Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Etablering av sebrafisk pasientderiverte xenotransplantater fra bukspyttkjertelkreft for kjemosensitivitetstesting

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/63744
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Biology, University of Pisa, 2General Surgery Unit, Department of Translational Research and New Technologies in Medicine and Surgery, University of Pisa

Summary

Prekliniske modeller tar sikte på å fremme kunnskapen om kreftbiologi og forutsi behandlingseffekt. Denne artikkelen beskriver genereringen av sebrafiskbaserte pasientderiverte xenotransplantater (zPDX) med tumorvevsfragmenter. ZPDX-ene ble behandlet med kjemoterapi, hvis terapeutiske effekt ble vurdert med hensyn til celleapoptose i det transplanterte vevet.

Abstract

Kreft er en av de viktigste dødsårsakene over hele verden, og forekomsten av mange typer kreft fortsetter å øke. Mye fremgang har blitt gjort når det gjelder screening, forebygging og behandling; Imidlertid mangler fortsatt prekliniske modeller som forutsier kjemosensitivitetsprofilen til kreftpasienter. For å fylle dette gapet ble en in vivo pasientderivert xenograftmodell utviklet og validert. Modellen var basert på sebrafisk (Danio rerio) embryoer 2 dager etter befruktning, som ble brukt som mottakere av xenograftfragmenter av tumorvev tatt fra pasientens kirurgiske prøve.

Det er også verdt å merke seg at bioptiske prøver ikke ble fordøyd eller disaggregert for å opprettholde tumormikromiljøet, noe som er avgjørende når det gjelder å analysere tumoradferd og respons på terapi. Protokollen beskriver en metode for å etablere sebrafiskbaserte pasientderiverte xenotransplantater (zPDX) fra primær solid tumor kirurgisk reseksjon. Etter screening av en anatomopatolog, blir prøven dissekert ved hjelp av et skalpellblad. Nekrotisk vev, kar eller fettvev fjernes og hakkes deretter i 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm stykker.

Bitene blir deretter fluorescerende merket og xenotransplantert inn i perivitellinerommet til sebrafiskembryoer. Et stort antall embryoer kan behandles til en lav kostnad, noe som muliggjør høy gjennomstrømning in vivo-analyser av kjemosensitiviteten til zPDX for flere kreftmedisiner. Konfokale bilder blir rutinemessig anskaffet for å oppdage og kvantifisere de apoptotiske nivåene indusert av kjemoterapibehandling sammenlignet med kontrollgruppen. Xenograft-prosedyren har en betydelig tidsfordel, siden den kan fullføres på en enkelt dag, noe som gir et rimelig tidsvindu for å utføre en terapeutisk screening for samtidige kliniske studier.

Introduction

Et av problemene med klinisk kreftforskning er at kreft ikke er en enkelt sykdom, men en rekke forskjellige sykdommer som kan utvikle seg over tid, og krever spesifikke behandlinger avhengig av egenskapene til selve svulsten og pasienten1. Følgelig er utfordringen å bevege seg mot pasientorientert kreftforskning, for å identifisere nye personlige strategier for tidlig prediksjon av kreftbehandlingsresultater2. Dette er spesielt relevant for bukspyttkjertelduktalt adenokarsinom (PDAC), siden det regnes som en vanskelig å behandle kreft, med en 5-års overlevelsesrate på 11%3.

Den sene diagnosen, rask progresjon og mangel på effektive terapier forblir de mest presserende kliniske problemene med PDAC. Hovedutfordringen er derfor å modellere pasienten og identifisere biomarkører som kan brukes i klinikken for å velge den mest effektive terapien i tråd med persontilpasset medisin 4,5,6. Over tid har nye tilnærminger blitt foreslått for å modellere kreftsykdommer: pasientavledede organoider (PDOer) og muspatientavledede xenotransplantater (mPDX) stammer fra en kilde til humant tumorvev. De har blitt brukt til å reprodusere sykdommen for å studere responsen og motstanden mot terapi, samt sykdomsfall 7,8,9.

På samme måte har interessen for sebrafiskbaserte pasientavledede xenograftmodeller (zPDX) økt, takket være deres unike og lovende egenskaper10, som representerer et raskt og billig verktøy for kreftforskning11,12. zPDX-modeller krever bare en liten tumorprøvestørrelse, noe som gjør høy gjennomstrømningsscreening av kjemoterapi mulig13. Den vanligste teknikken som brukes til zPDX-modeller er basert på fullstendig prøvefordøyelse og implantasjon av de primære cellepopulasjonene, som delvis reproduserer svulsten, men har ulempene med mangel på tumormikromiljø og crosstalk mellom ondartede og friske celler14.

Dette arbeidet viser hvordan zPDX kan brukes som en preklinisk modell for å identifisere kjemosensitivitetsprofilen til pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. Den verdifulle strategien letter xenograftprosessen, siden det ikke er behov for celleutvidelse, noe som muliggjør akselerasjon av kjemoterapiscreeningen. Modellens styrke er at alle mikromiljøkomponentene opprettholdes som de er i pasientens kreftvev, fordi, som det er kjent, avhenger svulstens oppførsel av samspillet15,16. Dette er svært gunstig i forhold til alternative metoder i litteraturen, da det er mulig å bevare tumorheterogeniteten og bidra til å forbedre forutsigbarheten av behandlingsutfall og tilbakefall på en pasientspesifikk måte, slik at zPDX-modellen kan brukes i kokliniske studier. Dette manuskriptet beskriver trinnene som er involvert i å lage zPDX-modellen, som starter med et stykke pasienttumorreseksjon og behandler det for å analysere responsen på kjemoterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Det italienske folkehelsedepartementet godkjente alle dyreforsøkene som ble beskrevet, i samsvar med direktiv 2010/63/EU om bruk og stell av dyr. Den lokale etiske komiteen godkjente studien, under registreringsnummer 70213. Informert samtykke ble innhentet fra alle involverte personer. Før start skal alle løsninger og utstyr klargjøres (del 1) og fisken krysses (seksjon 2).

1. Klargjøring av løsninger og utstyr

MERK: Se tabell 1 for løsninger og medier som skal utarbeides.

  1. Agarose gel støtte
    1. Vei agarosepulveret i en mikrobølgeovn og oppløs det i et gitt volum E3 sebrafiskmedium for å lage en 1% gel. Varm opp i en mikrobølgeovn til agarose er fullstendig oppløst.
      NOTAT: Ikke overkok løsningen.
    2. Hell den smeltede agarosen i en petriskål og vent til gelen har størknet helt.
    3. Lag små agarosesylindere (~5 mm høye) ved hjelp av en plastisk Pasteur-pipette med spissen avskåret. Når den er tilberedt, oppbevares i en petriskål ved 4 °C innpakket i aluminiumsfolie.
  2. Glass mikronåler
    1. Trekk i borosilikatglasskapillærene med en avtrekker for å få fine nåler (innstillinger: HEAT 990, TREKK 550).
      MERK: Fra en kapillær er det mulig å få to fine nåler med en spissdiameter på 10 μm.

2. Fiskekryssing og egghenting

  1. Overfør voksen fisk i avlstanker 3 dager før vevsimplantasjon, som beskrevet av Avdesh et al.17.
  2. MERK: Et forhold på 1:1 eller 2:3 menn til kvinner anbefales. Fisketettheten skal være maksimalt fem fisk per liter vann. Hold hanner og hunner adskilt med en barriere over natten.
  3. Neste dag, fjern barrieren og la fisken mate.
  4. Fjern fisken fra avlstankene og returner dem til hustankene.
  5. Hell vannet fra avlstanken gjennom et finmasket nett. Overfør de befruktede eggene til en petriskål med E3 sebrafiskmedium.
  6. Sjekk petriskålen med et stereomikroskop og kast de overskyede eggene. Oppbevar de befruktede eggene i fersk E3 sebrafisk ved 28 °C.

3. Innsamling av prøver

MERK: Autoklavtang og skalpellhåndtak.

  1. Umiddelbar behandling
    1. Samle kirurgisk prøve av tumor i 10 ml tumormedium ved 4 ° C (tumorprøve fra 5 mm til 10 mm i diameter). Overfør prøven ved 4 °C fra ønsket sted for umiddelbar behandling.
  2. Oppbevaring over natten (valgfritt)
    1. Oppsamle den kirurgiske tumorprøven i 10 ml tumormedium og oppbevar prøven over natten ved 4 °C.
  3. Oppbevaring ved -80 °C (valgfritt, minst anbefalt)
    1. Oppbevar prøven ved -80 °C i et kryogent hetteglass med tumormedium tilsatt 5 % dimetylsulfoksid (DMSO).

4. Prøvebehandling

MERK: Utfør trinnene under en hette for laminær flyt i steril vevskultur.

  1. Vask hele tumorvevet med 5 ml ferskt tumormedium, pipetter opp og ned 10x ved hjelp av en plastisk Pasteur-pipette. Aspirer og kast vaskemediet. Gjenta dette trinn 3x.
    MERK: Unngå aspirasjon av tumorvevet, da det kan forbli festet til plastisk Pasteur-pipette.
  2. Overfør prøven i en petriskål og senk den ned i 1-2 ml friskt tumormedium. Klipp tumorprøven i små biter (1-2 mm3) ved hjelp av et skalpellblad og legg dem i et sterilt 5 ml plastrør med tumormedium.
  3. Sett McIlwain-vevshakkeren til 100 μm tykkelse. Plasser prøvefragmentene på det sirkulære plastbordet til helikopteret og hakk dem. Roter bordet 90° og gjenta hakkingen.
  4. Sentrifuge fragmentene ved 300 × g i 3 minutter. Deretter aspirerer du forsiktig supernatanten og kaster den.
  5. Inkuber fragmentene med en fluorescerende cellesporing, CM-DiI (endelig konsentrasjon på 10 μg / ml i Dulbeccos fosfatbufrede saltvann [DPBS]), dyp rød (endelig konsentrasjon på 1 μL / ml i DPBS) eller CellTrace (endelig konsentrasjon på 5 μM i DPBS) i 30 minutter, og plasser røret i et 37 ° C vannbad.
  6. Bryt fragmentene på nytt ved å pipettere forsiktig opp og ned hvert 10. minutt.
    MERK: Når det gjelder CellTrace, tilsett medium som inneholder minst 1% protein på slutten av inkubasjonen, i henhold til produsentens instruksjoner.
  7. Sentrifuge ved 300 x g i 3 min og kast supernatanten. Gjenta dette trinn 3x med 1 ml DPBS for å fjerne ikke-innlemmet fargestoff.
  8. Oppheng fragmentene i 5 ml DPBS i en 60 mm petriskål.
    MERK: Pass på at vevet ikke tørker ut.

5. Etablering av zPDX

MERK: Utfør trinnene under en hette for laminær flyt i steril vevskultur.

  1. Bedøve embryoene 2 dager etter befruktning (dpf) med 0,16 mg/ml trikain i E3 sebrafiskmedium.
  2. Legg tre agarosesylindere (trinn 1.1.3) i en petriskål og legg et sebrafiskembryo på en sylinder, og blottlegg den ene siden. Fjern overflødig løsning for å holde embryoet i bare en tynn film.
  3. Overfør stykket farget vev med steril tang fra petriskålen til 1% agarosestøtten der embryoet ligger. Plukk opp vevet, legg det på toppen av embryoplommen, og skyv det deretter inn i perivitellinerommet ved hjelp av den varmetrukne glassmikronedlen (trinn 1.2.1).
  4. Tilsett forsiktig noen dråper E3 1% penicillin-streptomycin (Pen-Strep) til embryoet for å bringe det tilbake i væsken.
  5. Gjenta trinn 5.2-5.4 for alle embryoene, og til slutt, fjern agarosestøttene fra petriskålen og rug embryoene ved 35 °C.
  6. Kontroller embryoene for riktig xenotransplantat (positiv farging) 2 timer etter implantasjon ved hjelp av et fluorescerende stereomikroskop. Kast embryoene med tumorfragmenter som ikke er helt inne i perivitellinerommet, så vel som de døde embryoene. Tilfeldig fordel embryoene i seks flerbrønnsplater (maksimum n = 20 embryoer/brønn), likt fordelt i grupper i henhold til eksperimentplanen (f.eks. kontroll og FOLFOXIRI).

6. Behandling

  1. Fortynn stoffet (f.eks. 5-fluorouracil, oksaliplatin, irinotecan) til E3 1% Pen-Strep, bland grundig ved å pipettere opp og ned flere ganger. Som foreslått av Usai et al.12, bruk en femfoldig fortynning av stoffet i fiskevannet, med hensyn til ekvivalent plasmakonsentrasjon (EPC).
  2. Bland stoffene for å tilberede cocktailen (f.eks.
  3. Fjern mediet fra hver brønn og tilsett stoffcocktailen 2 timer etter implantasjon.
  4. Behandle embryoene i 3 dager. Forny stoffcocktailen hver dag.

7. Helmontert immunfluorescerende farging

MERK: Før du starter, plasser aceton ved -20 °C og klargjør løsningene oppført i tabell 1.

  1. Dag 1:
    1. Fest larvene med 1 ml 4 % paraformaldehyd i hetteglass ved 4 °C over natten.
  2. Dag 2:
    1. Vask larvene 3 x 5 min med 1 ml PBS, rør forsiktig på en rocker på laboratorieplattformen (400 o / min).
    2. Oppbevares i 1 ml 100 % metanol ved -20 °C over natten (eller til langtidslagring).
    3. Rehydrer 3 x 10 min med 1 ml PTw (0,1 % tween i PBS), forsiktig omrøring på en rocker på en laboratorieplattform (400 rpm).
    4. Permeabiliser med 1 ml 150 mM Tris-HCl ved pH 8,8 i 5 minutter ved RT, etterfulgt av oppvarming i 15 minutter ved 70 °C.
    5. Vask 2 x 10 min med 1 ml PTw, forsiktig omrøring på en laboratorieplattformvipper (400 o / min).
    6. Vask 2 x 5 min med 1 ml dH2O, rør forsiktig på en vippe på en laboratorieplattform (400 o / min).
    7. Permeabiliser med 1 ml iskald aceton i 20 minutter ved -20 °C.
    8. Vask 2 x 5 min med 1 ml dH2O, rør forsiktig på en vippe på en laboratorieplattform (400 o / min).
    9. Vask 2 x 5 min med 1 ml PTw, forsiktig omrøring på en laboratorieplattformvipper (400 o / min).
    10. Inkuber larvene i 1 ml blokkbuffer i 3 timer ved 4 °C, rør forsiktig på en laboratorieplattformvipper (400 o / min).
    11. Plasser larvene i brønnplater fordelt på gruppe på følgende måte: 10 larver i 50 μL volum/brønn i en 96-brønns plate eller 20 larver i 100 μL volum/brønn i en 48-brønnsplate.
    12. Kast blokkeringsbufferen, inkuber larvene med primær antistoffløsning (f.eks. kanin anti-human spaltet caspase-3, 1:250) fortynnet i inkubasjonsbuffer over natten ved 4 °C i mørket, og gyng forsiktig på en risteplate (400 rpm). Se trinn 7.2.11 for anbefalte volumer.
  3. Dag 3:
    1. Vask larvene sekvensielt 3 x 1 time med 1 ml PBS-TS (10 % geiteserum, 1 % Triton X-100 i PBS) og deretter med 2 x 10 min med 1 ml PBS-T (1 % Triton X-100 i PBS) og 2 x 1 time med 1 ml PBS-TS. I hver vask, beveg forsiktig platene som inneholder larvene på en risterplate (400 o / min).
    2. Inkuber larvene med fluorescerende fargestoffkonjugerte sekundære antistoffer (f.eks. Geitantikanin IgG [H+L] kryssadsorbert sekundært antistoff, Alexa Fluor 647, 1:500) og 100 μg/ml Hoechst 33258 fortynnet i inkubasjonsbuffer i mørket over natten ved 4 °C, med lett omrøring på en risteplate (400 rpm). Se trinn 7.2.11 for anbefalte volumer av sekundær antistoffoppløsning.
  4. Dag 4:
    1. Vask 3 x 1 time med 1 ml PBS-TS og 2 x 1 time med 1 ml PTw, med forsiktig omrøring på en risteplate (400 o / min).
    2. Lag et sirkulært lag med emaljen (tykkelse på ~ 0,5-1 mm) på mikroskoplysbilder. La emaljen tørke ut og plasser larvene i midten av det sirkulære laget, og utsett siden av xenograftet.
    3. Tørk overflødig oppløsning og monter glassdekselet med et vannløselig, ikke-fluorescerende monteringsmedium.

8. Bildebehandling

  1. Ta bilder under konfokalmikroskopi med et 40x objektiv. Bruk følgende innsamlingsparametere: en oppløsning på 1024 x 512 piksler med en Z-avstand på 5 μm.

9. Analyse av apoptose av ImageJ

  1. Last inn (Fiji er bare) ImageJ-programvare (https://imagej.net/Fiji/Downloads) og åpne Z-stack-filbildet (klikk File | Åpen). I popup-vinduet velger du Stack viewing/Hyperstack og klikker på OK.
  2. Overlegg de forskjellige kanalene ved å velge Bilde | Farge | Lag kompositt.
  3. Dra Z-linjen nederst i bildet for å bla gjennom Z-stakkbildet og identifisere xenograftområdet (celler som er positive for fluorescerende cellesporing. Se trinn 4.5) i sebrafiskens perivitellinerom.
  4. Velg punktverktøy og tell antall apoptotiske humane celler (positiv til fluorescerende cellesporing og spaltet caspase-3), som vist i tilleggsvideo S1.
  5. Dobbeltklikk på Point Tool-ikonet , endre telleren, og tell det totale antallet humane cellekjerner (kjerner av CM-DiI positive celler).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen beskriver den eksperimentelle tilnærmingen for å etablere zPDX fra primært humant adenokarsinom i pankreas. En tumorprøve ble samlet, hakket og farget med fluorescerende fargestoff, som beskrevet i protokoll avsnitt 4. zPDX ble deretter vellykket etablert ved implantasjon av et stykke tumor i perivitellinerommet til 2 dpf sebrafiskembryoer, som beskrevet i protokollavsnitt 5. Som beskrevet i protokollavsnitt 6 ble zPDX-ene ytterligere screenet for å identifisere kjemoterapisensitivitetsprofilene til pasientavledede kreftceller. For eksempel ble kjemoterapikombinasjonen FOLFOXIRI (5-fluorouracil, folinsyre, oksaliplatin og irinotecan) testet, siden den brukes som førstelinje kjemoterapi for avansert pankreasduktalt adenokarsinom og i metastatisk kolorektal kreft. Helmonterte bilder av zPDXene ble anskaffet som Z-stabler på konfokalmikroskopet, og apoptoseinduksjonen ble analysert som beskrevet i protokollseksjonene 8 og 9. Som vist i figur 1A,B førte kombinasjonsbehandlingen til en økning i celleapoptose sammenlignet med kontrollgruppen. I kasuistikkstudien rapportert her, ble det identifisert en statistisk signifikant økning i fraksjonen av apoptotiske celler i implanterte xenotransplantater for den FOLFOXIRI-behandlede gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (figur 1C).

Figure 1

Figur 1: zPDX fra humant pankreasduktalt adenokarsinom 3 dager etter behandling med FOLFOXIRI. Cellemembranene ble farget med CM-DiI (rød) og vevet ble xenografert inn i perivitellinerommet til 2 dpf AB villtype sebrafisk. Larvene ble eksponert for en FOLFOXIRI-kombinasjon (0,216 mg/ml 5-fluorouracil, 0,013 mg/ml folinsyre, 0,006 mg/ml oksaliplatin, 0,011 mg/ml irinotekan) eller ikke eksponert (CTRL) i 3 dager, fiksert og immunfarget med spaltet caspase-3 antistoff (cyan) og motfarget av Hoechst (blå kjerner). Larvene ble montert med Aqua Poly-Mount i glassmikroskopglass. (A1-3) Representativt eksempel på en kontrolllarve (ikke utsatt for kjemoterapi). Ingen spaltede caspase-3-positive celler ble observert. (B1-3) Representativt eksempel på en xenotransplantert larve 3 dager etter behandling med FOLFOXIRI, som viser konsistent aktivering av spaltet caspase-3. Helmonterte bilder ble tatt på et Nikon A1 konfokalmikroskop med et digitalt kamera. De stiplede linjene viser xenograftområdene. (C) Kvantifisering av spaltet caspase-3 og CM-DiI dobbelt positive celler i xenotransplanterte larver behandlet med FOLFOXIRI sammenlignet med CTRL, plottet som gjennomsnitt ± SEM (n ≥ 12); p < 0,001, Mann-Whitney U test. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: zPDX = sebrafisk pasientavledet xenograft; dpf = dager etter befruktning; FOLFOXIRI = 5-fluorouracil, folinsyre, oksaliplatin og irinotekan; CTRL = kontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Løsning/medium Sammensetning, kommentarer Hensikt
Tumormedium (1x) Til RPMI-1640 medium, tilsett penicillin-streptomycin (endelig konsentrasjon 100 U / ml) og amfotericin (endelig konsentrasjon 2,50 μg / ml).
E3 sebrafisk medium (1x) Fortynn 60x E3 embryomediet (NaCl 3 M, KCl 0,1 M, CaCl 2 0,2 M, MgSO4 0,2 M) i avionisert vann til en endelig arbeidskonsentrasjon på 1x.
E3 1% Pen-streptokokker Tilsett 1 ml penicillin-streptomycin til 99 ml E3 sebrafiskmedium. Bland ved inversjon. Oppbevar oppløsningen ved 4 °C
PTw 0.1% tween i PBS Hel-mount immunostaining
Blokkering av buffer 10% geiteserum, 1% DMSO, 1% BSA, 0,8% Triton X-100 i PTw Hel-mount immunostaining
Inkubasjon buffer 1% geiteserum, 1% DMSO, 1% BSA, 0,8% Triton X-100 i PTw Hel-mount immunostaining
PBS-TS 10% geiteserum, 1% Triton X-100 i PBS Hel-mount immunostaining
PBS-T 1% Triton X-100 i PBS Hel-mount immunostaining

Tabell 1: Løsninger og medier brukt i protokollen.

Tilleggsfigur S1: PDAC-tumorprøve ble DiO-farget (grønn) og xenografert inn i perivitellinerommet til 2 dpf sebrafiskembryoer. Etter en 3-dagers inkubasjonstid ble zPDX injisert med 2 μg / ml propidiumjodid (PI; rød) og deretter utsatt for 3D konfokal avbildning. Cellens levedyktighet ble kontrollert ved å måle PI-positive celler ut av det totale antall humane celler (DiO-positive). Skala bar = 100 μm. Forkortelser: PDAC = pankreasduktalt adenokarsinom; dpf = dager etter befruktning; zPDX = sebrafisk pasientderivert xenograft. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsvideo S1: Eksempel på apoptotisk telling av humane celler ved bruk av flerpunktsverktøyet i ImageJ. Videoen er en Z-stack av en zPDX 3 dager etter implantasjon, ervervet etter spaltet caspase-3 og Hoechst 33258 immunostaining. Forkortelser: zPDX = zebrafisk pasientderivert xenograft. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vivo-modeller innen kreftforskning gir uvurderlige verktøy for å forstå kreftbiologi og forutsi kreftbehandlingsresponsen. For tiden er forskjellige in vivo-modeller tilgjengelige, for eksempel genetisk modifiserte dyr (transgene og knockoutmus) eller pasientavledede xenotransplantater fra humane primære celler. Til tross for mange optimale funksjoner, har hver og en forskjellige begrensninger. Spesielt mangler de nevnte modellene en pålitelig måte å etterligne pasientens tumorvevsmikromiljø på.

Det har blitt antydet at tumormikromiljøet kan spille mange viktige roller i legemiddelrespons18. Derfor, for å finne en passende dyremodell som opprettholder tumorvevets mikromiljø, ble det utviklet en alternativ PDX-modell ved å bruke biter av tumorvev xenografted i 2 dpf sebrafiskembryoer. Protokollen beskriver hvordan xenotransplantater skal utføres i et stort antall embryoer, noe som muliggjør screening av legemidler med høy gjennomstrømning, både som enkeltagens og i kombinasjoner.

Hovedpoenget med denne innovative tilnærmingen er at den bevarer både celle-celle-interaksjoner og tumormikromiljøet, sammenlignet med de ofte utførte zPDX-ene med enkeltcellesuspensjoner. PDAC fra en kirurgisk prøve blir umiddelbart satt i frisk og kald tumormedia, og svulsten hakkes i små fragmenter. Den overordnede prosedyren som brukes til å generere zPDX-modellen er basert på direkte implantasjon av et fragment fra pasientens svulst i perivitellinerommet til et 2 dpf sebrafiskembryo.

Den foreslåtte modellen kan tjene som et alternativ til PDX-modellen basert på fordøyelsen av den pasientavledede tumorvevsprøven, etterfulgt av direkte injeksjon i eggeplommesekken eller i perivitellinerommet. Som det fremgår av arbeidet til Fior et al., er det mulig å etablere en zAvatar-modell fra enzymatisk disseksjon av kirurgisk resektert pankreatobilær kreft. Implantasjonshastigheten varierte mellom 44% og 64%, på grunn av den typiske lave cellulariteten til tumorbukspyttkjertelprøven og den ugunstige tette desmoplastiske stroma19.

Imidlertid reproduserte cellesuspensjonen bare delvis den opprinnelige svulsten14. Omvendt ligner mPDX, konstruert ved direkte transplantasjon av tumorvev i immundefekte mus, best den opprinnelige svulsten, noe som bedre kan hjelpe klinikere til å forstå tumoradferd og evaluere individuelle responser før behandling20. Faktisk opprettholder det lille, engrafted fragmentet tumormikromiljøet og bevarer crosstalk mellom ondartede og friske celler, som ligner på den opprinnelige svulsten21. Kjemosensitiviteten eller kjemoresistensen reproduseres dermed bedre, med direkte påvirkning av zPDX-teknologi innen translasjonell onkologi14. zPDX-tilnærmingen gjør det mulig for hver pasient å få sin egen svulst utviklet i et levende system. Dermed representerer dette et godt alternativ til bruk av mPDX, hvor tumorvevet ortopograferes intakt eller disaggregeres i celler, som deretter xenograferes inn i musemottakermodeller13.

Denne protokollen ble utviklet i samarbeid med patologer som er ansvarlige for å velge de mest egnede tumorbitene for transplantasjon. Biologiske vevsprøver har alltid blitt tatt fra kirurgisk prøve og aldri fra en biopsi, da sistnevnte vanligvis er preget av mangel på vev og derfor kun er bestemt for diagnostiske formål. Kriteriet for vevsprøvetaking er vanligvis ikke marginalt versus kjerne, men et tumorområde uten blødning og nekrose. Histologisk snitt ble derfor alltid utført på den ene halvdelen av prøven for umiddelbar kvalitetskontroll av materialet. Den foreliggende studien kan være begrenset av kapasiteten til de primære tumorcellene til å innpode i perivitellinerommet til sebrafiskembryoer. Imidlertid ble det observert en 80% engraftmentrate av levedyktig vev 3 dager etter transplantasjonen, både etter lagring ved 4 ° C (12/15 tilfeller) og tint fra -80 ° C (10/12 tilfeller), noe som tyder på at svulsten effektivt kan kryopreserveres, med en celle levedyktighet på 74% ± 2% (tilleggsfigur S1). Til tross for dette varierer suksessraten for vevstransplantasjon mellom forskjellige PDAC-pasienttumorer; Følgelig kan den raske behandlingen av vevet kort tid etter kirurgisk reseksjon, samt forhindre frysing, øke effektiviteten.

Noen tekniske hensiktsmessigheter er også foreslått i protokollen for vellykkede xenotransplantater. For eksempel standardiserte bruken av helikopteret dimensjonene til de xenograftede stykkene. For å kontrollere at bitene av tumorvev er like i dimensjon etter hakkingen, er en potensiell løsning å bruke et kalibreringsglass for å måle diameteren på fragmentene før xenotransplantasjon.

Bruken av 1% agarose-sylinderstøtten er avgjørende for både å legge embryoene på den ene siden og bare implantere et stykke svulst, samt for å forhindre å bryte mikronålen. Fordi svulster utviser en høy variabilitet, er en annen begrensning av metoden at den intratumorale heterogeniteten er mindre representert i et fragment sammenlignet med en cellulær suspensjon. Faktisk kan små vevsbiter avvike når det gjelder godartede cellepopulasjoner og tumorsubkloner. For å overvinne denne kritikken, bør et høyt antall injiserte embryoer brukes til å rekapitulere tumorheterogeniteten og redusere variabiliteten i analysen. Ifølge den statistiske analysen krever hver gruppe en utvalgsstørrelse større enn 15, med tanke på en effektstørrelse på d = 2, og en styrke på 80% og 95% statistisk signifikans. Dette tallet er rimelig, da en ekspertoperatør kan behandle omtrent 40 embryoer per time.

I tillegg til metodikken som ble brukt til å generere zPDX-modellen, ble det også her vist at en FOLFACIRI-kombinasjon induserer apoptose av pasientavledede celler i zPDX-modellen. Som med FOLFOXIRI er det mulig å teste zPDX-kjemosensitiviteten overfor andre kjemoterapiskjemaer, slik som de som er vellykket testet av Usai et al.11.

I tillegg presenteres teknikken for helmontert immunfarging og avbildning for å gi kvantifisering av funksjonen av interesse. For å overvinne noen problemer og for å føre til vellykket helmontert immunfarging, anbefales en 5% DMSO-løsning for å permeabilisere vevet. Når det gjelder konfokal avbildning, kan oppløsningsbegrensningene til konfokalmikroskopet svekke oppkjøpet av de dypere stablene til de xenograftede larvene. Men i studien telles de apoptotiske cellene ut av det totale antall pasientceller. En tredimensjonal rekonstruksjon fra basen til toppen av den implanterte tumormassen, med en trinnstørrelse på 5 μm, gjør det mulig å identifisere alle de menneskelige kjernene, med tanke på sannsynligheten for at den samme kjernen kan spre seg i forrige eller neste Z-plan. Følgelig kan ImageJ-flerpunktsverktøytelleren brukes til å kontrollere og forhindre telling av samme celle to ganger og til å kjøre dobbelttelling i de samme Z-stakkene (apoptotisk ut av totale humane celler) og kan enkelt spore apoptose på enkeltcellenivå.

Til tross for sine begrensninger har zPDX-modellen flere fordeler sammenlignet med in vivo-modeller : den ekstremt raske livssyklusen til sebrafisk, å kunne skaffe et stort antall dyr på kort tid; den optiske klarheten i utviklingsstadiene; og fremfor alt den ekstremt lave etiske effekten i 0-120 h etter befruktningstidsvinduet22. I dag er en co-klinisk studie med zPDX billigere enn den som utføres med musebaserte PDXer, siden immundefekte vertsstammer krever høye vedlikeholdskostnader, samt komplekse bildebehandlingsmetoder for å overvåke tumorvekst23. Avslutningsvis fremhever alle disse faktorene potensialet til zPDX-modellen for bruk i samkliniske studier for å forutsi kjemoterapifølsomhetsprofilene til kreftpasienter og for bruk av forskere som er interessert i nye modeller for legemiddelscreening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av Fondazione Pisa (prosjekt 114/16). Forfatterne vil gjerne takke Raffaele Gaeta fra Histopathology Unit of Azienda Ospedaliera Pisana for pasientprøvevalg og patologistøtte. Vi takker også Alessia Galante for den tekniske støtten i eksperimentene. Denne artikkelen er basert på arbeid fra COST Action TRANSPAN, CA21116, støttet av COST (European Cooperation in Science and Technology).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-fluorouracil Teva Pharma AG SMP 1532755
48 multiwell plate Sarstedt 83 3923
96 multiwell plate Sarstedt 82.1581.001
Acetone Merck 179124
Agarose powder  Merck A9539
Amphotericin Thermo Fisher Scientific 15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 Merck MAB1281  1:200 dilution
Aquarium net QN6 Penn-plax 0-30172-23006-6
BSA Merck A9418
CellTrace Thermo Fisher Scientific C34567
CellTracker CM-DiI  Thermo Fisher Scientific C7001
CellTracker Deep Red  Thermo Fisher Scientific C34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 9661S 1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)  PanReac AppliChem ITW Reagents A3672,0250
Dumont #5 forceps World Precision Instruments 501985
Folinic acid -  Lederfolin Pfizer
Glass capillaries, 3.5" Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. 
Glass vials  VWR International WHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific A-21244   1:500 dilution
Goat serum Thermo Fisher Scientific 31872
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
Irinotecan Hospira
Low Temperature Freezer Vials VWR International 479-1220
McIlwain Tissue Chopper World Precision Instruments
Microplate Mixer SCILOGEX 822000049999
Oxaliplatin Teva
Paraformaldehyde Merck P6148-500G
PBS Thermo Fisher Scientific 14190094
Penicillin-streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140122
Petri dish 100 mm Sarstedt 83 3902500
Petri dish 60 mm Sarstedt 83 3901
Plastic Pasteur pipette Sarstedt 86.1171.010
Poly-Mount Tebu-bio 18606-5
Propidium iodide Merck P4170
RPMI-1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel VWR International SWAN3001
Scalpel handle #3 World Precision Instruments 500236
Tricaine Merck E10521
Triton X-100  Merck T8787
Tween 20 Merck P9416
Vertical Micropipette Puller Shutter instrument P-30 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubin, H. Understanding cancer. Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).
  2. Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
  3. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
  4. Trunk, A., et al. Emerging treatment strategies in pancreatic cancer. Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).
  5. Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care. Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).
  6. Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).
  7. Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
  8. Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
  9. Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
  10. Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).
  11. Usai, A., et al. Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Cancers. 13 (16), 4131 (2021).
  12. Usai, A., et al. A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials. Cancers. 12 (3), 677 (2020).
  13. Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).
  14. Miserocchi, G., et al. Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).
  15. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
  16. Albini, A., et al. Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity. Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).
  17. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
  18. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  19. Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077 (2021).
  20. Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men. Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).
  21. Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).
  22. Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
  23. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).

Tags

Cancer Research sebrafisk avatar preklinisk modell co-klinisk studie tumortransplantasjon kjemosensitivitet hel-mount immunfluorescens
Etablering av sebrafisk pasientderiverte xenotransplantater fra bukspyttkjertelkreft for kjemosensitivitetstesting
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Usai, A., Di Franco, G., Gabellini,… More

Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing. J. Vis. Exp. (195), e63744, doi:10.3791/63744 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter