Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Identifiering av RNA-fragment till följd av enzymatisk nedbrytning med maldi-TOF masspektrometri

Published: April 11, 2022 doi: 10.3791/63720
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1
1Department of Chemistry, University of Colorado, Denver, 2Department of Chemistry & Biochemistry, University of Denver, 3Analytical Resources Core Bioanalysis & Omics, Colorado State University

Summary

MALDI-TOF användes för att karakterisera fragment erhållna från reaktiviteten mellan oxiderat RNA och exoribonukleasen Xrn-1. Det föreliggande protokollet beskriver en metodik som kan tillämpas på andra processer som involverar RNA och /eller DNA.

Abstract

RNA är en biopolymer närvarande i alla livets domäner, och dess interaktioner med andra molekyler och / eller reaktiva arter, t.ex. DNA, proteiner, joner, läkemedel och fria radikaler, är allestädes närvarande. Som ett resultat genomgår RNA olika reaktioner som inkluderar dess klyvning, nedbrytning eller modifiering, vilket leder till biologiskt relevanta arter med distinkta funktioner och konsekvenser. Ett exempel är oxidationen av guanin till 7,8-dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG), som kan förekomma i närvaro av reaktiva syrearter (ROS). Sammantaget är förfaranden som karakteriserar sådana produkter och omvandlingar i stor utsträckning värdefulla för det vetenskapliga samfundet. För detta ändamål är matrisassisterad laserdesorptionsjoniseringstid (MALDI-TOF) masspektrometri en allmänt använd metod. Det föreliggande protokollet beskriver hur man karakteriserar RNA-fragment som bildas efter enzymatisk behandling. Den valda modellen använder en reaktion mellan RNA och exoribonukleasen Xrn-1, där enzymatisk matsmältning stoppas vid oxiderade platser. Två 20-nukleotidlånga RNA-sekvenser [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] och [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] erhölls via fastfassyntes, kvantifierad med UV-vis-spektroskopi och karakteriserad via MALDI-TOF. De erhållna strängarna fosforylerades sedan (1) 5'-fosforylerades och karakteriserades via MALDI-TOF; 2) behandlas med Xrn-1, (3) filtreras och avsaltas, (4) analyseras via MALDI-TOF. Denna experimentella inställning ledde till entydig identifiering av fragmenten associerade med stallningen av Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] och [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. De beskrivna experimenten utfördes med 200 pikomoler RNA (20 pmol som används för MALDI-analyser); Lägre mängder kan dock resultera i detekterbara toppar med spektrometrar som använder laserkällor med mer effekt än den som används i detta arbete. Viktigt är att den beskrivna metoden kan generaliseras och potentiellt utvidgas till produktidentifiering för andra processer som involverar RNA och DNA, och kan hjälpa till att karakterisera / belysa andra biokemiska vägar.

Introduction

MALDI-TOF 1,2,3 är en allmänt använd teknik för karakterisering och/eller detektion av molekyler av varierande storlek och egenskaper. Några av dess användningsområden inkluderar olika tillämpningar som att detektera tanniner från naturresurser4, avbildning av metaboliter i mat5, upptäckt eller övervakning av cellulära läkemedelsmål eller markörer6 och klinisk diagnostik7, för att nämna några. Av relevans för detta arbete är användningen av MALDI-TOF med DNA eller RNA, med dess användning på oligonukleotider som går tillbaka till över tre decennier8, där flera begränsningar noterades. Denna teknik har nu utvecklats till ett tillförlitligt, vanligt använt sätt att karakterisera både biopolymerer9 och identifiera/förstå kemiska och biokemiska reaktioner, t.ex. karakterisering av platinaterade platser i RNA10, identifiering av RNA-fragment efter strängklyvning11,12 eller bildning av protein-DNA-tvärlänkar13 . Således är det värdefullt att illustrera och lyfta fram viktiga aspekter av att använda denna teknik. Grunderna i MALDI-TOF har beskrivits i videoformat14 och kommer inte att utvecklas ytterligare häri. Dessutom har dess tillämpning i ett DNA- eller proteinsammanhang tidigare beskrivits och illustrerats i nämnda format 15,16,17.

Protokollet för detektion av RNA-fragment som bildas efter enzymatisk hydrolys rapporteras häri. Den experimentella modellen valdes baserat på ett nyligen publicerat fynd av vår grupp18, där MALDI-TOF användes för att bestämma den unika reaktiviteten mellan exoribonukleas Xrn-1 och oligonukleotider av RNA innehållande den oxidativa lesionen 8-oxoG. De 20-nukleotidlånga strängarna erhölls via fastfassyntes19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] och [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], medan Xrn-1 uttrycktes och renades enligt den tidigare beskrivna rapporten20. I korthet är Xrn-121 en 5'-3' exoribonukleas med olika viktiga biologiska roller som bryter ner flera typer av RNA, inklusive oxiderat RNA22. Det visade sig att enzymets processivitet stannar vid möte med 8-oxoG, vilket ledde till RNA-fragment innehållande 5'-fosforylerade ändar [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] och [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.

Slutligen är det viktigt att notera att masspektrometri är en kraftfull metod som genom olika metoder kan anpassas till andra ändamål23,24; Därför är det av yttersta vikt att välja rätt joniseringsmetod samt annan experimentell uppsättning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

RNasfritt ultrarent vatten (tabell 1) användes för den aktuella studien.

1. Koncentrationsbestämning av RNA-lösning

  1. Förbered RNA-provet enligt stegen nedan.
    1. Använd ett mikrocentrifugrör (0,6 ml) för att bereda en lösning av RNA genom att späda 1 μL stamlösning (erhållen via fastfassyntes)19 till 159 μL RNasfriH2O. Blanda lösningen genom att pipettera blandningen upp och ner upprepade gånger (10x).
      OBS: Eftersom ett brett utbud av kyvetter är kommersiellt tillgängliga kan de nödvändiga volymerna skilja sig åt. Cuvettes med en 1 cm väglängd och minskad volym (150 μL) användes i detta arbete.
    2. Skölj UV-vis-kyvetten med metanol (2x), följt av vatten (ultrarentH2O, 3x, se Materialtabell). Använd ett flöde av kvävgas för att torka kyvetten noggrant.
    3. Använd en pipett för att överföra lösningen (steg 1.1.1) till kyvetten, så att inga luftbubblor bubblar. Täck kyvetten och placera den åt sidan tills den behövs.
  2. Bestäm koncentrationen av den beredda RNA-lösningen med användning av UV-vis-spektrofotometer.
    1. Slå på UV-Vis-spektrofotometern genom att vrida på strömbrytaren på baksidan av instrumentet. Låt instrumentet slutföra startproceduren och klicka på UV WinLab-ikonen för att öppna instrumentets drift/kontrollfönster.
    2. Slå på Peltier Temperature Controller-spektrofotometern med hjälp av omkopplaren till höger om instrumentet.
    3. Under Basmetoder klickar du på Skanna - Lambda 365. En annan skärm öppnas och uppmanar användaren att se till att cellhållarna är tomma. Klicka på OK och låt instrumentet utföra sina systemkontroller. Systemet visar sedan en lista med kontroller, se till att alla "Pass" och klicka på OK.
      OBS: Vi rekommenderar att du följer steg 1.2.1-1.2.3 i den angivna ordningen; Att ändra detta händelseförlopp kan leda till programvarufel.
    4. Justera skanningsparametrarna genom att välja Datainsamling. I det nya fönstret under Skanningsinställningar ändrar du Start till 350 nm och End till 215 nm.
    5. Aktivera Peltier genom att välja + till vänster om tillbehöret. Klicka på Multiple Cell Peltier, ändra Temperature °C till 25 och klicka på Peltier On.
    6. Navigera till fliken Exempelinformation och ange antalet prover, namn och cellposition efter behov.
    7. Klicka på Autozero och sätt in kyvetten som innehåller bakgrundslösningen. Se till att placera denna kyvett i samma spår där mätningarna kommer att utföras.
    8. Klicka på Start och sätt in kyvetten (steg 1.1.3) i önskad cell. Se till att kyvettfönstret är orienterat parallellt med instrumentets framsida. Klicka på OK för att påbörja den första skanningen vid 25 °C.
    9. För mätningar vid högre temperaturer, upprepa steg 1.2.5–1.2.8 och ändra temperaturen till önskad provtemperatur (90 °C i detta fall).
    10. Klicka på Arkiv > Exportera och välj önskad filplats. Välj XY Data för att hämta en .txt fil.
      OBS: Ett illustrativt stöd för steg 1.2 finns i kompletterande fil 1 (S1-S7).
  3. Utför datainsamling för bestämning av RNA-koncentrationen.
    1. Hitta filen för varje spektrum under fliken Resultat . För att få absorbansen, håll muspekaren över linjen, navigera till 260 nm och registrera de visade absorbanserna. Alternativt, genom File > Export kaskad, exportera data som en .txt fil för ytterligare grafisk analys med hjälp av annan plottningsprogramvara.
      OBS: Om 0,1 < A ≥ 1, kommer det att vara nödvändigt att antingen späda ut eller öka koncentrationen av RNA-provet framställt i steg 1.1.1.
    2. Använd Beer-Lambert-lagen för att beräkna koncentrationen av lösningen.
      OBS: Ölets lag: A = εcl, där:
      A: Absorbans (vid 260 nm i detta fall, från steg 1.3.1)
      ε: Utrotningskoefficient. För den sekvens som används häri är 208 000 L mol-1 cm-1 det värde som erhålls från ett OligoAnalyzer-verktyg.
      l: Banans längd, 1 cm
      c: provets koncentration
    3. Använd dessa beräkningar för att förbereda den önskade lösningen av RNA som ska användas för efterföljande experiment. Lösningar med [RNA] = 200 μM användes i den aktuella studien.

2. Hydrolys av oligonukleotider av RNA genom Xrn-1

  1. Utför 5 'fosforylering av RNA enligt stegen nedan.
    1. Använd ett mikrocentrifugrör på 0,6 ml för att bereda följande lösning (50 μL total volym).
      1. Tillsätt RNasfriH2O(33,5 μL); volymerna kan variera beroende på [RNA].
      2. Lägg sedan till lösning A (5 L, tabell 1).
      3. Tillsätt en vattenlösning av adenosintrifosfat (ATP, se materialtabell) (6 L, 10 mM, 60 nmol).
      4. Tillsätt RNA vattenlösning (1 μL, 200 μM, 200 pmol).
      5. Tillsätt polynukleotidkinas (PNK-enzym, se materialtabell) lösning (4,5 l, 45 enheter). Blanda försiktigt genom att pipettera blandningen upp och ner (10x).
    2. Inkubera reaktionsblandningen vid 37 °C i 45 minuter genom att placera den i ett vattenbad.
    3. Inaktivera enzymet genom att placera reaktionsröret i ett förvärmt värmeblock (65 °C) och inkubera lösningen i 10 minuter.
    4. Låt lösningen svalna till rumstemperatur (RNA-fosforylering karakteriserades via MALDI-TOF-analys, se Representativa resultat) för att ge en slutlig 5'-fosforylerad RNA-lösning (4 μM, 50 μL).
  2. Utför RNA-hydrolys med Xrn-1 enligt stegen nedan.
    1. Använd lösningen (50 μL) från steg 2.1.4 och utför följande steg.
      1. Tillsätt lösning B (5 L, tabell 1).
      2. Tillsätt en lösning av Xrn-1 (0,5 L, 1 ng, 30 fmol). Blanda lösningen genom att försiktigt pipettera upp och ner (10x).
      3. Inkubera reaktionsröret vid rumstemperatur i 2 timmar.
    2. Överför reaktionsblandningen (steg 2.2.1.3) till en 10 kDa porstor centrifugalanordning (se materialtabell) och filtrera enzymerna genom centrifugering (700 x g i 10 min vid rumstemperatur).
    3. Överför filtratet till ett centrifugrör på 0,6 ml.
    4. Tvätta resterande RNA på centrifugalröret (steg 2.2.2.) genom att tillsätta RNasfriH2O(20 L), följt av centrifugering (700 x g i 10 min vid rumstemperatur).
    5. Kombinera filtratet med det som erhålls från steg 2.2.3.
    6. Förvara röret som innehåller den resulterande lösningen i en frys (0 °C) eller skickas för analys.

3. Avsaltning av RNA-lösning, MALDI-TOF-plattspottning

  1. Avsalta och koncentrera provet med hjälp av kommersiellt tillgängliga katjonbyte C18-pipettspetsar (se Materialtabell).
    1. Placera en 10 L C18 pipettspets (pipettspets laddad med en bädd av C18-kromatografimedium fixerad i slutet) på en 10 μL pipett och fortsätt sedan med följande:
      1. Tvätta C18-spetsen med 50 % vattenhaltig acetonitrillösning (10 μL) två gånger. Kassera de använda volymerna i ett separat avfallsrör varje gång.
      2. Balansera C18-spetsen med en vattenhaltig trifluorättiksyralösning (0,1% TFA, 10 μL) två gånger. Kassera de använda volymerna i ett separat avfallsrör varje gång.
      3. Ta bort C18-spetsen manuellt från pipetten och fäst den på en 200 μL pipett som innehåller en P200-pipettspets (C18-spetsen kommer nu att fästas på P200-pipettspetsen).
      4. Sänk ner C18-spetsen i lösningen (steg 2.2.6) och aspirera lösningen genom C18-spetsen tio gånger.
        OBS: RNA-provet blir bundet till katjonutbyteshartset inuti spetsen.
      5. Lossa C18-spetsen från P200-pipetten och placera den på en 10 μL pipett.
      6. Tvätta C18-spetsen med en vattenlösning av 0,1% TFA (10 μL) två gånger. Kassera de använda volymerna i ett separat avfallsrör varje gång.
      7. Tvätta C18-spetsen med RNasfritt vatten (10 μL) två gånger. Kassera de använda volymerna i ett separat avfallsrör varje gång.
  2. Sätt på MALDI-plattan genom att följa stegen nedan.
    1. Eluera RNA-oligonukleotiden från C18-spetsen (steg 3.1.1.7) genom att nedsänka provet i önskad matris (10 μL, 1:1 lösning av C och D, tabell 1), följt av att avge lösningen tillbaka i röret. Upprepa denna process tio gånger.
    2. Pipettera lösningen från 3.2.1 på två separata fläckar på plattan (1 μL vardera, 20 pmol). Låt fläckar lufttorka (figur 1A och video 1).
      OBS: Denna process kan upprepas på samma plats för att öka provkoncentrationen på varje plats.
    3. Pipett önskad kaliber (1 L) på två separata fläckar fysiskt nära provplatsen och låt lufttorka.
      OBS: Teststandarden som användes i denna studie erhölls från kommersiella källor (se Materialtabell).
    4. Lägg över den [helt torkade] bromsoken med önskad matris (1 liter). Låt lufttorka.
      OBS: Det är viktigt att spåra positionen där proverna och bromsokarna upptäcks innan de sätts in i instrumentet. Anteckna detta med hjälp av plattans koordinatsystem, t.ex. är prov 1 placerat på plats (C,3)

4. Datainsamling och databehandling

OBS: I allmänhet kräver THAP högre lasereffekt för att uppnå jonisering. Dessutom kan oligos vara svåra att jonisera utan fragmentering. Således är det vanligtvis nödvändigt att använda så låg lasereffekt som möjligt och höja detektorvinsterna och / eller sänka laserfrekvensen för att maximera detekteringen och minimera fragmenteringen.

  1. Utför datainsamling enligt stegen nedan.
    OBS: Molekylviktsmätningar utfördes med hjälp av en masspektrometer (se Materialtabell) i positiv jon, linjärt läge med en jonkällspänning på 20 kV, detektorförstärkning på ~2,8 kV och en laserfrekvens på 20 Hz. Skanningsområdena fastställdes baserat på förväntad molekylvikt(er). Dessa beräknades och uttrycktes som massa över laddning (m/z), där laddningen var 1. Extern kalibrering utfördes med användning av en proteinkalibreringsblandning (Bacterial Test Standard, se Materialtabell) på en plats i anslutning till provet. Rådata bearbetades sedan i programvaran flexAnalysis (se Tabell över material).
    1. Öppna "Flexcontrol-programvara" för drift. Tryck på instrumentets gröna in/ut-knapp , vänta tills målsteget rör sig och dammsug för att ventilera. Öppna locket, placera den helt torkade målplattan i instrumentet. Se till att justera i rätt riktning (figur 1B).
    2. Sänk försiktigt ner locket och tryck sedan på den gröna in/ut-knappen . Vänta tills plattan dras in och instrumentet pumpas ner igen. När statusfältet (nedre högra hörnet av programvarufönstret) återspeglar "Klar", fortsätt med kalibreringen.
    3. För att kalibrera instrumenten med hjälp av programvaran, utför följande.
      1. Välj önskad metod genom att klicka på Arkiv > Välj metod eller trycka på Välj-knappen intill den laddade metoden. Klicka på koordinaten för calibrant-platsen. Navigera till fliken Kalibrering och bekräfta att rätt calibrant är valt. Se till att Random Walk är inaktiverat (på fliken Sample Carrier ).
      2. Tryck på Start och rikta lasern manuellt längs en kristall (klicka på muspilen på önskad plats i kameravyn). Justera lasereffekten, om det behövs. När du är nöjd med inställningarna trycker du på Start för att samla in spektra och lägga till dem i summabufferten.
      3. Lägg till spektra till summan tills tillräcklig intensitet uppnås. Växla för att bara visa summabufferten, subtrahera baslinjen och jämna ut. Klicka sedan på Automatisk tilldelning. Kontrollera varje tilldelad topp och notera ppm-felet. Om du är nöjd med uppdrag och fel klickar du på Apply.
      4. Rensa summabufferten och navigera till positionen för det första provet.
      5. Bekräfta önskat skanningsområde (fliken "Detektering"). Justera staplarna i "Mass Range" så att det gröna området är representativt för förväntad massa(er).
      6. Klicka direkt på förstoringsfönstret så att hårkorset är orienterat vid önskat kristalliserat fragment (större kristaller ger ofta bäst resultat, figur 2).
      7. Samla några spektra längs de stora kristallerna, justera laserkraften efter behov. Den korrekta inställningen är 5% -10% över den effekt vid vilken toppar uppträder.
    4. För att erhålla spektra, utför följande.
      1. Klicka på Start för att observera laserblixten i kombination med ökande spektralintensitet (visas i fönstret uppe till höger). Flytta lasern längs kristallens längd genom att klicka på muspilen upp och ner i kristallen (Video 2).
      2. Klicka på Lägg till direkt under Start.
      3. Upprepa detta flera gånger tills önskad intensitet/antal bilder har uppnåtts (reflekteras på spektralfönstrets y-axel)
      4. Justera lasereffekten och/eller hastigheten och/eller detektorns vinster om de första skanningarna är otillfredsställande. Upprepa steg 4.1.4.1–4.1.4.3 efter behov.
      5. Om du är nöjd med spektrumet klickar du på Spara som för att spara spektrumet under ett angivet namn. Sedan, om andra prover behövs, klicka på Rensa summa och upprepa stegen under steg 4.1.4.
  2. Utför databehandling.
    OBS: Steg 4.2 beskriver ett sätt att analysera data med hjälp av flexAnalysis-programvaran.
    1. Öppna önskad programvara. Öppna sedan spektrum (a) genom att välja Arkiv. Välj Öppna på rullgardinsmenyn.
    2. Ett nytt fönster visas. Klicka på Bläddra för att hitta filerna som sparats från steg 4.1.4. Markera rutorna för önskade filer och klicka sedan på Öppna till vänster. Om bara ett enda spektrum kräver analys, dra helt enkelt och släpp filen i programvarufönstret.
    3. Markera de inlästa filarna för massanalys. Navigera till fliken Process i verktygsfältet. I listrutan väljer du Subtrahera massspektrumbaslinje.
      OBS: Algoritmen som används för subtraktionen bestäms av den metod som valts i steg 4.1.3.
    4. Navigera till fliken Process i verktygsfältet. I listrutan väljer du Smooth Mass Spectrum.
      OBS: Algoritmen som används för utjämningen bestäms av den metod som valts i steg 4.1.3.
    5. Klicka på fliken Masslista ; i listrutan väljer du Sök. Detta kommando etiketterar automatiskt toppar med sina massor; en lista över massorna visas på skärmen till höger.
    6. Om du vill lägga till eller ta bort toppar fortsätter du till fliken Masslista . Klicka på Redigera i rullgardinsmenyn.
    7. Håll muspekaren över spektrumets x-axel; en vertikal linje representerar platsen för spektrumet där markören är på.
      OBS: En ikon med ett diagram och en markör visas när en ny massa kan läggas till genom att klicka. Den här ikonen visas när du håller muspekaren över toppar som kan tas bort genom att klicka (se steg 4.2.7 i tilläggsfil 1).
    8. Upprepa steg 4.1.3–4.1.7 för ytterligare spektra. Exportera masslistan för alla spektra genom att klicka och dra för att markera filerna till vänster och kör följande menykaskad Fil > Exportera > Mass list till Excel.
    9. Om du vill exportera spektra som visas på skärmen tar du antingen en skärmdump eller exporterar den som en rapport. För det senare navigerar du till menyn Rapport . I listrutan väljer du Spara som PDF.
      OBS: Man kan ändra hur spektra visas med hjälp av de tre flikarna under spektra och / eller variera de markerade filerna. En skärm dyker upp. Namnge PDF-dokumentet efter önskemål, justera inställningarna / layouten och klicka på Spara för att generera en bild av spektrumet.
    10. Den genererade bilden kommer att återspegla spektralvyn i programmet. Utför följande för att manipulera vyn.
      1. Zooma in: Klicka på knappen Zooma in i verktygsfältet.
      2. Håll muspekaren över x-axeln och klicka tills önskat intervall uppnås.
      3. Zooma ut / ångra: Klicka på knappen Zooma ut och klicka var som helst i spektrumet för att återgå till full vy.
        OBS: Ett illustrativt stöd för steg 4.1 och 4.2 finns i tilläggsakt 1 (s. S8-S23 respektive S24-S30).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oligonukleotiderna som användes i detta arbete syntetiserades, karakteriserades och kvantifierades före användning. Koncentrationen av alla oligonukleotider bestämdes via UV-vis-spektroskopi som registrerades vid 90 °C för att undvika felaktiga avläsningar till följd av den potentiella bildningen av sekundärstrukturerna. Figur 3 visar spektra av modellen oligonukleotider av RNA som används i detta arbete, tagna vid rumstemperatur och efter applicering av värme.

Det övergripande förfarandet, tillsammans med strukturen hos den oxidativa lesionen som orsakar Xrn-1-stallning, illustreras i figur 4. Oligonukleotid (1) innehåller en 8-oxoG vid position-11 och är där Xrn-1-aktiviteten blockeras, vilket resulterar i stoppad hydrolys av RNA-strängen. Viktigt är att resultaten som avbildas i denna figur motsvarar experiment utförda med hjälp av lösningar innehållande 200 pmol av modersträngen (1), även om endast 20 pmol upptäcktes på plattan. Det är viktigt att notera att den genomsnittliga massan användes i alla beräkningar och att skillnader som varierar mellan 1-3 atommassenheter (amu) observerades. Figuren visar två processer, (1) den effektiva 5'-fosforyleringen av RNA, vilket framgår av utseendet av endast en topp (1') som motsvarar den förväntade produkten, och (2) det stallande fragmentet som härrör från behandlingen av provblandningen med Xrn-1. Kontrollexperiment där modersträngen behandlades under samma förhållanden, i frånvaro av kinas (PNK), och ribonukleasen (Xrn-1) visade inte skillnader från de som visas i figur 4 (RNA-sträng 1).

Samma resultat erhölls med användning av en annan sekvens (3) som innehöll två oxidativa lesioner (figur 5). Motsvarande fosforylering och enzymatisk nedbrytning gav två huvudprodukter som föreslog att enzymet successivt stannar på båda platserna innehållande 8-oxoG. Som avbildats i massspektra som motsvarar fragmenten av intresse observerades en avvikelse vid MALDI-TOF-förvärv när man tog spektra av samma oligonukleotid på olika dagar. Detta illustreras i figur 4, där ytterligare två atomenheter observerades. Resultaten som visas i denna figur motsvarar experiment utförda med 100 pmol av modersträngen (3). Det är viktigt att notera att kvantitativa data kan erhållas för att bedöma den biokemiska processens totala effektivitet (och fullständig spårning via MALDI-TOF) genom att införa en intern standard för prover före och efter enzymatisk nedbrytning.

Figure 1
Figur 1: Spotting av RNA-lösning. (A) Spotting på MALDI-plattan. B) Illustration av MALDI-plattans placering på MALDI-spektrometern. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Kamerabilden som illustrerar bildandet av provet: matriskristaller som ses på plattan. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: UV-visspektra av oligonukleotider (1) och (3) registrerade vid 25 °C respektive 90 °C. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Experimentell process för oligonukleotidberedning och masspektra för varje steg. (A) Övergripande steg med användning av oligonukleotid (1) illustreras. Händelseförloppet motsvarar (B) 5'-fosforylering i närvaro av polynukleotidkinas (PNK), följt av (C) enzymatisk hydrolys i närvaro av Xrn-1. MALDI-TOF-spektra erhållna före och efter båda biokemiska processerna visas. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: MALDI-TOF-spektra, med användning av oligonukleotid (3), erhållen före (vänster)/efter (höger) behandling med Xrn-1. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Lösning Sammansättning
A Tris-HCl (700 mM), DTT (50 mM), pH 7,6, T4 polynukleotidkinasbuffert
B NaCl (1 M), Tris-HCl (0,5 M),MgCl2 (0,1 M), DTT (10 mM), pH 7,9
C 2,4,6-Tihydroxiacetofenonmonohydrat (THAP, 25 mM), ammoniumcitrat (10 mM)
D Ammoniumfluorid (300 mM i 50 % aq. acetonitril)
RNasfriH2O Ultrarent vatten behandlades med dietylpyrokarbonat (DEPC, 1 ml per liter vatten), inkuberades vid 37 ° C (12 timmar) och autoklaverades (1 timme)

Tabell 1: Lösningskompositioner som används i studien.

Video 1: Demonstration för att upptäcka på MALDI-plattan. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video 2: Demonstration som beskriver dataanalyserna. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande fil 1: Steg-för-steg-illustration för hantering av UV-vis-programvara (steg 1.2), DATAINSAMLING FRÅN MS (steg 4.1) och MS-databehandling (steg 4.2). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den största utmaningen i detta arbetsflöde uppstod mellan att slutföra experimenten och utföra de masspektrometriska analyserna. Experiment utfördes och slutfördes vid University of Colorado Denver och skickades (över natten) till Colorado State University-anläggningarna. Datainsamling utfördes vid mottagandet, enligt bekvämlighet. Flera oväntade omständigheter ledde till tidsfördröjningar i processen. I ett fall krävde oväntade instrumentfel att proverna frystes (en gång i 21 dagar) innan de upptäcktes och förvärvades. Denna tidsfördröjning tycktes emellertid inte påverka det experimentella resultatet, även om nedbrytning av RNA (vilket leder till minskade signalintensiteter) inte kan uteslutas.

Begränsningen av de beskrivna experimenten, i termer av RNA-koncentration, var att experimenten utfördes med [RNA] högre än vad som kan erhållas in vivo, för en enda RNA-sekvens23,24. Vi fann att när experiment utfördes med 20 pmol RNA (2 pmol fläckig på plattan), eller lägre mängder, observerades inte de förväntade topparna. Användningen av spektrometrar med förbättrad lasereffekt kan sannolikt leda till förbättrad signal och lägre detektionsgränser.

Det förväntas att steget där enzymerna filtreras (med hjälp av en 10 kDa filtreringsanordning) för att separera enzymerna kan undvikas. Experiment som utfördes utan detta steg ledde till liknande resultat. Filtreringssteget rekommenderas dock om prover ska skickas eller lagras ett tag.

De tillhandahållna stegen kan vara mottagliga för att karakterisera och förstå flera biokemiska processer. Exempel kan innefatta karakterisering av processer som involverar skadat DNA25, peptider26,27 eller RNA-konjugat28, bland många andra. I allmänhet spekulerar vi i att processen som illustreras här kan vara tillämplig på olika experimentella inställningar som involverar nukleinsyror, proteiner, biomaterial och / eller andra biopolymerer. Dessutom kommer utvecklingen av förbättrade spektrometrar att leda till förbättrade resultat och viktiga upptäckter inom områden som involverar de ovan nämnda biomolekylerna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Det är viktigt att notera att detta arbete var ett samarbete mellan tre institutioner, två forskargrupper och en kärnanläggning. Distributionen och arbetsbelastningen utfördes enligt följande: Proteinuttryck (Xrn-1) utfördes vid University of Denver (Denver, CO). Oligonukleotidsyntes, kvantifiering och experiment (främst enzymatisk nedbrytning) genomfördes vid University of Colorado Denver (Denver, CO). Optimering utfördes också där. MALDI-TOF spotting, förvärv och analys utfördes vid Analytical Resources Core Facility vid Colorado State University. (Fort Collins, CO). SS vill uppmärksamma ett UROP Award (CU Denver) och Eureca-bidrag (CU Denver) för stöd. E. G.C. erkänner stöd från NIGMS, via R00GM115757. MJER bekräftar stöd från NIGMS, via 1R15GM132816. K.B. bekräftar resurs-ID: SCR_021758. Arbetet stöddes också av ett Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, från Henry Dreyfus Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6 mL MCT Graduated Violet Fisher Scientific 05-408-127
6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% Sigma Aldrich 480-66-0
Acetonitrile 99.9%, HPLC grade Fisher Scientific 75-05-8
Adenosine triphosphate, 10 mM New Englang Bioscience P0756S
Ammonium citrate, dibasic 98% Sigma Aldrich 3012-65-5
Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade Alfa Aesar 12125-01-8
Bruker bacterial test standard Bruker Daltonics 8255343
Commercial source of Xrn-1 New England BioLabs M0338S
Diethyl pyrocarbonate, 97% ACROS Organics A0368487
Flex analysis software Bruker daltonics FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics
Lambda 365 UV-vis spectrophotometer Perkin Elmer
MALDI plate: MSP 96 ground steel target Bruker Daltonics 280799
Mass Spectrometer Bruker Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA)
Mili-Q IQ 7000 Milipore Sigma A Mili-Q system was used to purify all water used in this work
Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) Pall Corporation OD010C33 filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size
NEBuffer 3 New England Biolabs B7003S This is solution B
Oligo Analyzer tool IDT-DNA https://www.idtdna.com/calc/analyzer
Pipette tips P10 Fisher Scientific 02-707-441
Pipette tips P200 Fisher Scientific 02-707-419
RNase Away Molecular BioProducts 7005-11
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer New England BioLabs B0201S This is solution A
Triflouroacetic Acid Alfa Aesar 76-05-1
Xrn-1 exoribonuclease Expressed in house See ref. 20
ZipTip Pipette Tips for Sample preparation Millipore ZTC 18S 096 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  2. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  3. Zenobi, R. Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry. Chimia. 57, 73 (2003).
  4. Aristri, M. A., et al. Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application. Forests. 12 (11), 1516 (2021).
  5. Pedrazzani, C., et al. 5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).
  6. Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).
  7. Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).
  8. Kaufmann, R. Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology. Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).
  9. Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer. ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).
  10. Chapman, E. G., DeRose, V. J. Enzymatic processing of platinated RNAs. Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).
  11. Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical. Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).
  12. Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry. Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).
  13. Ghodke, P. P., Guengerich, P. DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides. Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).
  14. JoVE. JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2021).
  15. Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).
  16. Su, K. -Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).
  17. Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).
  18. Phillips, C. N., et al. Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).
  19. Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).
  20. Langeberg, C. J., et al. Biochemical characterization of yeast Xrn1. Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).
  21. Stevens, A. Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis. Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).
  22. Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control. Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).
  23. Fasnacht, M., et al. Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress. Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).
  24. Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).
  25. Tomar, R., et al. DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct. Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).
  26. Gaffney, A., et al. HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates. ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).
  27. Sikorski, E. L., et al. Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells. ChemBioChem. , 202100521 (2022).
  28. Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency. ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).

Tags

Biokemi utgåva 182 MALDI-TOF RNA-karakterisering nukleinsyramasspektrometri 8-oxoG i RNA ribonukleasreaktivitet enzymatisk nedbrytning
Identifiering av RNA-fragment till följd av enzymatisk nedbrytning med maldi-TOF masspektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schowe, S. W., Langeberg, C. J.,… More

Schowe, S. W., Langeberg, C. J., Chapman, E. G., Brown, K., Resendiz, M. J. E. Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (182), e63720, doi:10.3791/63720 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter