Summary
L'incisivo del topo contiene preziose cellule che conservano l'etichetta nella sua nicchia di cellule staminali. Abbiamo un nuovo modo per rilevare e quantificare in modo imparziale le celle che conservano l'etichetta; il nostro studio ha utilizzato l'etichettatura EdU e un approccio di ricostruzione 3D dopo la pulizia del tessuto PEGASOS della mandibola.
Abstract
L'incisivo murino è un organo che cresce continuamente per tutta la durata della vita del topo. Le cellule staminali epiteliali e mesenchimali che risiedono nei tessuti prossimali degli incisivi danno origine a progenie che si differenziano in ameloblasti, odontoblasti e fibroblasti della polpa. Queste cellule sono cruciali nel sostenere il turnover sostenuto dei tessuti incisivi, rendendo l'incisivo murino un modello eccellente per studiare l'omeostasi delle cellule staminali adulte. Si ritiene che le cellule staminali contengano cellule quiescenti di lunga durata che possono essere etichettate con analoghi nucleotidici come la 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU). Le cellule mantengono questa etichetta nel tempo e sono di conseguenza chiamate cellule di conservazione dell'etichetta (LRC). Gli approcci per la visualizzazione di LRC in vivo forniscono uno strumento robusto per il monitoraggio dell'omeostasi delle cellule staminali. In questo studio, abbiamo descritto un metodo per visualizzare e analizzare gli LRC. Il nostro approccio innovativo prevede LRC negli incisivi di topo dopo la pulizia dei tessuti e la colorazione EdU a montaggio completo, seguita da microscopia confocale e ricostruzione tridimensionale (3D) con il software di imaging. Questo metodo consente l'acquisizione di immagini 3D e la quantificazione non distorta rispetto all'analisi LRC tradizionale su vetrini sezionati.
Introduction
L'incisivo di topo in continua crescita è un modello eccellente per lo studio delle cellule staminali adulte1. Le cellule staminali epiteliali (ansa cervicale labiale e linguale) e mesenchimali (tra l'ansa cervicale labiale e linguale) che risiedono sul lato prossimale dell'incisivo si differenziano in ameloblasti, odontoblasti e cellule polpa dentali. Questo processo unico fornisce una fonte di cellule per la compensazione della perdita di tessuto e del turnover2. Anche se diversi marcatori di cellule staminali come Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1, ecc. sono stati identificati in vivo per i sottogruppi di cellule staminali adulte negli incisivi di topo, sono inadeguati nel rappresentare le popolazioni di cellule staminali quando usati da soli 1,3,4,5. La visualizzazione di cellule quiescenti a lunga vita mediante marcatura e ritenzione del DNA analogico nucleotidico potrebbe fornire un rilevamento imparziale per la maggior parte dei sottogruppi di cellule staminali adulte6. Inoltre, questo approccio è utile tra molti metodi di identificazione delle cellule staminali7 per comprendere il comportamento cellulare e l'omeostasi delle popolazioni di cellule staminali dentali 3,8. Mentre le cellule staminali in divisione perderebbero la loro etichettatura del DNA dopo un considerevole inseguimento, le presunte cellule staminali quiescenti mantengono la loro etichetta di DNA, ritenendole cellule che mantengono l'etichetta (LRC)6. L'etichettatura e la conservazione del DNA da parte di cellule staminali non in divisione segneranno e localizzeranno le cellule staminali adulte putative nelle loro nicchie.
Negli ultimi anni, l'analogo della timidina 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU) ha sostituito l'ingombrante, dispendioso in termini di tempo e ad alta risoluzione incompatibile metodo di marcatura del DNA 3H-timidina per i saggi di proliferazione cellulare 6,9. Negli ultimi anni, la tecnica di etichettatura della 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) è stata sempre più utilizzata su BrdU. Questo modello è emerso a causa di diversi motivi. In primo luogo, il metodo BrdU è lento e laborioso. Le condizioni dell'utente sono variabili e non è in grado di preservare l'ultrastruttura nei campioni (a causa della denaturazione del DNA). Allo stesso modo, il metodo BrdU perde l'antigenicità delle cellule, rendendolo così inefficiente per analisi funzionali a valle e saggi come gli esperimenti di co-localizzazione e il trapianto di cellule staminali in vivo 3,7,9,10,11,12. BrdU è anche un teratogeno, che non è adatto per etichettare LRC nello sviluppo embrionale6. Inoltre, il metodo BrdU è inefficiente se utilizzato nei campioni a montaggio intero. Gli svantaggi sono la bassa penetrazione degli anticorpi nella parte profonda dei campioni o la necessità di un lungo periodo di incubazione degli anticorpi per la penetrazione profonda13. L'etichettatura EdU sfugge alle fasi di denaturazione dei campioni, preservando così l'ultrastruttura. Questa caratteristica è vantaggiosa per le analisi funzionali a valle come esperimenti di co-localizzazione e trapianto di cellule staminali11,12. Inoltre, l'etichettatura EdU è altamente sensibile e rapida; La penetrazione dei campioni è elevata grazie all'uso di azidi fluorescenti ad assorbimento rapido e di dimensioni più piccole per rilevare etichette EdU attraverso una reazione di cicloaddizione catalizzata da Cu(I) [3 + 2] (chimica a "clic")14.
Un altro metodo di marcatura del DNA sempre più applicato è l'uso di topi transgenici ingegnerizzati. Questi topi esprimono la proteina fluorescente verde dell'istone 2B (H2B-GFP) controllata da un elemento regolatore sensibile alla tetraciclina 5,14. Dopo aver alimentato i topi con tetraciclina chow/acqua per un periodo di inseguimento da 4 settimane a 4 mesi, la fluorescenza GFP diminuirà nelle cellule cicliche e solo gli LRC manterranno la fluorescenza6. Il vantaggio di questo metodo è che le LRC marcate possono essere isolate e rimanere vitali per la coltura cellulare o le analisi funzionali a valle 6,7. Alcuni studi hanno riportato un'etichettatura imprecisa delle cellule staminali quiescenti quando inseguite per un uso a lungo termine. Questo risultato era dovuto a un'espressione di fondo permeabile dal ceppo H2B-GFP e non alla risposta appropriata regolata dalla tetraciclina15.
Inoltre, la maggior parte della letteratura in passato utilizzava il rilevamento degli LRC principalmente su vetrini sezionati, che sono bidimensionali e spesso erroneamente distorti nel mostrare la posizione accurata e il numero di LRC. L'approccio ha mostrato angoli errati per sezioni di strutture tissutali complesse16. L'altro metodo era quello di ottenere immagini 3D da sezioni seriali ed eseguire ricostruzioni post-immagine. Questi passaggi erano imprecisi a causa della distorsione dell'immagine dovuta alle variazioni in ogni sezione seriale a causa di sezioni compresse o allungate, con conseguente perdita di informazioni16,17,18. Il metodo era anche laborioso e richiedeva molto tempo.
Per facilitare l'imaging completo degli LRC, i campioni devono essere chiari mentre la fluorescenza deve essere ben mantenuta. Le attuali tecniche di pulizia dei tessuti possono essere classificate in tre categorie principali: tecniche di pulizia dei tessuti a base di solventi organici, tecniche di pulizia dei tessuti a base di reagenti acquosi e tecniche di pulizia dei tessuti a base di idrogel17,19. Il sistema solvente associato al glicole polietilenico (PEG) (PEGASOS) è stato recentemente sviluppato. Questo approccio rende trasparenti quasi tutti i tipi di tessuti e preserva la fluorescenza endogena, compresi i tessuti duri come ossa e denti20. Il metodo PEGASOS presenta vantaggi rispetto ad altri metodi di pulizia dei tessuti, specialmente nella pulizia dei materiali dentali e ossei. La maggior parte degli altri metodi potrebbe eliminare solo parzialmente i tessuti duri, avere lunghi tempi di lavorazione o richiedere costosi reagenti21. Inoltre, il metodo PEGASOS può preservare efficacemente la fluorescenza endogena rispetto ad altri metodi.
Questa letteratura ci ha portato a creare un nuovo metodo per lo studio cellulare. Abbiamo combinato i vantaggi di rilevamento LRC dell'etichettatura EdU con l'imaging 3D a montaggio intero più superiore di campioni eliminati dai tessuti; i campioni sono stati elaborati con la tecnica di pulizia dei tessuti PEGASOS (Advanced Polyethylene Glycol (PEG)-associated solvent system (PEGASOS)15. La trasparenza dei tessuti duri ci ha permesso di ricostruire il segnale 3D della fluorescenza delle LRC in vivo senza rompere i denti o la mandibola, creando un modo più accurato per visualizzare e quantificare gli LRC.
In questo studio, forniamo una guida innovativa per visualizzare gli LRC nell'incisivo del topo. Abbiamo realizzato un approccio visivo 3D per determinare la posizione e la quantità di LRC all'interno della nicchia delle cellule staminali incisive del topo. Questo progetto ha utilizzato l'etichettatura EdU, le tecniche di eliminazione dei tessuti PEGASOS e la microscopia confocale. Il nostro metodo di marcatura EdU degli LRC su tessuto a montaggio intero e l'uso di un campione chiaro e trasparente supera sia i limiti dei tradizionali vetrini sezionati che altri metodi di etichettatura del DNA svantaggiosi. Pertanto, la nostra tecnica sarà adatta per studi sull'omeostasi delle cellule staminali che richiedono il rilevamento di LRC, in particolare sui tessuti duri. Il protocollo può essere ugualmente vantaggioso per coloro che si concentrano sull'omeostasi delle cellule staminali in altri tessuti e organi.
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) per il Texas A & M University College of Dentistry.
1. Preparazione del cocktail di etichettatura EdU
- Preparare le soluzioni di cocktail come descritto nella tabella 1.
- Preparare il cocktail di etichettatura EdU come descritto nella Tabella 1.
2. Preparazione dei topi e della soluzione EdU
- Preparare la soluzione EdU. Sciogliere EdU in DMSO a 20 mg/ml e conservare in un congelatore a -20 °C.
ATTENZIONE: EdU è un mutageno. Gli utilizzatori devono indossare adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) quando maneggiano questa sostanza. - Iniettare topi C57BL/6J di 5 giorni con la soluzione EdU preparata per via intraperitoneale a 3 μL/g di peso corporeo. I topi devono ricevere la soluzione una volta al giorno per 7 giorni consecutivi. Successivamente, subiscono un periodo di inseguimento per 6 settimane prima di essere raccolti per l'analisi (Figura 1).
ATTENZIONE: Fare attenzione ad evitare la puntura dell'ago quando si inietta EdU nei topi. Dopo aver iniettato EdU per 7 giorni consecutivi, posizionare i topi in una nuova gabbia. Dopo che i topi sono nella loro nuova casa, smaltire la lettiera nella vecchia gabbia utilizzando le regole di rischio biologico appropriate.
3. Preparazione del campione mediante perfusione transcardiaca (topi postnatali di 53 giorni dopo il periodo di inseguimento di 6 settimane)
NOTA: Il fegato del topo dovrebbe impallidire dopo il successo della perfusione transcardiaca.
- Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale. Devono essere somministrati una combinazione di anestetici xilazina e ketamina (Xilazina 10-12,5 mg/kg; Ketamina, 80-100 mg/kg di peso corporeo).
- Attendere ~ 10 minuti fino a quando il mouse non risponde più agli stimoli dolorosi (come i riflessi di pizzicamento della zampa).
- Posizionare i topi in posizione supina stabilizzati su supporto di polistirolo con aghi in ogni zampa.
- Esporre la cavità toracica aprendo la pelle sovrastante usando pinzette e forbici da dissezione.
- Tagliare il diaframma usando forbici affilate. Fai attenzione a non trafiggere il cuore.
- Tagliare la gabbia toracica, afferrando la base dello sterno con le forbici a morsetto per esporre il cuore.
- Trasferire il mouse allo stadio di perfusione vicino alla pompa di circolazione in una cappa aspirante.
- Inserire l'ago da 25 G (dal tubo riempito con soluzione salina tamponata fosfato (PBS)/paraformaldeide al 4% (PFA)) all'apice del ventricolo sinistro. Fare attenzione a mantenere la punta dell'ago nel lume del ventricolo.
ATTENZIONE: Il PFA è moderatamente tossico e un probabile cancerogeno. Utilizzare i DPI per maneggiare il PFA e preparare la soluzione sotto una cappa aspirante chimica. Il PFA dei rifiuti richiede un corretto smaltimento secondo le linee guida dell'istituzione. - Tagliare il ventricolo destro usando una forbice affilata subito dopo aver inserito l'ago nel ventricolo sinistro. Questo passaggio consente al sangue di fuoriuscire dal mouse e drenare nel piatto di raccolta.
- Perfondere i campioni con 50 mL di soluzione PBS ad una portata di 7 mL/min.
- Dopo la perfusione PBS, commutare il rubinetto di arresto per consentire un flusso di 20 ml di soluzione PFA al 4% alla stessa portata di 5 ml/min.
- Mentre la pompa di circolazione è ancora accesa, rimuovere l'ago dal ventricolo sinistro.
NOTA: il mouse è ora fisso per la raccolta dei tessuti. Per preservare la fluorescenza, l'esposizione alla luce dovrebbe essere evitata quando possibile durante l'intero protocollo. Durante la lavorazione del tessuto, il tubo conico da 50 ml con i campioni di tessuto può essere coperto con un foglio di alluminio.
4. Pulizia tissutale della mandibola con la tecnica PEGASOS
NOTA: Un tubo conico da 15 ml o 50 ml in base al volume dei tessuti può essere utilizzato per mantenere i campioni pronti per il trattamento in ogni fase. I campioni vengono elaborati a scuotitori a 37 °C (~100 giri/min) dalle fasi 4.2 a 4.7. Utilizzare contenitori in plastica a base di polipropilene resistenti ai solventi organici per evitare di sciogliere la plastica. In alternativa, è possibile utilizzare vetreria.
ATTENZIONE: La tecnica di pulizia dei tessuti PEGASOS utilizza soluzioni tossiche come Quadrol, polietilenglicole (PEG), benzil benzoato (BB), MMA500, ecc. Sono necessari DPI appropriati per evitare potenziali esposizioni.
- Sezionare le mandibole e fissare ulteriormente i campioni in PFA al 4%. Tenerli a temperatura ambiente durante la notte.
- Rimuovere i muscoli dalle mandibole e immergerli in una soluzione di EDTA 0,5 M (pH 8,0) per decalcificare per 4 giorni. Durante questo periodo, eseguire un cambio giornaliero del mezzo su uno shaker a 37 °C.
NOTA: È auspicabile rimuovere i muscoli dal campione il più possibile. Questa precauzione semplificherà il processo di imaging e ridurrà l'autofluorescenza dai muscoli. - Decolorare le mandibole con una soluzione Quadrol al 25% (v/v in H2O) su uno shaker a 37 °C per un giorno per rimuovere l'eme sanguigno rimanente.
- Colorazione completa dell'intero supporto EdU.
- Preparare un cocktail fresco di etichettatura EdU secondo la Tabella 1.
NOTA: Il cocktail di etichettatura EdU deve essere preparato fresco ogni volta con l'aggiunta di una soluzione di ascorbato preparata al momento per ottenere risultati ottimali di etichettatura EdU. - Risciacquare le mandibole con PBST per 30 minuti su uno shaker a 37 °C.
- Risciacquare le mandibole con PBS tre volte per 3 minuti ogni volta.
- Incubare le mandibole in un cocktail di etichettatura EdU appena fatto su uno shaker a 37 °C durante la notte.
- Risciacquare le mandibole con PBS tre volte per 3 minuti ogni volta.
- Preparare un cocktail fresco di etichettatura EdU secondo la Tabella 1.
- Effettuare la dislipidazione seriale in ciascuna delle seguenti soluzioni per 6 ore a 37 °C:
Soluzione di tert-butanolo (tB) al 30%: 75% v / v H2O, 22% v / v tB e 3% v / v Quadrol.
Soluzione al 50% di tB: 50% v/v H2O, 47% v/v tB e 3% v/v Quadrol.
Soluzione al 70% tB: 30% v / v H2O, 67% v / v tB e 3% v / v Quadrol
NOTA: La fase di delipidazione è fondamentale. La dislipidazione può essere effettuata tra 4-6 ore in soluzione al 30% e al 50% di tB e per 1 giorno in soluzione al 70% di tB. - Disidratare le mandibole in soluzione di tB-PEG per 2 giorni con il seguente cambio giornaliero del mezzo: 75% tB, 22% v/v polietilenglicole metil-etere metacrilato medio MMA500 e 3% v/v Quadrol a 37 °C.
- Cancellare la mandibola nel mezzo di compensazione benzil benzoato (BB)-PEG per ottenere la corrispondenza dell'indice di rifrazione: 75% v/v BB, 22% v/v PEG-MMA500 e 3% Quadrol fino al raggiungimento della trasparenza.
NOTA: abbiamo informazioni sulla corrispondenza dell'indice di rifrazione. I componenti inorganici e organici nei tessuti come acqua, lipidi, proteine, minerali, organelli, ecc. hanno un diverso indice di rifrazione (RI) compreso tra 1,33 e 1,55. Questa mancata corrispondenza RI tra i componenti del tessuto ostacola il processo di imaging. La trasparenza può essere ottenuta eliminando la mancata corrispondenza del RI all'interno del tessuto. Si consiglia di immergere i campioni di tessuto nel mezzo di compensazione di BB-PEG. Questo passaggio darà il RI interno uniforme di ~ 1,54 (chiamato corrispondenza RI) all'intero campione, facilitando il processo di imaging. - Conservare le mandibole nel mezzo di pulizia del tessuto BB-PEG a temperatura ambiente per la conservazione e l'imaging.
NOTA: È bene completare l'imaging il prima possibile per evitare la graduale perdita di reporter fluorescenti. Tuttavia, il metodo PEGASOS manterrà i reporter di fluorescenza ben conservati anche dopo diverse settimane di conservazione20,21. Per la conservazione a lungo termine, i campioni possono anche essere conservati a 4°C.
5. Imaging confocale della mandibola eliminata dal tessuto
- Montare l'intera mandibola ripulita sul tessuto su vetrini di cavità di marca nel mezzo di compensazione BB-PEG e coprire con vetrini di copertura. Evitare eventuali bolle.
- Eseguire l'acquisizione di immagini con un microscopio confocale a scansione laser adatto. Selezionare Acquisisci e impostare i parametri di acquisizione delle immagini su una risoluzione di 512 x 512 pixel e una velocità di acquisizione di 400 Hz. Queste impostazioni si trovano nel menu della modalità di acquisizione del software che controlla il microscopio.
- Nel pannello per l'eccitazione fluorescente, attivare il laser richiesto (TRITC) per eccitare in modo ottimale i fluorofori (la sonda che abbiamo utilizzato per la visualizzazione LRC ha proprietà fluorescenti come Cy3 con eccitazione a 548 nm ed emissione a 563 nm di lunghezza d'onda del laser).
- Nel pannello per il rilevamento fluorescente, spostare il cursore per selezionare le lunghezze d'onda che verranno misurate (ad esempio, tra 555 e 625 nm per un fluoroforo simile a Cy3).
- Posizionare la mandibola montata sul palco del microscopio per visualizzare e trovare il campione utilizzando la luce bianca e un obiettivo di ingrandimento inferiore (2-10x).
- Aggiungere una goccia di olio ad immersione con un indice di rifrazione di 1,52 sopra il vetrino per abbinare l'indice di rifrazione del vetrino e dell'obiettivo.
NOTA: Abbinare il più possibile l'indice di rifrazione di obiettivi, supporti di imaging e tessuti per ridurre al minimo l'introduzione di distorsioni ottiche durante l'acquisizione dell'immagine. - Accendi le lampade fluorescenti e scegli un obiettivo di ingrandimento appropriato per le regioni di interesse. Abbiamo usato un obiettivo 20x con un'apertura numerica di 0,9 con una distanza di lavoro di 1,95 mm. Una lente a distanza di lavoro più lunga può essere necessaria quando si visualizzano campioni di tessuto più grandi nel microscopio confocale. In alternativa, l'imaging può essere eseguito facilmente utilizzando un microscopio a foglio di luce per campioni di tessuto più grandi.
- Sul software di imaging confocale, premere il pulsante Live per avviare la modalità di scansione dal vivo. Per massimizzare la gamma dinamica delle immagini ed evitare la saturazione dei pixel, regolate il guadagno e l'intensità del laser per il canale selezionato.
- Identifica il campo visivo per visualizzare l'intera regione della mandibola nelle dimensioni X e Y. Impostare i parametri di acquisizione dello stadio Z superiore e inferiore che coprono accuratamente il volume della nicchia delle cellule staminali nell'incisivo dei topi. Utilizzare una dimensione Z-step di 2 μm o secondo le proprie esigenze. Le versioni più recenti dei microscopi confocali dovrebbero essere in grado di acquisire automaticamente z-stack delle varie regioni sovrapposte.
- Acquisire e salvare file immagine Z-stack in formato .lif.
NOTA: Le mosche .lif possono essere convertite in file .tiff e utilizzate per altri software di analisi 3D.
6. Elaborazione delle immagini, ricostruzione delle immagini 3D e quantificazione delle celle di conservazione delle etichette mediante la creazione di una superficie, la segmentazione della regione di interesse (ROI), il mascheramento del ROI e la creazione di punti
NOTA: Abbiamo utilizzato Imaris (Bitplane 9.0.1) per l'elaborazione delle immagini e la ricostruzione 3D, ma passaggi di elaborazione delle immagini simili possono essere condotti utilizzando altre suite software (ad esempio, ImageJ / Fiji, affettatrice 3D, Avizo, Arivis, Amira, ecc.).
- Nel software di imaging, fai clic sul pulsante Arena , quindi scegli Immagine. Seleziona il file .lif originale e scegli il file unito, le immagini verranno importate nel software di imaging.
NOTA: in alternativa, utilizzare un convertitore di file software di imaging per convertire il file di immagine dello stack Z nel tipo di file in formato nativo per il software. Ad esempio: convertire i file .lif in file .ims utilizzando il convertitore di file Imaris e aprire i file .ims nel software di imaging. La conversione dei dati nel formato di file nativo del software consentirà una rapida conversione dei file e ridurrà al minimo gli errori. - Fare doppio clic sul file importato per aprire il set di dati dell'immagine.
- Visita il pannello Regolazione schermo , fai clic sul nome del canale. Di solito è etichettato come rosso in modalità predefinita.
- Nella finestra Proprietà immagine , fare clic sulla scheda Colore mappato . Nell'opzione File tabella colori , scegliere Flusso fuoco, quindi fare clic su OK. Il colore del display viene normalmente scelto per distinguere la fluorescenza di fondo e la fluorescenza positiva dal campione.
- Nella parte superiore sinistra dello schermo, nel riquadro Scena - Proprietà , fai clic sull'icona blu Aggiungi nuova superficie. Deselezionare l'icona Volume che rimuoverà la maggior parte della fluorescenza di fondo e la fluorescenza positiva è chiaramente visibile (vedere Passo 6.4.2).
- Avviare il processo di segmentazione manuale della regione di interesse (ROI) facendo clic sulla scheda Crea e selezionando la scheda Salta creazione automatica, Modifica manualmente . Nella procedura guidata di creazione manuale della superficie, fare clic sulla scheda Contorno per scegliere l'orientamento (XY, YZ o XZ) in base ai campioni per contornare facilmente il ROI. Qui, scegliamo l'orientamento XY.
- Quindi, assicurati che il menu del puntatore nell'angolo destro sia in modalità Seleziona . Regolare la posizione della fetta per individuare il ROI nel tessuto. Noterai che la maggior parte della fluorescenza di fondo è stata rimossa con fluorescenza positiva distinta come menzionato nel passaggio 6.4. Fai clic sul pulsante Disegna e disegna una regione provvisoria di interesse. Seleziona l'opzione Visibilità su nessuno per evitare interferenze da aree diverse dal ROI.
- Ripetere il passaggio 6.4.2. Fetta per fetta per disegnare l'intera regione di interesse.
- Al termine del disegno del ROI, fare clic su Crea superficie per ottenere una geometria 3D del ROI.
- Fate clic sul pulsante Modifica (Edit ) nella procedura guidata di creazione manuale della superficie e selezionate Maschera tutto (Mask All).
- Nella finestra Canale maschera visualizzata, selezionare Canale 1 nelle opzioni di selezione del canale. Successivamente, selezionare Duplica canale prima di applicare la maschera. Nelle impostazioni della maschera, selezionare Constant Inside/Outside (Costante interno/esterno) e impostare la superficie esterna del voxel su 0.
- Nel riquadro Proprietà scena, deselezionate l'oggetto superficie e selezionate l'oggetto volume. Nella regolazione dello schermo, deselezionate il canale "Rosso" originale e selezionate il canale Rosso mascherato e regolate le intensità di colore per ottenere il ROI di fluorescenza desiderato reso in 3D e etichettato positivamente.
- Create un nuovo oggetto spot. Inizia facendo clic sull'icona Aggiungi punti per quantificare gli LRC renderizzati in 3D creando spot 3D che si sovrappongono in modo comparabile agli LRC renderizzati in 3D. Utilizzare le frecce inferiori per spostarsi tra i passaggi della procedura guidata di creazione spot.
- Nella procedura guidata di creazione degli spot, ci saranno quattro passaggi sequenziali di istruzioni per creare automaticamente gli spot con il software. Assicurati che l'opzione Solo segmento una regione di interesse sia selezionata nel primo passaggio. Fare clic sull'icona Avanti .
- Nella seconda fase, ci sarà una "scatola XYZ 3D". Regola la casella XYZ per coprire il ROI. Fare clic sull'icona Avanti .
- Nel terzo passaggio, vai alle opzioni del canale sorgente . Scegli il canale rosso mascherato; immettere il diametro dello spot XY stimato paragonabile per adattarsi e sovrapporsi ai punti di fluorescenza del campione. Fare clic sull'icona Avanti .
- Nella quarta fase, aggiungi il tipo di filtro "Qualità" e regola la soglia di intensità inferiore spostando la finestra scorrevole sull'istogramma "Qualità" fino a quando la maggior parte degli LRC identificabili non viene etichettata.
NOTA: La segmentazione e quindi le letture statistiche (esempio: numero di celle) dipendono molto dai valori di soglia di intensità. Fare attenzione a impostare con precisione i valori di soglia appropriati. - Fare clic sul pulsante Fine e selezionare il pulsante Statistiche . Selezionare la scheda Generale per trovare il valore del numero totale di punti nell'immagine.
- Esporta le statistiche facendo clic sul pulsante Tab Display to File e ricevi i risultati in un file .xls.
- Utilizzare un diagramma adatto per presentare i risultati della quantificazione.
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Representative Results
Dopo l'etichettatura EdU e il processo di eliminazione dei tessuti PEGASOS (Figura 2), la mandibola trasparente è stata ottenuta come mostrato nella nostra immagine (Figura 3B). Abbiamo confrontato il campione modificato con una mandibola normale senza un processo di pulizia dei tessuti (Figura 3A). La mandibola trasparente (Figura 3B) con etichettatura EdU è stata sottoposta a imaging confocale. Ci siamo concentrati sull'apice dell'incisivo che mostra la nicchia delle cellule staminali come mostrato in (Figura supplementare 1). La sezione ottica dell'incisivo ha mostrato LRC nella nicchia delle cellule staminali dell'apice dell'incisivo nel piano XY (Figura 4A). Abbiamo ricostruito un'immagine 3D di un apice incisivo che mostra cellule staminali quiescenti che mantengono l'etichetta EdU + sia nella nicchia delle cellule staminali epiteliali (verde) che mesenchimali (rosso) (Figura 4B). Le cellule EdU+ sono state trasferite in punti per la quantificazione che si sovrapponevano in modo comparabile alle LRC mesenchimali (Figura 4C). La figura 4D mostra le macchie create solo per le LRC mesenchimali. La figura 4E mostra le macchie create solo per le LRC epiteliali. Abbiamo quindi completato la quantificazione delle LRC epiteliali e mesenchimali (Figura 4F).
Figura 1: Protocollo di iniezione EdU per etichettare gli LRC. I topi wild-type (WT) sono stati iniettati con EdU a partire da P5. Le iniezioni sono durate per 7 giorni consecutivi fino a P11. Successivamente, i topi hanno subito un periodo di inseguimento di 6 settimane. Li abbiamo raccolti il giorno postnatale 53. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Flusso di lavoro del protocollo. I topi sono stati iniettati con EdU per 7 giorni consecutivi e poi messi in un periodo di inseguimento per 6 settimane. Le mandibole sono state raccolte e fissate dopo la perfusione transcardiaca. Successivamente, le mandibole sono state decalcificate e sottoposte alle fasi di pulizia dei tessuti di decalcificazione, decolorazione, colorazione EdU a montaggio intero, delipidazione, disidratazione e corrispondenza dell'indice di rifrazione (RI). L'imaging per le mandibole cancellate è stato eseguito al microscopio confocale seguito dall'analisi dei dati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Immagini di una mandibola di topo WT postnatale di 53 giorni prima della pulizia del tessuto (A) e dopo la pulizia del tessuto (B). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Una sezione ottica dell'incisivo che mostra LRC nella nicchia delle cellule staminali dell'apice dell'incisivo nel piano XY (A). Una ricostruzione di immagini 3D di LRC epiteliali e mesenchimali in incisivi mandibolari di topo verso l'apice (B). LRC mesenchimali sovrapposti (rosso) con macchie 3D create (grigio) (C). Macchie create solo per LRC mesenchimali (D). Macchie create solo per LRC epiteliali (E). Risultati di quantificazione per LRC epiteliali e mesenchimali (F). Bar: 300 μm in A e 150 μm in B-E. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Preparazione del cocktail di etichettatura EdU |
| Preparazione di soluzioni madre (acquosa) |
| TBS (10x) 1 M, pH 7,6 |
| CuSO 4 (100x),0,4 M |
| Solfa-cianina 3 Azide (100x), 300 μM in DMSO |
| Sodio ascorbato (10x), 0,2 g/mL in H2O |
| PBST (0,1% Triton X-100 in PBS, v/v) |
| Preparazione del cocktail di etichettatura EdU |
| Aggiungere i seguenti reagenti nell'ordine indicato: |
| Soluzione salina tris-tamponata (100 mM finale, pH 7,6) |
| CuSO 4 (4 mM finale) |
| Solfa-cianina 3 Azide (3 μM finale) |
| Ascorbato di sodio (100 mM finale, appena fatto per ogni uso) |
Tabella 1: Preparazione del cocktail di etichettatura EdU
Figura supplementare: Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Dosi multiple di iniezioni (BrdU, EdU) sono solitamente utilizzate su topi neonatali in crescita per etichettare il più possibile le cellule proliferanti 1,6,13. Il periodo di inseguimento è considerato un passo critico per quanto riguarda il tasso di rinnovamento dei tessuti 6,13. L'incisivo del topo si rinnova circa ogni mese. Questa caratteristica consente ai ricercatori di impostare il periodo di inseguimento a 4 settimane o più 4,5,22. Il nostro periodo di inseguimento di 6 settimane potrebbe marcare le cellule staminali nei compartimenti mesenchimali ed epiteliali (ansa cervicale labiale e linguale). Quest'area comprendeva alcune delle popolazioni progenitrici nelle TAC (Transit-Amplifying Cells) provenienti da entrambi i compartimenti epiteliali e mesenchimali. Sarebbe auspicabile un periodo di inseguimento più lungo per mostrare vere cellule che mantengono l'etichetta che risiedono esclusivamente nelle nicchie delle cellule staminali epiteliali e mesenchimali.
Ci sono più passaggi critici nelle fasi di elaborazione e pulizia dei tessuti per questo protocollo. La prima nota è per la fase di perfusione e fissazione dei tessuti. Gli incisivi dei topi contengono tessuti pulpari che hanno un ricco apporto di vasi sanguigni e contengono un'elevata quantità di tessuti sanguigni. Pertanto, la perfusione di eparina PBS deve essere iniziata il prima possibile dopo che i topi sono stati profondamente anestetizzati e trattenuti. Il motivo è quello di evitare la formazione di coaguli di sangue che porta all'autofluorescenza19. Bisogna fare attenzione per evitare un'eccessiva fissazione con PFA, che può portare a una trasparenza insufficiente e a una colorazione giallastra del tessuto dopo la pulizia. Uno scolorimento eccessivo riduce la qualità del segnale nei campioni durante l'imaging19. La fase di perfusione transcardiaca attiva è preferita alla fissazione passiva ad immersione di organi / tessuti, che fisserà rapidamente i tessuti per evitare la perdita di fluorescenza endogena nelle fasi di pulizia dei tessuti. Nella fissazione passiva, le aree più profonde del tessuto possono rimanere meno trasparenti; I campioni potrebbero non avere risultati di imaging soddisfacenti19. La corretta rimozione dei muscoli dalle mandibole consente una corretta visualizzazione delle strutture che interessano i ricercatori. Inoltre, una rimozione efficace impedisce ai disturbi dell'autofluorescenza di avere un impatto sui tessuti muscolari. Una corretta decalcificazione è indispensabile nella pulizia dei tessuti duri. Si deve prestare attenzione a decalcificare adeguatamente i tessuti regolando il tempo di immersione EDTA in base alle dimensioni e al contenuto minerale dei campioni. La concentrazione di EDTA è fondamentale per evitare un eccessivo restringimento dei tessuti. Pertanto, la concentrazione deve essere scelta secondo i campioni e gli esperimenti in questione16,19. Allo stesso modo, una fase di decolorazione è fondamentale per rimuovere adeguatamente l'eme rimanente per ridurre l'autofluorescenza. Un tempo di dislipidazione inadeguato può causare tessuti meno trasparenti e non è consigliato. Generalmente, la delipidazione per i tessuti duri come le mandibole dei topi può essere effettuata da 4-6 ore in soluzione al 30% e al 50% di tB e per 1 giorno in soluzione di TB al 70%20. Il tempo di incubazione dipende dalla dimensione del campione e dal suo contenuto lipidico. Il tempo può essere prolungato per garantire la completa delipidazione19,20. I singoli laboratori possono regolare i tempi secondo le loro esigenze senza ridurre il tempo minimo richiesto per la dislipidazione.
Il problema più comune nelle tecniche di pulizia dei tessuti riguarda l'inadeguata trasparenza del tessuto causata da fasi improprie di elaborazione e pulizia dei tessuti. Questa situazione porta alla difficoltà di ottenere immagini chiare, ostacolando la corretta visualizzazione delle strutture cellulari o subcellulari marcate con fluorescenza. La risoluzione dei problemi dei tessuti non adeguatamente trasparenti dovrebbe essere eseguita assicurando che ogni passaggio critico sia eseguito correttamente. Questa pratica dovrebbe iniziare dalle fasi di perfusione e fissazione dei tessuti fino alle fasi di pulizia dei tessuti. Le proprietà di ogni tessuto o organo sono diverse. Pertanto, le fasi di trattamento e pulizia dei tessuti dovrebbero essere ottimizzate per ottenere risultati soddisfacenti19.
L'imaging dei campioni di tessuto eliminati può essere completato con un microscopio a scansione laser confocale (CLSM) o un microscopio a fluorescenza a foglio luminoso (LSFM) a seconda delle esigenze e della domanda sperimentale e della disponibilità dell'apparecchiatura17. Abbiamo usato CLSM per l'imaging della mandibola, che fornisce immagini ad alta risoluzione a un ingrandimento più elevato ma richiede un tempo più lungo rispetto a LSFM17,20. Quando l'alta risoluzione e un maggiore ingrandimento non sono un requisito, il microscopio a fluorescenza a foglio di luce veloce (LSFM) può essere desiderabile19. LSFM è costoso e potrebbe non essere facilmente disponibile per i normali laboratori. Per la microscopia confocale, la scelta degli obiettivi giusti con la giusta apertura numerica è fondamentale per una buona immagine 19,20. Per campioni di tessuto di grandi dimensioni, obiettivi di ingrandimento inferiori come 10x con un'apertura numerica ridotta e una distanza di lavoro maggiore possono essere appropriati19,21. Per campioni di tessuto più piccoli, possono essere desiderabili obiettivi di ingrandimento più elevati come 20x con un'elevata apertura numerica e una distanza di lavoro inferiore. Inoltre, l'utilizzo di un olio ad immersione con un indice di rifrazione corrispondente al mezzo di compensazione e una lente obiettivo è fondamentale per evitare la distorsione dell'immagine e ottenere chiarezza17,19. Per l'imaging, sono disponibili diverse suite software di elaborazione e analisi delle immagini. Mentre alcune delle suite software sono gratuite, altre sono costose e potrebbero essere inaccessibili per i singoli laboratori. Queste piattaforme di imaging generano file di grandi dimensioni (in gigabyte) che richiedono workstation informatiche di fascia alta per la visualizzazione e la quantificazione dei dati 17,20,21.
Sebbene più veloce e più facile da eseguire rispetto ad altri metodi di marcatura del DNA come BrdU, ci sono limitazioni nel rilevare LRC attraverso l'etichettatura EdU in vivo rispetto alla marcatura LRC con topi transgenici H2B-GFP. In primo luogo, è difficile distinguere le LRC di origine epiteliale o di origine mesenchimale. La marcatura H2B-GFP può essere utilizzata in un attivatore di tetracicline tessuto-specifico, guidato dal promotore, che può etichettare specificamente le cellule staminali quiescenti in vari tessuti. Nel caso di incisivi di topi, il metodo H2B-GFP può marcare specificamente le cellule staminali dall'epitelio o dal mesenchima 4,22. Tuttavia, i metodi di pulizia dei tessuti e di costruzione di immagini 3D descritti in questo protocollo si applicano anche agli LRC marcati con fluorescenza H2B-GFP, offrendo flessibilità e una varietà di opzioni. Il nostro lavoro consente l'etichettatura e la caratterizzazione degli LRC in base alle esigenze scientifiche. Il metodo H2B-GFP richiede la produzione di topi transgenici e l'incrocio con altri ceppi, che richiede tempo e più costoso dell'etichettatura EdU. L'altra limitazione dell'etichettatura EdU con il metodo di eliminazione dei tessuti è che i campioni non possono essere utilizzati ulteriormente per analisi funzionali a valle.
Questo protocollo è vantaggioso per i ricercatori che non richiedono l'etichettatura specifica del tessuto e vogliono risultati più rapidi dall'etichettatura delle cellule staminali quiescenti. Questo metodo può essere modificato per essere utilizzato per il tracciamento della linea cellulare; quando incorporato con l'etichettatura a fluorescenza guidata da Cre delle cellule staminali / progenitrici, il nostro metodo ottiene maggiori dettagli sulla posizione della progenie e quantificazione / contributi più accurati23.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Meghann K. Holt per aver curato il manoscritto. Questo studio è stato supportato dalle sovvenzioni NIH / NIDCR DE026461 e DE028345 e dal finanziamento di avvio della Texas A & M School of Dentistry al Dr. Xiaofang Wang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
| 20 × Objective/NA 0.9 | Leica | 507702 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| BD PrecisionGlide Needle | BD | REF 305111 | |
| Bezyl benzoate (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
| Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
| BRAND cavity slides | Millipore Sigma | BR475505 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Circulation Pump | VWR | 23609-170 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
| DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
| EdU | Carboynth | NE08701 | |
| Heparin | Miiilipore Sigma | H3149 | |
| Imaging System | Olympus | DP27 | |
| LAS X Software | Leica | ||
| Olympus Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
| PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
| Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide | Lumiprobe | D1330 | |
| TBS-10X | Cell Signaling Technology | 12498 | |
| TCS SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
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