Summary
A microscopia de fluorescência intravital pode ser utilizada para estudar interações leucócito-endotelial e perfusão capilar em tempo real. Este protocolo descreve métodos para imagem e quantificação desses parâmetros na microcirculação pulmonar usando um sistema de imagem pulmonar estabilizado a vácuo.
Abstract
A imagem intravital das interações leucócito-endotelial oferece insights valiosos sobre doenças imunomediadas em animais vivos. O estudo da lesão pulmonar aguda (ALI)/síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS) e outras patologias respiratórias in vivo é difícil devido à acessibilidade limitada e artefatos de movimento inerentes aos pulmões. No entanto, várias abordagens foram desenvolvidas para superar esses desafios. Este protocolo descreve um método para microscopia de fluorescência intravital para estudar interações leucócito-endoteliais em tempo real na microcirculação pulmonar em um modelo experimental de ALI. Um sistema de imagem pulmonar in vivo e uma plataforma de microscopia intravital impressa em 3D são usados para proteger o camundongo anestesiado e estabilizar o pulmão, minimizando a lesão pulmonar confusa. Após a preparação, a microscopia de fluorescência widefield é usada para estudar a adesão de leucócitos, rolamento de leucócitos e função capilar. Embora o protocolo aqui apresentado se concentre na imagem em um modelo agudo de doença pulmonar inflamatória, ele também pode ser adaptado para estudar outros processos patológicos e fisiológicos no pulmão.
Introduction
A microscopia intravital (IVM) é uma ferramenta útil de imagem para visualizar e estudar vários processos biofísicos in vivo. O pulmão é altamente desafiador para a imagem in vivo devido à sua localização fechada, a natureza frágil de seu tecido, e artefatos de movimento induzidos pela respiração e batimentos cardíacos 1,2. Várias configurações de microscopia intravital (IVM) foram desenvolvidas para imagens em tempo real de interações leucócito-endotelial em microcirculação pulmonar para superar esses desafios. Tais abordagens baseiam-se na exposição cirúrgica e estabilização do pulmão para imagem.
Os animais são tipicamente preparados para o IVM pulmonar por procedimentos cirúrgicos. Primeiro, os animais são entubados e ventilados, o que permite a excisão cirúrgica de uma janela torácica e intervenções subsequentes para estabilizar o pulmão para imagem. Uma técnica envolve colar o parenchyma em uma tampa de vidro3, procedimento que corre o risco de trauma físico significativo no tecido imageado. Mais avançado é a utilização de um sistema de vácuo para estabilizar o pulmão sob uma janela de vidro4. Esta configuração facilita a adesão frouxa da superfície pulmonar ao deslizamento de cobertura através de um vácuo reversível espalhado sobre uma grande área local e expande o pulmão enquanto ainda limita o movimento nas dimensões x, y e z4. O vácuo é aplicado uniformemente através de um canal ao redor da área de imagem da configuração e puxa o tecido para uma região cônica rasa de frente para o deslizamento de grau de imagem4. Através desta janela de visualização, a microcirculação pulmonar pode ser estudada utilizando várias modalidades de imagem óptica.
O IVM pulmonar permite imagens quantitativas de uma infinidade de parâmetros microcirculatórios. Estes incluem medidas como velocidade da pista leucócito e comprimento5, velocidade de fluxo de glóbulos vermelhos6 e oxigenação7, metástasestumorais 8, distinção de subpopulações de células imunes 9,10,11, visualização de micropartículas12, dinâmica alveolar13,14, permeabilidade vascular15, e função capilar16 . O foco aqui é o recrutamento de leucócitos e a função capilar. O início do recrutamento de leucócitos na microcirculação pulmonar envolve interações rolantes transitórias e interações adesivas firmes entre leucócitos e células endoteliais, ambas aumentadas sob condições inflamatórias16,17. Normalmente, a rolagem é quantificada pelo número de leucócitos que passam por uma linha de referência definida pelo operador, enquanto a adesão é quantificada pelo número de leucócitos que são imóveis no endotélio16. A função capilar também pode ser afetada em estados inflamatórios, muitas vezes resultando em diminuição da perfusão. Isso pode ser atribuído a vários fatores, incluindo uma redução da deformabilidade dos glóbulos vermelhos18 e expressão variegada de sinthase indutível por células endoteliais resultando em desvio patológico19. Normalmente, o comprimento agregado de capilares perfusados por área é medido e relatado como densidade capilar funcional (FCD).
Estudar o recrutamento de leucócitos nos pulmões em tempo real requer rotular alvos biológicos com corantes fluorescentes ou anticorpos fluorescentes20. Alternativamente, várias cepas de camundongos transgênicos, como camundongos lysozyme M-green fluorescente (LysM-GFP), podem ser utilizadas para imagem de subconjuntos de células imunes específicas, como os neutrófilos21,22. Os leucócitos com rótulo fluorescente podem então ser visualizados usando microscopia de fluorescência widefield, microscopia confocal ou microscopia multifotífera. Essas técnicas conseguem o contraste utilizando comprimentos de onda de excitação específicos e detectando fluorescência emitida ao mesmo tempo em que bloqueiam simultaneamente a detecção do comprimento de onda de excitação, destacando assim o objeto rotulado.
Pesquisas existentes sobre a quantificação do rolamento de leucócitos, adesão e densidade capilar funcional no pulmão murino basearam-se principalmente na análise manual de vídeo. Isso é possível através de software de código aberto, como o Fiji 6,23, software proprietário como o CapImage12 ou sistemas de processamento de imagempersonalizados 24. Por outro lado, várias plataformas de software proprietárias (por exemplo, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) permitem a medição automatizada de uma ampla gama de outros parâmetros fisiológicos, incluindo muitos dos mencionados anteriormente aqui 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Observações importantes têm sido feitas em relação à patologia da lesão pulmonar aguda (ALI) e síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS) utilizando IVM pulmonar. A ARDS é caracterizada por uma série de processos fisiodicosiológicos no pulmão, incluindo edema pulmonar e danos alveolares causados pela disfunção do endotélio e barreira epitelial25. Usando um modelo murino, descobriu-se que a ALI induzida pela sepse está associada a mudanças prejudiciais significativas no tráfico de células imunes no ambiente pulmonar26. Os neutrófilos recrutados para os capilares de camundongos com ALI induzido pela sepse foram encontrados para impedir a microcirculação, aumentando assim a hipóxia em ALI26. Além disso, o IVM tem sido usado para obter insights sobre o mecanismo de reparo subjacente após o início do ARDS27. O IVM pulmonar também tem sido uma ferramenta valiosa na compreensão de alterações fisiodicosiológicas em várias doenças pulmonares obstrutivas. Por exemplo, a visualização do transporte de mucosa em doenças como fibrose cística (CF) e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) tem facilitado o estudo de tratamentos novos e existentes para a liberação de mucosas28. O tráfico de leucócitos nessas condições também foi analisado, assim como17.
Este protocolo expande a abordagem inicialmente descrita por Lamm et al.29 para estudar interações leucócito-endotelial usando microscopia de fluorescência convencional. Os procedimentos descritos empregam um sistema de imagem pulmonar in vivo , que inclui uma base metálica de 16,5 cm x 12,7 cm, micromanipulador e janela de imagem a vácuo (Figura 1). O sistema é montado em uma plataforma impressa 3D de 20 cm x 23,5 cm (Arquivo Suplementar 1) para fornecer fixação segura para o tubo do ventilador e almofada de aquecimento. Este método oferece imagens reprodutíveis e quantificáveis de microcirculação pulmonar murina em vivo. Aspectos importantes da preparação cirúrgica, bem como a utilização adequada de um sistema de imagem pulmonar estabilizado a vácuo são explicados em detalhes. Finalmente, um modelo experimental de ALI é usado para fornecer imagens representativas e análises de rolagem de leucócitos alterados, aderência leucócito e perfusão capilar associada à inflamação. O uso deste protocolo deve facilitar investigações mais importantes sobre alterações fisiofisiológicas na microcirculação pulmonar durante estados com doenças agudas.
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Protocol
Todos os procedimentos aqui descritos foram realizados com aprovação prévia pelo Comitê de Animais de Laboratório da Universidade de Dalhousie (UCLA).
1. Preparação
- Sistema de imagem pulmonar: Para preparar a janela, administre uma fina camada de graxa de vácuo no topo do anel externo, evitando a contaminação do canal de vácuo. Coloque uma tampa de vidro limpa de 8 mm na janela e pressione suavemente para baixo para criar uma vedação.
- Microscópio de fluorescência widefield: Realize imagens com um microscópio de fluorescência widefield convencional equipado com um objetivo de distância de trabalho de 20x/0,40 e uma câmera de dispositivo acoplado a carga (CCD) em preto e branco com uma taxa de quadro de 25 FPS. Aplique um filtro de excitação de bandpass de 530-550 nm para excitar Rhodamine-6G e um filtro de bandpass de 460-490 nm para excitar isothiocyanato fluoresceína (FITC).
- Sistema de vácuo: Conecte a janela de imagem a uma bomba de vácuo equipada com um medidor de pressão digital capaz de fornecer sucção constante de 50-60 mmHg, como mostrado na Figura Suplementar 1. Em suma, conecte a janela de imagem à bomba através de tubos de polietileno de 1,0 mm, tubos de polietileno de 1,0 cm, um frasco de vácuo e um filtro de 0,2 μm inline.
- Ventilador: Configure um pequeno ventilador de roedores para fornecer ventilação controlada por pressão a uma taxa e volume calculado com base no peso do mouse. Forneça uma pressão final-expiratória positiva (PEEP) a 5 cmH2O durante a duração do experimento, e defina a pressão-alvo para 20 cmH2O.
- Anestésico: Utilizando um sistema de entrega de anestesia de baixo fluxo, prime uma seringa de 5,0 mL com 99,9% de isoflurane. Use um sistema de limpeza de gás para minimizar o risco de inalação pelo cirurgião.
2. Anestesia
- Coloque um rato C57Bl/6 masculino de 20-25 g de 12 semanas na câmara de indução da anestesia. Com a câmara bem fechada, comece a indução com gás isoflurane a uma concentração de 3% e uma vazão de 500 mL/min.
- Uma vez que o mouse é anestesiado (visualizado pela taxa de respiração lenta), transfira-o para o suporte de intubação e fixe os incisivos superiores à sutura pendurada.
- Aperte a sutura para fixar o focinho dentro do cone do nariz. Comece a fluir pelo cone do nariz com uma concentração de 2,5%.
- Confirme a profundidade adequada da anestesia através da beliscão do dedo do dedo do dedo antes de passar para o próximo passo.
3. Intubação
- Gire a posição de tal forma que a parte de trás do suporte e o lado dorsal do mouse face em direção ao cirurgião.
- Passe a ponta de um cabo de fibra óptica de 20 cm através de uma cânula endotraqueal de 20 G e submersa na ponta em Lidocaína HCl (1%) para facilitar a passagem do cabo através da laringe.
- Usando fórceps contundentes, levante a mandíbula inferior e desloque a língua para fornecer uma passagem clara para o trato respiratório.
- Insira um otoscópio modificado (~60° de circunferência espéculo removido) de tal forma que os incisivos superiores se encaixem dentro da lacuna no espéculo. Ajuste o escopo e a posição da língua até que a epiglote e as cordas vocais estejam claramente visíveis.
- Insira o cabo de fibra óptica carregado com a cânula endotraqueal através da abertura no espéculo e na laringe. Usando pequenos movimentos circulares, passe o cabo através das cordas vocais e para dentro da traqueia.
- Empurre a cânula ao longo do cabo de fibra óptica, passando entre as cordas vocais e para dentro da traqueia.
4. Ventilação
- Recupere o mouse do suporte de intubação e coloque-o em uma almofada de aquecimento na posição de decúbito lateral direito.
- Conecte a cânula ao tubo do ventilador e inicie o ventilador. Reduza a concentração anestésico para 1,5% e monitore a profundidade testando o reflexo do pedal. Se o reflexo persistir, aumente a concentração incrementalmente para até 2%.
- Coloque gel de lágrima nos olhos do rato para evitar a secagem.
- Usando fita médica, proteja a cânula até o focinho. Usando fita de rotulagem, fixe a prevada direita na almofada de aquecimento na posição das 9 horas. Estenda a pata traseira esquerda caudally e fixe na posição das 6 horas.
- Usando uma fita de pano, estique levemente a prensa esquerda até a posição das 12 horas e fixe a outra extremidade da fita até o topo da plataforma IVM, como mostrado na Figura 2A (manter uma ligeira tensão aqui facilita a toracotomia subsequente).
- Insira uma sonda de temperatura retal e fixe a sonda gravando-a na almofada de aquecimento. Coloque um oxímetro de pulso na pata traseira direita e fixe na almofada de aquecimento, tomando cuidado para não interromper a circulação.
- Uma vez que a temperatura esteja estável a 37,0 °C ± 0,1 °C, prossiga para realizar a toracotomia.
5. Toracotomia
- Esterilize o tórax e o abdômen com 70% de álcool. Aplique uma camada leve de óleo mineral para umedecer o cabelo do lado esquerdo do rato-do-esterno para a coluna vertebral e do ombro para o fundo da caixa torácica.
- Com força-tarefas cegas e tesouras retas, faça uma pequena incisão longitudinal perto da parte inferior da caixa torácica para expor a camada muscular subjacente.
- Movendo-se ventrally, use dissecção contundente para separar o tecido epitelial e adiposo da camada muscular. Cauterize qualquer vaso sanguíneo exposto. Uma vez mitigado o risco de perda de sangue, estenda a incisão original ventrally até o processo xiphoide.
- Repita este processo dorsalmente até ~5 mm lateralmente à coluna vertebral.
- Movendo-se cranialmente, use dissecção contundente para expor a caixa torácica. Cauterize qualquer vaso sanguíneo exposto para preservar a estabilidade hemodinâmica.
- Uma vez mitigado o risco de perda de sangue, amplie a incisão do processo xifoide até a axila.
- Repita este processo no lado dorsal da incisão até ~1 cm inferior à orelha esquerda.
- Utilizando fórceps hemostáticos, segure o tecido epitelial e adiposo dissecado e coloque-se afastado da área cirúrgica (Figura 2B).
- Injete uma solução de Rhodamine-6G (0,5 mg/mL; 1,5 mL/kg) para visualização de leucócitos e fitc-albumina bovina (50 mg/mL; 1 mL/kg) para visualização de perfusão capilar pela veia traseira.
- Usando fórceps dentados, segure a costela imediatamente inferior à posição da base do pulmão na inspiração final e retraia levemente para puxar a costela para longe do pulmão. Corte a costela para induzir um pneumotórax.
- Estenda a incisão lateralmente ao longo do músculo intercostal em ambas as direções, tomando cuidado para não tocar na superfície pulmonar exposta.
- Usando fórceps contundentes, segure a próxima costela mais alta e retraia levemente para permitir que o pulmão caia da parede do peito. Se o pulmão não se soltar, pressione levemente a parede torácica contra o pulmão para fazer com que o pulmão adera à pleura subjacente e, assim, caia mais facilmente.
- Continue a incisão original ventrally até que o esterno e cranialmente até que o ápice do pulmão seja exposto. Use aplicadores de algodão e gaze para atenuar qualquer sangramento que surgir.
- Levante a caixa torácica para expor os vasos sanguíneos intercostais no aspecto dorsal da cavidade torácica. Tomando cuidado para não danificar o pulmão, cauterizar o vaso intercostal mais inferior perto da coluna vertebral, e depois cortar a costela. Movendo-se cranialmente e ventrally, repita até que uma porção de aproximadamente 1 cm x 1,5 cm da caixa torácica seja extirpada (Figura 2C).
- Remova qualquer acúmulo de fluido excessivo na cavidade torácica através de ação capilar usando pequenas tiras de gaze.
- Enquanto prossegue para a microscopia, permita que ~5 min para o fluido intrapleural se dissipe para uma interface mais segura entre o pulmão e a janela de imagem.
6. Microscopia
- Ligue a bomba de vácuo e ajuste a pressão para ~50-60 mmHg.
- Transfira a plataforma IVM para o estágio do microscópio. Posicione o poste de metal e o micromanipulador de tal forma que a janela de imagem esteja diretamente acima do pulmão exposto e o braço da janela se aproxime do pulmão da posição das 3 horas.
- Usando o micromanipulador, abaixe cuidadosamente a janela de imagem até que adere e estabilize a superfície pulmonar (Figura 3A).
- Utilizando o objetivo de 20x e o filtro de excitação de bandpass de 460-490 nm, identifique um venule pulmonar baseado no padrão convergente do fluxo sanguíneo. Centralize a embarcação no campo de visão e grave 30 s de vídeo.
- Mude para o filtro de excitação do bandpass de 530-550 nm e grave 30 s de vídeo no mesmo campo de visão.
- Repita a etapa anterior até que cinco venules pulmonares tenham sido imagens.
- Usando o filtro de excitação de bandpass de 460-490 nm, identifique uma arteriola pulmonar baseada no padrão divergente do fluxo sanguíneo. Centralize a embarcação no campo de visão e grave 30 s de vídeo.
- Mude para o filtro de excitação do bandpass de 530-550 nm e grave 30 s de vídeo no mesmo campo de visão.
- Repita a etapa anterior até que cinco artérias pulmonares tenham sido imagens.
- Usando o filtro de excitação de bandpass de 460-490 nm, localize uma região de alvéolos e capilares não interceptados por vasos maiores e grave 30 s de vídeo.
- Mude para o filtro de excitação do bandpass de 530-550 nm e grave 30 s de vídeo no mesmo campo de visão.
- Repita a etapa anterior até que cinco regiões capilares tenham sido imagens.
7. Eutanásia e protocolo de limpeza
- Remova a plataforma IVM do estágio do microscópio e ajuste a entrega de isoflurane para 5% por 5 minutos para eutanásia do mouse.
- Enquanto estiver esperando, descarte o vidro de cobertura e desconecte a janela de imagem da plataforma. Limpe a janela de imagem com uma escova pequena e use uma seringa de 30 G inserida no canal para lavá-la várias vezes com água destilada. Em seguida, lave com 95% de etanol usando a bomba de vácuo.
- Depois de 5 min decorrido, pare o ventilador e garanta a eutanásia completa através da luxação cervical.
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Representative Results
Para ilustrar os resultados alcançáveis através deste protocolo, a lesão pulmonar aguda (ALI) foi induzida 6 h antes da imagem usando um modelo de lipopolilcarida bacteriana intranasal (LPS) de instilação. Resumidamente, os camundongos (n = 3) foram anestesiados com isoflurano, e pequenas gotículas de LPS de Pseudomonas aeruginosa em solução salina estéril (10 mg/mL) foram pipetadas na naris esquerda em uma dosagem de 5 mg/kg. Isso foi comparado com camundongos ingênuos (n = 3; sem administração intranasal).
Ao fotografar, uma preparação cirúrgica bem sucedida é identificável por vários fatores. O pulmão deve ser relativamente estável com a respiração causando mudanças cíclicas de quadros não superiores a 25 μm. Os alvéolos devem ser claramente visíveis e podem apresentar distensão/contração das marés. A excitação por luz azul (comprimento de onda de 450-490 nm) permitirá a visualização da direcionalidade do fluxo sanguíneo, e pode ser possível distinguir glóbulos vermelhos individuais (Filme Suplementar 1, Filme Suplementar 3 e Filme Suplementar 5). Leucócitos serão claramente identificáveis após a excitação por luz verde (comprimento de onda de 530-560 nm, filme suplementar 2, filme suplementar 4 e filme suplementar 6). Após a conclusão da imagem e remoção da janela de sucção, pode haver leves contusões na superfície pulmonar, embora não dentro da área imagem, como mostrado na Figura 3B.
Vários desafios técnicos podem interferir na viabilidade experimental. O acúmulo de sangue na superfície pulmonar comprometerá a estabilização do vácuo e pode até entupir o canal. Para evitar isso, deve-se ter extrema cautela durante cada etapa cirúrgica. A pressão excessivamente alta do vácuo pode danificar o pulmão e afetar a microcirculação. Isso pode ser identificável por estase alveolar ou contusões excessivas na superfície pulmonar (Figura 3C) e pode ser remediado reduzindo a pressão da bomba de vácuo. Além disso, erros na injeção de fluoróforo intravenoso podem levar à má visualização do tráfico de leucócitos e do fluxo sanguíneo.
Após a conclusão do protocolo, a análise manual cega foi realizada utilizando-se fiji21 de forma adaptada da literatura anterior28. Foram analisadas cinco venules, artérias e regiões capilares de interesse (ROIs) de cada animal. A adesão de leucócitos em venules e arterioles foi definida como o número de células que permanecem aderidas ao endotélio vascular durante 30 s de observação por área de superfície endotelial. Isto é retransmitido em células/mm2. A adesão de leucócitos em capilares foi definida como o número de células dentro do ROI que permanecem aderidas ao endotélio vascular durante 30 s de observação por área total analisada. Isso também é retransmitido em células/mm2. O rolamento de leucócitos foi definido como o dobro do número de células que passagem um ponto de referência no vaso durante o período de observação dos anos 30. Leucócitos de fluxo livre foram excluídos comparando a velocidade de passagem com a do fluxo de glóbulos vermelhos, e isso é retransmitido em células/min. Para medir a perfusão microcirculatória, a FCD foi definida como a soma dos comprimentos dos capilares perfusados por área de observação. Isto é retransmitido em cm/cm2. Cada parâmetro é relatado como um valor médio para cada animal.
Uma tendência comum de recrutamento de leucócitos foi observada em venules pulmonares, com aumento da adesão e rolagem em camundongos tratados com LPS versus ingênuos (Figuras 4C,D). Essa tendência foi recapitulada pela adesão arteriolar leucócito, embora ambos os níveis de rolagem e adesão tenham sido altamente variáveis no grupo ingênuo (Figuras 5C,D). Notavelmente, a administração do LPS resultou em um aumento substancial da adesão de leucócitos em ROIs capilares pulmonares (Figura 6C). Os ratos LPS também demonstraram uma FCD reduzida versus ratos ingênuos (Figura 7C). Esses efeitos dentro dos capilares pulmonares são consistentes com a literatura anterior identificando aumentos nas células imunes por campo de visão e desarranjo da perfusão capilar normal após vários estímulos inflamatórios 4,5,16.
Figura 1: Sistema de imagem pulmonar. O sistema de encomenda personalizada inclui (1) uma base metálica anodizada, (2) janela de imagem, (3) entrada a vácuo, (4) micromanipulador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação cirúrgica. (A) O mouse é fixado à plataforma IVM na posição de decúbito lateral direito. (B) A caixa torácica é exposta usando dissecção contundente para preservar a hemodinâmica. (C) A toracotomia é realizada para expor o pulmão esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Estabilização a vácuo. (A) A aplicação da janela de imagem a vácuo estabiliza a superfície pulmonar. (B) A utilização de pressões de vácuo abaixo de 75 mmHg minimiza danos ao pulmão, particularmente dentro da área imagem. (C) Pressões de vácuo mais altas podem causar contusões significativas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Tráfico de leucócitos em venules pulmonares. A excitação da rhodamina 6G permite a visualização de leucócitos adeptos e rolantes. As áreas delineadas representam porções analisadas de endotélio vascular confirmadas pela excitação do FITC-albumin em (A) ingênuos e (B) camundongos tratados com LPS. (C,D) A administração intranasal do LPS impacta o rolamento de leucócitos e a adesão em venules pulmonares. Valores são dados como ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Tráfico de leucócitos em artérias pulmonares. A excitação da rhodamina 6G permite a visualização de leucócitos adeptos e rolantes. As áreas delineadas representam porções analisadas de endotélio vascular confirmadas pela excitação do FITC-albumin em (A) ingênuos e (B) camundongos tratados com LPS. (C,D) A administração intranasal do LPS impacta o rolamento de leucócitos e a adesão em artérias pulmonares. Valores são dados como ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Leucócitos adeptos em capilares pulmonares. A excitação da rhodamina 6G permite a visualização de leucócitos dentro de ROIs em (A) camundongos ingênuos e (B) tratados com LPS. (C) A administração do LPS intranasal impacta a adesão de leucócitos em camundongos tratados com LPS. Valores são dados como ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Função capilar pulmonar. A excitação do FITC-albumin permite a visualização do fluxo sanguíneo capilar dentro de ROIs em (A) ratos ingênuos e (B) tratados com LPS. (C) A administração do LPS intranasal impacta a FCD em capilares pulmonares. Valores são dados como ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar: Arquivo para plataforma IVM 3D imprimível. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar 1: Diagrama do sistema de vácuo. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Filme suplementar 1: Amostra de vídeo de fluxo sanguíneo na venule pulmonar. O Arqueiro Verde denota a direção do fluxo sanguíneo. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme suplementar 2: Vídeo amostra de tráfico de leucócitos na venule pulmonar. Flechas vermelhas denotam leucócitos adeptos dentro da nave. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme suplementar 3: Amostra de vídeo de fluxo sanguíneo na artéria pulmonar. O Arqueiro Verde denota a direção do fluxo sanguíneo. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme suplementar 4: Vídeo amostra de tráfico de leucócitos na arteriola pulmonar. Flechas vermelhas denotam leucócitos adeptos dentro de uma nave. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme suplementar 5: Amostra de vídeo de fluxo sanguíneo em capilares pulmonares. Flechas verdes denotam várias áreas bem visualizadas de capilares com glóbulos perfumados por glóbulos vermelhos. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme suplementar 6: Vídeo amostra de tráfico de leucócitos em capilares pulmonares. Setas vermelhas denotam leucócitos adeptos dentro do campo de visão. Clique aqui para baixar este Filme.
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Discussion
O protocolo aqui apresentado requer prática e atenção a alguns passos críticos. Primeiro, é importante preparar a janela de imagem antes de iniciar a intubação e a cirurgia. Use uma quantidade mínima de graxa de vácuo para revestir o anel externo da janela de imagem, aplique o vidro de cobertura e teste a sucção com uma gota de água destilada. Prepará-lo com antecedência evitará que o pulmão exposto seque durante a configuração de outra forma. Embora seja possível lavar com soro fisiológico quente, isso pode correr o risco de danificar o frágil tecido pulmonar.
Após a intubação, ao transferir o mouse para a plataforma IVM, a cânula pode ocasionalmente ficar deslocada. Para evitar isso, considere amarrar a cânula nos dentes da frente do camundongo ou suturar-a na pele ao redor da boca. Se usar ventilação controlada por pressão, o volume da maré deve ser cuidadosamente monitorado durante todo o procedimento. Deve permanecer estável a aproximadamente 0,20 mL, pois valores significativamente mais baixos (por exemplo, ~0,10 mL) podem indicar ventilação pulmonar única. Se isso ocorrer, a retração ligeiramente da cânula endotraqueal pode resolver o problema. O uso de anestesia inalante (isoflurane) facilita o controle da profundidade anestésico enquanto o rato é ventilado. Outros meios de anestesia (por exemplo, cetamina intravenosa/xilazina10,11) foram empregados por outros laboratórios, e cada um carrega suas respectivas vantagens e desvantagens.
Durante a cirurgia, é utilizada dissecção contundente para minimizar o risco de corte dos vasos sanguíneos. Isso é de particular importância ao dissecar o tecido adiposo espesso e fortemente vascularizado perto do ombro. A ressecção da caixa torácica requer velocidade e precisão. O calor do cauterizador é intenso o suficiente para queimar o pulmão se usado excessivamente. Ao ressecar a caixa torácica, deve haver espaço vazio entre o pulmão e a parede do peito. Se o pulmão aderir à parede torácica, pressionar levemente para baixo na parte externa da caixa torácica incentivará a adesão à pleura parietal subjacente. Alternativamente, use uma agulha cega para injetar uma pequena quantidade de soro fisiológico quente entre o pulmão e a caixa torácica para facilitar a liberação. O posicionamento do braço da janela na posição das 3 horas é aconselhável evitar pressão indesejada nas costelas durante a imagem (Figura 3A). Também deixará mais espaço entre o micromanipulador e o objetivo do microscópio, permitindo um acesso mais fácil para manipulações. Ao baixar a janela de imagem, é fundamental atingir a região central do pulmão, pois o contato com a borda resultará em uma vedação inadequada e artefato de movimento excessivo durante a imagem. Além disso, várias tentativas de baixar a janela podem danificar o pulmão. Da mesma forma, ciclos de descolamento e reestaização contribuirão para lesões pulmonares e podem comprometer a precisão experimental. Quando realizada corretamente, no entanto, a preparação aqui apresentada é estável o suficiente para permitir imagens intravitais de alta resolução com um objetivo de 20x.
Um protocolo de limpeza rigoroso é necessário para evitar contaminação e bloqueio do canal de vácuo dentro da janela de imagem. O uso de uma agulha de 30 G imediatamente após experimentos para lavar repetidamente com água destilada é eficaz para remover a maioria dos contaminantes. Isso é seguido por uma descarga com etanol concentrado e uma descarga final com água destilada antes de recolocar na linha de vácuo para remover a umidade. O uso de acetona ou detergentes fortes pode ser adequado para resolver bloqueios graves, caso ocorram.
Notavelmente, este protocolo emprega uma leitura mais alta da pressão do vácuo em comparação com alguns outros métodos relatados 4,11, e isso pode levantar preocupações de danos ao tecido pulmonar. Uma distinção importante, no entanto, é que o medidor digital utilizado aqui mede a pressão apenas na bomba de vácuo. Esta pressão é fornecida através de tubos estreitos e o canal extremamente estreito da própria janela de imagem antes da distribuição sobre uma área de superfície maior do pulmão. Como tal, não foram observadas evidências de danos à região de imagem nesses experimentos após sessões intravitais. Além disso, os alvéolos imageados apresentaram distensão e contração das marés, indicando que esse fenômeno fisiológico não foi significativamente interrompido.
Apesar da crescente popularidade do IVM pulmonar como ferramenta de estudo da doença in vivo, há limitações para essa técnica. Em primeiro lugar, a natureza invasiva e terminal da cirurgia induz um efeito não desprezível sobre o estado fisiológico do camundongo e limita o procedimento a uma única sessão de imagem. No entanto, deve-se notar que várias abordagens longitudinais de IVM pulmonar foram desenvolvidas30. Em segundo lugar, o uso de ventilação mecânica pode induzir um grau de lesão pulmonar associada ao ventilador (VALI)31, embora isso seja limitado pela curta duração do procedimento. Terceiro, o contato entre a pleura visceral e a mancha de vidro e a aplicação da pressão a vácuo pode resultar em fluxo sanguíneo microvascular alterado. Finalmente, talvez a limitação mais significativa dessa abordagem seja que a imagem se restringe aos alvéolos subpleurais em regiões pulmonares não dependentes, que não são representativas de todo o pulmão32.
Em resumo, este protocolo pode ser usado para estudar interações leucócito-endotelial na microvasculatura pulmonar usando microscopia de fluorescência intravital. Embora esses experimentos empregam lesão pulmonar induzida por endotoxina, um modelo agudo que foi selecionado com base em pesquisas anteriores, este protocolo também pode ser adaptado para estudar outros processos patológicos e fisiológicos no pulmão. Além disso, o sistema de imagem pulmonar empregado aqui é aplicável a uma série de abordagens de microscopia, e a janela de imagem é grande o suficiente para acomodar objetivos de alta abertura numérica de imersão em óleo. Assim, os procedimentos descritos devem facilitar novas pesquisas sobre o impacto de vários estados da doença na microcirculação pulmonar.
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Disclosures
Kamala D. Patel é presidente e co-fundadora da Luxidea, a empresa da qual a janela de imagem utilizada neste experimento foi comprada.
Acknowledgments
Os autores agradecem à Dra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 1 mL syringe |
| ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Blunt forceps |
| Albumin-Fluorescein Isothiocyanate | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumin |
| Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Alcohol wipe |
| AVDC110 Advanced Digital Video Converter | Canopus | 00631069602029 | Digital video converter |
| B/W - CCD - Camera | Horn Imaging | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Cauterizer |
| C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories International | C57BL/6NCrl | C57BL/6 Mice |
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | Cotton applicator |
| CS-8R 8mm Round Glass Coverslip | Warner Instruments | 64-0701 | Glass coverslip |
| Digital Pressure Gauge | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM&V | Digital Pressure Gauge |
| Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope | Dr. Mom Otoscopes | 1001 | Otoscope |
| Ethyl Alchohol 95% Vol | Commercial Alcohols | P016EA95 | 95% ethanol |
| Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | Scissors |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | Fisher Scientific | 1590110 | Labeling tape |
| Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Vacuum pump |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Hemostatic forceps |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | DC976VF | Vacuum grease |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurane |
| LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaine HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Designed for intravital microscopy of the lung |
| Mineral Oil | Teva Canada | 00485802 | Mineral oil |
| Mouse Endotracheal Intubation Kit | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable |
| MST49 Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | 10 450 022 | Fluorescence Microscope |
| N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective | Leica Microsystems | 566035 | 20x objective |
| Non-Woven Sponges 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gauze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI | 3D printer |
| Oxygen, Compressed | Linde Canada Inc. | Oxygen | |
| PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | 30 G needle |
| Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Vacuum flask |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Secure Soft Cloth Medical Tape - 3" | Primed | PM5-630709 | Cloth tape |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD | Dow Corning | 602-205 | 1.0 mm I.D. polyethylene tubing |
| Somnosuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-module | Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter |
| Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth | World Precision Instruments | 501216 | Toothed forceps |
| Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) | 3M | 7000002795 | Medical tape |
| Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | 1.0 cm I.D. polyethylene tubing |
| Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | Inline 0.2µm filter |
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