Summary
MALDI-TOF è stato utilizzato per caratterizzare frammenti ottenuti dalla reattività tra RNA ossidato ed esoribonucleasi Xrn-1. Il presente protocollo descrive una metodologia che può essere applicata ad altri processi che coinvolgono RNA e/o DNA.
Abstract
L'RNA è un biopolimero presente in tutti i domini della vita e le sue interazioni con altre molecole e / o specie reattive, ad esempio DNA, proteine, ioni, farmaci e radicali liberi, sono onnipresenti. Di conseguenza, l'RNA subisce varie reazioni che includono la sua scissione, degradazione o modifica, portando a specie biologicamente rilevanti con funzioni e implicazioni distinte. Un esempio è l'ossidazione della guanina a 7,8-diidro-8-ossoguanina (8-oxoG), che può verificarsi in presenza di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Nel complesso, le procedure che caratterizzano tali prodotti e trasformazioni sono in gran parte preziose per la comunità scientifica. A tal fine, la spettrometria di massa a ionizzazione a desorbimento laser assistita da matrice (MALDI-TOF) è un metodo ampiamente utilizzato. Il presente protocollo descrive come caratterizzare i frammenti di RNA formatisi dopo il trattamento enzimatico. Il modello scelto utilizza una reazione tra l'RNA e l'esoribonucleasi Xrn-1, in cui la digestione enzimatica viene interrotta in siti ossidati. Due sequenze di RNA lungo 20 nucleotidi [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] e [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] sono state ottenute tramite sintesi in fase solida, quantificate mediante spettroscopia UV-vis e caratterizzate tramite MALDI-TOF. I fili ottenuti sono stati poi (1) fosforilati 5' e caratterizzati tramite MALDI-TOF; (2) trattati con Xrn-1; (3) filtrati e dissalati; (4) analizzato tramite MALDI-TOF. Questa configurazione sperimentale ha portato all'identificazione inequivocabile dei frammenti associati allo stallo di Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] e [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Gli esperimenti descritti sono stati condotti con 200 picomoli di RNA (20 pmol utilizzati per le analisi MALDI); tuttavia, quantità inferiori possono comportare picchi rilevabili con spettrometri che utilizzano sorgenti laser con più potenza di quella utilizzata in questo lavoro. È importante sottolineare che la metodologia descritta può essere generalizzata e potenzialmente estesa all'identificazione del prodotto per altri processi che coinvolgono RNA e DNA e può aiutare nella caratterizzazione / delucidazione di altri percorsi biochimici.
Introduction
MALDI-TOF 1,2,3 è una tecnica ampiamente utilizzata per la caratterizzazione e/o la rilevazione di molecole di varie dimensioni e caratteristiche. Alcuni dei suoi usi includono diverse applicazioni come il rilevamento di tannini dalle risorse naturali4, l'imaging di metaboliti negli alimenti5, la scoperta o il monitoraggio di bersagli o marcatori di farmaci cellulari6 e la diagnostica clinica7, per citarne alcuni. Di rilevanza per il presente lavoro è l'uso di MALDI-TOF con DNA o RNA, con il suo uso su oligonucleotidi risalenti a oltre tre decenni8, dove sono state notate diverse limitazioni. Questa tecnica si è ora evoluta in un mezzo affidabile e comunemente usato per caratterizzare entrambi i biopolimeri9 e identificare / comprendere reazioni chimiche e biochimiche, ad esempio, caratterizzazione di siti platinati in RNA10, identificazione di frammenti di RNA a seguito di scissione del filamento 11,12 o formazione di legami incrociati proteina-DNA13 . Pertanto, è utile illustrare ed evidenziare aspetti importanti dell'utilizzo di questa tecnica. Le basi di MALDI-TOF sono state descritte anche in formato video14 e non saranno ulteriormente elaborate nel presente documento. Inoltre, la sua applicazione in un contesto di DNA o proteine è stata precedentemente descritta e illustrata nel suddetto formato 15,16,17.
Il protocollo per la rilevazione di frammenti di RNA formatisi dopo idrolisi enzimatica è riportato qui. Il modello sperimentale è stato scelto sulla base di una recente scoperta pubblicata dal nostro gruppo18, in cui MALDI-TOF è stato utilizzato per determinare la reattività unica tra l'esoribonucleasi Xrn-1 e gli oligonucleotidi dell'RNA contenenti la lesione ossidativa 8-oxoG. I filamenti lunghi a 20 nucleotidi sono stati ottenuti tramite sintesi in fase solida19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] e [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], mentre Xrn-1 è stato espresso e purificato seguendo il rapporto20 precedentemente descritto. In breve, Xrn-121 è un'esoribonucleasi 5'-3' con vari ruoli biologici chiave che degradano più tipi di RNA, incluso l'RNAossidato 22. Si è scoperto che la processività dell'enzima si blocca incontrando 8-oxoG, che ha portato a frammenti di RNA contenenti estremità 5'-fosforilate [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] e [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Infine, è importante notare che la spettrometria di massa è un metodo potente che, attraverso varie metodologie, può essere adattato ad altri scopi23,24; pertanto, la scelta del giusto metodo di ionizzazione e di altre impostazioni sperimentali è della massima importanza.
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Protocol
Per il presente studio è stata utilizzata acqua ultra pura priva di RNasi (Tabella 1).
1. Determinazione della concentrazione della soluzione di RNA
- Preparare il campione di RNA seguendo i passaggi seguenti.
- Utilizzare un tubo microcentrifuga (0,6 mL) per preparare una soluzione di RNA diluendo 1 μL di soluzione madre ( ottenuta tramite sintesi in fase solida)19 in 159 μL di H2O privo di RNasi. Mescolare la soluzione convogliando ripetutamente la miscela su e giù (10x).
NOTA: poiché una vasta gamma di cuvette è disponibile in commercio, i volumi necessari possono differire. In questo lavoro sono state utilizzate cuvette con una lunghezza di percorso di 1 cm e un volume ridotto (150 μL). - Risciacquare la cuvetta UV-vis con metanolo (2x), seguita da acqua (ultrapura H2O, 3x, vedi Tabella dei materiali). Utilizzare un flusso di azoto gassoso per asciugare accuratamente la cuvetta.
- Utilizzare una pipetta per trasferire la soluzione (punto 1.1.1) nella cuvetta, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria. Tappare la cuvetta e metterla di lato fino a quando necessario.
- Utilizzare un tubo microcentrifuga (0,6 mL) per preparare una soluzione di RNA diluendo 1 μL di soluzione madre ( ottenuta tramite sintesi in fase solida)19 in 159 μL di H2O privo di RNasi. Mescolare la soluzione convogliando ripetutamente la miscela su e giù (10x).
- Determinare la concentrazione della soluzione di RNA preparata utilizzando lo spettrofotometro UV-vis.
- Accendere lo spettrofotometro UV-Vis ruotando l'interruttore situato nella parte posteriore dello strumento. Consentire allo strumento di completare la procedura di avvio e fare clic sull'icona UV WinLab per aprire la finestra di funzionamento/ controllo dello strumento.
- Accendere lo spettrofotometro Peltier Temperature Controller utilizzando l'interruttore situato alla destra dello strumento.
- In Metodi di base, fare clic su Scansione - Lambda 365. Si aprirà un'altra schermata e verrà richiesto all'utente di assicurarsi che i porta celle siano vuoti. Fare clic su OK e consentire allo strumento di eseguire i controlli del sistema. Il sistema visualizzerà quindi un elenco di controlli, assicurerà che tutti "Pass" e fare clic su OK.
NOTA: si consiglia di seguire i passaggi 1.2.1-1.2.3 nell'ordine fornito; l'alterazione di questa sequenza di eventi può causare malfunzionamenti del software. - Regolare i parametri di scansione selezionando Raccolta dati. Nella nuova finestra in Impostazioni di scansione modificare l'inizio a 350 nm e l'estremità a 215 nm.
- Attiva il Peltier selezionando il + a sinistra dell'accessorio. Fare clic su Peltier a celle multiple, modificare la temperatura °C a 25 e fare clic su Peltier On.
- Passare alla scheda Informazioni di esempio e immettere il numero di campioni, i nomi e la posizione della cella come desiderato.
- Clicca su Autozero e inserisci la cuvetta contenente la soluzione di sfondo. Assicurarsi di posizionare questa cuvetta nello stesso slot in cui verranno eseguite le misurazioni.
- Fare clic su Start e inserire la cuvetta (passaggio 1.1.3) nella cella desiderata. Assicurarsi che la finestra della cuvetta sia orientata parallelamente alla faccia anteriore dello strumento. Fare clic su OK per iniziare la prima scansione a 25 °C.
- Per le misurazioni a temperature più elevate, ripetere i passaggi da 1.2.5 a 1.2.8 e modificare la temperatura alla temperatura del campione desiderata (90 °C nel caso di specie).
- Fare clic su File > Esporta e scegliere la posizione del file desiderata. Selezionare Dati XY per ottenere un file .txt.
NOTA: un aiuto illustrativo del passaggio 1.2 è disponibile nel file supplementare 1 (S1-S7).
- Eseguire l'acquisizione dei dati per determinare la concentrazione di RNA.
- Trova il file per ogni spettro nella scheda Risultati . Per ottenere l'assorbanza, passare il puntatore del mouse sulla linea, passare a 260 nm e registrare le assorbanze visualizzate. In alternativa, tramite la cascata File > Export , esportare i dati come file .txt per ulteriori analisi grafiche utilizzando altri software di plottaggio.
NOTA: Se 0,1 < A ≥ 1, sarà necessario diluire o aumentare la concentrazione del campione di RNA preparato nella fase 1.1.1. - Utilizzare la legge di Beer-Lambert per calcolare la concentrazione della soluzione.
NOTA: Legge della birra: A = εcl, dove:
A: Assorbanza (a 260 nm in questo caso, dal passo 1.3.1)
ε: Coefficiente di estinzione. Per la sequenza qui utilizzata, 208.000 L mol-1 cm-1 è il valore ottenuto da uno strumento OligoAnalyzer.
l: Lunghezza percorso, 1 cm
c: concentrazione del campione - Utilizzare questi calcoli per preparare la soluzione desiderata di RNA da utilizzare per esperimenti successivi. Soluzioni con [RNA] = 200 μM sono state utilizzate nel presente studio.
- Trova il file per ogni spettro nella scheda Risultati . Per ottenere l'assorbanza, passare il puntatore del mouse sulla linea, passare a 260 nm e registrare le assorbanze visualizzate. In alternativa, tramite la cascata File > Export , esportare i dati come file .txt per ulteriori analisi grafiche utilizzando altri software di plottaggio.
2. Idrolisi di oligonucleotidi di RNA da parte di Xrn-1
- Eseguire la fosforilazione 5' dell'RNA seguendo i passaggi seguenti.
- Utilizzare un tubo microcentrifuga da 0,6 mL per preparare la seguente soluzione (volume totale di 50 μL).
- Aggiungere H2O senza RNasi (33,5 μL); i volumi possono variare a seconda di [RNA].
- Quindi, aggiungere la soluzione A (5 L, Tabella 1).
- Aggiungere una soluzione acquosa di adenosina trifosfato (ATP, vedi Tabella dei materiali) (6 L, 10 mM, 60 nmol).
- Aggiungere soluzione acquosa di RNA (1 μL, 200 μM, 200 pmol).
- Aggiungere la soluzione di polinucleotide chinasi (enzima PNK, vedi Tabella dei materiali) (4,5 L, 45 unità). Mescolare delicatamente pipettando il composto su e giù (10x).
- Incubare la miscela di reazione a 37 °C per 45 minuti ponendola a bagnomaria.
- Inattivare l'enzima posizionando il tubo di reazione in un blocco di calore preriscaldato (65 °C) e incubando la soluzione per 10 minuti.
- Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente (la fosforilazione dell'RNA è stata caratterizzata tramite analisi MALDI-TOF, vedi Risultati rappresentativi) per produrre una soluzione finale di RNA 5'-fosforilata (4 μM, 50 μL).
- Utilizzare un tubo microcentrifuga da 0,6 mL per preparare la seguente soluzione (volume totale di 50 μL).
- Eseguire l'idrolisi dell'RNA da Xrn-1 seguendo i passaggi seguenti.
- Utilizzando la soluzione (50 μL) dal passaggio 2.1.4, eseguire i seguenti passaggi.
- Aggiungere la soluzione B (5 L, Tabella 1).
- Aggiungere una soluzione di Xrn-1 (0,5 L, 1 ng, 30 fmol). Mescolare la soluzione pipettando delicatamente su e giù (10x).
- Incubare il tubo di reazione a temperatura ambiente per 2 ore.
- Trasferire la miscela di reazione (fase 2.2.1.3) in un dispositivo centrifugo da 10 kDa (vedere Tabella dei materiali) e filtrare gli enzimi mediante centrifugazione (700 x g per 10 minuti a temperatura ambiente).
- Trasferire il filtrato in un tubo centrifugo da 0,6 mL.
- Lavare l'RNA residuo sul tubo centrifugo (fase 2.2.2.) aggiungendo H 2 O (20L) privo di RNasi, seguito da centrifugazione (700 x g per 10 minuti a temperatura ambiente).
- Combinare il filtrato con quello ottenuto dal punto 2.2.3.
- Conservare il tubo contenente la soluzione risultante in un congelatore (0 °C) o spedirlo per l'analisi.
- Utilizzando la soluzione (50 μL) dal passaggio 2.1.4, eseguire i seguenti passaggi.
3. Dissalazione della soluzione di RNA, spotting della piastra MALDI-TOF
- Dissalare e concentrare il campione utilizzando punte di pipette C18 a scambio cationico disponibili in commercio (vedere Tabella dei materiali).
- Posizionare una punta della pipetta C18 da 10 L (punta della pipetta caricata con un letto di mezzo cromatografico C18 fissato alla sua estremità) su una pipetta da 10 μL, quindi continuare con quanto segue:
- Lavare la punta C18 con una soluzione acquosa di acetonitrile (10 μL) al 50% due volte. Scartare i volumi utilizzati in un tubo di scarico separato ogni volta.
- Equilibrare la punta C18 con una soluzione acquosa di acido trifluoroacetico (0,1% TFA, 10 μL) due volte. Scartare i volumi utilizzati in un tubo di scarico separato ogni volta.
- Rimuovere manualmente la punta C18 dalla pipetta e fissarla su una pipetta da 200 μL contenente una punta della pipetta P200 (la punta C18 sarà ora fissata alla punta della pipetta P200).
- Immergere la punta C18 nella soluzione (passaggio 2.2.6) e aspirare il rilascio della soluzione attraverso la punta C18 dieci volte.
NOTA: Il campione di RNA si lega alla resina a scambio cationico all'interno della punta. - Staccare la punta C18 dalla pipetta P200 e posizionarla su una pipetta da 10 μL.
- Lavare la punta C18 utilizzando una soluzione acquosa di TFA allo 0,1% (10 μL) due volte. Scartare i volumi utilizzati in un tubo di scarico separato ogni volta.
- Lavare la punta C18 con acqua priva di RNasi (10 μL) due volte. Scartare i volumi utilizzati in un tubo di scarico separato ogni volta.
- Posizionare una punta della pipetta C18 da 10 L (punta della pipetta caricata con un letto di mezzo cromatografico C18 fissato alla sua estremità) su una pipetta da 10 μL, quindi continuare con quanto segue:
- Posiziona sulla piastra MALDI seguendo i passaggi seguenti.
- Eluire l'oligonucleotide dell'RNA dalla punta C18 (fase 3.1.1.7) immergendo il campione nella matrice desiderata (10 μL, soluzione 1:1 di C e D, Tabella 1), quindi dispensare nuovamente la soluzione nel tubo. Ripeti questo processo dieci volte.
- Pipettare la soluzione da 3.2.1 su due punti separati sulla piastra (1 μL ciascuno, 20 pmol). Lasciare asciugare i punti all'aria (Figura 1A e Video 1).
NOTA: questo processo può essere ripetuto nello stesso punto per aumentare la concentrazione del campione su ciascun punto. - Pipettare il calibrante desiderato (1 L) su due punti separati fisicamente vicini alla posizione del campione e lasciare asciugare all'aria.
NOTA: Lo standard di prova utilizzato nel presente studio è stato ottenuto da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali). - Sovra-posare il calibrante [completamente essiccato] con la matrice desiderata (1 L). Lasciare asciugare all'aria.
NOTA: è importante tenere traccia della posizione in cui i campioni e i calibranti vengono individuati prima dell'inserimento nello strumento. Prendetene nota utilizzando il sistema di coordinate della piastra, ad esempio il campione 1 si trova in posizione (C,3)
4. Acquisizione ed elaborazione dei dati
NOTA: In generale, THAP richiede una maggiore potenza laser per ottenere la ionizzazione. Inoltre, gli oligo possono essere difficili da ionizzare senza frammentarsi. Pertanto, di solito è necessario utilizzare la potenza laser più bassa possibile e aumentare i guadagni del rilevatore e / o una frequenza laser inferiore per massimizzare il rilevamento e ridurre al minimo la frammentazione.
- Eseguire l'acquisizione dei dati seguendo i passaggi seguenti.
NOTA: le misurazioni del peso molecolare sono state eseguite utilizzando uno spettrometro di massa (vedere Tabella dei materiali) in modalità positivo, lineare con una tensione della sorgente ionica di 20 kV, guadagno del rivelatore di ~2,8 kV e una frequenza laser di 20 Hz. Gli intervalli di scansione sono stati impostati in base al peso molecolare atteso. Questi sono stati calcolati ed espressi come massa su carica (m / z), dove la carica era 1. La calibrazione esterna è stata eseguita utilizzando una miscela di calibrazione proteica (Bacterial Test Standard, vedere Tabella dei materiali) in un punto adiacente al campione. I dati grezzi sono stati quindi elaborati nel software flexAnalysis (vedere Tabella dei materiali).- Aprire "Flexcontrol software" per il funzionamento. Premere il pulsante verde di ingresso/uscita dello strumento, attendere che lo stadio di destinazione si muova e aspirare per sfogarsi. Aprire il coperchio, posizionare la piastra di destinazione completamente asciutta nello strumento. Assicurarsi di allinearsi con il giusto orientamento (Figura 1B).
- Abbassare delicatamente il coperchio, quindi premere il pulsante verde di ingresso/uscita . Attendere che la piastra venga retratta e che lo strumento si ricacci verso il basso. Una volta che la barra di stato (angolo in basso a destra della finestra del software) riflette "Pronto", procedere con la calibrazione.
- Per calibrare gli strumenti utilizzando il software, effettuare quanto segue.
- Selezionare il metodo desiderato facendo clic su File > Select Method o premendo il pulsante Select adiacente al metodo caricato. Fate clic su Coordinate (Coordinate ) per il punto di calibro. Passare alla scheda Calibrazione e verificare che sia selezionato il calibrante corretto. Assicurarsi che Random Walk sia disattivato (nella scheda Vettore campione ).
- Premere Start e dirigere manualmente il laser lungo un cristallo (facendo clic sulla freccia del mouse nella posizione desiderata nella vista della fotocamera). Regolare la potenza del laser, se necessario. Una volta soddisfatte le impostazioni, premere Start per raccogliere gli spettri e aggiungerli al buffer di somma.
- Aggiungere spettri alla somma fino a raggiungere un'intensità sufficiente. Attiva/disattiva per visualizzare solo il buffer di somma, sottrarre la linea di base e smussare. Quindi fare clic su Assegnazione automatica. Controllare ogni picco assegnato e notare l'errore ppm. Se sei soddisfatto delle assegnazioni e degli errori, fai clic su Applica.
- Cancellare il buffer di somma e passare alla posizione del primo campione.
- Confermare l'intervallo di scansione desiderato (scheda "Rilevamento"). Regolare le barre nell'"Intervallo di massa" in modo che la regione verde sia rappresentativa delle masse previste.
- Fare clic direttamente sulla finestra Ingrandimento in modo che il mirino sia orientato verso il frammento cristallizzato desiderato (i cristalli più grandi spesso producono i migliori risultati, Figura 2).
- Raccogli alcuni spettri lungo i grandi cristalli, regolando la potenza del laser secondo necessità. L'impostazione corretta è del 5%-10% al di sopra della potenza alla quale compaiono i picchi.
- Per ottenere spettri, eseguire le operazioni seguenti.
- Clicca su Start per osservare il flash laser in tandem con intensità spettrale crescente (mostrato nella finestra in alto a destra). Spostare il laser lungo la lunghezza del cristallo facendo clic sulla freccia del mouse su e giù per il cristallo (Video 2).
- Fai clic su Aggiungi direttamente sotto Start.
- Ripeti questa operazione più volte fino a raggiungere l'intensità/numero di colpi desiderato (riflesso sull'asse y della finestra spettrale)
- Regolare la potenza e/o la velocità del laser e/o i guadagni del rilevatore se le scansioni iniziali sono insoddisfacenti. Ripetere i passaggi 4.1.4.1-4.1.4.3 in base alle esigenze.
- Se sei soddisfatto dello spettro, fai clic su Salva con nome per salvare lo spettro con un nome specificato. Quindi, se sono necessari altri campioni, fare clic su Cancella somma e ripetere i passaggi nel passaggio 4.1.4.
- Eseguire l'elaborazione dei dati.
NOTA: il passaggio 4.2 descrive un modo per analizzare i dati utilizzando il software flexAnalysis.- Aprire il software desiderato. Quindi, aprire lo spettro (a) selezionando File. Dal menu a discesa, seleziona Apri.
- Verrà visualizzata una nuova finestra. Fare clic su Sfoglia per individuare i file salvati dal passaggio 4.1.4. Seleziona le caselle per i file desiderati, quindi fai clic su Apri a sinistra. Se solo un singolo spettro richiede l'analisi, è sufficiente trascinare e rilasciare il file nella finestra del software.
- Evidenziare i file caricati per l'analisi di massa. Passare alla scheda Processo sulla barra degli strumenti. Nel menu a discesa, selezionare Sottrai linea di base dello spettro di massa.
NOTA: l'algoritmo utilizzato per la sottrazione sarà determinato dal metodo selezionato nel passaggio 4.1.3. - Passare alla scheda Processo sulla barra degli strumenti. Nel menu a discesa, selezionare Spettro di massa uniforme.
NOTA: l'algoritmo utilizzato per lo smoothing sarà determinato dal metodo selezionato nel passaggio 4.1.3. - Fare clic sulla scheda Elenco di massa ; nell'elenco a discesa, seleziona Trova. Questo comando etichetta automaticamente i picchi con le loro masse; un elenco delle masse verrà visualizzato sullo schermo a destra.
- Per aggiungere o eliminare picchi, passare alla scheda Elenco di massa . Nel menu a discesa, fai clic su Modifica.
- Passa il mouse sopra l'asse x dello spettro; una linea verticale rappresenta la posizione dello spettro in cui si trova il cursore.
NOTA: un'icona con un grafico e un cursore apparirà quando è possibile aggiungere una nuova massa facendo clic. Questa icona verrà visualizzata quando si passa il mouse su picchi che possono essere eliminati facendo clic (vedere il passaggio 4.2.7 nel file supplementare 1). - Ripetere i passaggi 4.1.3-4.1.7 per ulteriori spettri. Esporta l'elenco di massa per tutti gli spettri facendo clic e trascinando per evidenziare i file a sinistra ed esegui il seguente menu a cascata File > Esporta >alenco di massa in Excel.
- Per esportare gli spettri come mostrato sullo schermo, acquisire uno screenshot o esportarlo come report. Per quest'ultimo, passare al menu Report . Nel menu a discesa, seleziona Salva come PDF.
NOTA: È possibile modificare il modo in cui gli spettri vengono visualizzati utilizzando le tre schede sotto gli spettri e / o variando i file evidenziati. Apparirà una schermata. Assegna un nome al documento PDF come desiderato, regola le impostazioni / layout e fai clic su Salva per generare un'immagine dello spettro. - L'immagine generata rifletterà la vista spettrale nel programma software. Per modificare la vista, eseguire le operazioni seguenti.
- Zoom avanti: fai clic sul pulsante Zoom avanti nella barra degli strumenti.
- Passare il puntatore del mouse sull'asse x e fare clic fino a raggiungere l'intervallo desiderato.
- Zoom indietro / annulla: fare clic sul pulsante Zoom indietro e fare clic in qualsiasi punto dello spettro per tornare alla visualizzazione completa.
NOTA: un aiuto illustrativo per i passaggi 4.1 e 4.2 è disponibile nel file supplementare 1 (pp S8-S23 e S24-S30, rispettivamente).
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Representative Results
Gli oligonucleotidi utilizzati in questo lavoro sono stati sintetizzati, caratterizzati e quantificati prima dell'uso. La concentrazione di tutti gli oligonucleotidi è stata determinata tramite spettroscopia UV-vis registrata a 90 °C per evitare letture errate derivanti dalla potenziale formazione delle strutture secondarie. La Figura 3 mostra gli spettri degli oligonucleotidi modello di RNA utilizzati in questo lavoro, presi a temperatura ambiente e dopo l'applicazione di calore.
La procedura complessiva, insieme alla struttura della lesione ossidativa che causa lo stallo di Xrn-1, è illustrata nella Figura 4. L'oligonucleotide (1) contiene un 8-oxoG in posizione-11 ed è dove l'attività di Xrn-1 è bloccata, con conseguente idrolisi arrestata del filamento di RNA. È importante sottolineare che i risultati raffigurati in questa figura corrispondono a esperimenti condotti utilizzando soluzioni contenenti 200 pmol del filamento genitore (1), sebbene solo 20 pmol siano stati individuati sulla piastra. È importante notare che la massa media è stata utilizzata in tutti i calcoli e che sono state osservate discrepanze variabili tra 1-3 unità di massa atomica (amu). La figura mostra due processi: (1) l'efficiente 5'-fosforilazione dell'RNA, evidenziata dalla comparsa di un solo picco (1') corrispondente al prodotto atteso, e (2) il frammento di stallo derivante dal trattamento della miscela campione con Xrn-1. Esperimenti di controllo in cui il filamento genitore è stato trattato nelle stesse condizioni, in assenza della chinasi (PNK), e la ribonucleasi (Xrn-1) non ha mostrato differenze rispetto a quelle mostrate nella Figura 4 (filamento di RNA 1).
Gli stessi risultati sono stati ottenuti utilizzando una sequenza diversa (3) che conteneva due lesioni ossidative (Figura 5). La corrispondente fosforilazione e degradazione enzimatica ha prodotto due prodotti principali che hanno suggerito che l'enzima si blocca successivamente in entrambi i siti contenenti 8-oxoG. Come illustrato negli spettri di massa corrispondenti ai frammenti di interesse, è stata osservata una discrepanza sull'acquisizione di MALDI-TOF durante l'assunzione di spettri dello stesso oligonucleotide in giorni diversi. Questo è illustrato nella Figura 4, dove sono state osservate due unità atomiche aggiuntive. I risultati illustrati in questa figura corrispondono a esperimenti condotti con 100 pmol del filamento genitore (3). È importante notare che è possibile ottenere dati quantitativi per valutare l'efficienza complessiva del processo biochimico (e il monitoraggio completo tramite MALDI-TOF) introducendo uno standard interno sui campioni prima e dopo la degradazione enzimatica.
Figura 1: Spotting della soluzione di RNA. (A) Spotting sulla piastra MALDI. (B) Illustrazione del posizionamento della piastra MALDI sullo spettrometro MALDI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La ripresa della telecamera che illustra la formazione del campione: cristalli di matrice individuati sulla piastra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Spettri UV-vis degli oligonucleotidi (1) e (3) registrati rispettivamente a 25 °C e 90 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Processo sperimentale per la preparazione di oligonucleotidi e spettri di massa per ogni fase. (A) Sono illustrate le fasi complessive utilizzando oligonucleotidi (1). La sequenza di eventi corrisponde a (B) 5'-fosforilazione in presenza di polinucleotide chinasi (PNK), seguita da (C) idrolisi enzimatica in presenza di Xrn-1. Vengono visualizzati gli spettri MALDI-TOF ottenuti prima e dopo entrambi i processi biochimici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Spettri MALDI-TOF, utilizzando oligonucleotidi (3), ottenuti prima (a sinistra)/dopo (a destra) con Xrn-1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Soluzione | Composizione | ||
| Un | Tris-HCl (700 mM), DTT (50 mM), pH 7,6, tampone polinucleotide chinasi T4 | ||
| B | NaCl (1 M), Tris-HCl (0,5 M), MgCl2 (0,1 M), DTT (10 mM), pH 7,9 | ||
| C | 2,4,6-Tiidrossiacetofenone monoidrato (THAP, 25 mM), citrato di ammonio (10 mM) | ||
| D | Fluoruro di ammonio (300 mM in acetonitrile al 50 % aq.) | ||
| Senza RNasi H2O | L'acqua ultrapura è stata trattata con pirocarbonato di dietile (DEPC, 1 ml per litro di acqua), incubata a 37 °C (12 h) e autoclavata (1 h) | ||
Tabella 1: Composizioni di soluzioni utilizzate nello studio.
Video 1: Dimostrazione per l'individuazione sulla piastra MALDI. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 2: Dimostrazione che delinea le analisi dei dati. Clicca qui per scaricare questo video.
File supplementare 1: illustrazione passo-passo per la gestione del software UV-vis (passaggio 1.2), acquisizione dati MS (passaggio 4.1) ed elaborazione dati MS (passaggio 4.2). Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
La sfida principale in questo flusso di lavoro è sorta tra la finalizzazione degli esperimenti e l'esecuzione delle analisi spettrometriche di massa. Gli esperimenti sono stati condotti e completati presso l'Università del Colorado a Denver e spediti (durante la notte) alle strutture della Colorado State University. L'acquisizione dei dati è stata effettuata al momento del ricevimento, come da convenienza. Diverse circostanze impreviste hanno portato a ritardi nel processo. In un caso, malfunzionamenti imprevisti dello strumento hanno richiesto il congelamento dei campioni (una volta per 21 giorni) prima dell'individuazione e dell'acquisizione; tuttavia, questo ritardo temporale non sembra influenzare l'esito sperimentale, sebbene la degradazione dell'RNA (che porta a una diminuzione delle intensità del segnale) non possa essere esclusa.
Il limite degli esperimenti descritti, in termini di concentrazione di RNA, era che gli esperimenti erano condotti con [RNA] superiore a quello che si può ottenere in vivo, per una singola sequenza di RNA23,24. Abbiamo scoperto che quando gli esperimenti sono stati condotti con 20 pmol di RNA (2 pmol individuati sulla piastra), o quantità inferiori, i picchi attesi non sono stati osservati. L'uso di spettrometri con una migliore potenza laser può probabilmente portare a un segnale migliorato e a limiti di rilevamento più bassi.
Si prevede che la fase in cui gli enzimi vengono filtrati (utilizzando un dispositivo di filtraggio da 10 kDa) per separare gli enzimi possa essere evitata. Gli esperimenti condotti senza questo passaggio hanno portato a risultati simili. Tuttavia, la fase di filtrazione è consigliata se i campioni devono essere spediti o conservati per un po '.
I passaggi forniti possono essere suscettibili di caratterizzare e comprendere diversi processi biochimici. Gli esempi possono includere la caratterizzazione di processi che coinvolgono DNA25 danneggiato, peptidi 26,27 o coniugati RNA28, tra molti altri. In generale, ipotizziamo che il processo qui illustrato possa essere applicabile a varie configurazioni sperimentali che coinvolgono acidi nucleici, proteine, biomateriali e / o altri biopolimeri. Inoltre, lo sviluppo di spettrometri potenziati porterà a risultati migliori, e a importanti scoperte, in aree che coinvolgono le suddette biomolecole.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
È importante notare che questo lavoro è stato uno sforzo collaborativo tra tre istituzioni, due gruppi di ricerca e una struttura principale. La distribuzione e il carico di lavoro sono stati effettuati come segue: L'espressione della proteina (Xrn-1) è stata effettuata presso l'Università di Denver (Denver, CO). La sintesi, la quantificazione e la sperimentazione degli oligonucleotidi (principalmente la degradazione enzimatica) sono state condotte presso l'Università del Colorado Denver (Denver, CO). L'ottimizzazione è stata effettuata anche lì. L'individuazione, l'acquisizione e l'analisi di MALDI-TOF sono state effettuate presso l'Analytical Resources Core Facility della Colorado State University. (Fort Collins, CO). SS desidera riconoscere un urop award (CU Denver) e le sovvenzioni Eureca (CU Denver) per il supporto. E. G.C. riconosce il supporto di NIGMS, tramite R00GM115757. MJER riconosce il supporto di NIGMS, tramite 1R15GM132816. K.B. riconosce l'ID risorsa: SCR_021758. Il lavoro è stato anche sostenuto da un Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, dalla Henry Dreyfus Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
References
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