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Biochemistry

Une approche basée sur la spectrométrie de masse pour identifier les phosphoprotéines phosphatases et leurs interacteurs

Published: April 29, 2022 doi: 10.3791/63805
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Geisel School of Medicine at Dartmouth, 2Norris Cotton Cancer Center

Summary

Nous présentons ici un protocole pour l’enrichissement des phosphoprotéines phosphatases endogènes et de leurs protéines en interaction à partir de cellules et de tissus et leur identification et quantification par spectrométrie de masse protéomique.

Abstract

La plupart des processus cellulaires sont régulés par phosphorylation dynamique des protéines. Plus des trois quarts des protéines sont phosphorylées et les phosphoprotéines phosphatases (PPP) coordonnent plus de 90 % de toute la déphosphorylation cellulaire de la sérine/thréonine. La dérégulation de la phosphorylation des protéines a été impliquée dans la physiopathologie de diverses maladies, y compris le cancer et la neurodégénérescence. Malgré leur activité généralisée, les mécanismes moléculaires contrôlant les PPP et ceux contrôlés par les PPP sont mal caractérisés. Ici, une approche protéomique appelée perles inhibitrices de la phosphatase et spectrométrie de masse (PIB-MS) est décrite pour identifier et quantifier les PPP, leurs modifications post-traductionnelles et leurs interacteurs en aussi peu que 12 heures en utilisant n’importe quelle lignée cellulaire ou tissu. PIB-MS utilise un inhibiteur non sélectif du PPP, la microcystine-LR (MCLR), immobilisé sur des billes de sépharose pour capturer et enrichir les PPP endogènes et leurs protéines associées (appelées PPPome). Cette méthode ne nécessite pas l’expression exogène de versions marquées de PPP ni l’utilisation d’anticorps spécifiques. PIB-MS offre un moyen innovant d’étudier les PPP conservés de manière évolutive et d’élargir notre compréhension actuelle de la signalisation de déphosphorylation.

Introduction

La phosphorylation des protéines contrôle la plupart des processus cellulaires, y compris, mais sans s’y limiter, la réponse aux dommages à l’ADN, la signalisation du facteur de croissance et le passage par la mitose 1,2,3. Dans les cellules de mammifères, la majorité des protéines sont phosphorylées à un ou plusieurs résidus de sérine, de thréonine ou de tyrosine à un moment donné, les phosphosérines et les phosphothréonines représentant environ 98 % de tous les sites de phosphorylation 2,3. Alors que les kinases ont été largement étudiées dans la signalisation cellulaire, le rôle des PPP dans la régulation des processus cellulaires dynamiques est encore émergent.

La dynamique de phosphorylation est contrôlée par l’interaction dynamique entre les kinases et les phosphatases. Dans les cellules de mammifères, il existe plus de 400 protéines kinases qui catalysent la phosphorylation de la sérine/thréonine. Plus de 90% de ces sites sont déphosphorylés par les phosphoprotéines phosphatases (PPP), une petite famille d’enzymes composée de PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT et PPZ 2,3. PP1 et PP2A sont responsables de la majorité de la déphosphosérine et de la phosphothréonine dans une cellule 2,3,4. La différence notable de nombre entre les kinases et les phosphatases et le manque de spécificité des sous-unités catalytiques PPP in vitro ont conduit à la croyance que les kinases sont le principal déterminant de la phosphorylation 2,3. Cependant, de multiples études ont montré que les phosphatases établissaient la spécificité du substrat par la formation d’holoenzymes multimériques 5,6,7,8,9. Par exemple, PP1 est un hétérodimère constitué d’une sous-unité catalytique et, à un moment donné, d’une des plus de 150 sous-unités régulatrices 6,7,8. Inversement, PP2A est un hétérotrimère formé d’un échafaudage (A), d’une sous-unité régulatrice (B) et d’une sous-unité catalytique (C) 2,3,9. Il existe quatre familles distinctes de sous-unités régulatrices PP2A (B55, B56, PR72 et striatine), chacune avec plusieurs gènes, variantes d’épissure et modèles de localisation 2,3,9. La nature multimérique des PPP comble le manque de kinases et de sous-unités catalytiques PPP. Cependant, cela crée des défis analytiques pour l’étude de la signalisation PPP. Pour analyser de manière exhaustive la signalisation PPP, il est essentiel d’étudier les différentes holoenzymes au sein d’une cellule ou d’un tissu. De grands progrès ont été réalisés dans l’étude du kinome humain grâce à l’utilisation de perles inhibitrices de kinases, appelées perles inhibitrices multiplex ou kinobeads, une stratégie protéomique chimique où les inhibiteurs de kinases sont immobilisés sur des perles et où la spectrométrie de masse est utilisée pour identifier les kinases enrichies et leurs interacteurs 10,11,12,13.

Nous avons établi une approche similaire pour étudier la biologie des PPP. Cette technique implique la capture d’affinité de sous-unités catalytiques PPP à l’aide de billes avec un inhibiteur de PPP non sélectif immobilisé appelé microcystine-LR (MCLR) appelé billes inhibitrices de phosphatase (PIBs)14,15. Contrairement à d’autres méthodes qui nécessitent le marquage endogène ou l’expression de sous-unités PPP exogènes susceptibles de modifier l’activité ou la localisation des protéines, LE PIB-MS permet l’enrichissement des sous-unités catalytiques PPP endogènes, de leurs sous-unités régulatrices et d’échafaudage associées et des protéines en interaction (appelées PPPome) à partir de cellules et de tissus à un moment donné ou dans des conditions de traitement spécifiques. McLR inhibe PP1, PP2A, PP4-6, PPT et PPZ à des concentrations nanomolaires, ce qui rend les PIB très efficaces pour enrichir le PPPome16. Cette méthode peut être mise à l’échelle pour être utilisée sur n’importe quel matériau de départ, des cellules aux échantillons cliniques. Ici, nous décrivons en détail l’utilisation des PIB et de la spectrométrie de masse (PIB-MS) pour capturer, identifier et quantifier efficacement le PPPome endogène et ses états de modification.

Figure 1
Figure 1 : Résumé visuel du protocole PIB-MS. Dans une expérience PIB-MS, des échantillons peuvent être obtenus sous diverses formes, des cellules aux tumeurs. L’échantillon est collecté, lysé et homogénéisé avant l’enrichissement en PPP. Pour enrichir les PPP, le lysat est incubé avec des PIB avec ou sans inhibiteur de PPP, tel que LE MCLR. Les PIB sont ensuite lavés et les PPP sont élués dans des conditions de dénaturation. Les échantillons sont préparés pour l’analyse par spectrométrie de masse par élimination des détergents par enrichissement en protéines SP3, digestion tryptique et dessalement. Les échantillons peuvent ensuite être éventuellement marqués TMT avant l’analyse par spectrométrie de masse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

PIB-MS implique la lyse et la clarification des cellules ou des tissus, l’incubation du lysat avec des PIB, l’élution et l’analyse de l’éluat via des approches basées sur le transfert occidental ou la spectrométrie de masse (Figure 1). L’ajout de MCLR libre peut être utilisé comme contrôle pour distinguer des liants PIB spécifiques des interacteurs non spécifiques. Pour la plupart des applications, une approche sans étiquette peut être utilisée pour identifier directement les protéines dans les éluats. Dans les cas où une plus grande précision dans la quantification ou l’identification des espèces de faible abondance est nécessaire, un traitement supplémentaire avec l’étiquetage en tandem masse-étiquette (TMT) peut être utilisé pour augmenter la couverture et diminuer les intrants.

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Protocol

REMARQUE: La génération de PIB se fait comme décrit par Moorhead et al., où 1 mg de microcystine et environ 6 mL de sépharose sont couplés pour générer des PIBs avec une capacité de liaison allant jusqu’à 5 mg / mL17.

1. Préparation de l’échantillon

REMARQUE: Une quantité de départ typique pour PIB-MS est de 1 mg de protéines totales par condition. Pour cette expérience, environ 2,5 x 106 cellules HeLa ont été utilisées pour extraire 1 mg de protéines. Ce calcul doit être effectué pour chaque lignée cellulaire ou tissu utilisé dans une expérience18. Si l’échantillon est limité et qu’il est impossible d’obtenir 1 mg, la quantité d’entrée peut être réduite avec une perte mineure de détection de sous-unité PPP. Alternativement, l’étiquetage TMT peut être utilisé pour permettre le mélange de toutes les conditions dans un échantillon, augmentant ainsi la sensibilité de détection comme indiqué à l’étape 9.

  1. Prélever des échantillons de tissus ou des granulés de cellules. Pour les granulés cellulaires, prélever les cellules par centrifugation à 277 x g pendant 2 min à température ambiante (RT), prélever les milieux et laver les cellules avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Les granulés cellulaires peuvent être conservés à -80 °C pendant plusieurs mois.
  2. Préparer le tampon de lyse (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 % Triton X-100 (vol/vol), 5 mM acide bêta-glycérophosphorique sel disodique pentahydraté, 1:500 (vol/vol) inhibiteur de la protéase cocktail III) et garder sur la glace. Faites assez pour lyser et laver tous les échantillons. Si vous commencez avec 1 mg de protéines par condition, faites environ 3 mL de tampon par échantillon pour la lyse et les lavages.
    REMARQUE: Le tampon de lyse noté à cette étape est une solution détergente douce, qui peut ne pas être suffisante pour solubiliser les membranes insolubles ou les protéines associées au cytosquelette. D’autres détergents pourraient être explorés pour améliorer la solubilisation. Une gamme de concentrations de NaCl et de Triton-X-100 a été testée, et les concentrations ci-dessus se sont avérées optimales pour une liaison à faible niveau de fond et à haute phosphatase.
  3. Ajouter un tampon de lyse réfrigéré aux échantillons. Pour la lyse de 1 mg de protéines, utilisez 1 mL de tampon. Si l’échantillon est congelé, ajoutez un tampon de lyse et laissez l’échantillon décongeler sur de la glace dans le tampon.
    1. Pour les cellules, homogénéisez les échantillons par sonification, en gardant les cellules sur la glace entre les impulsions. Soniquer les échantillons à 15% d’amplitude avec trois impulsions de 15 s. Cela peut varier en fonction du sonicateur utilisé (voir tableau des matériaux).
    2. Pour les tissus, homogénéiser d’abord les échantillons à l’aide d’un broyeur de tissus Dounce pour broyer le tissu jusqu’à ce qu’il soit liquéfié avant de soniquer, comme décrit à l’étape 1.3.1.
  4. Clarifier l’échantillon homogénéisé de débris insolubles par centrifugation à 21 130 x g pendant 15 min à 4 °C. Ensuite, sans perturber les pastilles ou les lipides formés qui se sont accumulés sur le côté des tubes, transférez les lysats dans de nouveaux tubes. Prélever 100 μL de l’échantillon de pré-enrichissement du lysat clarifié si désiré et conserver à -20 °C. Assurez-vous de garder les lysats sur la glace.
  5. Déterminer la teneur totale en protéines de chaque échantillon en effectuant un test de quantification des protéines, tel qu’un test d’acide bicinchoninique (BCA), sur une petite aliquote de chaque échantillon, conformément aux instructions du fabricant. Assurez-vous que les lysats sont conservés sur la glace pendant le test BCA.
  6. Après avoir effectué le test BCA, transférer une quantité équivalente de protéines dans de nouveaux tubes et diluer avec un tampon de lyse pour vous assurer que chaque tube a la même concentration de protéines (par exemple, 1 mg / mL). Si l’expérience nécessite un contrôle inhibiteur de PPP, préparez deux aliquotes de chaque échantillon qui ont la même teneur en protéines et passez à l’étape 1.7. Si des témoins inhibiteurs de PPP ne sont pas nécessaires, passez à l’étape 2. Assurez-vous que les échantillons sont conservés sur la glace.
    REMARQUE: Il est essentiel que des concentrations égales de protéines soient utilisées par condition dans une analyse PIB-MS. Les témoins inhibiteurs de PPP sont utilisés pour distinguer les liants spécifiques aux PIB du fond non spécifique.
  7. Pour le contrôle de l’inhibiteur de PPP, traiter un échantillon avec un MCLR libre (1 μM) et l’autre avec un volume égal de DMSO comme témoin. Vortex les échantillons doucement et les incuber sur de la glace pendant 15 min.
    REMARQUE: Le traitement MCLR des lysats bloque la liaison des sous-unités catalytiques PPP, mais pas les protéines qui se lient non spécifiquement aux PIB dans les échantillons. Soyez prudent lorsque vous manipulez le MCLR car il est toxique. Reportez-vous aux précautions de manipulation dans la Table des matériaux.

2. Préparation des PIB

  1. Déterminez la quantité de PIB nécessaire pour l’expérience. Pour 1 mg de protéines, on peut obtenir 1 à 3 μg de PPP et de protéines en interaction; utiliser au moins 10 μL de résine PIBs solide par échantillon pour minimiser la perte de billes. La capacité de liaison des PIB est de 3-5 mg/mL14,17.
  2. Transférer la quantité appropriée de PIB dans un tube de 1,5 mL et les laver 3x avec 0,5 mL de tampon de lyse en vortexant doucement puis en centrifugant à 376 x g pendant 30 s à RT entre les lavages. Évitez de pipeter les billes lorsque vous retirez le tampon de lyse entre les lavages.
  3. Faire une solution PIB/tampon à 50 % (vol/vol) en ajoutant une quantité appropriée de tampon de lyse aux PIB lavés. Pipetez doucement de haut en bas et faites tourbillonner la pointe de pipet dans la boue pour remettre en suspension les PIB.
  4. Transférer 20 μL de la boue dans un nouveau tube de 1,5 mL contenant déjà 0,5 mL de tampon de lyse. Le tampon de lyse dans le tube aide à expulser les perles de la pointe de la pipette. Faites-le jusqu’à ce qu’il y ait suffisamment de tubes contenant une quantité égale de PIB pour chaque échantillon.
  5. Faites tourner les tubes à 376 x g pendant 30 s à TA. Assurez-vous que tous les tubes contiennent une quantité égale de résine de perles. Jetez tout surnageant, en ne laissant que de la résine solide et un maximum de 50 μL de tampon de lyse dans chaque tube.

3. Incubation de PIBs avec des lysats

  1. Transférez les lysats de l’étape 1.6. ou l’étape 1.7. au tube correctement étiqueté contenant des PIB de l’étape 2. Faire pivoter le lysat à 8 tr/min avec les PIBs pendant 1 h à 4 °C.

4. Lavage des PIBs

  1. Centrifugez les PIBs à 376 x g pendant 30 s à 4 °C pour recueillir les billes. Retirez et jetez le surnageant, en économisant une aliquote de 100 μL pour l’analyse post-enrichissement, si vous le souhaitez.
  2. Lavez les PIBs 3x en ajoutant 0,5 mL de tampon de lyse aux billes, en inversant les tubes (vortex non recommandé), en collectant les billes par centrifugation à 376 x g pendant 30 s à 4 °C, et en retirant le tampon de lyse des billes décantées, en prenant soin de ne pas perturber la pastille de perle.

5. Élution des PPP des PIB

  1. Après le lavage final, retirez autant de tampon de lyse que possible sans pipeter aucun des PIB. Créez un tampon d’élution contenant 2% de FDS (vol/vol) et éluez les PPP des PIBs en ajoutant suffisamment de volume de tampon d’élution pour être 4x-5x le volume des PIB. Par exemple, si 10 μL de PIB sont utilisés, utilisez 50 μL de tampon d’élution. Incuber les PIBs avec le tampon d’élution à 65 °C pendant 1 h pour éluer les PPP des PIB.
  2. Après élution, recueillir l’éluat en centrifugant les tubes à 376 x g pendant 30 s à RT et en pipetant l’éluat dans un tube séparé, en prenant soin de ne pas transférer de PIBs. Utilisez l’éluat pour l’analyse par transfert de Western ou pour les analyses de spectrométrie de masse. Les éluats peuvent être conservés à -20 °C jusqu’à plusieurs mois.
  3. Pour régénérer les PIBs en vue d’une utilisation ultérieure, incuber les billes dans 2% de SDS (vol/vol), en tournant à 8 tr/min à RT pendant 1 h. Lavez-les 3x-5x dans 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) avec rotation pendant 30 min par lavage. Après tous les lavages, stocker les PIB dans un tampon de stockage Tris-HCl (pH 7,5) de 25 mM avec de l’azoture de sodium (0,05 % p/vol).
  4. Analyser les éluats par western blotting ou spectrométrie de masse. L’analyse par spectrométrie de masse des éluats du FRP est décrite ci-dessous.

6. Élimination des détergents

REMARQUE: Diverses approches peuvent être utilisées pour retirer le détergent des échantillons d’éluat pour l’analyse de la SEP. Nous avons constaté que la préparation d’échantillons améliorée en phase solide (SP3) à pot unique, décrite par Hughes et al., fonctionne bien19.

  1. Ajouter 0,5 μL de billes SP3 à 50 μL d’éluat de l’étape 5.2 ci-dessus. Utilisez des billes SP3 dans un rapport de 10:1 (μg:μg) ou d’au moins 0,5 μg/μL (la solution mère est de 50 μg/μL). Vortex doucement les perles et élucident.
  2. Ajouter un volume d’élution d’éthanol à 100 % au mélange perle-éluat (p. ex., si 50 μL de l’éluat ont été utilisés, utiliser 50 μL d’éthanol à 100 %). Incuber les échantillons pendant 5 min dans un thermomélangeur réglé pour agiter à 1000 tr/min à 24 °C.
  3. Pour collecter toutes les perles, placez-les dans un support à tubes magnétiques. Une fois les billes recueillies, jeter le surnageant et laver les perles avec 0,5 mL d’éthanol à 80% (vol/vol) 3x. Pour le lavage, remettez en suspension les perles par vortex, collectez les perles en les plaçant dans le support à tubes magnétiques et jetez le surnageant entre les lavages.
  4. Lavez les billes une fois de plus avec 0,5 mL d’acétonitrile à 100 % (ACN) pour éliminer toute trace d’éthanol, en éliminant autant d’ACN que possible.

7. Digestion des protéines

  1. Effectuer une dilution 1:100 de la trypsine (concentration finale de 0,004 μg/μL) dans 166 mM HEPES (pH 8,5) et ajouter 30 μL de cette solution de trypsine à chaque tube avec les billes, en les réapprouvant par vortex.
  2. Incuber le mélange de billes de trypsine SP3 dans le thermomélangeur à 1000 tr/min à 37 °C pendant 5 h ou toute la nuit à 30 °C. Placez les tubes dans le rack magnétique pour recueillir les billes et retirez les digestes dans de nouveaux tubes.
  3. Pour une analyse sans étiquette, éteindre la réaction en ajoutant 20 % d’acide trifluoroacétique (TFA) (vol/vol) à une concentration finale de 0,2 % de TFA (vol/vol). Vérifiez que le pH de chaque échantillon est compris entre 2 et 3 avec un papier pH. Si ce n’est pas le cas, ajoutez de petites aliquotes supplémentaires de 20 % d’AFE jusqu’à ce que cela soit réalisé. Les échantillons doivent être acidifiés de manière appropriée avant le dessalement. Passez à l’étape 8.
  4. Pour l’étiquetage TMT des échantillons, ne pas acidifier et passer à l’étape 9.

8. Dessalage du digest

  1. Préparer une pointe d’étape pour chaque échantillon en emballant une pointe compatible avec le solvant MS de 200 μL avec de la résine C18 comme décrit par Rappsilber et al.20. Utilisez une aiguille émoussée pour presser deux disques en matériau C18, en vous assurant que les disques restent dans l’aiguille. Transférez les disques dans la pointe compatible avec le solvant MS à l’aide d’un piston à fil mince pour expulser les disques de l’aiguille.
    REMARQUE: Il est essentiel d’utiliser des embouts compatibles avec les solvants MS à partir de ce point du protocole, car d’autres embouts de pipette peuvent lessiver des produits chimiques dans les échantillons qui peuvent être détectés par spectrométrie de masse.
  2. Équilibrez chaque pointe d’étape avec 30 μL de 100% MeOH, puis avec 30 μL de 60% MeOH (vol/vol), suivi de 30 μL de 0,1% TFA (vol/vol). Poussez chaque solution à travers la pointe de la scène avec une seringue. Fixez une pointe de pipette à l’extrémité d’une seringue avec un film transparent pour augmenter le contact entre la seringue et la pointe de la scène si nécessaire. Assurez-vous de ne jamais laisser le matériau C18 à l’intérieur de la pointe de la scène sécher.
  3. Ajouter la digestion peptidique acidifiée de l’étape 7.3 à la pointe de l’étape étiquetée et pousser à travers la pointe de la scène avec une seringue, en faisant attention à ne pas laisser la pointe de la scène sécher complètement.
  4. Lavez chaque échantillon 2x avec 30 μL de 0,1% TFA (vol/vol). Éluez les peptides de chaque extrémité d’étape en ajoutant 30 μL de 60% de MeOH (vol / vol) à chaque extrémité d’étape et en expulsant le tout de la pointe avec la pression de la seringue dans un nouveau tube étiqueté. C’est la seule étape où le matériau C18 est complètement séché.
  5. Sécher chaque échantillon par centrifugation sous vide. Les peptides séchés peuvent être conservés à -20°C pendant plusieurs mois. Les échantillons sont maintenant prêts pour l’analyse par spectrométrie de masse sans étiquette. N’utilisez que la moitié de l’échantillon pour l’analyse sur le spectromètre de masse et l’autre moitié pour la réinjection si nécessaire. S’assurer de l’utilisation d’une méthode de spectromètre de masse appropriée pour l’analyse.

9. Étiquetage TMT

REMARQUE: L’étiquetage des étiquettes de masse en tandem est utilisé pour multiplexer les échantillons à des fins d’analyse quantitative. Un flacon de 0,8 mg de réactif TMT est suffisant pour marquer jusqu’à 0,8 mg de protéine21. Dans une expérience de prélèvement PIB commençant avec 1 mg de protéine, 1 à 3 μg de sous-unités de phosphoprotéines sont obtenus. Le protocole ci-dessous est optimal pour jusqu’à 10 μg de protéines.

  1. Reconstituer un flacon de 0,8 mg de réactif TMT dans 80 μL d’ACN anhydre.
  2. Étiquetez chaque échantillon de l’étape 7.4 avec une étiquette TMT différente pour un maximum de 18 canaux. Assurez-vous de noter quelle étiquette TMT est ajoutée à chaque échantillon. Ajouter 2 μL du réactif TMT et 2 μL d’ACN au condensé peptidique, vortex doucement pour mélanger, centrifuger à 376 x g pendant 30 s à RT pour prélever l’échantillon et incuber à RT pendant 1 h pour étiqueter l’échantillon.
  3. Pour tester l’efficacité de l’étiquetage TMT, faites un échantillon de vérification d’étiquette en combinant 1 μL de chaque réaction de marquage dans un tube de 0,5 mL contenant 9 μL d’eau de qualité LC-MS et 1 μL d’hydroxylamine à 10% (vol/vol) pour éteindre la réaction. Placer les échantillons non scellés étiquetés restants dans un congélateur à -80 °C. Les échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs jours pendant que l’efficacité de l’étiquetage est évaluée.
  4. Acidifier l’échantillon de contrôle de l’étiquette TMT en ajoutant 30 μL de TFA à 0,1 % (vol/vol). Vérifiez que le pH est compris entre 2 et 3. Sinon, ajoutez 20% de TFA (vol/vol) jusqu’à ce que ce pH soit atteint. Dessalez l’échantillon de contrôle de l’étiquette par basculement par étape, comme décrit aux étapes 8.1.-8.5.
  5. Analysez l’échantillon de vérification de l’étiquette TMT sur le spectromètre de masse pour évaluer l’efficacité de l’étiquetage. Filtrez les résultats de la recherche à un taux de fausse découverte (FDR) de 1% au niveau peptidique et déterminez l’efficacité d’étiquetage21,22.
  6. Les peptides entièrement marqués TMT ont un réactif TMT au N-terminus et à toutes les lysines. Quantifiez les intensités ioniques du rapporteur TMT et comparez leur somme totale sur tous les canaux. L’échantillon est suffisamment marqué lorsque >95% de tous les peptides sont marqués et que les intensités de somme des ions rapporteurs TMT sont comparables
    REMARQUE: Outre l’étiquetage incomplet, les différences dans les intensités d’ions rapporteurs TMT additionnées pourraient être le résultat d’un pipetage inexact de l’échantillon d’essai de 1 μL. Il pourrait également refléter une véritable observation biologique, auquel cas tous les répliques devraient afficher le même comportement.
  7. Retirer les échantillons non immêlés du stockage à -80 °C et les décongeler. S’ils ne sont pas entièrement étiquetés, ajouter 1 μL du réactif TMT approprié à l’échantillon comme indiqué ci-dessus, incuber pendant 1 h et répéter la vérification de l’étiquette TMT. Si les échantillons sont entièrement étiquetés, passez à l’étape 9.8.
  8. Lorsqu’il est complètement marqué, ajouter 2 μL d’hydroxylamine à 10 % (vol/vol) aux réactions TMT pour éteindre le marquage. Incuber les échantillons à TA pendant 15 min. Une fois trempés, les échantillons peuvent être conservés à -80 °C pendant plusieurs mois.
  9. Combinez tous les canaux TMT trempés et ajoutez 2 μL de TFA à 20 % (vol/vol) pour acidifier la réaction. Vérifiez le pH de la réaction combinée, en vous assurant qu’il se situe entre 2 et 3. Sinon, ajoutez de petites aliquotes de 20% de TFA jusqu’à ce que le pH souhaité soit atteint. Ceci est essentiel pour un dessalage approprié.
  10. Prélever l’ACN par centrifugation sous vide pendant 30 min et dessaler l’échantillon comme décrit ci-dessous.

10. Dessalage de l’échantillon combiné marqué TMT

  1. Utilisez une plaque de dessalement SPE C18 avec la capacité protéique appropriée (2 mg de sorbant est généralement suffisant pour cette application) pour dessaler le réactif TMT combiné. Équilibrer le puits avec 200 μL de 60 % de MeOH (vol/vol) et 200 μL de 10 % de MeOH/0,1 % de TFA (vol/vol).
  2. Chargez les peptides acidifiés marqués TMT à partir de l’étape 9.10. sur la plaque de dessalement. Laver les puits d’échantillon 2x avec 200 μL de 10% MeOH/0,1% TFA (vol/vol).
  3. Éluez les peptides avec 100 μL de 60% de MeOH (vol/vol). Sécher les échantillons par centrifugation sous vide. L’échantillon séché marqué TMT peut être conservé à -80 °C pendant plusieurs mois.
  4. Pour l’analyse par spectrométrie de masse de l’échantillon marqué TMT, injecter la moitié de l’échantillon et enregistrer l’autre moitié si une réinjection est nécessaire.
    REMARQUE: Les quantités d’injection sur la spectrométrie de masse varient en fonction de la colonne spécifique, de la configuration de l’instrument et du type d’échantillon.

11. Analyse des données

REMARQUE : Les méthodes de filtrage et d’analyse des données varient et dépassent le cadre du présent protocole, mais les notes d’analyse suivantes sont incluses pour fournir des conseils spécifiques au type de données résultant de ce protocole.

  1. Recherchez les données brutes de spectrométrie de masse dans une base de données de protéome spécifique à l’espèce en fonction de l’origine de l’échantillon de cellules ou de tissus utilisés. Ici, Comet a été utilisé comme algorithme de recherche23.
  2. Filtrez les résultats de la recherche avec un FDR de 1% en ajustant les paramètres spécifiques à l’algorithme de recherche22. Pour une quantification sans étiquette, utilisez les mesures de la surface de crête MS1 pour quantifier les données. Pour les échantillons marqués TMT, utilisez les intensités d’ions rapporteurs dérivées de MSn pour la quantification. Pour la signification statistique, analysez les échantillons en triples biologiques.
  3. Pour identifier de novo les sous-unités PPP et leurs interacteurs, assurez-vous que des échantillons biologiques triplicates d’échantillons inhibés par MCLR et traités par DMSO sont comparés. Pour comparer le PPPome dans différentes conditions ou lors d’un traitement médicamenteux, assurez-vous que des triples biologiques de chaque condition ou traitement médicamenteux ont été générés.
  4. Filtrer les données de sorte que seules les protéines ayant un nombre total de peptides >1 dans au moins deux des trois échantillons traités par contrôle du DMSO sont présentes. La concurrence MCLR ne concurrence pas toujours toutes les liaisons catalytiques de sous-unités. En outre, certaines sous-unités catalytiques PPP peuvent ne pas coller spécifiquement à la résine sépharose. Pour tenir compte de l’une ou l’autre possibilité tout en filtrant les protéines qui ne se lient pas spécifiquement à la résine, éliminez les protéines dont le nombre total de peptides dans l’état traité par MCLR est supérieur à celui de toute sous-unité catalytique PPP.
  5. Exclure de l’analyse14 les contaminants courants, tels que la kératine, le collagène, les protéines ribosomiques 40S et 60S, et les ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes qui ne sont pas des sous-unités PPP.
  6. Importez les données filtrées dans Perseus en cliquant sur Téléchargement de matrice générique dans la section Charger24,25. Le journal2 transforme les données en accédant à Basic > Transform, en sélectionnant les données et en spécifiant la fonction de transformation, dans ce cas log2(x).
  7. Imputez les valeurs manquantes d’une distribution normale en accédant à Imputation > Remplacer les valeurs manquantes de la distribution normale, en sélectionnant les données et en spécifiant la largeur (0,3 par défaut) et le décalage vers le bas (par défaut 1,8) pour le calcul. Effectuez la normalisation des quantiles en accédant à Normaliser > Normalisation des quantiles.
  8. Calculez les ratios log2 et les valeurs p du test T de Student pour les conditions respectives. Tout d’abord, annotez les données en accédant à Annot. Lignes > Lignes d’annotation catégorielles. Effectuez le test T en allant dans Tests > Tests à deux échantillons et en sélectionnant les groupes à comparer, le test à effectuer et la méthode de correction des tests d’hypothèses multiples utilisée pour la troncature.
    REMARQUE: Pour l’identification de novo , une protéine est considérée comme une protéine interagissant avec ppp si son abondance est statistiquement significative dans la condition traitée par MCLR par rapport au DMSO, avec un changementlogarithmique de 2 fois supérieur au changement de pli minimum de toute sous-unité PPP connue spécifiquement liée.

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Representative Results

Figure 2
Figure 2 : Identification de liants PIB spécifiques. (A) Divers types de tissus ou de cellules peuvent être analysés via PIB-MS. Les cellules HeLa en triplicate biologique ont été soit traitées avec du DMSO ou l’inhibiteur de PPP MCLR, incubées avec des PIBs, et analysées via LC-MS/MS. (B) Volcano plot de l’analyse PIB-MS dans les lysats cellulaires HeLa traités par DMSO et MCLR, avec des liants PIB spécifiques montrés en rouge. Les sous-unités catalytiques PPP sont étiquetées et indiquées en bleu. Les nouvelles sous-unités PPP candidates ou les protéines en interaction sont représentées en noir. Les liants non spécifiques sont représentés en gris. (C) Nuage de points de la zone log2 de deux répliques biologiques à partir de lysats cellulaires HeLa traités avec du DMSO pour démontrer la reproductibilité de l’enrichissement. Les liants spécifiques aux PIB sont indiqués en rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Analyse en réseau de toutes les sous-unités PPP et protéines interagissant avec PPP identifiées dans les cellules HeLa. Ces protéines se sont avérées être des interacteurs PIB spécifiques dans le pull down HeLa PIB avec et sans MCLR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour démontrer la performance des PIB, nous avons effectué une expérience de prélèvement PIB dans des cellules HeLa pour identifier les PPP et leurs interacteurs (Figure 2A). Les cellules HeLa ont été cultivées en triple exemplaire biologique et lysées. Chaque lysat triplicate a été divisé en deux, où la moitié a été traitée avec MCLR pendant 15 minutes pour empêcher la liaison des sous-unités catalytiques PPP ou DMSO avant l’enrichissement du PIB. À la suite de l’enrichissement du FRP, une comparaison sans étiquette de l’abondance des protéines quantifiées dans les échantillons traités au DMSO et traités par MCLR a été effectuée pour distinguer les interacteurs spécifiques des interacteurs non spécifiques (figure 2B). Dans l’analyse, nous avons détecté toutes les sous-unités catalytiques PPP sensibles au MCLR PP1ca, PP1cb, PP1cc, PP2Aca, PP2Acb, PP4c, PP5c et PP6c. Dans les échantillons traités par DMSO, les abondances (log2 zones de quantification des protéines) étaient fortement corrélées, indiquant la reproductibilité (Figure 2C), mais lors du traitement par MCLR, l’abondance des protéines catalytiques PPP ou interactions PPP dans les extractions PIB a été considérablement réduite (Figure 2B). Dans cette analyse, nous avons identifié 92 sous-unités PPA et des interacteurs PPP spécifiques (voir le tableau supplémentaire 1), ce qui est comparable à une analyse précédente de PIB-MS dans les cellules HeLa14 (figure 3).

Tableau supplémentaire 1: Données sur les États membres de l’analyse représentative du PIB-EM. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

PIB-MS est une approche protéomique chimique utilisée pour profiler quantitativement le PPPome à partir de diverses sources d’échantillons en une seule analyse. Beaucoup de travail a été fait en utilisant des billes inhibitrices de kinase pour étudier le kinome et comment il change dans le cancer et d’autres états pathologiques 10,11,12,13. Pourtant, l’étude du PPPome est à la traîne. Nous prévoyons que cette approche est capable de combler cette lacune et de faire la lumière sur la régulation de la déphosphorylation cellulaire. Ici, nous montrons que, en utilisant des PIB, nous pouvons enrichir les composants catalytiques et non cataalytiques de PP1, PP2A, PP4, PP5 et PP6. Nous sommes également en mesure d’identifier de nouveaux interacteurs PPP candidats dans une variété de lignées cellulaires, de types de tissus et d’organismes.

Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole PIB-MS qui ne doivent pas être négligées. Il s’agit notamment de l’incorporation de contrôles et de répliques appropriés, de l’apport de quantités égales de protéines dans tous les échantillons, du maintien de conditions non dénaturantes pendant la préparation de l’échantillon, de l’incubation de l’échantillon avec des PIB et du lavage des PIB. En ce qui concerne les témoins et les répliques, il est important que la moitié de chaque échantillon soit traitée avec un inhibiteur de PPP si l’objectif est d’identifier de nouvelles sous-unités et interacteurs de PPP. Ceci est nécessaire pour différencier les interacteurs spécifiques et non spécifiques du FRP. Si l’on cherche à identifier comment la sous-unité PPP connue ou l’expression de l’interacteur PPP change à travers les types de cellules ou de tissus et les phases du cycle cellulaire, ou sur divers traitements médicamenteux, il est essentiel d’organiser une liste de sous-unités et d’interacteurs PPP connus à des fins de comparaison. De plus, ces expériences sont généralement réalisées en triple exemplaire biologique pour assurer la confiance statistique. Un apport égal en protéines par échantillon est essentiel pour la reproductibilité des données entre les échantillons; il garantit également que les différences dans la sous-unité PPP ou l’abondance des interacteurs ne sont pas simplement dues à des différences dans l’apport en protéines. Un dosage protéique tel qu’un BCA doit être utilisé pour déterminer la concentration en protéines dans chaque échantillon. Enfin, des conditions non dénaturantes dans la préparation des échantillons, l’enrichissement du PIB et le lavage du PIB sont essentielles pour s’assurer que les protéines restent dans leur état natif. Cela préserve les interactions des sous-unités PPP.

PIB-MS est un outil puissant pour interroger le PPPome, mais il comporte plusieurs limitations. Les PIB peuvent s’enrichir pour les composants catalytiques et non cataalytiques de PP1, PP2A, PP4, PP5 et PP6, mais pas PP2B ou PP7, puisque MCLR n’inhibe pas ces phosphatases à des concentrations nanomolaires. Il est important de noter que cet outil est adapté pour faciliter l’identification et la quantification des holoenzymes PPP endogènes sensibles aux MCLR, telles que celles notées. PIB-MS est incapable de détecter les holoenzymes PPP qui sont inhibées par des inhibiteurs endogènes de PPP qui bloquent le site actif PPP, tels que α4 et SET14. Cette technique ne nécessite pas l’expression exogène de sous-unités PPP marquées ni l’utilisation d’anticorps spécifiques au PPP. Comme d’autres stratégies d’enrichissement par affinité utilisant des matrices à base de sépharose, PIB-MS est sujette à la liaison de protéines non spécifiques. Cependant, l’ajout de MCLR libre en tant que témoin négatif permet de distinguer les interacteurs spécifiques des interacteurs non spécifiques, ce qui permet d’identifier de nouvelles sous-unités PPP et des protéines en interaction. En outre, les interacteurs non spécifiques peuvent être réduits grâce à des lavages supplémentaires et à l’utilisation prudente de la quantité appropriée de PIB.

Nous avons utilisé PIB-MS pour comparer les modèles d’expression PPP de diverses lignées cellulaires cancéreuses, y compris le cancer du sein et le glioblastome14. Nous avons constaté que ces types de cancer ont des modèles d’expression PPP uniques indiquant leur origine14. Les PPA sont parmi les enzymes les plus conservées 2,3. Nous avons pu démontrer que PIB-MS est efficace dans l’analyse du PPPome dans les tissus de levure et de souris14. PIB-MS peut également être utilisé pour identifier les différences dans les modèles d’expression ppp dans diverses conditions, telles que les échantillons interphasiques par rapport aux échantillons mitotiques15. Ainsi, PIB-MS fournit des informations sur les réseaux de phosphoprotéines phosphatases et élargit notre compréhension de la régulation ppp à travers de multiples lignées cellulaires et états pathologiques, ainsi que sur les traitements médicamenteux.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer et aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

A.N.K. reconnaît le soutien des NIH R33 CA225458 et R35 GM119455. Nous remercions les laboratoires Kettenbach et Gerber pour leur discussion utile.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (ACN) Honeywell AH015-4 CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.
Anhydrous Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004-100ML CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.
Benchtop centrifuge Eppendorf model no. 5424
Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate Acros Organics 410991000
Centrifuge Eppendorf model no. 5810 R 15 amp version
Distilled water
DMSO Fisher Scientific BP231-100
Dounce tissue grinder Fisherbrand Pellet Pestles 12-141-363
Empore solid phase extraction disk, C18 CDS Analytical 76333-132
Eppendorf tubes, 1.5 mL Eppendorf 22363204 CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.
Eppendorf tubes, 2 mL Eppendorf 22363352 CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.
Extraction plate manifold Waters WAT097944
Falcon tubes, 50 mL VWR 21008
Generic blunt end needle and plunger
Generic magnetic separation rack
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen chloride (HCl) VWR Chemicals BDH BDH3028 CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood.
Hydroxylamine solution 50% (wt/vol) Sigma-Aldrich 467804
Incubator, 65 °C VWR model no. 1380FM
Koptec Pure Ethanol, 200 Proof Decon Labs V1001
Methanol for HPLC (MeOH) Sigma-Aldrich 34860-4L-R CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.
Microcystin LR (MCLR) Cayman Chemical 10007188 CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact.
PBS, 1× without calcium and magnesium, pH 7.4 ± 0.1 Corning  21-040-CV
pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers Fisher Scientific M1095310001
PIBs For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pipette tips, 10 μL Eppendorf 22491504 CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.
Pipette tips, 1000 μL Eppendorf 22491555 CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.
Pipette tips, 200 μL Eppendorf 22491539 CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.
plastic syringe, 10 mL BD 309604
Protease inhibitor cocktail III Research Products International P50700-1
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer  Thermo Scientific
Refrigerated benchtop centrifuge Eppendorf model no. 5424 R
Rotator (Labquake Shaker Rotisserie) Thermo Scientific 13-687-12Q 8 rpm rotation
Sample collection plate, 96- well, 1 mL Waters WAT058957
SDS Fisher Scientific BP1311-1
Sequencing grade modified trypsin Promega V511C
Sodium azide EMD Chemicals SX0299-1 CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals.
Sodium chloride (NaCl) Fisher Chemical S27110
Sonicator (Branson digital sonifier) model no. SFX 250
SPE C18 desalting plate Waters 186001828BA
SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads) Cytiva 6.51521E+13
Thermomixer Eppendorf model no. 5350
TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 × 0.8 mg per tag ThermoFisher A37725
Trifluoroacetic acid (TFA) Honeywell T6508-25ML CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood.
Tris Base Research Products International T60040
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
Vacuum centrifuge and vapor trap Thermo Scientific model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105
Vortexer (Vortex-Genie 2) Scientific Industries
Water LC-MS Honeywell LC365-4

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References

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Biochimie numéro 182
Une approche basée sur la spectrométrie de masse pour identifier les phosphoprotéines phosphatases et leurs interacteurs
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Smolen, K. A., Kettenbach, A. N. A… More

Smolen, K. A., Kettenbach, A. N. A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors. J. Vis. Exp. (182), e63805, doi:10.3791/63805 (2022).

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