffney, A., et al. HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates. ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).
  27. Sikorski, E. L., et al. Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells. ChemBioChem. , 202100521 (2022).
  28. Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency. ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).

Tags

ביוכימיה גיליון 182 MALDI-TOF אפיון RNA ספקטרומטריית מסה של חומצות גרעין 8-oxoG ב-RNA תגובתיות ריבונוקלאז השפלה אנזימטית
זיהוי שברי RNA כתוצאה מהשפלה אנזימטית באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schowe, S. W., Langeberg, C. J.,… More

Schowe, S. W., Langeberg, C. J., Chapman, E. G., Brown, K., Resendiz, M. J. E. Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (182), e63720, doi:10.3791/63720 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter