Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En massespektrometribaseret tilgang til identifikation af fosfoproteinphosphataser og deres interaktionorer

Published: April 29, 2022 doi: 10.3791/63805
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Geisel School of Medicine at Dartmouth, 2Norris Cotton Cancer Center

Summary

Her præsenterer vi en protokol til berigelse af endogene phosphoproteinphosphataser og deres interagerende proteiner fra celler og væv og deres identifikation og kvantificering ved massespektrometribaseret proteomik.

Abstract

De fleste cellulære processer reguleres af dynamisk proteinfosforylering. Mere end tre fjerdedele af proteinerne phosphoryleres, og phosphoproteinphosphataser (PPP'er) koordinerer over 90% af al cellulær serin / threonin dephosphorylation. Deregulering af proteinfosforylering har været impliceret i patofysiologien af forskellige sygdomme, herunder kræft og neurodegeneration. På trods af deres udbredte aktivitet er de molekylære mekanismer, der styrer PPP'er, og dem, der kontrolleres af PPP'er, dårligt karakteriseret. Her beskrives en proteomisk tilgang kaldet phosphatasehæmmerperler og massespektrometri (PIB-MS) for at identificere og kvantificere PPP'er, deres posttranslationelle modifikationer og deres interagerer på så lidt som 12 timer ved hjælp af en hvilken som helst cellelinje eller væv. PIB-MS anvender en ikke-selektiv PPP-hæmmer, microcystin-LR (MCLR), immobiliseret på sepharose perler til at fange og berige endogene PPP'er og deres tilknyttede proteiner (kaldet PPPome). Denne metode kræver ikke eksogen ekspression af mærkede versioner af PPP'er eller anvendelse af specifikke antistoffer. PIB-MS tilbyder en innovativ måde at studere de evolutionært bevarede PPP'er og udvide vores nuværende forståelse af dephosphorylationssignalering.

Introduction

Proteinfosforylering styrer de fleste cellulære processer, herunder men ikke begrænset til reaktionen på DNA-skader, vækstfaktorsignalering og passage gennem mitose 1,2,3. I pattedyrceller phosphoryleres størstedelen af proteinerne ved en eller flere serin-, threonin- eller tyrosinrester på et eller andet tidspunkt, hvor fosfosiner og fosfothrenoner udgør ca. 98% af alle phosphoryleringssteder 2,3. Mens kinaser er blevet grundigt undersøgt i cellulær signalering, er PPP'ernes rolle i reguleringen af dynamiske cellulære processer stadig ved at dukke op.

Fosforyleringsdynamik styres af det dynamiske samspil mellem kinaser og fosfataser. I pattedyrceller er der mere end 400 proteinkinaser, der katalyserer serin / threonin phosphorylering. Over 90% af disse steder dephosphoryleres af phosphoproteinphosphataser (PPP'er), en lille familie af enzymer, der består af PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT og PPZ 2,3. PP1 og PP2A er ansvarlige for størstedelen af fosphoserin- og phosfothreonin-dephosphorylation i en celle 2,3,4. Den bemærkelsesværdige forskel i antal mellem kinaser og fosfataser og manglen på specificitet af PPP-katalytiske underenheder in vitro førte til troen på, at kinaser er den vigtigste determinant for phosphorylering 2,3. Imidlertid har flere undersøgelser vist fosfataser at etablere substratspecificitet gennem dannelsen af multimere holoenzymer 5,6,7,8,9. For eksempel er PP1 en heterodimer, der består af en katalytisk underenhed og på et givet tidspunkt en ud af de mere end 150 regulatoriske underenheder 6,7,8. Omvendt er PP2A en heterotrimer, der er dannet af et stillads (A), en regulatorisk (B) og en katalytisk (C) underenhed 2,3,9. Der er fire forskellige familier af PP2A-regulatoriske underenheder (B55, B56, PR72 og striatin), hver med flere gener, splejsningsvarianter og lokaliseringsmønstre 2,3,9. PPP'ernes multimere karakter udfylder hullet i antallet af kinaser og PPP-katalytiske underenheder. Det skaber dog analytiske udfordringer for at studere OPP-signalering. For omfattende at analysere PPP-signalering er det afgørende at undersøge de forskellige holoenzymer i en celle eller et væv. Der er gjort store fremskridt med at studere det humane kinom ved hjælp af kinasehæmmerperler, kaldet multiplexhæmmerperler eller kinobeader, en kemisk proteomisk strategi, hvor kinasehæmmere immobiliseres på perler, og massespektrometri bruges til at identificere berigede kinaser og deres interagerere 10,11,12,13.

Vi har etableret en lignende tilgang til at studere PPP biologi. Denne teknik involverer affinitetsindfangning af PPP-katalytiske underenheder ved anvendelse af perler med en immobiliseret, ikke-selektiv PPP-hæmmer kaldet microcystin-LR (MCLR) kaldet phosphatasehæmmerperler (PIBs)14,15. I modsætning til andre metoder, der kræver endogen mærkning eller ekspression af eksogene PPP-underenheder, der kan ændre proteinaktivitet eller lokalisering, giver PIB-MS mulighed for berigelse af endogene PPP-katalytiske underenheder, deres tilknyttede regulatoriske og stilladsunderenheder og interagerende proteiner (kaldet PPPome) fra celler og væv på et givet tidspunkt eller under specifikke behandlingsbetingelser. MCLR hæmmer PP1, PP2A, PP4-6, PPT og PPZ i nanomolære koncentrationer, hvilket gør PIB'er yderst effektive til berigelse for PPPome16. Denne metode kan skaleres til brug på ethvert udgangsmateriale fra celler til kliniske prøver. Her beskriver vi detaljeret brugen af PIB'er og massespektrometri (PIB-MS) til effektivt at fange, identificere og kvantificere det endogene PPPome og dets modifikationstilstande.

Figure 1
Figur 1: Visuel oversigt over PIB-MS-protokollen. I et PIB-MS-eksperiment kan prøver opnås i forskellige former, fra celler til tumorer. Prøven opsamles, lyses og homogeniseres inden PPP-berigelse. For at berige for PPP'er inkuberes lysatet med PIB'er med eller uden en PPP-hæmmer, såsom MCLR. POB'erne vaskes derefter, og OPP'er elueres under denatureringsforhold. Prøverne fremstilles til massespektrometrianalyse ved fjernelse af vaskemidler gennem SP3-proteinberigelse, tryptisk fordøjelse og afsaltning. Prøver kan derefter valgfrit TMT-mærkes inden massespektrometrianalyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

PIB-MS involverer lysis og afklaring af celler eller væv, inkubation af lysatet med PIB'er, eluering og analyse af eluatet via western blotting eller massespektrometribaserede tilgange (figur 1). Tilføjelsen af gratis MCLR kan bruges som en kontrol til at skelne specifikke PIB-bindemidler fra ikke-specifikke interagerere. Til de fleste applikationer kan en etiketfri tilgang bruges til direkte at identificere proteiner i eluater. I tilfælde, hvor der er behov for større præcision i kvantificeringen eller identifikationen af arter med lav forekomst, kan yderligere behandling med tandemmassemærkemærkning (TMT) anvendes til at øge dækningen og mindske inputtet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Genereringen af PIB'er udføres som beskrevet af Moorhead et al., hvor 1 mg mikrocystin og ca. 6 ml sepharose er koblet til at generere PIBs med en bindingskapacitet på op til 5 mg / ml17.

1. Forberedelse af prøve

BEMÆRK: En typisk udgangsmængde for PIB-MS er 1 mg totalt protein pr. tilstand. Til dette forsøg blev ca. 2,5 x 106 HeLa-celler brugt til at ekstrahere 1 mg protein. Denne beregning skal udføres for hver cellelinje eller hvert væv, der anvendes i et forsøg18. Hvis prøven er begrænset, og der ikke kan opnås 1 mg, kan mængden af input reduceres med et mindre tab af PPP-underenhedsdetektion. Alternativt kan TMT-mærkning anvendes til at tillade blanding af alle forhold i en prøve, hvilket øger detektionsfølsomheden som vist i trin 9.

  1. Indsamle vævsprøver eller cellepiller. For cellepiller opsamles celler ved centrifugering ved 277 x g i 2 minutter ved stuetemperatur (RT), medier fjernes, og cellerne vaskes med 5 ml fosfatbufferet saltvand (PBS). Cellepiller kan opbevares ved -80 °C i flere måneder.
  2. Forbered lysisbuffer (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5% Triton X-100 (vol/vol), 5 mM beta-glycerophosphorsyre dinatrium salt pentahydrat, 1:500 (vol/vol) proteasehæmmercocktail III) og opbevares på is. Lav nok til at lyse og vaske alle prøverne. Hvis der startes med 1 mg protein pr. tilstand, skal der laves ca. 3 ml buffer pr. prøve til lysis og vaske.
    BEMÆRK: Lysisbufferen, der er noteret i dette trin, er en mild vaskemiddelopløsning, som muligvis ikke er tilstrækkelig til at opløse uopløselige membraner eller cytoskeletalassocierede proteiner. Andre vaskemidler kunne undersøges for at forbedre opløseliggørelsen. En række NaCl- og Triton-X-100-koncentrationer blev testet, og ovennævnte koncentrationer viste sig at være optimale for lav baggrund og høj fosfatase-underenhedsbinding.
  3. Der tilsættes kølet lysisbuffer til prøverne. For lysis af 1 mg protein skal du bruge 1 ml buffer. Hvis prøven er frossen, tilsættes lysisbuffer og lades tø op på is i bufferen.
    1. For celler homogeniseres prøverne via sonificering og holder cellerne på is mellem impulser. Soniker prøverne ved 15% amplitude med tre 15 s impulser. Dette kan variere afhængigt af den anvendte sonikator (se Materialetabel).
    2. For væv homogeniseres prøverne først ved hjælp af en Dounce-vævssliber til at male vævet, indtil det er flydende inden sonikering som beskrevet i trin 1.3.1.
  4. Den homogeniserede prøve af uopløseligt affald klargøres ved centrifugering ved 21.130 x g i 15 minutter ved 4 °C. Derefter overføres lysaterne til nye rør uden at forstyrre de dannede pellets eller lipider, der har samlet sig på siden af rørene. 100 μL af præberigelsesprøven af det klarede lysat fjernes, hvis det ønskes, og den opbevares ved -20 °C. Sørg for at holde lysaterne på is.
  5. Det samlede proteinindhold i hver prøve bestemmes ved at udføre et proteinkvantificeringsassay, såsom et bicinchoninsyreassay (BCA), på et lille aliquot af hver prøve i henhold til producentens anvisninger. Sørg for, at lysaterne opbevares på is under BCA-analysen.
  6. Efter udførelse af BCA-assayet overføres en tilsvarende mængde protein til nye rør og fortyndes med lysisbuffer for at sikre, at hvert rør har den samme koncentration af protein (f.eks. 1 mg / ml). Hvis forsøget kræver en PPP-hæmmerkontrol, skal der fremstilles to alikvoter af hver prøve, der har samme proteinindhold, og fortsætte til trin 1.7. Hvis PPP-hæmmerkontrol ikke er nødvendig, skal du gå til trin 2. Sørg for, at prøver opbevares på is.
    BEMÆRK: Det er afgørende, at der anvendes lige proteinkoncentrationer pr. tilstand i en PIB-MS-analyse. PPP-hæmmerkontroller bruges til at skelne specifikke bindemidler til PIB'er fra den ikke-specifikke baggrund.
  7. Til PPP-hæmmerkontrol skal en prøve behandles med fri MCLR (1 μM) og den anden med et tilsvarende volumen DMSO som en kontrol. Vortex prøverne forsigtigt og inkuber dem på is i 15 min.
    BEMÆRK: MCLR-behandling af lysaterne blokerer bindingen af PPP-katalytiske underenheder, men ikke proteiner, der binder ikke-specifikt til PIB'er i prøverne. Vær forsigtig, når du håndterer MCLR, da det er giftigt. Se forholdsregler for håndtering i materialetabellen.

2. Forberedelse af PIBs

  1. Bestem mængden af PIB'er, der er nødvendige for eksperimentet. For 1 mg protein kan der opnås 1-3 μg PPP'er og interagerende proteiner; anvende mindst 10 μL fast PIBs-harpiks pr. prøve for at minimere perletab. Bindingskapaciteten for PIB'er er 3-5 mg/ml14,17.
  2. Overfør den passende mængde PIB'er til et 1,5 ml rør, og vask dem 3x med 0,5 ml lysisbuffer ved forsigtigt at hvirvle og derefter centrifugere ved 376 x g i 30 s ved RT mellem vaske. Undgå at pipettere perlerne, når du fjerner lysisbufferen mellem vaskene.
  3. Lav en 50% PIB/bufferopløsning (vol/vol) ved at tilsætte en passende mængde lysisbuffer til de vaskede PIB'er. Rør forsigtigt op og ned og hvirvl rørspidsen i gyllen for at resuspendere PIB'erne.
  4. 20 μL af gyllen overføres til et nyt 1,5 ml rør, der allerede indeholder 0,5 ml lysisbuffer. Lysisbufferen i røret hjælper med at udvise perlerne fra pipettespidsen. Gør dette, indtil der er nok rør, der indeholder en lige stor mængde PIBs til hver prøve.
  5. Spin rørene ved 376 x g i 30 s ved RT. Sørg for, at alle rør indeholder en lige stor mængde perleharpiks. Eventuelle supernatanter kasseres, idet der kun efterlades fast harpiks og højst 50 μL lysisbuffer i hvert rør.

3. Inkubation af PIB'er med lysater

  1. Overfør lysaterne fra trin 1.6. eller trin 1.7. til det passende mærkede rør, der indeholder PIB'er fra trin 2. Lysatet drejes ved 8 o /min med PIB'erne i 1 time ved 4 °C.

4. Vask af PIBs

  1. Pib'erne centrifugeres ved 376 x g i 30 s ved 4 °C for at opsamle perlerne. Supernatanten fjernes og kasseres, og der gemmes en 100 μL alikvote til analyse efter berigelse, hvis det ønskes.
  2. Pib'erne vaskes 3x ved at tilsætte 0,5 ml lysisbuffer til perlerne, invertere rørene (hvirvelstrøm anbefales ikke), opsamling af perlerne ved centrifugering ved 376 x g i 30 s ved 4 °C og fjernelse af lysisbufferen fra de bundfældede perler, idet man skal passe på ikke at forstyrre perlepillen.

5. Eluering af opp'er fra PIB'erne

  1. Efter den sidste vask skal du fjerne så meget af lysisbufferen som muligt uden at pipettere nogen af PIB'erne. Lav elueringsbuffer indeholdende 2% SDS (vol/vol), og eluter PPP'erne fra PIB'erne ved at tilføje tilstrækkeligt volumen af elueringsbuffer til at være 4x-5x volumenet af PIB'er. For eksempel, hvis der anvendes 10 μL PIB'er, skal du bruge 50 μL elueringsbuffer. Piber inkuberes med elueringsbufferen ved 65 °C i 1 time for at elvere PPP'erne fra PIB'erne.
  2. Efter eluering opsamles eluatet ved at centrifugere rørene ved 376 x g i 30 s ved RT og pipettere eluatet i et separat rør, idet man skal være omhyggelig med ikke at overføre PIBs. Brug eluatet til western blot-analyse eller til massespektrometrianalyser. Eluater kan opbevares ved -20 °C i op til flere måneder.
  3. For at regenerere PIB'erne til videre brug inkuberes perlerne i 2% SDS (vol/vol), der roterer ved 8 o / min ved RT i 1 time. Vask dem 3x-5x i 25 mM Tris-HCi (pH 7,5) med rotation i 30 minutter pr. vask. Efter alle vaske opbevares PIB'er i 25 mM Tris-HCi (pH 7,5) opbevaringsbuffer med natriumazid (0,05% vægt/ vol).
  4. Analyser eluaterne ved western blotting eller massespektrometri. Massespektrometrianalysen af PIB-eluater er beskrevet nedenfor.

6. Fjernelse af vaskemidler

BEMÆRK: Forskellige tilgange kan bruges til at fjerne vaskemiddel fra eluatprøver til MS-analyse. Vi fandt ud af, at enkeltpotte, fastfaseforbedret prøveforberedelse (SP3), beskrevet af Hughes et al., fungerer godt19.

  1. Der tilsættes 0,5 μL SP3-perler til 50 μL eluat fra trin 5.2 ovenfor. Brug SP3-perler i et forhold på 10:1 (μg:μg) eller mindst 0,5 μg/μL (stamopløsning er 50 μg/μL). Vort forsigtigt perlerne og eluere.
  2. Tilsæt et elueringsvolumen på 100% ethanol til perle-eluatblandingen (f.eks. Hvis der anvendes 50 μL af eluatet, skal der anvendes 50 μL 100% ethanol). Prøverne inkuberes i 5 minutter i en termomixer, der er indstillet til at ryste ved 1000 o /min ved 24 °C.
  3. For at samle alle perlerne skal du placere dem i et magnetisk rørstativ. Når perlerne har samlet sig, kasseres supernatanten og perlerne vaskes med 0,5 ml 80% ethanol (vol/vol) 3x. Til vask skal du resuspender perlerne ved hvirvel, samle perlerne ved at placere dem i magnetrørstativet og kassere supernatanten mellem vaske.
  4. Vask perlerne endnu en gang med 0,5 ml 100% acetonitril (ACN) for at fjerne alle spor af ethanol og fjerne så meget ACN som muligt.

7. Fordøjelse af proteiner

  1. Der foretages en 1:100 fortynding af trypsin (slutkoncentration på 0,004 μg/μL) i 166 mM HEPES (pH 8,5) og der tilsættes 30 μL af denne trypsinopløsning til hvert rør med perlerne, hvorved den genopståes ved hvirveldannelse.
  2. Sp3-trypsinperleblandingen inkuberes i termomixeren ved 1000 o/min ved 37 °C i 5 timer eller natten over ved 30 °C. Placer rørene i magnetstativet for at samle perlerne og fjern fordøjelserne til nye rør.
  3. Til etiketfri analyse slukkes reaktionen ved at tilsætte 20% trifluoreddikesyre (TFA) (vol/vol) til en slutkoncentration på 0,2% TFA (vol/vol). Kontroller, at pH-værdien i hver prøve er mellem 2-3 med et pH-papir. Hvis ikke, tilsættes små yderligere alikvoter på 20% TFA, indtil dette er opnået. Prøverne skal syrnes på passende vis inden afsaltning. Fortsæt til trin 8.
  4. Ved TMT-mærkning af prøverne må prøverne ikke syrnes og fortsætte til trin 9.

8. Afsaltning af fordøjelsen

  1. Der fremstilles en trinspids for hver prøve ved at pakke en 200 μL MS-opløsningsmiddelkompatibel spids med C18-harpiks som beskrevet af Rappsilber et al.20. Brug en stump nål til at trykke på to C18-materialediske, hvilket sikrer, at diskene forbliver i nålen. Overfør diskene til den MS-opløsningsmiddelkompatible spids ved hjælp af et tyndt trådstempel til at fjerne skiverne fra nålen.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge MS-opløsningsmiddelkompatible spidser fra dette punkt i protokollen, da andre pipettespidser kan udvaske kemikalier i prøverne, der kan detekteres via massespektrometri.
  2. Ligevægt hver trinspids med 30 μL 100% MeOH, derefter med 30 μL 60% MeOH (vol / vol) efterfulgt af 30 μL 0,1% TFA (vol / vol). Skub hver opløsning gennem trinspidsen med en sprøjte. Fastgør en pipettespids til enden af en sprøjte med en gennemsigtig film for at øge kontakten mellem sprøjten og trinspidsen, hvis det er nødvendigt. Sørg for aldrig at lade C18-materialet inde i scenespidsen tørre.
  3. Tilsæt syrnet peptidfordøjelse fra trin 7.3 til den mærkede trinspids og skub gennem trinspidsen med en sprøjte, og pas igen på ikke at lade scenespidsen blive helt tør.
  4. Hver prøve vaskes 2x med 30 μL 0,1% TFA (vol/vol). Eluter peptiderne fra hver trinspids ved at tilsætte 30 μL 60% MeOH (vol / vol) til hver trinspids og udvise det hele fra spidsen med sprøjtetryk til et nyt, mærket rør. Dette er det eneste trin, hvor C18-materialet er helt tørret.
  5. Hver prøve tørres ved vakuumcentrifugering. Tørrede peptider kan opbevares ved -20 ° C i flere måneder. Prøverne er nu klar til etiketfri massespektrometrianalyse. Brug kun halvdelen af prøven til analyse på massespektrometeret og den anden halvdel til reinjektion, hvis det er nødvendigt. Sørg for anvendelse af en passende massespektrometermetode til analyse.

9. TMT-mærkning

BEMÆRK: Tandem-masse tag mærkning bruges til at multiplexe prøver til kvantitativ analyse. Et hætteglas med TMT-reagens på 0,8 mg er tilstrækkeligt til mærkning af op til 0,8 mg protein21. I et PIB pulldown-eksperiment, der starter med 1 mg protein, opnås 1-3 μg phosphoproteinunderenheder. Protokollen nedenfor er optimal for op til 10 μg protein.

  1. Rekonstituer et 0,8 mg hætteglas TMT-reagens i 80 μL vandfri ACN.
  2. Mærk hvert eksempel fra trin 7.4 med en anden TMT-etiket for op til 18 kanaler. Sørg for at bemærke, hvilken TMT-etiket der føjes til hver prøve. Der tilsættes 2 μL TMT-reagens og 2 μL ACN til peptidfordøjelsen, hvirvel forsigtigt for at blande, centrifuger ved 376 x g i 30 s ved RT for at opsamle prøven, og inkuberes ved RT i 1 time for at mærke prøven.
  3. For at teste TMT-mærkningseffektiviteten skal du lave en etiketkontrolprøve ved at kombinere 1 μL af hver mærkningsreaktion i et 0,5 ml rør indeholdende 9 μL vand af LC-MS-kvalitet og 1 μL 10% hydroxylamin (vol / vol) for at slukke reaktionen. Anbring de resterende uudspændte mærkede prøver i en -80 °C fryser. Prøver kan opbevares i flere dage, mens mærkningseffektiviteten evalueres.
  4. Tmt-etiketten kontrolleres ved at tilsætte 30 μL 0,1% TFA (vol/vol). Kontroller, at pH er mellem 2-3. Hvis ikke, tilsættes 20% TFA (vol/vol), indtil denne pH-værdi er opnået. Afsalt etiketkontrolprøven via trinspidsning som beskrevet i trin 8.1.-8.5.
  5. Analyser TMT-etiketkontrolprøven på massespektrometeret for at evaluere mærkningseffektiviteten. Filtrer søgeresultaterne til en 1% falsk opdagelsesrate (FDR) på peptidniveauet, og bestem mærkningseffektiviteten21,22.
  6. Fuldt TMT-mærkede peptider har TMT-reagens ved N-terminalen og ved alle lysiner. Kvantificer TMT-reporterens ionintensiteter og sammenlign deres samlede sum på tværs af alle kanaler. Prøven er tilstrækkeligt mærket, når >95% af alle peptider er mærket, og TMT-reporterens ion-sumintensiteter er sammenlignelige
    BEMÆRK: Udover ufuldstændig mærkning kan forskelle i opsummerede TMT-reporterionintensiteter være resultatet af unøjagtig pipettering af 1 μL-testprøven. Det kan også afspejle en sand biologisk observation, i hvilket tilfælde alle replikater skal vise den samme adfærd.
  7. De ubundne prøver fjernes fra -80 °C opbevaring, og optø dem. Hvis de ikke er fuldt mærket, tilsættes 1 μL af det relevante TMT-reagens til prøven som nævnt ovenfor, inkuberes i 1 time og gentages TMT-etiketkontrollen. Hvis prøverne er fuldt mærkede, skal du fortsætte til trin 9.8.
  8. Når den er fuldt mærket, tilsættes 2 μL 10% hydroxylamin (vol / vol) til TMT-reaktionerne for at slukke mærkningen. Prøverne inkuberes ved RT i 15 min. Når prøverne er slukket, kan de opbevares ved -80 °C i flere måneder.
  9. Kombiner alle slukkede TMT-kanaler og tilsæt 2 μL 20% TFA (vol / vol) for at forsure reaktionen. Kontroller pH-værdien af den kombinerede reaktion, og sørg for, at den er mellem pH 2-3. Hvis ikke, tilsættes små alikvoter på 20% TFA, indtil den ønskede pH er nået. Dette er afgørende for korrekt afsaltning.
  10. ACN fjernes ved vakuumcentrifugering i 30 minutter, og prøven afsaltes som beskrevet nedenfor.

10. Afsaltning af den TMT-mærkede kombinerede prøve

  1. Brug en SPE C18-afsaltningsplade med den passende proteinkapacitet (2 mg sorbent er normalt tilstrækkeligt til denne anvendelse) til at afsalte det kombinerede TMT-reagens. Ligevægt brønden med 200 μL 60% MeOH (vol/ vol) og 200 μL 10% MeOH / 0,1% TFA (vol / vol).
  2. Læg de syrnede TMT-mærkede peptider fra trin 9.10. på afsaltningspladen. Prøvebrøndene vaskes 2x med 200 μL 10% MeOH/0,1% TFA (vol/vol).
  3. Eluter peptiderne med 100 μL 60% MeOH (vol/ vol). Prøverne tørres ved vakuumcentrifugering. Den tørrede, TMT-mærkede prøve kan opbevares ved -80 °C i flere måneder.
  4. Til massespektrometrianalyse af den TMT-mærkede prøve injiceres halvdelen af prøven og gemmes den anden halvdel, hvis reinjektion er påkrævet.
    BEMÆRK: Injektionsmængderne på massespektrometrien varierer afhængigt af den specifikke kolonne, instrumentopsætning og prøvetype.

11. Analyse af data

BEMÆRK: Metoder til datafiltrering og analyse varierer og ligger uden for denne protokols anvendelsesområde, men følgende noter om analyse er inkluderet for at give vejledning, der er specifik for den type data, der er resultatet af denne protokol.

  1. Søg i rå massespektrometridata mod en artsspecifik proteomdatabase baseret på oprindelsen af de anvendte prøveceller eller væv. Her blev Comet brugt som søgealgoritme23.
  2. Filtrer søgeresultaterne med en FDR på 1 % ved at justere de søgealgoritmespecifikke parametre22. Til mærkningsfri kvantificering skal du bruge MS1-spidsarealmålinger til at kvantificere dataene. For TMT-mærkede prøver skal du bruge MSn-afledte reporterionintensiteter til kvantificering. For statistisk signifikans analyseres prøverne i biologiske tredoblinger.
  3. For de novo at identificere PPP-underenheder og deres interaktionorer skal det sikres, at tredobbelte biologiske prøver af MCLR-hæmmede og DMSO-behandlede prøver sammenlignes. For at sammenligne PPPome under forskellige forhold eller ved lægemiddelbehandling skal du sikre, at biologiske tredoblinger af hver tilstand eller lægemiddelbehandling blev genereret.
  4. Filtrer dataene, så kun proteiner med et samlet peptidantal >1 i mindst to af tre DMSO-kontrolbehandlede prøver er til stede. MCLR-konkurrence konkurrerer ikke altid fra al katalytisk underenhedsbinding. Nogle PPP-katalytiske underenheder klæber muligvis ikke specifikt til sepharoseharpiksen. For at tage højde for begge muligheder, mens du filtrerer proteiner, der ikke specifikt binder til harpiksen, skal du fjerne proteiner med et totalt peptidantal i den MCLR-behandlede tilstand højere end for enhver PPP-katalytisk underenhed.
  5. Ekskluder almindelige forurenende stoffer, såsom keratin, kollagen, 40S og 60S ribosomale proteiner og heterogene nukleare ribonukleoproteiner, der ikke er PPP-underenheder, fra analysen14.
  6. Importer filtrerede data til Perseus ved at klikke på Generic Matrix Upload i Load afsnit24,25. Log2 transformerer dataene ved at gå til Grundlæggende > Transformér, vælge dataene og angive transformationsfunktionen, i dette tilfælde log2(x).
  7. Imputer manglende værdier fra en normalfordeling ved at gå til Imputation > Erstat manglende værdier fra normalfordeling, vælge dataene og angive bredden (standard 0,3) og nedforskydningen (standard 1.8) for beregningen. Udfør kvantil normalisering ved at gå til Normaliser > Kvantil normalisering.
  8. Beregn log2-forhold og Elevens T-test p-værdier for de respektive forhold. Først skal du anmærke dataene ved at gå til Annot. Rækker > kategoriske annotationsrækker. Udfør T-testen ved at gå til Tests > To-prøve tests og vælge de grupper, der skal sammenlignes, testen, der skal udføres, og metoden til korrektion af flere hypotesetest som brugt til afkortning.
    BEMÆRK: Til de novo-identifikation betragtes et protein som et PPP-interagerende protein, hvis dets forekomst er statistisk signifikant i den MCLR-behandlede versus DMSO-tilstand med en log2-gange ændring større end den mindste foldændring af enhver specifikt bundet kendt PPP-underenhed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 2
Figur 2: Identifikation af specifikke PIBs-bindemidler. (A) En række vævstyper eller celler kan analyseres via PIB-MS. HeLa-celler i biologisk tredobling blev enten behandlet med DMSO eller PPP-hæmmeren MCLR, inkuberet med PIB'er og analyseret via LC-MS/MS. (B) Vulkandiagram over PIB-MS-analyse i DMSO- og MCLR-behandlede HeLa-cellelysater med specifikke PIB-bindemidler vist med rødt. PPP katalytiske underenheder er mærket og vist med blåt. Nye kandidat PPP-underenheder eller interagerende proteiner vises i sort. Ikke-specifikke ringbind er vist i gråt. (C) Spredningsdiagrammet af log2-området med to biologiske replikater fra HeLa-cellelysater behandlet med DMSO for at påvise reproducerbarheden af berigelsen. Specifikke ringbind til PIB'er er vist med rødt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Netværksanalyse af alle PPP-underenheder og PPP-interagerende proteiner identificeret i HeLa-celler. Disse proteiner viste sig at være specifikke PIB-interagerere i HeLa PIB pulldown med og uden MCLR. Klik her for at se en større version af denne figur.

For at demonstrere PIB'ernes ydeevne udførte vi et PIB-pulldown-eksperiment i HeLa-celler for at identificere PPP'er og deres interagerere (figur 2A). HeLa-celler blev dyrket i biologisk tredobling og lysed. Hvert tredobbelt lysat blev delt i to, hvor halvdelen blev behandlet med MCLR i 15 minutter for at forhindre binding af PPP-katalytiske underenheder eller DMSO, før PIB-berigelse blev udført. Efter PIB-tilsætning blev der udført en etiketfri sammenligning af mængden af proteiner kvantificeret i de DMSO-behandlede og MCLR-behandlede prøver for at skelne specifikke fra ikke-specifikke interagerere (figur 2B). I analysen påviste vi alle MCLR-følsomme PPP-katalytiske underenheder PP1ca, PP1cb, PP1cc, PP2Aca, PP2Acb, PP4c, PP5c og PP6c. I de DMSO-behandlede prøver var forekomsterne (log2 områder med proteinkvantificering) stærkt korrelerede, hvilket indikerer reproducerbarhed (figur 2C), men ved behandling med MCLR blev PPP-katalytisk underenhed eller PPP-interagerende proteinforekomst i PIB-pulldowns stærkt reduceret (figur 2B). I denne analyse identificerede vi 92 PPP-underenheder og specifikke PPP-interagerere (se supplerende tabel 1), som er sammenlignelig med en tidligere PIB-MS-analyse i HeLa-celler14 (figur 3).

Supplerende tabel 1: MS-data fra repræsentativ PIB-MS-analyse. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PIB-MS er en kemisk proteomics-tilgang, der bruges til kvantitativt at profilere PPPome fra forskellige prøvekilder i en enkelt analyse. Meget arbejde er blevet gjort ved hjælp af kinasehæmmerperler til at studere kinomet og hvordan det ændrer sig i kræft og andre sygdomstilstande 10,11,12,13. Alligevel halter undersøgelsen af PPPome bagud. Vi forventer, at denne tilgang er i stand til at udfylde dette hul og kaste lys over reguleringen af cellulær dephosphorylation. Her viser vi, at vi ved hjælp af PIB'er kan berige katalytiske og ikke-katalytiske komponenter i PP1, PP2A, PP4, PP5 og PP6. Vi er også i stand til at identificere nye kandidat PPP-interagerere i en række cellelinjer, vævstyper og organismer.

Der er flere kritiske trin i PIB-MS-protokollen, som ikke bør overses. Disse omfatter inkorporering af passende kontroller og replikater, tilførsel af lige store mængder protein på tværs af alle prøver, opretholdelse af ikke-denatureringsbetingelser under prøveforberedelsen, inkubation af prøven med PIB'er og vask af PIB'erne. Med hensyn til kontroller og replikater er det vigtigt, at halvdelen af hver prøve behandles med en OPP-hæmmer, hvis målet er at identificere nye OPP-underenheder og interaktionorer. Dette er nødvendigt for at skelne mellem specifikke og ikke-specifikke PIB-interagerere. Hvis man søger at identificere, hvordan kendt PPP-underenhed eller PPP-interaktionsekspression ændres på tværs af celle- eller vævstyper og cellecyklusfaser eller ved forskellige lægemiddelbehandlinger, er det afgørende at kuratere en liste over kendte PPP-underenheder og -interagerere til sammenligning. Desuden udføres disse eksperimenter typisk i biologisk tredobling for at sikre statistisk tillid. Lige proteininput pr. prøve er afgørende for datareproducerelighed på tværs af prøver; det sikrer også, at forskelle i PPP-underenhed eller interaktionsormængde ikke blot skyldes forskelle i proteininput. Et proteinassay såsom en BCA skal anvendes til at bestemme proteinkoncentrationen i hver prøve. Endelig er ikke-denaturerende betingelser i prøveforberedelse, PIB-berigelse og PIB-vask afgørende for at sikre, at proteinerne forbliver i deres oprindelige tilstand. Dette bevarer interaktioner mellem PPP-underenheder.

PIB-MS er et kraftfuldt værktøj til forhør af PPPome, men det kommer med flere begrænsninger. PIB'er kan berige for de katalytiske og ikke-katalytiske komponenter i PP1, PP2A, PP4, PP5 og PP6, men ikke PP2B eller PP7, da MCLR ikke hæmmer disse fosfataser ved nanomolære koncentrationer. Det er vigtigt at bemærke, at dette værktøj er velegnet til nem identifikation og kvantificering af endogene, MCLR-følsomme PPP holoenzymer, såsom de bemærkede. PIB-MS er ikke i stand til at detektere PPP-holoenzymer, der hæmmes af endogene PPP-hæmmere, der blokerer det PPP-aktive sted, såsom α4 og SET14. Denne teknik kræver ikke eksogen ekspression af mærkede PPP-underenheder eller anvendelse af PPP-specifikke antistoffer. Ligesom andre affinitetsberigelsesstrategier ved hjælp af sepharose-baserede matricer er PIB-MS tilbøjelig til binding af ikke-specifikke proteiner. Tilføjelsen af gratis MCLR som en negativ kontrol gør det imidlertid muligt at skelne specifikke fra ikke-specifikke interagerere, hvilket gør det muligt at identificere nye PPP-underenheder og interagerende proteiner. Desuden kan ikke-specifikke interagerere reduceres via yderligere vaske og omhyggelig brug af den passende mængde PIBs.

Vi har anvendt PIB-MS til at sammenligne PPP-ekspressionsmønstrene for forskellige kræftcellelinjer, herunder brystkræft og glioblastom14. Vi fandt ud af, at disse kræfttyper har unikke PPP-ekspressionsmønstre, der indikerer deres oprindelse14. PPP'er er blandt de mest konserverede enzymer 2,3. Vi var i stand til at demonstrere, at PIB-MS er effektiv til at analysere PPPome i gær- og musevæv14. PIB-MS kan også bruges til at identificere forskelle i PPP-ekspressionsmønstre under forskellige forhold, såsom interfase versus mitotiske prøver15. PIB-MS giver således indsigt i phosphoproteinphosphatasenetværk og udvider vores forståelse af PPP-regulering på tværs af flere cellelinjer og sygdomstilstande samt lægemiddelbehandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre og ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

A.N.K. anerkender støtte fra NIH R33 CA225458 og R35 GM119455. Vi takker Kettenbach- og Gerber-laboratorierne for deres nyttige diskussion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (ACN) Honeywell AH015-4 CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.
Anhydrous Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004-100ML CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.
Benchtop centrifuge Eppendorf model no. 5424
Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate Acros Organics 410991000
Centrifuge Eppendorf model no. 5810 R 15 amp version
Distilled water
DMSO Fisher Scientific BP231-100
Dounce tissue grinder Fisherbrand Pellet Pestles 12-141-363
Empore solid phase extraction disk, C18 CDS Analytical 76333-132
Eppendorf tubes, 1.5 mL Eppendorf 22363204 CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.
Eppendorf tubes, 2 mL Eppendorf 22363352 CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.
Extraction plate manifold Waters WAT097944
Falcon tubes, 50 mL VWR 21008
Generic blunt end needle and plunger
Generic magnetic separation rack
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen chloride (HCl) VWR Chemicals BDH BDH3028 CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood.
Hydroxylamine solution 50% (wt/vol) Sigma-Aldrich 467804
Incubator, 65 °C VWR model no. 1380FM
Koptec Pure Ethanol, 200 Proof Decon Labs V1001
Methanol for HPLC (MeOH) Sigma-Aldrich 34860-4L-R CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.
Microcystin LR (MCLR) Cayman Chemical 10007188 CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact.
PBS, 1× without calcium and magnesium, pH 7.4 ± 0.1 Corning  21-040-CV
pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers Fisher Scientific M1095310001
PIBs For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pipette tips, 10 μL Eppendorf 22491504 CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.
Pipette tips, 1000 μL Eppendorf 22491555 CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.
Pipette tips, 200 μL Eppendorf 22491539 CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.
plastic syringe, 10 mL BD 309604
Protease inhibitor cocktail III Research Products International P50700-1
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer  Thermo Scientific
Refrigerated benchtop centrifuge Eppendorf model no. 5424 R
Rotator (Labquake Shaker Rotisserie) Thermo Scientific 13-687-12Q 8 rpm rotation
Sample collection plate, 96- well, 1 mL Waters WAT058957
SDS Fisher Scientific BP1311-1
Sequencing grade modified trypsin Promega V511C
Sodium azide EMD Chemicals SX0299-1 CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals.
Sodium chloride (NaCl) Fisher Chemical S27110
Sonicator (Branson digital sonifier) model no. SFX 250
SPE C18 desalting plate Waters 186001828BA
SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads) Cytiva 6.51521E+13
Thermomixer Eppendorf model no. 5350
TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 × 0.8 mg per tag ThermoFisher A37725
Trifluoroacetic acid (TFA) Honeywell T6508-25ML CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood.
Tris Base Research Products International T60040
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
Vacuum centrifuge and vapor trap Thermo Scientific model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105
Vortexer (Vortex-Genie 2) Scientific Industries
Water LC-MS Honeywell LC365-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nilsson, J. Protein phosphatases in the regulation of mitosis. Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).
  2. Brautigan, D. L. Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling. The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).
  3. Brautigan, D. L., Shenolikar, S. Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates. Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).
  4. Janssens, V., Goris, J. Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling. Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).
  5. Virshup, D. M., Shenolikar, S. From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover. Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).
  6. Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. The extended PP1 toolkit: designed to create specificity. Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).
  7. Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. 4D-networking by mitotic phosphatases. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).
  8. Heroes, E., et al. The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity. The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).
  9. Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer. Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).
  10. Bantscheff, M., et al. Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors. Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).
  11. Klaeger, S., et al. Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors. ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).
  12. Duncan, J. S., et al. Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer. Cell. 149 (2), 307-321 (2012).
  13. Cooper, M. J., et al. Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia. PLoS ONE. 8 (6), 66755 (2013).
  14. Lyons, S. P., et al. A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans. Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).
  15. Nasa, I., et al. Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry. Science Signaling. 13 (648), (2020).
  16. Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse. Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).
  17. Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose. Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).
  18. Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).
  19. Hughes, C. S., Moggridge, S., Müller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  20. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  21. Zecha, J., et al. TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach. Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).
  22. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  23. Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool. Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).
  24. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  25. Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins. Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).

Tags

Biokemi udgave 182
En massespektrometribaseret tilgang til identifikation af fosfoproteinphosphataser og deres interaktionorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smolen, K. A., Kettenbach, A. N. A… More

Smolen, K. A., Kettenbach, A. N. A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors. J. Vis. Exp. (182), e63805, doi:10.3791/63805 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter