Summary
Intravital fluorescensmikroskopi kan anvendes til at studere leukocyt-endotelinteraktioner og kapillærperfusion i realtid. Denne protokol beskriver metoder til at afbilde og kvantificere disse parametre i lungemikrocirkulationen ved hjælp af et vakuumstabiliseret lungebilleddannelsessystem.
Abstract
Intravital billeddannelse af leukocyt-endotelinteraktioner giver værdifuld indsigt i immunmedieret sygdom hos levende dyr. Undersøgelsen af akut lungeskade (ALI)/akut respiratorisk distress syndrom (ARDS) og andre respiratoriske patologier in vivo er vanskelig på grund af lungernes begrænsede tilgængelighed og iboende bevægelsesartefakter. Ikke desto mindre er der udviklet forskellige tilgange til at overvinde disse udfordringer. Denne protokol beskriver en metode til intravital fluorescensmikroskopi til undersøgelse af realtids leukocyt-endotelinteraktioner i lungemikrocirkulationen i en eksperimentel model af ALI. Et in vivo lungebilleddannelsessystem og 3D-trykt intravital mikroskopiplatform bruges til at sikre den bedøvede mus og stabilisere lungen, samtidig med at forvirrende lungeskade minimeres. Efter fremstilling anvendes widefield fluorescensmikroskopi til at studere leukocytadhæsion, leukocytvalsning og kapillærfunktion. Mens protokollen, der præsenteres her, fokuserer på billeddannelse i en akut model af inflammatorisk lungesygdom, kan den også tilpasses til at studere andre patologiske og fysiologiske processer i lungen.
Introduction
Intravital mikroskopi (IVM) er et nyttigt billeddannelsesværktøj til visualisering og undersøgelse af forskellige biofysiske processer in vivo. Lungen er meget udfordrende at afbilde in vivo på grund af dens lukkede placering, den skrøbelige karakter af dets væv og bevægelsesartefakter induceret af åndedræt og hjerteslag 1,2. Forskellige intravital mikroskopi (IVM) opsætninger er blevet udviklet til real-time billeddannelse af leukocyt-endotel interaktioner i lungemikrocirkulation for at overvinde disse udfordringer. Sådanne tilgange er baseret på kirurgisk eksponering og stabilisering af lungen til billeddannelse.
Dyr er typisk forberedt til lunge IVM ved kirurgiske procedurer. For det første intuberes og ventileres dyr, hvilket tillader kirurgisk udskæring af et brystvindue og efterfølgende indgreb for at stabilisere lungen til billeddannelse. En teknik involverer limning af parenchymen på et glasdæksel3, en procedure, der risikerer betydeligt fysisk traume på det afbildede væv. Mere avanceret er brugen af et vakuumsystem til at stabilisere lungen under et glasvindue4. Denne opsætning letter løs vedhæftning af lungeoverfladen til dækslippen via et reversibelt vakuum spredt over et stort lokalt område og udvider lungen, mens den stadig begrænser bevægelsen i x, y og z dimensioner4. Vakuumet påføres jævnt gennem en kanal, der omgiver opsætningens billeddannelsesområde og trækker vævet ind i et lavt konisk område, der vender mod billeddannelsesdæksler4. Gennem dette visningsvindue kan lungemikrocirkulationen studeres ved hjælp af forskellige optiske billeddannelsesmetoder.
Lung IVM muliggør kvantitativ billeddannelse af en lang række mikrocirkulatoriske parametre. Disse omfatter målinger såsom leukocytsporhastighed og længde5, røde blodlegemers strømningshastighed6 og iltning7, tumormetastaser8, sondringen mellem immuncelleunderpopulationer 9,10,11, visualisering af mikropartikler12, alveolær dynamik13,14, vaskulær permeabilitet15 og kapillærfunktion16 . Fokus her er på leukocytrekruttering og kapillærfunktion. Initiering af leukocytrekruttering i lungemikrocirkulationen involverer forbigående rullende interaktioner og faste klæbende interaktioner mellem leukocytter og endotelceller, som begge øges under inflammatoriske tilstande16,17. Typisk kvantificeres rullning af antallet af leukocytter, der passerer en operatordefineret referencelinje, mens adhæsion kvantificeres af antallet af leukocytter, der er immobile på endotelet16. Kapillærfunktionen kan også påvirkes i inflammatoriske tilstande, hvilket ofte resulterer i nedsat perfusion. Dette kan tilskrives flere faktorer, herunder en reduktion af deformerbarheden af røde blodlegemer18 og varieret ekspression af inducerbar NO-syntase af endotelceller, hvilket resulterer i patologisk rangering19. Typisk måles og rapporteres den samlede længde af perfunderede kapillærer pr. område som funktionel kapillærtæthed (FCD).
Undersøgelse af leukocytrekruttering i lungerne i realtid kræver mærkning af biologiske mål med fluorescerende farvestoffer eller fluorescerende mærkede antistoffer20. Alternativt kan forskellige transgene musestammer såsom lysozym M-grønt fluorescerende protein (LysM-GFP) mus bruges til at afbilde specifikke immuncelleundergrupper såsom neutrofiler21,22. De fluorescerende mærkede leukocytter kan derefter visualiseres ved hjælp af widefield fluorescensmikroskopi, konfokal mikroskopi eller multiphotonmikroskopi. Disse teknikker opnår kontrast ved at anvende specifikke excitationsbølgelængder og detektere udsendt fluorescens, samtidig med at de blokerer detektionen af excitationsbølgelængden og dermed fremhæver det mærkede objekt.
Eksisterende forskning vedrørende kvantificering af leukocytvalsning, adhæsion og funktionel kapillærtæthed i murin lungen har primært været afhængig af manuel videoanalyse. Dette er muliggjort gennem open source-software som Fiji 6,23, proprietær software som CapImage12 eller specialfremstillede billedbehandlingssystemer24. Omvendt muliggør forskellige proprietære softwareplatforme (f.eks. NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) automatiseret måling af en lang række andre fysiologiske parametre, herunder mange af dem, der tidligere er nævnt her 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Der er gjort vigtige observationer vedrørende patologien for akut lungeskade (ALI) og akut respiratorisk nødsyndrom (ARDS) ved hjælp af lunge IVM. ARDS er kendetegnet ved en lang række patofysiologiske processer i lungen, herunder lungeødem og alveolær skade forårsaget af dysfunktion af endotel- og epitelbarrieren25. Ved hjælp af en murinmodel har det vist sig, at sepsis-induceret ALI er forbundet med betydelige skadelige ændringer i immuncellehandel i lungemiljøet26. Neutrofiler rekrutteret til kapillærerne hos mus med sepsisinduceret ALI viste sig at hæmme mikrocirkulationen og derved øge hypoxi i ALI26. Derudover er IVM blevet brugt til at få indsigt i den underliggende reparationsmekanisme efter begyndelsen af ARDS27. Lung IVM har også været et værdifuldt redskab til at forstå patofysiologiske ændringer i forskellige obstruktiv lungesygdomme. For eksempel har visualisering af slimtransport i sygdomme som cystisk fibrose (CF) og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) lettet undersøgelsen af nye og eksisterende behandlinger for slimclearance28. Leukocythandel under disse forhold er også blevet analyseret17.
Denne protokol udvider den tilgang, der oprindeligt blev beskrevet af Lamm et al.29 for at studere leukocyt-endotelinteraktioner ved anvendelse af konventionel fluorescensmikroskopi. De beskrevne procedurer anvender et in vivo lungebilleddannelsessystem, som omfatter et 16,5 cm x 12,7 cm metalbase, mikromanipulator og vakuumbilleddannelsesvindue (figur 1). Systemet er monteret i en 20 cm x 23,5 cm 3D trykt platform (Supplemental File 1) for at give sikker fastgørelse til ventilatorrør og varmepude. Denne metode tilbyder reproducerbar og kvantificerbar billeddannelse af murin lungemikrocirkulation in vivo. Vigtige aspekter af det kirurgiske præparat samt korrekt udnyttelse af et vakuumstabiliseret lungebilleddannelsessystem forklares detaljeret. Endelig anvendes en eksperimentel model af ALI til at tilvejebringe repræsentativ billeddannelse og analyse af ændret leukocytvalsning, leukocytadhæsion og kapillærperfusion forbundet med inflammation. Anvendelsen af denne protokol bør lette yderligere vigtige undersøgelser af patofysiologiske ændringer i lungemikrocirkulationen under akutte sygdomstilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de procedurer, der er beskrevet her, blev udført med forudgående godkendelse af Dalhousie University Committee on Laboratory Animals (UCLA).
1. Forberedelse
- Lungebilleddannelsessystem: For at forberede vinduet skal du administrere et tyndt lag vakuumfedt til toppen af den ydre ring, samtidig med at du undgår forurening af vakuumkanalen. Placer en ren 8 mm glasdæksler på vinduet, og tryk forsigtigt ned for at skabe en tætning.
- Widefield Fluorescens Microscope: Udfør billeddannelse med et konventionelt widefield fluorescensmikroskop udstyret med et 20x / 0,40 langdistancemål og et sort / hvid ladningskoblet enhed (CCD) kamera med en billedhastighed på 25 FPS. Påfør et 530-550 nm båndpas excitationsfilter for at excitere Rhodamine-6G og et 460-490 nm båndpasfilter for at excitere Fluorescein Isothiocyanat (FITC).
- Vakuumsystem: Tilslut billeddannelsesvinduet til en vakuumpumpe udstyret med en digital manometer, der er i stand til at give 50-60 mmHg konstant sugning, som vist i supplerende figur 1. Kort sagt, tilslut billeddannelsesvinduet til pumpen gennem 1,0 mm I.D. polyethylenrør, 1,0 cm I.D. polyethylenrør, en vakuumkolbe og et inline 0,2 μm filter.
- Ventilator: Indstil en lille gnaverventilator til at give trykstyret ventilation med en hastighed og et volumen beregnet ud fra musens vægt. Der tilvejebringes et positivt slutudåndingstryk (PEEP) ved 5 cmH2O i forsøgets varighed, og måltrykket indstilles til 20 cmH2O.
- Bedøvelse: Brug et anæstesiafgivelsessystem med lavt flow til at prime en 5,0 ml sprøjte med 99,9% isofluran. Brug et affaldsgasrensningssystem for at minimere risikoen for indånding af kirurgen.
2. Anæstesi
- Placer en 20-25 g 12 uger gammel mandlig C57Bl /6 mus i anæstesi induktionskammeret. Når kammeret er sikkert lukket, skal du begynde induktion med isoflurangas i en koncentration på 3% og en strømningshastighed på 500 ml / min.
- Når musen er bedøvet (visualiseret ved nedsat respirationshastighed), skal du overføre den til intubationsstativet og fastgøre de øverste fortænder til den hængende sutur.
- Stram suturen for at fastgøre snuden inde i næsekeglen. Begynd gasstrømmen gennem næsekeglen i en koncentration på 2,5%.
- Bekræft tilstrækkelig dybde af anæstesi via tåspids, inden du går videre til næste trin.
3. Intubation
- Drej stativet således, at bagsiden af stativet og den dorsale side af musen vender mod kirurgen.
- Før spidsen af et 20 cm langt fiberoptisk kabel gennem en 20 G endotracheal kanyle og nedsænk spidsen i Lidocaine HCI (1%) for at lette kablets passage gennem strubehovedet.
- Brug stump tang til at løfte underkæben og forskyde tungen for at give klar passage ind i luftvejene.
- Indsæt et modificeret otoskop (~ 60 ° spekulomkreds fjernet), således at de øvre fortænder passer inden for spalten i spekulumet. Juster omfanget og tungepositionen, indtil epiglottis og stemmebånd er tydeligt synlige.
- Indsæt det fiberoptiske kabel fyldt med endotrachealkanylen gennem spalten i spekulumet og ind i strubehovedet. Brug små cirkulære bevægelser til at føre kablet gennem stemmebåndene og ind i luftrøret.
- Skub kanylen langs det fiberoptiske kabel, der passerer mellem stemmebåndene og ind i luftrøret.
4. Ventilation
- Hent musen fra intubationsstativet og placer den på en varmepude i højre laterale decubitusposition.
- Tilslut kanylen til ventilatorslangen, og start ventilatoren. Reducer bedøvelseskoncentrationen til 1,5%, og overvåg dybden ved at teste for pedalrefleks. Hvis refleksen vedvarer, øges koncentrationen trinvist til så højt som 2%.
- Anbring tåregel i musens øjne for at forhindre tørring.
- Brug medicinsk tape til at fastgøre kanylen til snuden. Brug mærkningstape til at fastgøre den højre forpote til varmepuden ved ca. klokken 9. Forlæng venstre bagpote caudalt og fastgør ved ca. klokken 6.
- Brug et kludbånd til at strække venstre forpot let til klokken 12 og fastgør den anden ende af båndet til toppen af IVM-platformen som vist i figur 2A (opretholdelse af let spænding her letter efterfølgende thoracotomi).
- Indsæt en rektal temperatursonde, og fastgør sonden ved at tape den til varmepuden. Placer et pulsoximeter på højre bagpote og fastgør til varmepuden, og pas på ikke at forstyrre cirkulationen.
- Når temperaturen er stabil ved 37,0 °C ± 0,1 °C, fortsættes thoracotomien.
5. Thoracotomi
- Steriliser thorax og mave med en 70% alkoholserviet. Påfør et let lag mineralolie for at dæmpe håret på venstre side af musen - fra brystbenet til rygsøjlen og fra skulderen til bunden af brystkassen.
- Med stump tang og lige saks skal du lave et lille langsgående snit nær bunden af brystkassen for at udsætte det underliggende muskellag.
- Når du bevæger dig ventralt, skal du bruge stump dissektion til at adskille epitel- og fedtvævet fra muskellaget. Cauterize eventuelle udsatte blodkar. Når risikoen for blodtab er blevet mindsket, forlænge det oprindelige snit ventralt indtil xiphoid-processen.
- Gentag denne proces dorsalt indtil ~ 5 mm lateralt til rygsøjlen.
- Flyt kranialt, brug stump dissektion til at udsætte ribbenburet. Cauterize eventuelle udsatte blodkar for at bevare hæmodynamisk stabilitet.
- Når risikoen for blodtab er blevet afbødet, skal snittet fra xiphoidprocessen udvides til axillaen.
- Gentag denne proces på den dorsale side af snittet indtil ~ 1 cm ringere end venstre øre.
- Brug hæmostatiske tang til at gribe det dissekerede epitel- og fedtvæv og placere det fri af det kirurgiske område (figur 2B).
- Injicer en opløsning af Rhodamin-6G (0,5 mg / ml; 1,5 ml / kg) til visualisering af leukocytter og bovin FITC-albumin (50 mg / ml; 1 ml / kg) til visualisering af kapillærperfusion via halevenen.
- Brug tandtang til at gribe ribbenet umiddelbart ringere end placeringen af lungebasen ved endeinspiration og trække ribben let tilbage for at trække ribben væk fra lungen. Skær ribben for at fremkalde en pneumothorax.
- Forlæng snittet sideværts langs den interkostale muskel i begge retninger, og pas på ikke at røre ved den udsatte lungeoverflade.
- Brug stump tang til at gribe fat i det næsthøjeste ribben og trække sig lidt tilbage for at lade lungen falde væk fra brystvæggen. Hvis lungen ikke løsner sig, skal du trykke brystvæggen let mod lungen for at få lungen til at klæbe til den underliggende pleura og dermed falde lettere væk.
- Fortsæt det oprindelige snit ventralt indtil brystbenet og kranialt, indtil lungens spids er udsat. Brug bomuldsapplikatorer og gasbind til at dæmpe enhver blødning, der opstår.
- Hæv brystkassen for at udsætte interkostale blodkar på det dorsale aspekt af brysthulen. Pas på ikke at beskadige lungen, cauterize det mest ringere interkostale fartøj tæt på rygsøjlen og derefter skære ribben. Flyt kranialt og ventralt, gentag, indtil en ca. 1 cm x 1,5 cm del af brystkassen er udskåret (figur 2C).
- Fjern overskydende væskeophobning i brysthulen via kapillærvirkning ved hjælp af små strimler gasbind.
- Mens du fortsætter med mikroskopi, skal du tillade ~ 5 minutter for intrapleural væske at sprede sig for en mere sikker grænseflade mellem lungen og billeddannelsesvinduet.
6. Mikroskopi
- Tænd for vakuumpumpen, og juster trykket til ~ 50-60 mmHg.
- Overfør IVM-platformen til mikroskopstadiet. Placer metalstolpen og mikromanipulatoren således, at billeddannelsesvinduet er direkte over den udsatte lunge, og vinduesarmen nærmer sig lungen fra ca. klokken 3.
- Brug mikromanipulatoren til forsigtigt at sænke billeddannelsesvinduet, indtil det klæber til og stabiliserer lungeoverfladen (figur 3A).
- Ved hjælp af 20x-målet og 460-490 nm bandpass excitationsfilteret skal du identificere en lungevenule baseret på det konvergente mønster af blodgennemstrømning. Centrer fartøjet i synsfeltet, og optag 30 s video.
- Skift til 530-550 nm båndpas excitationsfilter og optag 30 s video i samme synsfelt.
- Gentag det foregående trin, indtil fem lungevenler er blevet afbildet.
- Brug 460-490 nm båndpas excitationsfilteret til at identificere en lungearteriole baseret på det divergerende mønster af blodgennemstrømning. Centrer fartøjet i synsfeltet, og optag 30 s video.
- Skift til 530-550 nm båndpas excitationsfilter og optag 30 s video i samme synsfelt.
- Gentag det foregående trin, indtil fem lungearterioler er blevet afbildet.
- Brug 460-490 nm båndpas excitationsfilteret til at lokalisere et område med alveoler og kapillærer, der ikke gennemskæres af større fartøjer, og optag 30 s video.
- Skift til 530-550 nm båndpas excitationsfilter og optag 30 s video i samme synsfelt.
- Gentag det forrige trin, indtil fem kapillære regioner er blevet afbildet.
7. Eutanasi og rengøringsprotokol
- Fjern IVM-platformen fra mikroskopstadiet, og juster isofluranafgivelsen til 5% i 5 minutter for at aflive musen.
- Mens du venter, skal du kassere dækglasset og frakoble billedvinduet fra platformen. Rengør billeddannelsesvinduet med en lille børste, og brug en 30 G sprøjte indsat i kanalen til at skylle den flere gange med destilleret vand. Skyl derefter med 95% ethanol ved hjælp af vakuumpumpen.
- Når der er gået 5 minutter, skal du stoppe respiratoren og sikre fuldstændig eutanasi via cervikal dislokation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at illustrere resultater, der kunne opnås gennem denne protokol, blev akut lungeskade (ALI) induceret 6 timer før billeddannelse ved hjælp af en model af intranasal bakteriel lipopolysaccharid (LPS) instillation. Kort fortalt blev mus (n = 3) bedøvet med isofluran, og små dråber LPS fra Pseudomonas aeruginosa i steril saltvand (10 mg / ml) blev pipetteret i venstre naris i en dosis på 5 mg / kg. Dette blev sammenlignet med naive mus (n = 3; ingen intranasal administration).
Ved billeddannelse kan et vellykket kirurgisk præparat identificeres af flere faktorer. Lungen skal være relativt stabil med respiration, der forårsager cykliske frameshifts, der ikke er større end 25 μm. Alveoler skal være tydeligt synlige og kan udvise tidevandsudspiling/sammentrækning. Excitation ved blåt lys (450-490 nm bølgelængde) vil muliggøre visualisering af blodgennemstrømningsretning, og det kan være muligt at skelne individuelle røde blodlegemer (Supplerende film 1, Supplerende film 3 og Supplerende film 5). Leukocytter vil tydeligt kunne identificeres ved excitering ved grønt lys (530-560 nm bølgelængde, supplerende film 2, supplerende film 4 og supplerende film 6). Efter afslutning af billeddannelse og fjernelse af sugevinduet kan der være let blå mærker på lungeoverfladen, men ikke inden for det afbildede område, som vist i figur 3B.
Flere tekniske udfordringer kan forstyrre eksperimentel levedygtighed. Akkumulering af blod på lungeoverfladen vil kompromittere vakuumstabilisering og kan endda tilstoppe kanalen. For at undgå dette skal der udvises ekstrem forsigtighed under hvert kirurgisk trin. For højt vakuumtryk kan beskadige lungen og påvirke mikrocirkulationen. Dette kan identificeres ved alveolær stasis eller overdreven blå mærker på lungeoverfladen (figur 3C) og kan afhjælpes ved at reducere trykket fra vakuumpumpen. Desuden kan fejl i intravenøs fluoroforinjektion føre til dårlig visualisering af leukocythandel og blodgennemstrømning.
Efter afslutningen af protokollen blev blindet manuel analyse udført ved hjælp af Fiji21 på en måde tilpasset fra den tidligere litteratur28. Fem venuler, arterioler og kapillærområder af interesse (ROI'er) blev analyseret fra hvert dyr. Leukocytadhæsion i venler og arterioler blev defineret som antallet af celler, der forbliver klæbet til det vaskulære endotel under 30 s observation pr. Areal af endoteloverflade. Dette videresendes i celler/mm2. Leukocytadhæsion i kapillærer blev defineret som antallet af celler inden for ROI, der forbliver klæbet til det vaskulære endotel under 30 s observation pr. Samlet analyseret areal. Dette videresendes også i celler/mm2. Leukocytvalsning blev defineret som to gange antallet af celler, der passerede et referencepunkt i beholderen i løbet af 30 s observationsperiode. Fritflydende leukocytter blev udelukket ved at sammenligne passagehastigheden med strømmen af røde blodlegemer, og dette videresendes i celler / min. For at måle mikrocirkulatorisk perfusion blev FCD defineret som summen af længderne af røde blodlegemer-perfunderede kapillærer pr. Observationsområde. Dette videresendes i cm/cm2. Hver parameter rapporteres som en middelværdi for hvert dyr.
En almindelig tendens til leukocytrekruttering blev observeret i lungevenler med øget vedhæftning og rullning i LPS-behandlede mus versus naive (figur 4C, D). Denne tendens blev rekapituleret af arteriolær leukocytadhæsion, selv om begge niveauer af rullning og adhæsion var meget variable i den naive gruppe (figur 5C,D). Især resulterede LPS-administration i en betydelig stigning i leukocytadhæsion i lungekapillærRI'er (figur 6C). LPS-mus viste også en reduceret FCD versus naive mus (figur 7C). Disse virkninger i lungekapillærerne er i overensstemmelse med tidligere litteratur, der identificerer stigninger i immunceller pr. synsfelt og forstyrrelser af normal kapillærperfusion efter forskellige inflammatoriske stimuli 4,5,16.
Figur 1: Lungebilleddannelsessystem. Custom-order system inkluderer (1) en anodiseret metalbase, (2) billedvindue, (3) vakuumindløb, (4) mikromanipulator. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kirurgisk forberedelse. (A) Musen er fastgjort til IVM-platformen i højre laterale decubitusposition. (B) Brystkasse udsættes ved hjælp af stump dissektion for at bevare hæmodynamik. (C) Thoracotomi udføres for at udsætte venstre lunge. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Vakuumstabilisering. (A) Anvendelse af vakuumbilleddannelsesvindue stabiliserer lungeoverfladen. (B) Udnyttelse af vakuumtryk under 75 mmHg minimerer skader på lungen, især inden for det afbildede område. (C) Højere vakuumtryk kan forårsage betydelige blå mærker. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Leukocythandel med lungevenler. Excitation af rhodamin 6G tillader visualisering af vedhængende og rullende leukocytter. Skitserede områder repræsenterer analyserede dele af vaskulær endotel som bekræftet ved excitation af FITC-albumin i (A) naive og (B) LPS-behandlede mus. (C,D) Intranasal LPS-administration påvirker leukocytvalsning og adhæsion i lungevenler. Værdier er angivet som middel ± SD. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Leukocythandel med lungearterioler. Excitation af rhodamin 6G tillader visualisering af vedhængende og rullende leukocytter. Skitserede områder repræsenterer analyserede dele af vaskulær endotel som bekræftet ved excitation af FITC-albumin i (A) naive og (B) LPS-behandlede mus. (C,D) Intranasal LPS-administration påvirker leukocytvalsning og adhæsion i lungearterioler. Værdier er angivet som middel ± SD. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Vedhængende leukocytter i lungekapillærer. Excitation af rhodamin 6G tillader visualisering af leukocytter inden for RIE'er i (A) naive og (B) LPS-behandlede mus. (C) Intranasal LPS-administration påvirker leukocytadhæsion i LPS-behandlede mus. Værdier er angivet som middel ± SD. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Pulmonal kapillærfunktion. Excitation af FITC-albumin tillader visualisering af kapillær blodgennemstrømning inden for ROI'er i (A) naive og (B) LPS-behandlede mus. (C) Intranasal LPS-administration påvirker FCD i lungekapillærer. Værdier er angivet som middel ± SD. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil: Fil til 3D-printbar IVM-platform. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 1: Diagram over vakuumsystemet. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende film 1: Prøvevideo af blodgennemstrømning i lungevenule. Den grønne pil angiver retningen af blodgennemstrømningen. Klik her for at downloade denne film.
Supplerende film 2: Prøvevideo af leukocythandel i lungevenulen. Røde pile angiver vedhængende leukocytter i karret. Klik her for at downloade denne film.
Supplerende film 3: Prøvevideo af blodgennemstrømning i lungearteriolen. Den grønne pil angiver retningen af blodgennemstrømningen. Klik her for at downloade denne film.
Supplerende film 4: Prøvevideo af leukocythandel i lungearteriolen. Røde pile angiver vedhængende leukocytter i et kar. Klik her for at downloade denne film.
Supplerende film 5: Prøvevideo af blodgennemstrømning i lungekapillærer. Grønne pile angiver flere velvisualiserede områder af røde blodlegemer-perfunderede kapillærer. Klik her for at downloade denne film.
Supplerende film 6: Prøvevideo af leukocythandel i lungekapillærer. Røde pile angiver vedhængende leukocytter inden for synsfeltet. Klik her for at downloade denne film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen, der præsenteres her, kræver øvelse og opmærksomhed på et par kritiske trin. For det første er det vigtigt at forberede billeddannelsesvinduet, inden intubation og kirurgi påbegyndes. Brug en minimal mængde vakuumfedt til at belægge den ydre ring i billedvinduet, påfør dækglasset og testsugningen med en dråbe destilleret vand. Forberedelse af dette på forhånd forhindrer den udsatte lunge i at tørre ud under opsætningen ellers. Selvom det er muligt at skylle med varmt saltvand, kan det risikere at beskadige det skrøbelige lungevæv.
Efter intubation, mens musen overføres til IVM-platformen, kan kanylen lejlighedsvis blive forskudt. For at forhindre dette skal du overveje at binde kanylen til musens fortænder eller suturere den til huden omkring munden. Ved anvendelse af trykstyret ventilation skal tidevandsvolumenet overvåges nøje under hele proceduren. Det skal forblive stabilt ved ca. 0,20 ml, da signifikant lavere værdier (f.eks. ~ 0,10 ml) kan indikere enkelt lungeventilation. Hvis dette sker, kan lidt tilbagetrækning af endotrachealkanylen løse problemet. Brug af inhalationsanæstesi (isofluran) letter kontrol af bedøvelsesdybden, mens musen ventileres. Andre anæstesimidler (f.eks. intravenøs ketamin/xylazin10,11) er blevet anvendt af andre laboratorier, og de har hver især deres respektive fordele og ulemper.
Under operationen anvendes stump dissektion for at minimere risikoen for at afskære blodkar. Dette er af særlig betydning ved dissekering af det tykke og stærkt vaskulariserede fedtvæv nær skulderen. Resektion af brystkassen kræver både hastighed og nøjagtighed. Varmen fra cauterizeren er intens nok til at forbrænde lungen, hvis den bruges overdrevent. Når brystkassen reseceres, skal der være tomt mellemrum mellem lungen og brystvæggen. Hvis lungen klæber til brystvæggen, vil let tryk ned på ydersiden af ribbenburet tilskynde til vedhæftning til den underliggende parietale pleura. Alternativt kan du bruge en stump nål til at injicere en lille mængde varm saltvand mellem lungen og brystkassen for at lette frigivelsen. Placering af vinduesarmen ved klokken 3 anbefales for at undgå uønsket tryk på ribbenene under billeddannelse (figur 3A). Det vil også efterlade mere afstand mellem mikromanipulatoren og mikroskopmålet, hvilket giver lettere adgang til manipulationer. Når du sænker billeddannelsesvinduet, er det vigtigt at målrette mod det centrale område af lungen, da kontakt med kanten vil resultere i en utilstrækkelig tætning og overdreven bevægelsesartefakt under billeddannelse. Også flere forsøg på at sænke vinduet kan beskadige lungen. Ligeledes vil cyklusser af løsrivelse og restabilisering bidrage til lungeskade og kan kompromittere eksperimentel nøjagtighed. Når det udføres korrekt, er det præparat, der præsenteres her, imidlertid stabilt nok til at muliggøre intravital billeddannelse med høj opløsning med et 20x mål.
En streng rengøringsprotokol er nødvendig for at forhindre forurening og blokering af vakuumkanalen i billeddannelsesvinduet. Brug af en 30 G nål umiddelbart efter forsøg til gentagne gange at skylle med destilleret vand er effektiv til fjernelse af de fleste forurenende stoffer. Dette efterfølges af en skylning med koncentreret ethanol og en endelig skylning med destilleret vand, inden den fastgøres til vakuumledningen for at fjerne fugt. Brug af acetone eller stærke vaskemidler kan være tilstrækkeligt til at løse alvorlige blokeringer, hvis de opstår.
Især anvender denne protokol en højere aflæsning af vakuumtryk i forhold til nogle andre rapporterede metoder 4,11, og dette kan give anledning til bekymring for skade på lungevæv. En vigtig forskel er imidlertid, at den digitale måler, der bruges her, kun måler tryk ved vakuumpumpen. Dette tryk leveres gennem smalle slanger og den ekstremt smalle kanal i selve billeddannelsesvinduet inden distribution over et større overfladeareal af lungen. Som sådan blev der ikke observeret tegn på skade på den afbildede region i disse eksperimenter efter intravitale sessioner. Desuden udviste afbildede alveoler tidevandsudspiling og sammentrækning, hvilket indikerer, at dette fysiologiske fænomen ikke blev signifikant forstyrret.
På trods af den stigende popularitet af lunge IVM som et værktøj til at studere sygdom in vivo, er der begrænsninger for denne teknik. For det første inducerer operationens invasive og terminale karakter en ikke-ubetydelig effekt på musens fysiologiske tilstand og begrænser proceduren til en enkelt billeddannelsessession. Det skal dog bemærkes, at der er udviklet flere langsgående lunge IVM-tilgange30. For det andet kan brugen af mekanisk ventilation fremkalde en grad af respiratorassocieret lungeskade (VALI)31, selv om dette er begrænset af procedurens korte varighed. For det tredje kan kontakt mellem den viscerale pleura og glasdæksler og påføring af vakuumtryk resultere i ændret mikrovaskulær blodgennemstrømning. Endelig er måske den mest betydningsfulde begrænsning af denne tilgang, at billeddannelse er begrænset til subpleurale alveoler i ikke-afhængige lungeregioner, som ikke er repræsentative for hele lungen32.
Sammenfattende kan denne protokol bruges til at studere leukocyt-endotelinteraktioner i lungemikrovaskulaturen ved anvendelse af intravital fluorescensmikroskopi. Mens disse eksperimenter anvender endotoksininduceret lungeskade, en akut model, der blev valgt på baggrund af tidligere forskning, kan denne protokol også tilpasses til at studere andre patologiske og fysiologiske processer i lungen. Desuden er lungebilleddannelsessystemet, der anvendes her, anvendeligt til en række mikroskopimetoder, og billeddannelsesvinduet er stort nok til at rumme oliesænkningsmål med høj numerisk blænde. Således bør de beskrevne procedurer lette yderligere forskning i virkningen af forskellige sygdomstilstande på lungemikrocirkulationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Kamala D. Patel er præsident og medstifter af Luxidea, den virksomhed, hvorfra billeddannelsesvinduet, der blev brugt i dette eksperiment, blev købt.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Pina Colarusso, som har ydet betydelig ekspertise i redigering og revision af dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 1 mL syringe |
| ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Blunt forceps |
| Albumin-Fluorescein Isothiocyanate | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumin |
| Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Alcohol wipe |
| AVDC110 Advanced Digital Video Converter | Canopus | 00631069602029 | Digital video converter |
| B/W - CCD - Camera | Horn Imaging | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Cauterizer |
| C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories International | C57BL/6NCrl | C57BL/6 Mice |
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | Cotton applicator |
| CS-8R 8mm Round Glass Coverslip | Warner Instruments | 64-0701 | Glass coverslip |
| Digital Pressure Gauge | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM&V | Digital Pressure Gauge |
| Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope | Dr. Mom Otoscopes | 1001 | Otoscope |
| Ethyl Alchohol 95% Vol | Commercial Alcohols | P016EA95 | 95% ethanol |
| Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | Scissors |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | Fisher Scientific | 1590110 | Labeling tape |
| Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Vacuum pump |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Hemostatic forceps |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | DC976VF | Vacuum grease |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurane |
| LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaine HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Designed for intravital microscopy of the lung |
| Mineral Oil | Teva Canada | 00485802 | Mineral oil |
| Mouse Endotracheal Intubation Kit | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable |
| MST49 Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | 10 450 022 | Fluorescence Microscope |
| N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective | Leica Microsystems | 566035 | 20x objective |
| Non-Woven Sponges 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gauze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI | 3D printer |
| Oxygen, Compressed | Linde Canada Inc. | Oxygen | |
| PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | 30 G needle |
| Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Vacuum flask |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Secure Soft Cloth Medical Tape - 3" | Primed | PM5-630709 | Cloth tape |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD | Dow Corning | 602-205 | 1.0 mm I.D. polyethylene tubing |
| Somnosuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-module | Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter |
| Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth | World Precision Instruments | 501216 | Toothed forceps |
| Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) | 3M | 7000002795 | Medical tape |
| Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | 1.0 cm I.D. polyethylene tubing |
| Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | Inline 0.2µm filter |
References
- Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).
- Gaertner, M., et al. Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Looney, M., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).
- Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice. IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).
- Blueschke, G., et al. Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation. Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
- Tschernig, T., et al. Direct visualisation of microparticles in the living lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).
- Mertens, M., et al. Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse. Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).
- Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy. Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).
- Margraf, A., et al. 6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice. Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).
- Roller, J., et al. Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice. Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).
- Marques, P., et al. Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease. Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).
- Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).
- Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
- Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Orthgiess, J., et al. Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research. European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).
- Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Amato, M. B. P., et al. Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).
- Looney, M. R., Bhattacharya, J.
