Summary
حد سمك أقسام الأنسجة من الدراسة المورفولوجية لتعصيب الجلد. يصف هذا البروتوكول تقنية فريدة لإزالة الأنسجة لتصور الألياف العصبية الجلدية في أقسام الأنسجة السميكة التي تبلغ سماكتها 300 ميكرومتر تحت المجهر البؤري.
Abstract
تعصيب الجلد هو جزء مهم من الجهاز العصبي المحيطي. على الرغم من أن دراسة الألياف العصبية الجلدية قد تقدمت بسرعة ، إلا أن معظم فهم خصائصها التوزيعية والكيميائية يأتي من تلطيخ الأنسجة الكيميائية التقليدية والكيميائية المناعية على أقسام الأنسجة الرقيقة. مع تطور تقنية إزالة الأنسجة ، أصبح من الممكن عرض الألياف العصبية الجلدية على أقسام الأنسجة الأكثر سمكا. يصف هذا البروتوكول تلطيخ الفلورسنت المتعدد على أقسام الأنسجة بسماكة 300 ميكرومتر من الجلد الأخمصي والظهري للقدم الخلفية للفئران ، وهما موقعان نموذجيان للبشرة المشعرة والزجاجية. هنا ، يقوم الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين بتسمية الألياف العصبية الحسية ، في حين أن الفيلويدين ومستقبل الهيالورونان البطاني البطاني للأوعية اللمفاوية 1 يصنفان الأوعية الدموية واللمفاوية ، على التوالي. تحت المجهر البؤري ، تم اتباع الألياف العصبية الحسية المسماة بالكامل على مسافة أطول ، وتعمل في حزم في الطبقة الجلدية العميقة وحرة في الطبقة السطحية. ركضت هذه الألياف العصبية بالتوازي مع الأوعية الدموية أو تحيط بها ، وشكلت الأوعية اللمفاوية شبكة ثلاثية الأبعاد (3D) في الجلد المشعر والزجاجي. يوفر البروتوكول الحالي نهجا أكثر فعالية لدراسة تعصيب الجلد من الطرق التقليدية الحالية من منظور المنهجية.
Introduction
الجلد ، أكبر عضو في الجسم ، بمثابة واجهة رئيسية للبيئة ، يتم تعصيبه بكثافة من قبل العديد من الألياف العصبية1،2،3. على الرغم من أن تعصيب الجلد قد تمت دراسته على نطاق واسع سابقا باستخدام طرق نسيجية مختلفة ، مثل التلطيخ على أقسام الجلد والأنسجة الكاملة4،5،6 ، إلا أن العرض الفعال المفصل للألياف العصبية الجلدية لا يزال يمثل تحديا7،8. وبالنظر إلى ذلك، طور البروتوكول الحالي تقنية فريدة من نوعها لإظهار الألياف العصبية الجلدية بشكل أكثر وضوحا في قسم الأنسجة السميكة.
بسبب الحد الأقصى لسمك الأقسام ، فإن مراقبة الألياف العصبية الجلدية المعصوبة ليست دقيقة بما يكفي لتصوير العلاقة بين الألياف العصبية للببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) والأنسجة والأعضاء المحلية بدقة من معلومات الصورة المكتسبة. يوفر ظهور تقنية إزالة الأنسجة ثلاثية الأبعاد طريقة مجدية لحل هذه المشكلة 9,10. قدم التطور السريع لنهج تطهير الأنسجة العديد من الأدوات لدراسة هياكل الأنسجة والأعضاء بأكملها والإسقاطات العصبية والحيوانات الكاملة في الآونة الأخيرة11. يمكن تصوير أنسجة الجلد الشفافة في قسم أكثر سمكا بواسطة المجهر البؤري للحصول على البيانات اللازمة لتصور الألياف العصبية الجلدية.
في الدراسة الحالية ، تم اختيار الجلد الأخمصي والظهري للفئران الخلفية كموقعين مستهدفين للجلد المشعر والزجاجي3،4،7. لتتبع الألياف العصبية الجلدية على مسافة أطول ، تم تقطيع أنسجة الجلد بسماكة 300 ميكرومتر للتلطيخ الكيميائي المناعي والكيميائي النسيجي ، يليه علاج إزالة الأنسجة. تم استخدام CGRP لتسمية الألياف العصبية الحسية12,13. بالإضافة إلى ذلك ، لتسليط الضوء على الألياف العصبية الجلدية على خلفية الأنسجة ، تم استخدام phalloidin و lymphatic الأوعية البطانية hyaluronan receptor 1 (LYVE1) لتسمية الأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية ، على التوالي14,15.
قدمت هذه الأساليب طريقة مباشرة يمكن تطبيقها لإظهار رؤية عالية الدقة للألياف العصبية الجلدية وأيضا لتصور العلاقة المكانية بين الألياف العصبية والأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية في الجلد ، والتي قد توفر المزيد من المعلومات لفهم توازن الجلد الطبيعي والتغيير الجلدي في ظل الظروف المرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة لمعهد الوخز بالإبر والكى ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية الصينية (الرقم المرجعي D2018-04-13-1). وأجريت جميع الإجراءات وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر (مطبعة الأكاديمية الوطنية، واشنطن العاصمة، 1996). تم استخدام ثلاثة فئران ذكور بالغة (Sprague-Dawley ، الوزن 230 ± 15 جم) في هذه الدراسة. تم إيواء جميع الحيوانات في دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة مع درجة حرارة ورطوبة يتم التحكم فيها والسماح لها بحرية الوصول إلى الطعام والماء.
1. التروية وإعداد العينات
- حقن 250 مغ/كغ من محلول ثلاثي برومو الإيثانول (انظر جدول المواد) داخل الصفاق في الفئران للحث على القتل الرحيم.
- بمجرد توقف التنفس ، استخدم مقص جراحي من الفولاذ المقاوم للصدأ لفتح التجويف الصدري للفئران. استخدم إبر 20 جم للتنقل عبر البطين القلبي الأيسر13 بمعدل 3 مل / دقيقة مع 100 مل من محلول ملحي طبيعي بنسبة 0.9٪ متبوعا ب 250-300 مل من 4٪ بارافورمالديهايد في مخزن فوسفات 0.1 م (PB ، درجة الحموضة 7.4) (الشكل 1A ، B).
- بعد التروية ، استخدم مشرطا لإزالة جلد الظهرية والنعل من المخلب الخلفي.
- بالنسبة للعينات التي تتطلب قسما مجمدا ، قم بعد إصلاح الأنسجة في 4٪ paraformaldehyde في 0.1 M PB لمدة 2 ساعة ؛ ثم بالتبريد حماية الأنسجة في 25٪ السكروز في 0.1 M PB لأكثر من 24 ساعة عند 4 درجة مئوية
- بالنسبة للعينات ذات القسم السميك الذي يتطلب إزالة الأنسجة ، قم بعد إصلاح الأنسجة بنسبة 4٪ paraformaldehyde في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x PBS) لمدة 2 ساعة ؛ ثم قم بتجميد الأنسجة في 1x PBS عند 4 درجات مئوية (الشكل 1C-E).
2. تلطيخ الفلورسنت الثلاثي مع CGRP ، phalloidin ، و LYVE1 تليها معالجة إزالة الأنسجة
ملاحظة: تم تطبيق تلطيخ الفلورسنت الثلاثي مع CGRP و phalloidin و LYVE1 للكشف عن الألياف العصبية والأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية في الجلد المشعر والزجاجي على أقسام الأنسجة بسماكة 300 ميكرومتر بعد علاج إزالة الأنسجة.
- تحضير 2٪ من الأغاروز في 1x PBS عن طريق التسخين في فرن صغير لمدة دقيقتين حتى يذوب الأغاروز (انظر جدول المواد).
- بعد الغسيل ، قم بتضمين أنسجة الجلد في 2٪ من الأغاروز عند 37 درجة مئوية ، وضعها داخل صندوق الثلج للتبريد (الشكل 1F ، G).
- ثبت الأنسجة المثبتة على الميكروتوم الاهتزازي بالماء المثلج وقطعها بسماكة 500 ميكرومتر في الاتجاه المستعرض. استخدم المعلمات التالية لضبط قطاعة الاهتزاز وإنهاء التقطيع: السرعة، 0.50 مم/ثانية، والسعة، 1.5 مم (الشكل 1H-K).
- بعد التقطيع ، قم بإزالة الأغاروز من الأقسام ، وتخزينها في لوحة من ستة آبار مع 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) (الشكل 1L).
- احتضان أقسام الأنسجة في محلول 2٪ Triton X-100 في 1x PBS (TriX-PB) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. انظر الشكل 2 للاطلاع على الإجراء التالي.
- ضع أقسام الأنسجة في المخزن المؤقت المانع وقم بتدويرها عند 72 دورة في الدقيقة على الخلاط طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: تركيبة المخزن المؤقت المانع هي 10٪ مصل الحمير العادي ، و 1٪ Triton-X 100 ، و 0.2٪ أزيد الصوديوم في 1x PBS (انظر جدول المواد). - انقل أقسام الأنسجة إلى المحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية للفأر أحادي النسيلة المضاد ل CGRP (1:500) والجسم المضاد متعدد النسيلة متعدد النسيلة LYVE1 (1:500) في مخزن مؤقت للتخفيف في أنبوب الطرد المركزي الدقيق (انظر جدول المواد) ، وقم بالتدوير على الخلاط لمدة يومين عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: تكوين المخزن المؤقت للتخفيف هو 1٪ مصل الحمير العادي ، 0.2٪ Triton-X 100 ، و 0.2٪ أزيد الصوديوم في 1x PBS. - اغسل أقسام المناديل مرتين باستخدام مخزن الغسيل المؤقت في درجة حرارة الغرفة ، ثم احتفظ بها على الخلاط طوال الليل عند 4 درجات مئوية في مخزن الغسيل المؤقت.
ملاحظة: تركيبة المخزن المؤقت للغسيل هي 0.2٪ Triton-X 100 في 0.1 M PB (درجة الحموضة 7.4). - في اليوم التالي ، انقل أقسام الأنسجة إلى محلول مختلط يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية للحمار المضاد للفأر IgG H & L Alexa-Flour488 (1:500) والحمار المضاد للأغنام IgG H & L Alexa-Flour405 (1:500) ، وكذلك Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000) (انظر جدول المواد) في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وتدور عند 72 دورة في الدقيقة على الخلاط لمدة 5 ساعات عند 4 درجات مئوية.
- اغسل أقسام الأنسجة في طبق من ستة آبار مع مخزن مؤقت للغسيل لمدة 1 ساعة ، مرتين ، في درجة حرارة الغرفة. احتفظ بأقسام الأنسجة في مخزن الغسيل المؤقت على الخلاط طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- انقل مقاطع الأنسجة إلى كاشف إزالة الأنسجة (انظر جدول المواد ، كان حجمه أكبر بخمس مرات من حجم العينة) وقم بالتدوير عند 60 دورة في الدقيقة على الخلاط بلطف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: بعد هذا العلاج ، تصبح أقسام الأنسجة واضحة (الشكل 2B). - قم بتركيب الأنسجة التي تم تطهيرها على الشريحة ، وقم بتدوير الأنسجة باستخدام فاصل ، والتمسك بالفجوة باستخدام كاشف إزالة الأنسجة الطازجة والغطاء .
3. تلطيخ الفلورسنت الثلاثي مع CGRP ، phalloidin ، و LYVE1 باتباع النهج التقليدي
ملاحظة: على سبيل المقارنة، تم إجراء نفس التلطيخ على أقسام الأنسجة بسماكة 30 ميكرومتر وفقا للتقنيات التقليدية.
- قم بتقطيع مقاطع الأنسجة عند 30 ميكرومتر على ميكروتوم في الاتجاه العرضي وقم بتركيبها على الشريحة.
- أضف محلول الحجب مع مصل الحمار العادي بنسبة 3٪ و 0.3٪ Triton X-100 في 0.1 M PB واحتضن الأقسام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة محلول الحجب واحتضن الأقسام بالمحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية للفأر أحادي النسيلة المضاد ل CGRP (1:500) والجسم المضاد المضاد LYVE1 متعدد النسيلة (1:500) في مخزن مؤقت للتخفيف بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
- في اليوم التالي ، اغسل أقسام الأنسجة ب 0.1 M PB (الرقم الهيدروجيني 7.4) ثلاث مرات ، وأضف المحلول المختلط الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية للحمار المضاد للفأر IgG H & L Alexa-Flour488 (1:500) والحمار المضاد للأغنام IgG H & L Alexa-Flour405 (1:500) ، وكذلك Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000) على الأقسام واحتضنه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
- قبل المراقبة المجهرية ، اغسل الأقسام في 0.1 M PB (الرقم الهيدروجيني 7.4) ثلاث مرات ، ثم قم بتغطيتها بأغطية في 50٪ من الجلسرين.
4. التصوير والتحليلات
- راقب العينات الملطخة تحت مجهر الفلورسنت، ثم التقط الصور باستخدام مجهر متحد البؤرة.
- التقط 30 صورة (مكدسات Z)، كل منها في إطارات 10 ميكرومتر، من كل مقطع بسمك 300 ميكرومتر ودمج صورة واحدة في التركيز البؤري باستخدام معالج صور من نظام الفحص المجهري البؤري (انظر جدول المواد).
- قم بتنفيذ الخطوات التالية في برنامج معالجة الصور الخاص بالإعداد البؤري للتحليل ثلاثي الأبعاد (3D): تعيين بدء تشغيل المستوى البؤري | تعيين | المستوى البؤري النهائي تعيين | حجم الخطوة اختر نمط العمق | | التقاط الصور سلسلة Z.
ملاحظة: كانت الأطوال الموجية للإثارة والانبعاثات لإشارات التألق الأزرق 401 نانومتر و 421 نانومتر على التوالي. كانت الأطوال الموجية للإثارة والانبعاثات لإشارات التألق الأخضر 499 نانومتر و 519 نانومتر ، على التوالي. كانت الأطوال الموجية للإثارة والانبعاثات لإشارات التألق الأحمر 591 نانومتر و 618 نانومتر على التوالي. 152 ميكرومتر هو قطر الثقب البؤري (عدسة موضوعية 10x ، NA: 0.4). كانت دقة التقاط الصورة 1024 × 1024 بكسل.
- قم بتنفيذ الخطوات التالية في برنامج معالجة الصور الخاص بالإعداد البؤري للتحليل ثلاثي الأبعاد (3D): تعيين بدء تشغيل المستوى البؤري | تعيين | المستوى البؤري النهائي تعيين | حجم الخطوة اختر نمط العمق | | التقاط الصور سلسلة Z.
- بالنسبة للعينات التقليدية (الخطوة 3) ، التقط 30 صورة (مكدسات Z) في إطارات 1 ميكرومتر من كل مقطع بسمك 30 ميكرومتر وتعامل مع هذه الصور كما هو مذكور أعلاه (الخطوات 4.1-4.2).
- إظهار الصور في نمط إعادة الإعمار 3D مع نظام معالجة الصور.
- قم بإجراء عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد عن طريق استيراد صور متحدة البؤرة Z-stack إلى Imaris 9.0 (برنامج تصوير الخلايا ، انظر جدول المواد) وإنشاء عروض سطحية بناء على كثافة البقع: إضافة أسطح جديدة | اختر مصدر القناة | حدد المعلمات في الخيار السلس لتفاصيل الأسطح | تحديد المعلمات في خيار العتبة للكثافة المطلقة | تصنيف الأسطح | انتهى.
- الحصول على البيانات في مساحة سطح الألياف العصبية الإيجابية باستخدام برنامج تصوير الخلايا. حدد | الصورة المعروضة الإحصائيات | | مفصلة | قيم محددة الحجم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد تلطيخ الفلورسنت الثلاثي ، تم تصنيف الألياف العصبية والأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية بوضوح مع CGRP و phalloidin و LYVE1 ، على التوالي ، في الجلد المشعر و glabrous (الشكل 3,4). مع العلاج المقاصة ، يمكن تصوير الألياف العصبية الإيجابية CGRP ، والأوعية الدموية الإيجابية للفالويدين ، والأوعية اللمفاوية الإيجابية LYVE1 على عمق أكبر للحصول على المعلومات الهيكلية الكاملة للجلد (الشكل 3). عندما تم إعادة بناء هياكل الأنسجة هذه في نمط 3D ، أصبح توزيعها أسهل في التتبع. وقد تبين أن الألياف العصبية الإيجابية CGRP مرت عبر الأنسجة تحت الجلد والأدمة إلى البشرة. تعمل هذه الألياف العصبية في حزم في الأنسجة تحت الجلد ، متفرعة داخل الأدمة ، وتنتهي في البشرة (الشكل 3). في المقابل ، يتم توزيع الأوعية الدموية الإيجابية للفالويدين والأوعية اللمفاوية الإيجابية LYVE1 في الأنسجة والأدمة تحت الجلد (الشكل 3). بشكل عام ، ركضت الألياف العصبية الإيجابية CGRP بالتوازي مع أو تحيط بالأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية ، مما شكل شبكة 3D في الجلد المشعر والزجاجي.
مع النهج التقليدي ، على الرغم من أن الألياف العصبية والأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية تم تصنيفها بوضوح مع CGRP و phalloidin و LYVE1 في الأقسام الرقيقة ، فإن مراقبة هذه الهياكل محدودة بسمك الشريحة ولا يمكن ملاحظتها تماما (الشكل 4). قدمت تقنية التصوير صورا متعمقة لكل عنصر كائن من إشارات الفلورسنت الإيجابية المختلفة. بعد توليد الصورة ، تم الحصول على مساحة سطح الألياف العصبية الإيجابية CGRP من خلال برنامج Imaris. في القسم الذي يبلغ سمكه 30 ميكرومتر ، لم يكن هناك فرق بين الجلد المشعر والجلد اللامع في مساحة سطح الألياف العصبية الإيجابية CGRP. في أقسام الأنسجة السميكة التي يبلغ سمكها 300 ميكرومتر ، مقارنة بالجلد المشعر ، زادت مساحة سطح الألياف العصبية الإيجابية CGRP للجلد الزجاجي بشكل كبير (* P < 0.05 ، اختبار Kruskal-Wallis غير البارامتري ، n = 3 ، الشكل 5). لذلك ، لمقارنة مساحة سطح الألياف العصبية الإيجابية بدقة ، فإن القسم الذي تم مسحه 300 ميكرومتر أفضل من القسم التقليدي 30 ميكرومتر. على سبيل المقارنة، فمن الممكن الحصول على المزيد من الفرص للحصول على صورة مثالية 3D من قسم الأنسجة السميكة مع العلاج المقاصة مما كانت عليه في القسم الرقيق التقليدي.
الشكل 1: صور فوتوغرافية للأدوات التجريبية والخطوات الرئيسية في الدراسة. (أ) الأدوات الجراحية (المشرط ، المقصات ، إلخ). (ب) مضخة التروية. (ج) الجوانب الأخمصية والظهرية للمخلب الخلفي بعد التروية. (د) تمت إزالة الجلود النعلية والظهرية من المخلب الخلفي. (ه) تقليم أنسجة الجلد. (F,G) أنسجة الجلد المثبتة مع 2٪ من الأغاروز عند 37 درجة مئوية و 4 درجات مئوية (H) ميكروتوم اهتزازي. (I) أنسجة الجلد الثابتة على داعم القطع. (ي) تعيين معلمات للتقطيع. (ك) عملية التقطيع. (L) يبلغ سمك الأقسام التمثيلية 300 ميكرومتر .
الشكل 2: إجراء تلطيخ الفلورسنت وتطهير أنسجة الجلد . (أ) تمثيل لخطوات البروتوكول المشاركة في هذه الدراسة. (ب) المناظر الخارجية لأنسجة الجلد قبل وبعد العلاج المقاصة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الارتباط المكاني للألياف العصبية والأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية بعد معالجة إزالة الأنسجة في قسم الجلد السميك. (أ ، ب) تظهر الصور التمثيلية للقسم السميك من الجلد الأخمصي والظهري للفئران الخلفية توزيع الألياف العصبية والأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية في الجلد اللامع (أ) والشعر (ب). (A1-A3) وعرضت اللوحة ألف بشكل منفصل مع وسم CGRP (A1)، ووضع العلامات على Pha (A2)، ووضع العلامات على LYVE1 (A3). (A4، A5; B1، B2) تم تعديل اللوحات (A) و (B) في نمط ثلاثي الأبعاد وأظهرت مع وجهات النظر الأمامية (A4 ، B1) والخلفية (A5 ، B2) ، على التوالي. نفس شريط المقياس لجميع اللوحات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الارتباط المكاني للألياف العصبية والأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية في قسم الجلد الرقيق مع النهج التقليدي. (A,B) تظهر الصور التمثيلية للقسم السميك من الجلد الأخمصي والظهري للفئران توزيع الألياف العصبية والأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية في الجلد اللامع (A) والمشعر (B). (A1، A2; B1 و B2): تم تعديل اللوحات (A) و (B) في نمط ثلاثي الأبعاد وأظهرت مع طرق العرض الأمامية (A1 ، B1) والخلفية (A2 ، B2) ، على التوالي. نفس شريط المقياس لجميع اللوحات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: رسم بياني يوضح المساحة السطحية للألياف العصبية الموجبة CGRP في الجلد المشعر والزجاجي. (أ) في القسم الذي يبلغ سمكه 30 ميكرومتر ، لم يكن هناك فرق بين الجلد المشعر والجلد اللامع في مساحة سطح الألياف العصبية الإيجابية CGRP. (ب) في القسم الذي يبلغ سمكه 300 ميكرومتر ، مقارنة بالجلد المشعر ، زادت مساحة سطح الألياف العصبية الإيجابية CGRP للجلد الزجاجي بشكل كبير (* P < 0.05 ، n = 3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقدم هذه الدراسة عرضا مفصلا للألياف العصبية الجلدية في الجلد المشعر واللامع باستخدام التألق المناعي على أقسام الأنسجة السميكة مع علاج واضح وعرض 3D لفهم تعصيب الجلد بشكل أفضل. وقت حضانة الأجسام المضادة يصل إلى 1-2 أيام وعملية التنظيف بين عشية وضحاها مهمة. تؤثر هاتان الخطوتان الرئيسيتان بشكل مباشر على تأثير تلطيخ التألق المناعي للأقسام السميكة. أثيرت مشكلة أخرى من اختيار الأجسام المضادة ، ليست كلها مناسبة للأقسام السميكة. نتوقع أن الأجسام المضادة ذات الأوزان الجزيئية الأصغر قد تكون مثالية لتلطيخ التألق المناعي للأقسام السميكة. وبالتالي ، فإن صعوبة اختيار الأجسام المضادة هي قيد رئيسي لهذا النهج. وقد لاحظ العمل الحالي الاختلافات في توزيع الأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية والأعصاب على جلد الفئران المشعر وعديم الشعر. بالنسبة للبشر ، يختلف هيكل الجلد اختلافا كبيرا عن بنية القوارض. ونحن نتطلع إلى استخدام تكنولوجيا إزالة الأنسجة لمراقبة وبحث الجلد البشري في الخطوة التالية.
بذلت الدراسات السابقة العديد من الجهود للكشف عن الألياف العصبية الجلدية4،5،6،7،8. على النقيض من دراسة قسم الأنسجة التقليدية ، تم استخدام تقنيات إزالة الأنسجة بما في ذلك CUBE و CLARITY و vDISCO على نطاق واسع لدراسة أعضاء كاملة وأجسام كاملة من الحيوانات في السنوات الأخيرة16،17،18،19. عادة ، من الصعب تتبع الألياف العصبية الجلدية ذات بنية طويلة وكاملة في القسم الرقيق4،5،6،7،8 ؛ نسبيا ، يمكن أن يستغرق علاج إزالة الأنسجة على العينة كبيرة الحجم وقتا طويلا16،17،18،19. بالنظر إلى مزاياها وعيوبها ، فإن البروتوكول الحالي هو الخيار المناسب لفحص البنية التفصيلية للألياف العصبية الجلدية داخل القسم السميك المعالج بشفافية ، وهو مناسب ليتم ملاحظته وتسجيله تحت المجهر البؤري العادي. باستخدام هذا النهج ، يمكن للمرء أن يلاحظ الألياف العصبية الجلدية الأطول داخل القسم السميك مقارنة بالقسم الرقيق ، ويوفر الوقت التجريبي لعلاج الأنسجة مقارنة بالعينات كبيرة الحجم مع إزالة الأنسجة.
في هذه الدراسة ، تم تصنيف الألياف العصبية الجلدية مع CGRP. تنتمي هذه الأنواع من الألياف العصبية إلى الألياف الحسية C و Aδ ، وتلعب دور نقل الإشارات المسببة للألم وتعديل توسع الأوعية12,13. نظرا لأن الألياف العصبية الإيجابية CGRP تقع بالقرب من الأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية في الطبقة تحت الجلد ، فقد اقترح أيضا المشاركة في التئام الجروح عن طريق تحسين تكوين الأوعية الدموية وتكوين الأوعية اللمفاوية20,21. على غرار الدراسات السابقة14،20،21،22 ، تم التعبير عن الفلويدين بقوة في الأوعية الدموية مع تجربة وضع العلامات الثلاثية هذه. بالإضافة إلى ذلك ، LYVE1 هو بروتين سكري غشائي متكامل ويستخدم بشكل فعال كعلامة حيوية لفرز الخلايا البطانية اللمفاوية الجلدية للفئران15،23،24. الاستفادة من تلطيخ الفلورسنت الثلاثي مع CGRP و phalloidin و LYVE1 ، جنبا إلى جنب مع تقنية إزالة الأنسجة ، يتم تقديم صورة عالية الدقة للحصول على رؤية أفضل لشبكة الألياف العصبية والأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية في الجلد المشعر والزجاجي.
تجدر الإشارة إلى أنه تم إثبات الألياف العصبية الإيجابية CGRP فقط في هذه الدراسة. إلى جانب هذا النوع من الألياف العصبية الحسية ، قد يصلح هذا البروتوكول أيضا لفحص أنواع أخرى من الألياف العصبية الجلدية مع الأجسام المضادة المقابلة. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن phalloidin يتم التعبير عنه بشكل كبير في المكون الخلوي الهيكلي في الخلايا العضلية والبطانية الملساء21،22،25 ، إلى جانب الأوعية الدموية ، تم تسمية الأنسجة العضلية والبشرة أيضا بالفيلودين. ومع ذلك ، وفقا للخاصية المورفولوجية ، ليس من الصعب تحديد الأوعية الدموية من النوع الآخر من الأنسجة.
باختصار ، يستكشف هذا البروتوكول بشكل فعال تعصيب الجلد المشعر والزجاجي على أقسام أكثر سمكا باستخدام مزيج من التألق المناعي مع العلاج الواضح. من منظور المنهجية ، سيكون من المفيد التحقيق في الأنواع الأخرى من الألياف العصبية الجلدية وعلاقتها المكانية بالأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية صندوق الابتكار (رمز المشروع رقم. CI2021A03404) والصندوق الوطني للابتكار متعدد التخصصات في الطب الصيني التقليدي (رمز المشروع رقم. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
References
- Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181 (2012).
- Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).
- Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).
- Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).
- Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
- Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
- Schwager, S., Detmar, M.
- Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).
