Summary
Prekliniska modeller syftar till att öka kunskapen om cancerbiologi och förutsäga behandlingseffekt. Denna artikel beskriver genereringen av zebrafiskbaserade patient-derived xenografts (zPDX) med tumörvävnadsfragment. ZPDX behandlades med kemoterapi, vars terapeutiska effekt bedömdes med avseende på cellapoptos av den transplanterade vävnaden.
Abstract
Cancer är en av de främsta dödsorsakerna i världen, och förekomsten av många typer av cancer fortsätter att öka. Stora framsteg har gjorts när det gäller screening, förebyggande och behandling. Prekliniska modeller som förutsäger kemosensitivitetsprofilen hos cancerpatienter saknas dock fortfarande. För att fylla detta gap utvecklades och validerades en in vivo patient-härledd xenograftmodell. Modellen baserades på zebrafiskembryon (Danio rerio) 2 dagar efter befruktning, som användes som mottagare av xenograftfragment av tumörvävnad som tagits från en patients kirurgiska prov.
Det är också värt att notera att bioptiska prover inte smältes eller disaggregerades för att upprätthålla tumörmikromiljön, vilket är avgörande när det gäller att analysera tumörbeteende och svaret på terapi. Protokollet beskriver en metod för att etablera zebrafiskbaserade patient-derived xenografts (zPDX) från primär solid tumörkirurgisk resektion. Efter screening av en anatomipatolog dissekeras provet med hjälp av ett skalpellblad. Nekrotisk vävnad, kärl eller fettvävnad avlägsnas och hackas sedan i 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm bitar.
Bitarna märks sedan fluorescerande och xenotransplanteras in i perivitellinutrymmet hos zebrafiskembryon. Ett stort antal embryon kan bearbetas till en låg kostnad, vilket möjliggör in vivo-analyser med hög genomströmning av zPDX: s kemosensitivitet för flera cancerläkemedel. Konfokala bilder förvärvas rutinmässigt för att detektera och kvantifiera de apoptotiska nivåerna inducerade av kemoterapibehandling jämfört med kontrollgruppen. Xenograft-proceduren har en betydande tidsfördel, eftersom den kan slutföras på en enda dag, vilket ger ett rimligt tidsfönster för att genomföra en terapeutisk screening för samkliniska prövningar.
Introduction
Ett av problemen med klinisk cancerforskning är att cancer inte är en enda sjukdom, utan en mängd olika sjukdomar som kan utvecklas över tiden, vilket kräver specifika behandlingar beroende på tumörens egenskaper och patienten1. Följaktligen är utmaningen att gå mot patientorienterad cancerforskning för att identifiera nya personliga strategier för tidig förutsägelse av cancerbehandlingsresultat2. Detta är särskilt relevant för pankreas duktalt adenokarcinom (PDAC), eftersom det anses vara en svårbehandlad cancer, med en 5-årig överlevnad på 11%3.
Den sena diagnosen, snabba utvecklingen och bristen på effektiva terapier är fortfarande de mest pressande kliniska problemen med PDAC. Den största utmaningen är därför att modellera patienten och identifiera biomarkörer som kan appliceras i kliniken för att välja den mest effektiva terapin i linje med personlig medicin 4,5,6. Med tiden har nya metoder föreslagits för att modellera cancersjukdomar: patient-derived organoids (PDOs) och muspatient-derived xenografts (mPDX) härstammar från en källa till human tumörvävnad. De har använts för att reproducera sjukdomen för att studera svaret och resistensen mot terapi, liksom sjukdomsåterfall 7,8,9.
På samma sätt har intresset för zebrafiskbaserade patient-derived xenograft (zPDX) modeller ökat, tack vare deras unika och lovande egenskaper10, som representerar ett snabbt och billigt verktyg för cancerforskning11,12. zPDX-modeller kräver endast en liten tumörprovstorlek, vilket gör screening av kemoterapi med hög genomströmning möjlig13. Den vanligaste tekniken som används för zPDX-modeller är baserad på fullständig provsmältning och implantation av de primära cellpopulationerna, som delvis reproducerar tumören, men har nackdelarna med brist på tumörmikromiljö och överhörning mellan maligna och friska celler14.
Detta arbete visar hur zPDX kan användas som en preklinisk modell för att identifiera kemosensitivitetsprofilen hos patienter med bukspottkörtelcancer. Den värdefulla strategin underlättar xenograftprocessen, eftersom det inte finns något behov av cellexpansion, vilket möjliggör acceleration av kemoterapiscreeningen. Modellens styrka är att alla mikromiljökomponenter bibehålls som de är i patientens cancervävnad, eftersom, som det är välkänt, tumörens beteende beror på deras samspel15,16. Detta är mycket gynnsamt jämfört med alternativa metoder i litteraturen, eftersom det är möjligt att bevara tumörheterogeniteten och bidra till att förbättra förutsägbarheten av behandlingsresultat och återfall på ett patientspecifikt sätt, vilket gör att zPDX-modellen kan användas i samkliniska prövningar. Detta manuskript beskriver stegen som är involverade i att göra zPDX-modellen, börjar med en bit av patientens tumörresektion och behandlar den för att analysera svaret på kemoterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det italienska folkhälsoministeriet godkände alla beskrivna djurförsök, i enlighet med direktiv 2010/63/EU om användning och skötsel av djur. Den lokala etiska kommittén godkände studien med registreringsnummer 70213. Informerat samtycke erhölls från alla inblandade ämnen. Innan du börjar ska alla lösningar och utrustning förberedas (avsnitt 1) och fisken ska korsas (avsnitt 2).
1. Beredning av lösningar och utrustning
OBS: Se tabell 1 för de lösningar och medier som ska förberedas.
- Support för Agarose gel
- Väg agarospulvret i en mikrovågskolv och lös upp det i en given volym E3 zebrafiskmedium för att göra en 1% gel. Värm i en mikrovågsugn tills agarosen har löst sig helt.
OBS: Överkoka inte lösningen. - Häll den smälta agarosen i en petriskål och vänta tills gelén har stelnat helt.
- Gör små agaroscylindrar (~ 5 mm höga) med en plastpasteurpipett med spetsen avskuren. När du är beredd, förvara i en petriskål vid 4 ° C insvept i aluminiumfolie.
- Väg agarospulvret i en mikrovågskolv och lös upp det i en given volym E3 zebrafiskmedium för att göra en 1% gel. Värm i en mikrovågsugn tills agarosen har löst sig helt.
- Mikronålar av glas
- Dra i borosilikatglaskapillärerna med en avdragare för att få fina nålar (inställningar: HEAT 990, PULL 550).
OBS: Från en kapillär är det möjligt att erhålla två fina nålar med en spetsdiameter på 10 μm.
- Dra i borosilikatglaskapillärerna med en avdragare för att få fina nålar (inställningar: HEAT 990, PULL 550).
2. Fiskkorsning och ägguppsamling
- Överför vuxna fiskar i odlingsbassänger 3 dagar före vävnadsimplantation, enligt beskrivningen av Avdesh et al.17.
- OBS: Ett förhållande mellan 1: 1 eller 2: 3 män till kvinnor rekommenderas. Fiskdensiteten bör vara högst fem fiskar per liter vatten. Håll män och kvinnor åtskilda med en barriär över natten.
- Nästa dag, ta bort barriären och låt fisken kompisera.
- Ta bort fisken från avelstankarna och återför dem till sina bostadstankar.
- Häll vattnet från avelstanken genom ett finmaskigt nät. Överför de befruktade äggen till en petriskål med E3 zebrafiskmedium.
- Kontrollera petriskålen med ett stereomikroskop och kasta de grumliga äggen. Förvara de befruktade äggen i färskt E3-zebrafiskmedium vid 28 °C.
3. Insamling av exemplar
OBS: Autoklavpincett och ett skalpellhandtag.
- Omedelbar behandling
- Samla det kirurgiska provet av tumör i 10 ml tumörmedium vid 4 ° C (tumörprov från 5 mm till 10 mm i diameter). Överför provet vid 4 °C från önskad plats för omedelbar bearbetning.
- Förvaring över natten (tillval)
- Samla det kirurgiska tumörprovet i 10 ml tumörmedium och förvara provet över natten vid 4 ° C.
- Förvaring vid -80 °C (tillval, rekommenderas minst)
- Förvara provet vid -80 °C i en kryogen injektionsflaska med tumörmedium kompletterat med 5 % dimetylsulfoxid (DMSO).
4. Bearbetning av prover
OBS: Utför stegen under en steril vävnadskultur laminär flödeshuv.
- Tvätta hela tumörvävnaden med 5 ml färskt tumörmedium, pipettera upp och ner 10x med en plastpasteurpipett. Aspirera och kassera tvättmediet. Upprepa detta steg 3x.
OBS: Undvik aspiration av tumörvävnaden eftersom den kan förbli fäst vid plastpasteurpipetten. - Överför provet i en petriskål och sänk ner det i 1-2 ml färskt tumörmedium. Skär tumörprovet i små bitar (1-2 mm3) med ett skalpellblad och placera dem i ett sterilt 5 ml plaströr med tumörmedium.
- Ställ in McIlwains mjukpappershackare på 100 μm tjocklek. Placera provfragmenten på hackarens cirkulära plastbord och hugga dem. Rotera bordet 90° och upprepa hackningen.
- Centrifugera fragmenten vid 300 × g i 3 minuter. Aspirera sedan försiktigt supernatanten och kassera den.
- Inkubera fragmenten med en fluorescerande celltracker, CM-DiI (slutlig koncentration av 10 μg/ml i Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning [DPBS]), Deep Red (slutlig koncentration av 1 μl/ml i DPBS) eller CellTrace (slutlig koncentration av 5 μM i DPBS) i 30 minuter och placera röret i ett 37 °C vattenbad.
- Återsuspendera fragmenten genom att försiktigt pipettera upp och ner var 10:e minut.
OBS: Vid CellTrace, tillsätt medium som innehåller minst 1% protein i slutet av inkubationen, enligt tillverkarens instruktioner. - Centrifugera vid 300 x g i 3 minuter och kassera supernatanten. Upprepa detta steg 3x med 1 ml DPBS för att ta bort icke-inkorporerat färgämne.
- Suspendera fragmenten i 5 ml DPBS i en 60 mm petriskål.
OBS: Se till att vävnaden inte torkar ut.
5. Etablering av zPDX
OBS: Utför stegen under en steril vävnadskultur laminär flödeshuv.
- Bedövar embryon 2 dagar efter befruktning (dpf) med 0,16 mg/ml trikain i E3 zebrafiskmedium.
- Lägg tre agaroscylindrar (steg 1.1.3) i en petriskål och lägg ett zebrafiskembryo på en cylinder och exponera ena sidan. Ta bort överskottslösningen för att hålla embryot i bara en tunn film.
- Överför biten av färgad vävnad med sterila pincett från petriskålen till 1% agarosstödet där embryot ligger. Plocka upp vävnaden, lägg den ovanpå embryoäggulan och tryck sedan in den i perivitellinutrymmet med hjälp av den värmedragna glasmikronålen (steg 1.2.1).
- Tillsätt försiktigt några droppar E3 1% penicillin-streptomycin (Pen-Strep) till embryot för att föra tillbaka det i vätskan.
- Upprepa steg 5.2-5.4 för alla embryon och avlägsna slutligen agarosstöden från petriskålen och inkubera embryona vid 35 °C.
- Kontrollera embryona för rätt xenotransplantat (positiv färgning) 2 timmar efter implantation med hjälp av ett fluorescerande stereomikroskop. Kassera embryon med tumörfragment som inte är helt inne i perivitellinutrymmet, liksom de döda embryonerna. Fördela embryona slumpmässigt i sex flerbrunnsplattor (max n = 20 embryon/brunn), jämnt fördelade i grupper enligt experimentplanen (t.ex. kontroll och FOLFOXIRI).
6. Behandlingar
- Späd läkemedlet (t.ex. 5-fluorouracil, oxaliplatin, irinotekan) till E3 1% Pen-Strep, blanda noggrant genom pipettering upp och ner flera gånger. Som föreslagits av Usai et al.12, använd en femfaldig utspädning av läkemedlet i fiskvattnet med avseende på ekvivalent plasmakoncentration (EPC).
- Blanda läkemedlen för att förbereda cocktailen (t.ex. FOLFOXIRI).
- Ta bort mediet från varje brunn och tillsätt läkemedelscocktailen 2 h efter implantation.
- Behandla embryon i 3 dagar. Förnya drogcocktailen varje dag.
7. Helmonterad immunofluorescerande färgning
OBS: Före start, placera aceton vid -20 °C och bereda lösningarna i tabell 1.
- Dag 1:
- Fixera larverna med 1 ml 4% paraformaldehyd i glasflaskor vid 4 °C över natten.
- Dag 2:
- Tvätta larverna 3 x 5 min med 1 ml PBS, omrör försiktigt på en laboratorieplattformsvippa (400 rpm).
- Förvara i 1 ml 100% metanol vid -20 °C över natten (eller för långtidsförvaring).
- Rehydrera 3 x 10 min med 1 ml PTw (0,1% interpolering i PBS), omrör försiktigt på en laboratorieplattformsvippa (400 rpm).
- Permeabilisera med 1 ml 150 mM Tris-HCl vid pH 8,8 i 5 min vid RT, följt av uppvärmning i 15 min vid 70 °C.
- Tvätta 2 x 10 min med 1 ml PTw, skaka försiktigt på en laboratorieplattformsvippa (400 rpm).
- Tvätta 2 x 5 min med 1 ml dH2O, skaka försiktigt på en laboratorieplattformsvippa (400 rpm).
- Permeabilisera med 1 ml iskall aceton i 20 min vid -20 °C.
- Tvätta 2 x 5 min med 1 ml dH2O, skaka försiktigt på en laboratorieplattformsvippa (400 rpm).
- Tvätta 2 x 5 min med 1 ml PTw, omrör försiktigt på en laboratorieplattformsvippa (400 rpm).
- Inkubera larverna i 1 ml blockerande buffert i 3 timmar vid 4 °C och skaka försiktigt på en laboratorieplattform (400 rpm).
- Placera larverna i brunnsplattor uppdelade per grupp enligt följande: 10 larver i 50 μL volym/brunn i en platta med 96 brunnar eller 20 larver i 100 μl volym/brunn i en platta med 48 brunnar.
- Kassera den blockerande bufferten, inkubera larverna med primär antikroppslösning (t.ex. kanin anti-human klyvd kaspas-3, 1:250) utspädd i inkubationsbuffert över natten vid 4 °C i mörker och skaka försiktigt på en skakplatta (400 rpm). Se steg 7.2.11 för rekommenderade volymer.
- Dag 3:
- Tvätta larverna sekventiellt 3 x 1 h med 1 ml PBS-TS (10% getserum, 1% Triton X-100 i PBS) och sedan, med 2 x 10 min med 1 ml PBS-T (1% Triton X-100 i PBS) och 2 x 1 h med 1 ml PBS-TS. I varje tvätt, skaka försiktigt plattorna som innehåller larverna på en skakplatta (400 rpm).
- Inkubera larverna med fluorescerande färgkonjugerade sekundära antikroppar (t.ex. getantikanin IgG [H+L] korsadsorberad sekundär antikropp, Alexa Fluor 647, 1:500) och 100 μg/ml Hoechst 33258 utspädd i inkubationsbuffert i mörker över natten vid 4 °C, med försiktig omrörning på en skakplatta (400 rpm). Se steg 7.2.11 för rekommenderade volymer av sekundär antikroppslösning.
- Dag 4:
- Tvätta 3 x 1 h med 1 ml PBS-TS och 2 x 1 h med 1 ml PTw, med mild omrörning på en skakplatta (400 rpm).
- Skapa ett cirkulärt skikt med emaljen (tjocklek på ~ 0,5-1 mm) på mikroskopglas. Låt emaljen torka ut och placera larverna i mitten av det cirkulära skiktet och exponera xenogrampets sida.
- Torka överskottslösningen och montera glastäcket med ett vattenlösligt, icke-fluorescerande monteringsmedium.
8. Bildbehandling
- Ta bilder under konfokalmikroskopi med ett 40x mål. Använd följande förvärvsparametrar: en upplösning på 1024 x 512 pixlar med ett Z-avstånd på 5 μm.
9. Analys av apoptos av ImageJ
- Ladda (Fiji är bara) ImageJ-programvara (https://imagej.net/Fiji/Downloads) och öppna Z-stack-filbilden (klicka på Arkiv | Öppen). I popup-fönstret väljer du Stack viewing/Hyperstack och klickar på OK.
- Överlappa de olika kanalerna genom att välja Bild | Färg | Gör komposit.
- Dra Z-fältet längst ner i bilden för att bläddra igenom Z-stackbilden och identifiera xenograftområdet (celler som är fluorescerande cellspårare positiva. Se steg 4.5) i zebrafiskens perivitellinutrymme.
- Välj Punktverktyg och räkna antalet apoptotiska mänskliga celler (positiva till fluorescerande cellspårare och klyvda kaspas-3), som visas i kompletterande video S1.
- Dubbelklicka på ikonen Point Tool , byt räknare och räkna det totala antalet mänskliga cellkärnor (kärnor i CM-DiI-positiva celler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver den experimentella metoden för att etablera zPDX från primärt humant pankreasadenokarcinom. Ett tumörprov samlades in, maldes och färgades med fluorescerande färgämne, som beskrivs i protokollavsnitt 4. zPDX etablerades sedan framgångsrikt genom implantation av en tumörbit i perivitellinutrymmet på 2 dpf zebrafiskembryon, som beskrivs i protokollavsnitt 5. Som beskrivs i protokollavsnitt 6 screenades zPDX:erna ytterligare för att identifiera kemoterapikänslighetsprofilerna för cancerceller som härrör från patienter. Till exempel testades kemoterapikombinationen FOLFOXIRI (5-fluorouracil, folinsyra, oxaliplatin och irinotekan), eftersom den används som första linjens kemoterapi för avancerat pankreasduktalt adenokarcinom och vid metastaserad kolorektal cancer. Helmonterade bilder av zPDX: erna förvärvades som Z-staplar på konfokalmikroskopet, och apoptosinduktionen analyserades enligt beskrivningen i protokollavsnitt 8 och 9. Som visas i figur 1A,B ledde den kombinerade behandlingen till en ökning av cellapoptos jämfört med kontrollgruppen. I fallstudien som redovisas här identifierades en statistiskt signifikant ökning av andelen apoptotiska celler i implanterade xenotransplantat för den FOLFOXIRI-behandlade gruppen jämfört med kontrollgruppen (figur 1C).
| Figur 1: zPDX från humant pankreasduktalt adenokarcinom 3 dagar efter behandling med FOLFOXIRI. Cellmembranen färgades med CM-DiI (röd) och vävnaden xenograferades in i perivitellinutrymmet hos 2 dpf AB vildtyp zebrafisk. Larverna exponerades för en kombination av FOLFOXIRI (0,216 mg/ml 5-fluorouracil, 0,013 mg/ml folinsyra, 0,006 mg/ml oxaliplatin, 0,011 mg/ml irinotekan) eller exponerades inte (CTRL) under 3 dagar, fixerades och immunfärgades med klyvd kaspas-3-antikropp (cyan) och motfärgades av Hoechst (blå kärnor). Larver monterades med Aqua Poly-Mount i glasmikroskopglas. (A1-3) Representativt exempel på en kontrolllarva (inte utsatt för kemoterapi). Inga klyvda kaspas-3-positiva celler observerades. (B1-3) Representativt exempel på en xenotransplanterad larv 3 dagar efter behandling med FOLFOXIRI, som visar konsekvent aktivering av klyvd kaspas-3. Helmonterade bilder togs på ett Nikon A1-konfokalmikroskop med en digitalkamera. De streckade linjerna visar xenograftområdena. c) Kvantifiering av klyvda kaspas-3- och CM-DiI-dubbelpositiva celler i xenotransplanterade larver behandlade med FOLFOXIRI jämfört med CTRL, plottade som medelvärde ± SEM (n ≥ 12). p < 0,001, Mann-Whitney U-test. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: zPDX = zebrafisk patient-derived xenograft; dpf = dagar efter befruktning; FOLFOXIRI = 5-fluorouracil, folinsyra, oxaliplatin och irinotekan; CTRL = kontroll. Klicka här för att se en större version av denna figur. |
| Lösning/medium | Sammansättning, kommentarer | Avsikt | ||
| Tumör medium (1x) | Till RPMI-1640-mediet tillsätts penicillin-streptomycin (slutlig koncentration 100 U / ml) och amfotericin (slutlig koncentration 2,50 μg / ml). | |||
| E3 zebrafisk medium (1x) | Späd 60x E3-embryomediet (NaCl 3 M, KCl 0,1 M, CaCl 2 0,2 M, MgSO4 0,2 M) i avjoniserat vatten till en slutlig arbetskoncentration på 1x. | |||
| E3 1% penn-strep | Tillsätt 1 ml penicillin-streptomycin till 99 ml E3 zebrafiskmedium. Blanda genom inversion. Förvara lösningen vid 4 °C | |||
| Ptw | 0,1 % interpolering i PBS | Helmonterad immunfärgning | ||
| Blockerande buffert | 10% getserum, 1% DMSO, 1% BSA, 0,8% Triton X-100 i PTw | Helmonterad immunfärgning | ||
| Inkubationsbuffert | 1% getserum, 1% DMSO, 1% BSA, 0,8% Triton X-100 i PTw | Helmonterad immunfärgning | ||
| PBS-TS | 10% getserum, 1% Triton X-100 i PBS | Helmonterad immunfärgning | ||
| PBS-T | 1% Triton X-100 i PBS | Helmonterad immunfärgning | ||
Tabell 1: Lösningar och media som används i protokollet.
Kompletterande figur S1: PDAC-tumörprov färgades (grönt) och xenograferades in i perivitellinutrymmet hos 2 dpf zebrafiskembryon. Efter en 3-dagars inkubationstid injicerades zPDX med 2 μg/ml propidiumjodid (PI; röd) och utsattes sedan för 3D-konfokal avbildning. Cellviabiliteten kontrollerades genom att mäta PI-positiva celler ur det totala antalet humana celler (DiO-positiva). Skalstång = 100 μm. Förkortningar: PDAC = pankreas duktalt adenokarcinom; dpf = dagar efter befruktning; zPDX = zebrafisk patienthärledd xenograft. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande video S1: Exempel på apoptotisk human cellräkning med hjälp av flerpunktsverktyget i ImageJ. Videon är en Z-stack av en zPDX 3 dagar efter implantation, förvärvad efter klyvd kaspas-3 och Hoechst 33258 immunfärgning. Förkortningar: zPDX = zebrafisk patient-derived xenograft. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo-modeller inom cancerforskning ger ovärderliga verktyg för att förstå cancerbiologi och förutsäga cancerbehandlingssvaret. För närvarande finns olika in vivo-modeller tillgängliga, till exempel genetiskt modifierade djur (transgena möss och knockoutmöss) eller patienthärledda xenotransplantat från humana primära celler. Trots många optimala funktioner har var och en olika begränsningar. I synnerhet saknar de ovannämnda modellerna ett tillförlitligt sätt att efterlikna patientens tumörvävnadsmikromiljö.
Det har föreslagits att tumörmikromiljön kan spela många viktiga roller i läkemedelssvar18. För att hitta en lämplig djurmodell som upprätthåller tumörvävnadens mikromiljö utvecklades därför en alternativ PDX-modell med hjälp av bitar av tumörvävnad xenograferad i 2 dpf zebrafiskembryon. Protokollet beskriver hur man utför xenotransplantat i ett stort antal embryon, vilket möjliggör screening av läkemedel med hög kapacitet, både som enskilda medel och i kombinationer.
Nyckelpunkten i detta innovativa tillvägagångssätt är att det bevarar både cell-cellinteraktioner och tumörmikromiljön, jämfört med de vanligt utförda zPDX: erna med encellssuspensioner. PDAC från ett kirurgiskt prov sätts omedelbart i färskt och kallt tumörmedia, och tumören hackas i små fragment. Det övergripande förfarandet som används för att generera zPDX-modellen är baserat på direkt implantation av ett fragment från en patients tumör i perivitellinutrymmet hos ett 2 dpf zebrafiskembryo.
Den föreslagna modellen kan fungera som ett alternativ till PDX-modellen baserad på matsmältningen av det patienthärledda tumörvävnadsprovet, följt av direkt injektion i gulesäcken eller i perivitellinutrymmet. Som framgår av arbetet av Fior et al. är det möjligt att etablera en zAvatar-modell från den enzymatiska dissektionen av kirurgiskt resekterade bukspottkörtelcancer. Implantationshastigheten varierade mellan 44% och 64%, på grund av den typiska låga cellulariteten hos tumörpankreasprovet och det ogynnsamma täta desmoplastiska stroma19.
Cellsuspensionen reproducerade emellertid endast delvis den ursprungliga tumören14. Omvänt liknar mPDX, konstruerad genom att direkt transplantera tumörvävnad till immunbristfälliga möss, bäst den ursprungliga tumören, vilket bättre kan hjälpa kliniker att förstå tumörbeteende och utvärdera individuella svar före behandling20. Faktum är att det lilla, transplanterade fragmentet upprätthåller tumörmikromiljön och bevarar överhörningen mellan maligna och friska celler, liknande den ursprungliga tumören21. Kemosensitiviteten eller kemoresistensen reproduceras således bättre, med en direkt inverkan av zPDX-tekniken inom området translationell onkologi14. ZPDX-metoden gör det möjligt för varje patient att få sin egen tumör utvecklad i ett levande system. Således representerar detta ett bra alternativ till användningen av mPDX, där tumörvävnaden ortograferas intakt eller disaggregeras i celler, som sedan xenograferas till musmottagarmodeller13.
Detta protokoll utvecklades i samarbete med patologer som ansvarar för att välja de mest lämpliga tumörbitarna för transplantation. Biologiska vävnadsprover har alltid tagits från det kirurgiska provet och aldrig från en biopsi, eftersom den senare vanligtvis kännetecknas av brist på vävnad och därför endast är avsedd för diagnostiska ändamål. Kriteriet för vävnadsprovtagning är vanligtvis inte marginellt kontra kärna, utan snarare ett tumörområde som saknar blödning och nekros. Av denna anledning utfördes alltid en kryostathistologisk sektion på hälften av provet för omedelbar kvalitetskontroll av materialet. Den aktuella studien kan begränsas av de primära tumörcellernas förmåga att transplantera in i perivitellinutrymmet hos zebrafiskembryon. Emellertid observerades en 80% engraftmenthastighet av livskraftig vävnad 3 dagar efter transplantation, både efter lagring vid 4 ° C (12/15 fall) och avfrostad från -80 ° C (10/12 fall), vilket tyder på att tumören effektivt kan kryokonserveras, med en cellviabilitet på 74% ± 2% (kompletterande figur S1). Trots detta varierar framgångsgraden för vävnadsintagrelment mellan olika PDAC-patienttumörer; Följaktligen kan den snabba bearbetningen av vävnaden strax efter den kirurgiska resektionen, liksom att förhindra frysning, förbättra effektiviteten.
Vissa tekniska lösningar föreslås också i protokollet för framgångsrika xenotransplantat. Till exempel standardiserade användningen av helikoptern dimensionerna på de xenograferade bitarna. För att kontrollera att bitarna av tumörvävnad är lika stora efter hackningen är en potentiell lösning att använda ett kalibreringsglas för att mäta fragmentens diameter före xenotransplantation.
Användningen av 1% agaroscylinderstöd är avgörande för att både lägga embryon på ena sidan och helt enkelt implantera en bit tumör, samt för att förhindra att mikronålen bryts. Eftersom tumörer uppvisar en hög variabilitet är en annan begränsning av metoden att den intratumorala heterogeniteten är mindre representerad i ett fragment jämfört med en cellulär suspension. Faktum är att små vävnadsbitar kan avvika när det gäller godartade cellpopulationer och tumörsubkloner. För att övervinna denna kritik bör ett stort antal injicerade embryon användas för att rekapitulera tumörens heterogenitet och minska variationen i analysen. Enligt den statistiska analysen kräver varje grupp en provstorlek större än 15, med tanke på en effektstorlek på d = 2 och en effekt på 80% och 95% statistisk signifikans. Detta antal är rimligt, eftersom en expertoperatör kan bearbeta cirka 40 embryon per timme.
Förutom den metod som används för att generera zPDX-modellen visades det också här att en FOLFOXIRI-kombination inducerar apoptos av patient-härledda celler i zPDX-modellen. Liksom med FOLFOXIRI är det möjligt att testa zPDX-kemosensitiviteten mot andra kemoterapisystem, såsom de som framgångsrikt testats av Usai et al.11.
Dessutom presenteras tekniken för helmonterad immunfärgning och avbildning för att ge kvantifiering av funktionen av intresse. För att övervinna vissa problem och leda till framgångsrik helmonterad immunfärgning rekommenderas en 5% DMSO-lösning för att permeabilisera vävnaderna. När det gäller konfokal avbildning kan upplösningsbegränsningarna för det konfokala mikroskopet försämra förvärvet av de djupare staplarna av de xenotransplanterade larverna. I studien räknas dock de apoptotiska cellerna bort från det totala antalet patientceller. En tredimensionell rekonstruktion från basen till toppen av den implanterade tumörmassan, med en stegstorlek på 5 μm, gör det möjligt att identifiera alla mänskliga kärnor, med tanke på sannolikheten att samma kärna kan spridas inom föregående eller nästa Z-plan. Följaktligen kan ImageJ flerpunktsverktygsräknare användas för att kontrollera och förhindra att samma cell räknas två gånger och för att köra dubbelräkning i samma Z-staplar (apoptotisk av totala mänskliga celler) och kan enkelt spåra apoptos på encellsnivå.
Trots sina begränsningar har zPDX-modellen flera fördelar jämfört med in vivo-modeller : zebrafiskens extremt snabba livscykel, att kunna få ett stort antal djur på kort tid; den optiska klarheten i utvecklingsstadierna; och framför allt den extremt låga etiska påverkan i tidsfönstret 0-120 timmar efter befruktning22. Idag är en samklinisk prövning med zPDX billigare än den som utförs med musbaserade PDX, eftersom immunbristande värdstammar kräver höga underhållskostnader samt komplexa avbildningsmetoder för att övervaka tumörtillväxt23. Sammanfattningsvis belyser alla dessa faktorer potentialen hos zPDX-modellen för användning i samkliniska prövningar för att förutsäga kemoterapikänslighetsprofilerna hos cancerpatienter och för användning av forskare som är intresserade av nya modeller för läkemedelsscreening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Fondazione Pisa (projekt 114/16). Författarna vill tacka Raffaele Gaeta från histopatologiska enheten i Azienda Ospedaliera Pisana för patientprovvalet och patologistödet. Vi tackar också Alessia Galante för det tekniska stödet i experimenten. Denna artikel är baserad på arbete från COST Action TRANSPAN, CA21116, med stöd av COST (European Cooperation in Science and Technology).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
References
- Rubin, H.
- Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Trunk, A., et al. Emerging treatment strategies in pancreatic cancer. Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).
- Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care. Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).
- Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).
- Usai, A., et al. Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Cancers. 13 (16), 4131 (2021).
- Usai, A., et al. A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials. Cancers. 12 (3), 677 (2020).
- Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).
- Miserocchi, G., et al. Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Albini, A., et al. Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity. Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077 (2021).
- Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men. Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).
- Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
