Summary
마우스 앞니는 줄기 세포 틈새에 귀중한 표지 유지 세포를 포함합니다. 우리는 라벨 유지 세포를 편견 없이 검출하고 정량화하는 새로운 방법을 가지고 있습니다. 우리의 연구는 하악의 PEGASOS 조직 제거 후 EdU 라벨링과 3D 재구성 접근법을 사용했습니다.
Abstract
쥐 앞니는 마우스의 수명 동안 지속적으로 성장하는 기관입니다. 앞니의 근위 조직에 존재하는 상피 및 중간엽 줄기 세포는 아멜로아세포, 치모세포 및 치수 섬유아세포로 분화할 자손을 생성합니다. 이 세포는 앞니 조직의 지속적인 회전율을 지원하는 데 중요하므로 쥐 앞니는 성체 줄기 세포의 항상성을 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다. 줄기 세포는 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)과 같은 뉴클레오티드 유사체에 의해 표지 될 수있는 수명이 긴 정지 세포를 함유하고있는 것으로 여겨진다. 셀은 시간이 지남에 따라 이 레이블을 유지하며 그에 따라 레이블 유지 셀(LRC)로 명명됩니다. 생체 내에서 LRC를 시각화하기 위한 접근 방식은 줄기 세포 항상성을 모니터링하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. 본 연구에서는 LRC를 시각화하고 분석하는 방법에 대해 설명하였다. 당사의 혁신적인 접근 방식은 조직 세척 후 마우스 앞니의 LRC와 전체 장착 EdU 염색 후 컨포칼 현미경 및 이미징 소프트웨어를 사용한 3차원(3D) 재구성을 특징으로 합니다. 이 방법은 단면 슬라이드에 대한 기존 LRC 분석과 비교하여 3D 이미징 획득 및 비편향 정량화를 가능하게 합니다.
Introduction
지속적으로 성장하는 쥐 앞니는 성체 줄기 세포 연구를 위한 훌륭한 모델이다1. 앞니의 근위부에 상피(순순 및 설측 자궁경부 루프)와 중간엽 줄기세포(순순과 설측 경추 루프 사이)는 아멜로모세포, 치모세포, 치수 세포로 분화합니다. 이 독특한 과정은 조직 손실과 회전율을 보상하기 위한 세포의 공급원을 제공한다2. Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1 등과 같은 여러 줄기 세포 마커가 있지만. 마우스 앞니에서 성체 줄기 세포의 서브세트에 대해 생체 내에서 확인되었으며, 이들은 단독으로 사용될 때 줄기 세포 집단을 나타내는데 부적절하다 1,3,4,5. 뉴클레오티드 유사체 DNA 라벨링 및 보존에 의해 수명이 긴 정지 세포를 시각화하면 대부분의 성체 줄기 세포 하위 집합에 대해 편견 없는 검출을 제공할 수있습니다 6. 또한, 이러한 접근법은 세포 거동과 치아 줄기 세포 집단3,8의 항상성을 이해하기 위한 많은 줄기 세포 식별 방법7 중에서 유용하다. 분열하는 줄기 세포는 상당한 추적 후에 DNA 라벨링을 잃게 되지만, 추정되는 정지 줄기 세포는 DNA 라벨을 유지하여 라벨 유지 세포(LRC)로 간주합니다6. 분열하지 않는 줄기 세포에 의한 DNA 라벨링 및 보유는 틈새 시장에서 추정되는 성체 줄기 세포를 표시하고 찾습니다.
지난 몇 년 동안 티미딘 유사체 5-브로모-2′-데옥시유리딘(BrdU) 표지는 세포 증식 분석을 위한 번거롭고 시간이 많이 소요되는 고해상도 현미경 비호환 3H-티미딘 DNA 표지 방법을 대체했습니다 6,9. 최근 몇 년 동안 5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU) 표지 기술이 BrdU보다 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 이 패턴은 몇 가지 이유로 나타났습니다. 첫째, BrdU 방법은 느리고 노동 집약적입니다. 사용자 조건은 가변적이며 검체의 미세 구조를 보존할 수 없습니다(DNA 변성으로 인해). 마찬가지로, BrdU 방법은 세포의 항원성을 상실하여 공동 국소화 실험 및 생체 내 줄기 세포 이식 3,7,9,10,11,12와 같은 다운스트림 기능 분석 및 분석에 비효율적입니다. BrdU는 또한 기형 유발 물질로, 배아 발달에서 LRC를 표지하는 데 적합하지 않다6. 또한 BrdU 방법은 전체 장착 시편에 사용할 때 비효율적입니다. 단점은 검체의 깊은 부분에서의 항체 침투율이 낮거나 깊은 침투를 위해 긴 항체 배양 기간이 필요하다는 점이다13. EdU 라벨링은 표본을 변성시키는 단계를 벗어나 미세 구조를 보존합니다. 이 특징은 co-localization 실험 및 줄기 세포 이식과 같은 다운스트림 기능 분석에 유리합니다11,12. 또한 EdU 라벨링은 매우 민감하고 빠릅니다. Cu(I) 촉매 [3 + 2] 고리첨가 반응("클릭" 화학)14을 통해 EdU 라벨을 검출하기 위해 빠르게 흡수되고 더 작은 크기의 형광 아지드를 사용하기 때문에 시편 침투율이 높습니다.
점점 더 많이 적용되는 또 다른 DNA 라벨링 방법은 조작된 형질전환 마우스를 사용하는 것입니다. 이 마우스는 테트라사이클린 반응성 조절 요소 5,14에 의해 제어되는 히스톤 2B 녹색 형광 단백질(H2B-GFP)을 발현합니다. 4주에서 4개월의 추적 기간 동안 생쥐에게 테트라사이클린 차우/물을 먹인 후, GFP 형광은 사이클링 세포에서 감소하고 LRC만이 형광을 유지합니다6. 이 방법의 장점은 표지된 LRC를 분리할 수 있고 세포 배양 또는 다운스트림 기능 분석에 사용할 수 있다는 것입니다 6,7. 일부 연구에서는 장기간 사용을 위해 추적했을 때 정지 줄기 세포의 부정확한 라벨링을 보고했습니다. 이 결과는 H2B-GFP 균주에서 새는 배경 발현으로 인한 것이지 적절한 테트라사이클린 조절 반응이 아니었기 때문이다15.
더욱이 과거의 대부분의 문헌은 주로 단면 슬라이드에서 LRC 검출을 사용했는데, 이는 2차원이며 LRC의 정확한 위치와 수를 표시하는 데 종종 잘못 편향되어 있습니다. 이 접근법은 복잡한 조직 구조의 절편에 대해 부정확한 각도를 표시하였다16. 다른 방법은 직렬 섹션에서 3D 이미지를 얻고 사후 이미지 재구성을 수행하는 것이었습니다. 이들 단계들은 압축되거나 늘어난 섹션들로 인한 각각의 시리얼 섹션들의 변형으로 인한 이미지 왜곡 때문에 부정확하였고, 그 결과 정보(16,17,18)가 누락되었다. 이 방법은 또한 힘들고 시간이 많이 걸렸습니다.
LRC의 전체 마운트 이미징을 용이하게 하려면 형광이 잘 유지되는 동안 샘플을 선명하게 해야 합니다. 현재의 조직 투명화 기술은 세 가지 주요 범주로 분류할 수 있다: 유기 용매 기반 조직 투명화 기술, 수성 시약 기반 조직 투명화 기술, 및 하이드로겔 기반 조직 투명화 기술17,19. 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 관련 용매 시스템(PEGASOS)이 최근에 개발되었습니다. 이 접근법은 거의 모든 유형의 조직을 투명하게 만들고 뼈와 치아와 같은 경조직을 포함한 내인성 형광을 보존한다20. PEGASOS 방법은 특히 치아 및 뼈 재료를 청소할 때 다른 조직 청소 방법에 비해 장점이 있습니다. 대부분의 다른 방법들은 경조직을 부분적으로만 제거할 수 있거나, 처리 시간이 길거나, 값비싼 시약을 필요로 한다21. 또한 PEGASOS 분석법은 다른 분석법에 비해 내인성 형광을 효율적으로 보존할 수 있습니다.
이 문헌은 우리로 하여금 세포 연구를 위한 새로운 방법을 만들도록 이끌었습니다. 우리는 EdU 라벨링의 LRC 검출 이점과 조직 투명 표본의 가장 우수한 3D 전체 마운트 이미징을 결합했습니다. 샘플을 고급 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 관련 용매 시스템(PEGASOS) 조직 투명화 기술15로 처리하였다. 경조직 투명성을 통해 치아나 하악골을 부러뜨리지 않고 생체 내에서 LRC 형광의 3D 신호를 재구성할 수 있어 LRC를 시각화하고 정량화하는 보다 정확한 방법을 만들 수 있었습니다.
이 연구에서는 마우스 앞니에서 LRC를 시각화하는 혁신적인 가이드를 제공합니다. 우리는 마우스 앞니 줄기 세포 틈새 내에서 LRC의 위치와 양을 결정하기 위해 3D 시각적 접근 방식을 만들었습니다. 이 프로젝트에서는 EdU 라벨링, PEGASOS 조직 투명화 기술 및 컨포칼 현미경을 사용했습니다. 전체 마운트 조직에 LRC를 EdU로 라벨링하는 당사의 방법과 투명하고 투명한 표본을 사용하는 방법은 기존의 절편 슬라이드와 기타 불리한 DNA 라벨링 방법의 한계를 모두 극복합니다. 따라서 우리의 기술은 LRC 검출이 필요한 줄기 세포 항상성 연구, 특히 경조직에 적합 할 것입니다. 이 프로토콜은 다른 조직과 기관의 줄기 세포 항상성에 초점을 맞춘 사람들에게도 똑같이 유리할 수 있습니다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 Texas A&M University College of Dentistry의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.
1. EdU 라벨링 칵테일의 제조
- 표 1에 기재된 바와 같이 칵테일 스톡 용액을 준비한다.
- 표 1에 설명된 대로 EdU 라벨링 칵테일을 준비합니다.
2. 마우스 및 EdU 용액의 제조
- EdU 솔루션을 준비합니다. EdU를 DMSO에 20mg/mL로 녹이고 -20°C 냉동고에 보관합니다.
주의: EdU는 돌연변이 유발 물질입니다. 사용자는 이 물질을 취급할 때 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다. - 5일령 C57BL/6J 마우스에 준비된 EdU 용액을 3μL/g 체중으로 복강 주사합니다. 마우스는 연속 7일 동안 하루에 한 번 용액을 받아야 합니다. 다음으로, 분석을 위해 수확되기 전에 6주 동안 추적 기간을 거칩니다(그림 1).
주의 : EdU를 마우스에 주사할 때 바늘이 찔리지 않도록 주의하십시오. 연속 7일 동안 EdU를 주사한 후 마우스를 새 케이지에 넣습니다. 생쥐가 새 집에 들어간 후에는 적절한 생물학적 위험 규칙을 사용하여 오래된 새장에 침구를 버리십시오.
3. 경심 관류에 의한 시료 준비(생후 53일령 마우스, 6주간의 체이스 기간 후)
참고: 마우스 간은 성공적인 경심장 관류 후 창백해져야 합니다.
- 복강 주사로 마우스를 마취하십시오. 자일라진과 케타민 마취제(자일라진 10-12.5 mg/kg; 케타민, 80-100 mg/kg 체중).
- 마우스가 더 이상 고통스러운 자극(예: 발 꼬집음 반사)에 반응하지 않을 때까지 ~10분 동안 기다립니다.
- 각 발에 바늘이 있는 스티로폼 지지대에 안정된 앙와위 자세로 마우스를 놓습니다.
- 핀셋과 가위를 사용하여 위에 놓인 피부를 열어 흉강을 노출시킵니다.
- 날카로운 가위로 다이어프램을 자릅니다. 심장을 뚫지 않도록주의하십시오.
- 흉곽을 자르고 클램프 가위로 흉골 기저부를 잡고 심장을 노출시킵니다.
- 마우스를 관류로 옮깁니다.tage 흄 후드의 순환 펌프 근처.
- 25G 바늘(인산염 완충 식염수(PBS)/4% 파라포름알데히드(PFA) 용액으로 채워진 튜브에서)을 좌심실 정점에 삽입합니다. 바늘 끝이 심실의 내강에 유지되도록주의하십시오.
주의: PFA는 중간 정도의 독성을 지니고 있으며 발암 가능성이 있습니다. PPE를 사용하여 PFA를 처리하고 화학 흄 후드 아래에서 용액을 준비하십시오. 폐기물 PFA는 기관 지침에 따라 적절한 처리가 필요합니다. - 좌심실에 바늘을 삽입 한 직후 날카로운 가위로 우심실을 자릅니다. 이 단계를 통해 혈액이 마우스에서 흘러나와 수집 접시로 배출됩니다.
- 샘플을 50mL의 PBS 용액으로 7mL/분의 유속으로 관류합니다.
- PBS 관류 후 마개를 전환하여 5mL/min의 동일한 유속으로 4% PFA 용액 20mL를 흘릴 수 있도록 합니다.
- 순환 펌프가 켜져 있는 동안 좌심실에서 바늘을 제거합니다.
참고: 이제 마우스가 조직 수집을 위해 고정되었습니다. 형광을 보존하려면 전체 프로토콜에서 가능한 한 빛 노출을 피해야 합니다. 조직이 처리되는 동안 조직 샘플이 있는 50mL 원뿔형 튜브를 알루미늄 호일로 덮을 수 있습니다.
4. PEGASOS 기법을 이용한 하악 조직 제거
참고: 조직 부피에 따라 15mL 또는 50mL 원뿔형 튜브를 사용하여 각 단계에서 처리할 수 있는 샘플을 준비할 수 있습니다. 샘플은 4.2 단계에서 4.7 단계까지 37 °C 쉐이커 (~ 100 rpm)에서 처리됩니다. 플라스틱이 녹지 않도록 유기 용제에 내성이 있는 폴리프로필렌 기반 플라스틱 용기를 사용하십시오. 또는 유리 제품을 사용할 수 있습니다.
주의: PEGASOS 조직 투명 기술은 Quadrol, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 벤질 벤조에이트(BB), MMA500 등과 같은 독성 용액을 사용합니다. 잠재적인 노출을 방지하려면 적절한 PPE가 필요합니다.
- 하악골을 해부하고 샘플을 4% PFA로 추가로 고정합니다. 밤새 실온에 보관하십시오.
- 하악골에서 근육을 제거하고 0.5M EDTA 용액(pH 8.0)에 담가 4일 동안 석회질을 제거합니다. 이 기간 동안 37°C 셰이커에서 매일 배지 변경을 수행합니다.
알림: 샘플에서 근육을 가능한 한 많이 제거하는 것이 바람직합니다. 이 예방 조치는 이미징 과정을 단순화하고 근육의 자가 형광을 감소시킵니다. - 하악골을 37°C 쉐이커에서 하루 동안 25% Quadrol 용액(v/v in H2O)으로 탈색하여 남은 혈액 헴을 제거합니다.
- 전체 마운트 EdU 염색을 완료합니다.
- 표 1에 따라 신선한 EdU 라벨링 칵테일을 준비합니다.
알림: EdU 라벨링 칵테일은 최적의 EdU 라벨링 결과를 얻기 위해 새로 준비된 아스코르브산염 용액을 추가하여 매번 신선하게 만들어야 합니다. - 37°C 셰이커에서 30분 동안 PBST로 하악골을 헹굽니다.
- PBS로 하악골을 매번 3분 동안 세 번 헹굽니다.
- 하악골을 갓 만든 EdU 라벨링 칵테일에 넣고 37°C 셰이커에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- PBS로 하악골을 매번 3분 동안 세 번 헹굽니다.
- 표 1에 따라 신선한 EdU 라벨링 칵테일을 준비합니다.
- 37 °C에서 6 시간 동안 다음 각 용액에서 연속 지질 제거를 수행합니다.
30% tert-부탄올(tB) 용액: 75% v/v H 2O,22% v/v tB 및 3% v/v Quadrol.
50% tB 용액: 50% v/v H2O, 47% v/v tB 및 3% v/v 쿼드롤.
70% tB 용액: 30% v/v H2O, 67% v/v tB 및 3% v/v Quadrol
참고: 지질 제거 단계가 중요합니다. 탈지질화는 30% 및 50% tB 용액에서 4-6시간 사이, 70% tB 용액에서 1일 동안 수행할 수 있습니다. - 75% tB, 22% v/v 폴리에틸렌 글리콜 메틸-에테르 메타크릴레이트 평균 MMA500 및 37°C에서 3% v/v Quadrol로 매일 배지 교체로 2일 동안 tB-PEG 용액에서 하악골을 탈수합니다.
- 굴절률 매칭을 얻기 위해 벤질 벤조에이트(BB)-PEG 투명 매체에서 하악을 투명하게 합니다: 투명도가 달성될 때까지 75% v/v BB, 22% v/v PEG-MMA500 및 3% Quadrol.
참고: 굴절률 일치에 대한 정보가 있습니다. 물, 지질, 단백질, 미네랄, 세포 기관 등과 같은 조직의 무기 및 유기 성분. 1.33에서 1.55 사이의 다른 굴절률(RI)을 갖습니다. 조직 구성 요소 간의 이러한 RI 불일치는 이미징 프로세스를 방해합니다. 조직 내 RI 불일치를 제거함으로써 투명성을 얻을 수 있습니다. 조직 투명 샘플을 BB-PEG의 투명 매체에 담그는 것이 좋습니다. 이 단계는 전체 시편에 ~1.54(RI 매칭이라고 함)의 균일한 내부 RI를 제공하여 이미징 프로세스를 용이하게 합니다. - 보관 및 이미징을 위해 실온에서 BB-PEG 조직 투명 배지의 하악골을 보존합니다.
알림: 형광 리포터의 점진적인 손실을 피하기 위해 가능한 한 빨리 이미징을 완료하는 것이 좋습니다. 그러나, 페가소스(PEGASOS) 방법은 몇 주간의 보관 후에도 형광 리포터를 잘 보존할 수 있다20,21. 장기 보관을 위해 샘플을 4°C에서 보관할 수도 있습니다.
5. 조직 제거 하악의 공초점 영상
- 하악 전체를 투명하게 청소한 조직을 BB-PEG 투명 매체의 브랜드 캐비티 슬라이드에 장착하고 유리 커버 슬라이드로 덮습니다. 거품을 피하십시오.
- 적절한 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 이미지 획득을 수행합니다. Acquire 를 선택하고 이미지 획득 파라미터를 512 x 512 픽셀 해상도 및 400 Hz 획득 속도로 설정합니다. 이러한 설정은 현미경을 제어하는 소프트웨어의 획득 모드 메뉴에서 찾을 수 있습니다.
- 형광 여기 패널에서 형광단을 최적으로 여기시키기 위해 필요한 레이저(TRITC)를 활성화합니다(LRC 시각화에 사용한 프로브는 548nm에서 여기 및 563nm에서 방출되는 Cy3와 같은 형광 특성을 가짐).
- 형광 검출용 패널에서 슬라이더를 움직여 측정할 파장을 선택합니다(예: Cy3 유사 형광단의 경우 555 - 625 nm).
- 장착된 하악을 현미경 스테이지에 배치하여 백색광과 저배율 대물렌즈(2-10x)를 사용하여 샘플을 시각화하고 찾습니다.
- 커버슬립 위에 굴절률이 1.52인 이멀젼 오일 한 방울을 추가하여 유리 커버슬립과 대물렌즈의 굴절률과 일치시킵니다.
참고: 대물렌즈, 이미징 매체 및 조직의 굴절률을 최대한 가깝게 일치시켜 이미지 획득 중 광학 왜곡의 도입을 최소화합니다. - 형광등을 켜고 적절한 배율 대물렌즈를 선택하여 관심 영역을 이미지화합니다. 우리는 1.95mm의 작동 거리와 0.9의 개구수를 가진 20x 대물 렌즈를 사용했습니다. 컨포칼 현미경으로 더 큰 조직 샘플을 이미징할 때 더 긴 작동 거리 렌즈가 필요할 수 있습니다. 또는 더 큰 조직 샘플에 대해 광시트 현미경을 사용하여 이미징을 쉽게 수행할 수 있습니다.
- 컨포칼 이미징 소프트웨어에서 라이브 버튼을 눌러 라이브 스캔 모드를 시작합니다. 이미지의 다이내믹 레인지를 최대화하고 픽셀 채도를 피하려면 선택한 채널의 게인과 레이저 강도를 조정합니다.
- 시야를 식별하여 하악의 전체 영역을 X 및 Y 차원으로 시각화합니다. 마우스 앞니에서 줄기 세포 틈새의 부피를 정확하게 커버하는 상위 및 하단 Z-단계 획득 매개변수를 설정합니다. 2μm의 Z 단계 크기를 사용하거나 요구 사항에 따라 사용하십시오. 최신 버전의 컨포칼 현미경은 다양한 중첩 영역의 z-스택을 자동으로 획득할 수 있어야 합니다.
- Z-스택 이미지 파일을 .lif 형식으로 수집하고 저장합니다.
참고 : .lif 파리는 .tiff 파일로 변환하여 다른 3D 분석 소프트웨어에 사용할 수 있습니다.
6. 표면 생성, 관심 영역(ROI) 분할, ROI 마스킹 및 스팟 생성을 통한 표지 유지 세포의 이미지 처리, 3D 이미지 재구성 및 정량화
참고: 이미지 처리 및 3D 재구성을 위해 Imaris(Bitplane 9.0.1)를 사용했지만 다른 소프트웨어 제품군(예: ImageJ/Fiji, 3D 슬라이서, Avizo, Arivis, Amira 등)을 사용하여 유사한 이미지 처리 단계를 수행할 수 있습니다.
- 이미징 소프트웨어에서 Arena 버튼을 클릭한 다음 Image를 선택합니다. 원본 . lif 파일을 선택하고 병합된 파일을 선택하면 이미지를 이미징 소프트웨어로 가져옵니다.
참고: 또는 이미징 소프트웨어 파일 변환기를 사용하여 Z 스택 이미지 파일을 소프트웨어의 기본 형식 파일 형식으로 변환합니다. 예를 들어, Imaris 파일 변환기를 사용하여 .lif 파일을 .ims 파일로 변환하고 이미징 소프트웨어에서 .ims 파일을 엽니다. 데이터를 소프트웨어의 기본 파일 형식으로 변환하면 파일을 빠르게 변환하고 오류를 최소화할 수 있습니다. - 가져온 파일을 두 번 클릭하여 이미지 데이터 세트를 엽니다.
- 디스플레이 조정 패널을 방문하여 채널 이름을 클릭합니다. 일반적으로 기본 모드에서는 빨간색으로 표시됩니다.
- Image Properties(이미지 속성) 창에서 Mapped Color(매핑된 색상) 탭을 클릭합니다. Color Table File(색상 테이블 파일) 옵션에서 Fire Flow(Fire Flow)를 선택한 다음 OK(확인)를 클릭합니다. 디스플레이 색상은 일반적으로 배경 형광과 양성 형광을 샘플과 구별하기 위해 선택됩니다.
- 화면 왼쪽 상단의 장면 – 속성 창에서 새 표면 추가라는 파란색 아이콘을 클릭합니다. 볼륨 아이콘을 선택 취소하면 대부분의 배경 형광이 제거되고 양성 형광이 뚜렷하게 보입니다(6.4.2단계 참조).
- Create(만들기) 탭을 클릭하고 Skip Automatic Creation(자동 생성 건너뛰기), Edit Manually(수동 편집) 탭을 선택하여 관심 영역(ROI)을 수동으로 세분화하는 프로세스를 시작합니다. 수동 서피스 작성 마법사에서 컨투어(Contour) 탭을 클릭하고 샘플을 기반으로 방향(XY, YZ 또는 XZ)을 선택하여 ROI를 쉽게 컨투어링할 수 있습니다. 여기서는 XY 방향을 선택합니다.
- 그런 다음 오른쪽 모서리에 있는 포인터 메뉴가 선택 모드인지 확인합니다. 슬라이스 위치를 조정하여 조직에서 ROI를 찾습니다. 대부분의 배경 형광이 6.4단계에서 언급한 대로 뚜렷한 양성 형광으로 제거되었음을 알 수 있습니다. 그리기 버튼을 클릭하고 잠정 관심 영역을 그립니다. ROI 이외의 다른 영역에서 간섭을 피하기 위해 가시성 옵션을 없음 으로 선택합니다.
- 6.4.2단계를 반복합니다. 슬라이스 단위로 슬라이스하여 전체 관심 영역을 그립니다.
- ROI 도면이 완료되면 표면 생성을 클릭하여 ROI의 3D 지오메트리를 가져옵니다.
- 수동 서피스 작성 마법사에서 편집(Edit ) 버튼을 클릭하고 마스크 전체(Mask All)를 선택합니다.
- 튀어나온 마스크 채널 창의 채널 선택 옵션에서 채널 1 을 선택합니다. 그런 다음 마스크를 적용하기 전에 채널 복제를 선택합니다. 마스크 설정에서 Constant Inside/Outside 를 선택하고 복셀 외부 표면을 0으로 설정합니다.
- 장면 속성(Scene-Properties) 창에서 서피스 오브젝트(Surface Object)를 선택 취소하고 볼륨 오브젝트(Volume Object)를 선택합니다. 디스플레이 조정에서 원래 "빨간색" 채널을 선택 해제하고 마스크된 빨간색 채널을 선택하고 색상 강도를 조정하여 원하는 3D 렌더링 및 긍정적으로 레이블링된 형광 ROI를 얻습니다.
- 새 별색 개체를 만듭니다. 먼저 스팟에 추가 아이콘을 클릭하여 3D 렌더링 LRC와 비교적 겹치는 3D 스팟을 만들어 3D 렌더링 LRC를 정량화합니다. 아래쪽 화살표를 사용하여 스팟 생성 마법사의 단계 사이를 이동합니다.
- 스팟 생성 마법사에는 소프트웨어를 사용하여 자동으로 스팟을 생성하는 4개의 순차적인 지침 단계가 있습니다. 첫 번째 단계에서 Segment Only a Region of Interest(관심 영역만 세그먼트) 옵션이 선택되어 있는지 확인합니다. 다음 아이콘을 클릭합니다.
- 두 번째 단계에는 "XYZ 3D 상자"가 있습니다. ROI를 포함하도록 XYZ 상자를 조정합니다. 다음 아이콘을 클릭합니다.
- 세 번째 단계에서 소스 채널 옵션으로 이동합니다. 가면을 쓴 빨간색 채널을 선택하십시오. 맞는 추정 XY 스폿 직경을 입력하고 샘플 형광 점을 겹칩니다. 다음 아이콘을 클릭합니다.
- 네 번째 단계에서는 "품질" 필터 유형을 추가하고 식별 가능한 LRC의 대부분이 레이블이 지정될 때까지 '품질' 히스토그램을 가로질러 슬라이딩 윈도우를 이동하여 낮은 강도 임계값을 조정합니다.
참고: 세분화 및 그에 따른 통계적 판독값(예:ample: 셀 수)은 강도 임계값에 따라 크게 달라집니다. 적절한 임계값을 정확하게 설정해야 합니다. - Finish(마침) 버튼을 클릭하고 Statistic(통계) 버튼을 선택합니다. 전체 탭을 선택하여 이미지의 총 스팟 수에 대한 값을 찾습니다.
- Tab Display to File 버튼을 클릭하여 통계를 내보내고 결과를 .xls 파일로 받습니다.
- 정량화 결과를 제시하기 위해 적절한 다이어그램을 사용하십시오.
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Representative Results
EdU 라벨링 및 PEGASOS 조직 투명화 과정(그림 2) 후, 이미지와 같이 투명한 하악골을 얻었습니다(그림 3B). 우리는 변형된 샘플을 조직 투명화 과정 없이 정상 하악과 비교했습니다(그림 3A). EdU 표지가 있는 투명한 하악골(그림 3B)을 공초점 이미징을 실시했습니다. 우리는 (보충 그림 1)에서 볼 수 있듯이 줄기 세포 틈새를 보여주는 앞니 정점에 초점을 맞췄습니다. 앞니의 광학 섹션은 XY 평면에서 앞니 정점의 줄기 세포 틈새에서 LRC를 보여주었습니다(그림 4A). 우리는 상피(녹색) 및 중간엽(빨간색) 줄기 세포 틈새 모두에서 EdU+ 표지 유지 정지 줄기 세포를 보여주는 앞니 정점의 3D 이미지를 재구성했습니다(그림 4B). EdU+ 세포는 정량화를 위해 중간엽 LRC와 비교적 겹치는 지점으로 옮겨졌습니다(그림 4C). 그림 4D 는 중간엽 LRC에 대해서만 생성된 스팟을 보여줍니다. 그림 4E 는 상피 LRC에 대해서만 생성된 스팟을 보여줍니다. 그런 다음 상피 및 중간엽 LRC의 정량화를 완료했습니다(그림 4F).
그림 1: LRC에 라벨을 붙이기 위한 EdU 주입 프로토콜. 야생형(WT) 마우스에 P5에서 시작하는 EdU를 주사했습니다. 주사는 P11까지 연속 7일 동안 지속되었습니다. 다음으로, 마우스는 6 주간의 추적 기간을 거쳤다. 우리는 출생 후 53 일에 수확했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 프로토콜의 워크플로 마우스에 연속 7일 동안 EdU를 주사한 후 6주 동안 체이스 기간에 두었습니다. 하악골을 채취하여 경심 관류 후 고정했습니다. 다음으로, 하악골을 석회화하고 탈석화, 탈색, 전체 마운트 EdU 염색, 탈지질화, 탈수 및 굴절률(RI) 매칭의 조직 소거 단계를 거쳤습니다. 제거된 하악골에 대한 이미징은 컨포칼 현미경으로 수행된 후 데이터 분석되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 조직 청소 전(A)과 조직 청소 후(B) 출생 후 53일 된 WT 마우스 하악골의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: XY 평면(A)에서 앞니 정점의 줄기 세포 틈새에 있는 LRC를 보여주는 앞니의 광학 섹션. 정점을 향한 마우스 하악 절치에서 상피 및 중간엽 LRC의 3D 이미지 재구성(B). 중간엽 LRC(빨간색)와 생성된 3D 스팟(회색)(C)의 겹침. 중간엽 LRC(D)에 대해서만 생성된 스팟입니다. 상피 LRC(E)에 대해서만 생성된 스팟. 상피 및 중간엽 LRC에 대한 정량화 결과(F). Bar: A에서 300 μm, B-E에서 150 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| EdU 라벨링 칵테일 준비 |
| 원액 준비(수용성) |
| TBS(10x) 1M, pH 7.6 |
| CuSO4 (100x), 0.4 미터 |
| 설파-시아닌 3 아지드(100x), DMSO에서 300μM |
| 아스코르브산나트륨(10x),H2O중 0.2g/mL |
| PBST(PBS에서 0.1% Triton X-100, v/v) |
| EdU 라벨링 칵테일 준비 |
| 다음 시약을 순서대로 추가합니다. |
| 트리스 완충 식염수(최종 100mM, pH 7.6) |
| CuSO 4 (4 mM 최종) |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide (3 μM 최종) |
| 아스코르브산나트륨(최종 100mM, 매번 사용할 때마다 새로 만듦) |
표 1: EdU 표지 칵테일의 제조
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Discussion
증식하는 세포를 가능한 한 많이 표지하기 위해 성장하는 신생아 마우스에 다회 투여(BrdU, EdU)를 다회 투여한다 1,6,13. 추격 기간은 조직의 재생율 6,13에 관한 중요한 단계로 간주된다. 마우스 앞니는 매달 스스로 갱신됩니다. 이 특성을 통해 연구자는 추적 기간을 4주 이상으로 설정할 수 있습니다 4,5,22. 우리의 6주 추적 기간은 중간엽 및 상피(순순 및 설측 자궁 경부 루프) 구획에 있는 줄기 세포를 라벨링할 수 있습니다. 이 영역에는 상피 및 중간엽 구획 모두에서 TAC(Transit-Amplifying Cells)의 일부 전구 집단이 포함되었습니다. 더 긴 추적 기간은 상피 및 중간엽 줄기 세포 틈새에만 독점적으로 존재하는 진정한 표지 유지 세포를 보여주는 데 바람직할 것입니다.
이 프로토콜의 조직 처리 및 투명 단계에는 여러 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째 메모는 조직 관류 및 고정 단계에 대한 것입니다. 마우스 앞니는 혈관이 풍부하고 많은 양의 혈액 조직을 포함하는 펄프 조직을 포함합니다. 따라서, 헤파린 PBS 관류는 마우스가 깊게 마취되고 구속된 후 가능한 한 빨리 시작되어야 한다. 그 이유는 자가형광으로 이어지는 혈전 형성을 피하기 위함이다19. PFA로 과도하게 고정되지 않도록 주의해야 하며, 이는 투명도가 부족하고 투명도가 낮고 투명도가 낮아 조직이 황색을 띠게 변색될 수 있습니다. 과도한 변색은 이미징 동안 샘플의 신호 품질을 저하시킨다19. 능동 경심 관류 단계는 장기/조직의 수동적 침지 고정보다 선호되며, 이는 조직 투명화 단계에서 내인성 형광의 손실을 피하기 위해 조직을 신속하게 고정합니다. 수동 고정에서 조직의 더 깊은 영역은 덜 투명하게 유지될 수 있습니다. 샘플의 이미징 결과가 만족스럽지 않을 수 있다19. 하악골에서 근육을 적절하게 제거하면 연구자가 관심을 갖는 구조를 적절하게 시각화 할 수 있습니다. 또한, 효과적인 제거는 자가형광 장애가 근육 조직에 영향을 미치는 것을 방지합니다. 적절한 석회질 제거는 경조직 청소에 없어서는 안될 필수 요소입니다. 샘플의 크기와 미네랄 함량에 따라 EDTA 침지 시간을 조정하여 조직을 적절하게 석회화하기 위해 주의를 기울여야 합니다. EDTA 농도는 조직의 과도한 수축을 피하는 데 중요합니다. 따라서 농도는 질문16,19의 샘플 및 실험에 따라 선택해야 합니다. 마찬가지로, 탈색 단계는 자가형광을 줄이기 위해 남아 있는 헴을 적절하게 제거하는 데 중요합니다. 부적절한 탈지질 시간은 조직의 투명도를 떨어뜨릴 수 있으며 권장되지 않습니다. 일반적으로, 마우스 하악골과 같은 경조직에 대한 탈지질화는 30% 및 50% tB 용액에서 4-6시간, 70% tB 용액에서 1일 동안 수행될 수 있다20. 배양 시간은 샘플의 크기와 지질 함량에 따라 다릅니다. 완전한 탈리화(19,20)를 보장하기 위해 시간을 연장 할 수 있습니다. 개별 실험실은 지질 제거에 필요한 최소 시간을 줄이지 않고 요구 사항에 따라 타이밍을 조정할 수 있습니다.
조직 투명화 기술에서 가장 일반적인 문제는 부적절한 조직 처리 및 투명화 단계로 인한 조직의 부적절한 투명성을 포함합니다. 이러한 상황은 선명한 이미지를 얻는 데 어려움을 초래하여 형광 표지된 세포 또는 아세포 구조의 적절한 시각화를 방해합니다. 부적절하게 투명한 조직의 문제 해결은 각 중요한 단계가 올바르게 수행되었는지 확인하여 수행해야 합니다. 이 관행은 조직 관류 및 고정 단계에서 조직 청소 단계까지 시작해야 합니다. 각 조직이나 기관의 특성이 다릅니다. 따라서, 조직 처리 및 투명화 단계는 만족스러운 투명화 결과를 얻기 위해 최적화되어야 한다(19).
투명화된 조직 샘플의 이미징은 장비의 요구 사항 및 실험 질문 및 가용성에 따라 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM) 또는 광시트 형광 현미경(LSFM)으로 완료할 수 있다(17). 우리는 하악 영상에 CLSM을 사용했는데, 이는 더 높은 배율에서 더 높은 해상도의 영상을 제공하지만 LSFM17,20에 비해 시간이 더 오래 걸립니다. 고해상도와 고배율이 요구되지 않는 경우, 고속 광시트 형광 현미경(LSFM)이 바람직할 수 있다19. LSFM은 비싸고 일반 실험실에서는 쉽게 사용할 수 없습니다. 컨포칼 현미경의 경우, 올바른 개구수를 가진 올바른 대물 렌즈를 선택하는 것이 좋은 이미징을 위해 매우 중요합니다19,20. 큰 조직 샘플의 경우, 작은 개구수와 더 큰 작동 거리를 갖는 10x와 같은 더 낮은 배율 대물렌즈가 적절할 수 있다19,21. 더 작은 조직 샘플의 경우, 높은 개구수와 더 작은 작동 거리를 가진 20x와 같은 더 높은 배율 대물렌즈가 바람직할 수 있습니다. 또한, 투명 매체 및 대물 렌즈에 굴절률이 일치하는 이멀젼 오일을 사용하는 것은 이미지 왜곡을 방지하고 선명도를 얻는 데 중요합니다17,19. 이미징을 위해 여러 이미지 처리 및 분석 소프트웨어 제품군을 사용할 수 있습니다. 일부 소프트웨어 제품군은 무료이지만 다른 제품군은 비싸고 개별 실험실에서는 감당할 수 없을 수 있습니다. 이러한 이미징 플랫폼은 데이터 시각화 및 정량화를 위해 고급 컴퓨터 워크스테이션을 필요로 하는 대용량 파일(기가바이트 단위)을 생성합니다(17,20,21).
BrdU와 같은 다른 DNA 표지 방법보다 빠르고 쉽게 수행할 수 있지만 H2B-GFP 형질전환 마우스로 LRC를 표지하는 것에 비해 생체 내에서 EdU 표지를 통해 LRC를 검출하는 데는 한계가 있습니다. 첫째, 상피 기원 또는 중간엽 기원의 LRC를 구별하는 것은 어렵다. H2B-GFP 표지는 다양한 조직에서 정지 줄기 세포를 특이적으로 표지할 수 있는 조직 특이적, 프로모터 구동, 테트라사이클린 활성제에 사용할 수 있습니다. 마우스 앞니의 경우 H2B-GFP 방법은 상피 또는 중간엽의 줄기 세포를 특이적으로 표지할 수 있습니다 4,22. 그러나 이 프로토콜에 설명된 조직 투명화 및 3D 이미지 구성 방법은 H2B-GFP 형광 표지 LRC에도 적용되어 유연성과 다양한 옵션을 제공합니다. 우리의 연구는 과학적 필요에 따라 LRC의 라벨링 및 특성화를 가능하게합니다. H2B-GFP 방법은 형질전환 마우스 생산 및 다른 균주와의 교배가 필요하며, 이는 EdU 라벨링보다 시간과 비용이 많이 듭니다. 조직 투명 방법을 사용한 EdU 라벨링의 또 다른 한계는 표본을 다운스트림 기능 분석에 더 이상 사용할 수 없다는 것입니다.
이 프로토콜은 조직 특이적 표지가 필요하지 않고 정지 줄기 세포 표지에서 더 빠른 결과를 원하는 연구자에게 유리합니다. 이 방법은 세포 계통 추적에 사용하도록 수정할 수 있습니다. 줄기/전구 세포의 Cre-driven 형광 표지와 통합될 때, 우리의 방법은 자손 위치에 대한 더 많은 세부 사항과 보다 정확한 정량/기여를 얻습니다23.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
원고를 편집해 주신 Meghann K. Holt에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH/NIDCR 보조금 DE026461 및 DE028345와 텍사스 A&M 치과대학에서 Xiaofang Wang 박사에게 지원하는 스타트업 자금의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
| 20 × Objective/NA 0.9 | Leica | 507702 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| BD PrecisionGlide Needle | BD | REF 305111 | |
| Bezyl benzoate (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
| Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
| BRAND cavity slides | Millipore Sigma | BR475505 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Circulation Pump | VWR | 23609-170 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
| DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
| EdU | Carboynth | NE08701 | |
| Heparin | Miiilipore Sigma | H3149 | |
| Imaging System | Olympus | DP27 | |
| LAS X Software | Leica | ||
| Olympus Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
| PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
| Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide | Lumiprobe | D1330 | |
| TBS-10X | Cell Signaling Technology | 12498 | |
| TCS SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
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