Summary
组织切片的厚度限制了皮肤神经支配的形态学研究。本方案描述了一种独特的组织清除技术，用于在共聚焦显微镜下可视化300μm厚组织切片中的皮肤神经纤维。
Abstract
皮肤神经支配是周围神经系统的重要组成部分。虽然对皮肤神经纤维的研究进展迅速，但对其分布和化学特性的大部分理解来自对薄组织切片的常规组织化学和免疫组织化学染色。随着组织清除技术的发展，已经可以在较厚的组织切片上观察皮肤神经纤维。本方案描述了从大鼠后足的足底和背侧皮肤（两个典型的毛茸茸和光滑的皮肤部位）以300μm的厚度对组织切片进行多次荧光染色。这里，降钙素基因相关肽标记感觉神经纤维，而鬼臼肽和淋巴管内皮透明质酸受体1分别标记血液和淋巴管。在共聚焦显微镜下，标记的感觉神经纤维在更长的距离上完全跟随，在深层皮肤层成束运行，在浅层自由泳。这些神经纤维平行于或包围血管，淋巴管在毛茸茸的皮肤中形成三维（3D）网络。从方法论的角度来看，目前的方案提供了一种比现有传统方法更有效的研究皮肤神经支配的方法。
Introduction
皮肤是人体最大的器官，作为环境的关键界面，由许多神经纤维1，2，3密集支配。尽管皮肤神经支配以前已经通过各种组织学方法进行了广泛的研究，例如在全贴片皮肤和组织切片上染色4，5，6，但皮肤神经纤维的详细有效演示仍然是一个挑战7，8。鉴于此，本方案开发了一种独特的技术，可以在厚组织切片中更清楚地显示皮肤神经纤维。
由于切片厚度的限制，对受支配的皮肤神经纤维的观察不够精确，无法从获得的图像信息中准确描述降钙素基因相关肽（CGRP）神经纤维与局部组织和器官之间的关系。3D组织清除技术的出现为解决这一问题提供了一种可行的方法9，10。近年来，组织清除方法的快速发展为研究组织结构，整个器官，神经元投影和整个动物提供了许多工具11.透明的皮肤组织可以通过共聚焦显微镜在更厚的部分成像，以获得可视化皮肤神经纤维的数据。
在目前的研究中，选择大鼠后足的足底和背侧皮肤作为毛茸茸和光滑皮肤的两个靶位点3，4，7。为了在更长的距离上追踪皮肤神经纤维，将皮肤组织切片在300μm的厚度下进行免疫组织化学和组织化学染色，然后进行组织清除处理。CGRP用于标记感觉神经纤维12，13。此外，为了突出组织背景上的皮肤神经纤维，还进一步使用鬼笔分析蛋白和淋巴管内皮透明质酸受体1（LYVE1）分别标记血管和淋巴管14，15。
这些方法提供了一种简单的方法，可用于展示皮肤神经纤维的高分辨率视图，并可视化皮肤中神经纤维，血管和淋巴管之间的空间相关性，这可能为了解正常皮肤的稳态和病理条件下的皮肤改变提供更多的信息。
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Protocol
本研究经中国中医科学院针灸研究所伦理学委员会批准（参考编号D2018-04-13-1）。所有程序都是根据《国家卫生研究院实验动物护理和使用指南》（国家科学院出版社，华盛顿特区，1996年）进行的。本研究使用了三只成年雄性大鼠（斯普拉格 - 道利，体重230±15g）。所有动物都被饲养在12小时的光/暗循环中，温度和湿度受控，并允许自由获取食物和水。
1. 灌注和样品制备
- 将250mg / kg三溴乙醇溶液（见 材料表）腹膜内注射到大鼠中以诱导安乐死。
- 一旦呼吸停止，使用不锈钢手术剪刀打开大鼠的胸腔。使用20G针头以3mL / min的速率 通过 左心室13 与100mL的0.9%生理盐水灌注，然后在0.1M磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.4）中灌注250-300mL 4%多聚甲醛（图1A，B）。
- 灌注后，使用手术刀从后爪上取下背侧和鞋底的皮肤。
- 对于需要冷冻切片的样品，将组织在0.1 M PB的4%多聚甲醛中后固定2小时;然后在4°C下在0.1 M PB的25%蔗糖中冷冻保护组织超过24小时
- 对于具有需要组织清除的厚切片的样品，将组织固定在1x磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）中的4%多聚甲醛中2小时;然后在4°C下冷冻保护1x PBS中的组织（图1C-E）。
2. 使用CGRP、鬼牙盯和LYVE1进行三重荧光染色，然后进行组织清除处理
注意：使用CGRP，鬼笔蓝和LYVE1进行三重荧光染色，以揭示组织清空处理后厚度为300μm的组织切片上毛茸茸和光滑皮肤中的神经纤维，血管和淋巴管。
- 通过在微型烤箱中加热2分钟直到琼脂糖溶解，在1x PBS中制备2%琼脂糖（参见材料表）。
- 洗涤后，将皮肤组织包埋在37°C的2%琼脂糖中，并将其置于冰箱内冷却（图1F，G）。
- 用冰水将安装的组织固定在振动切片机上，并在横向方向上以500μm的厚度将其切片。使用以下参数设置振动切片机并完成切片：速度为 0.50 mm/s，振幅为 1.5 mm（图 1H-K）。
- 切片后，从切片中取出琼脂糖，并将其储存在具有1x PBS（pH 7.4）的六孔板中（图1L）。
- 将组织切片在2%曲拉通X-100的溶液中在4°C下在1x PBS（TriX-PB）中孵育过夜。 有关以下过程，请参见 图 2 。
- 将组织切片放入封闭缓冲液中，并在4°C下在振荡器上以72rpm旋转过夜。
注意：封闭缓冲液组成是1x PBS中的10%正常驴血清，1%Triton-X 100和0.2%叠氮化钠（见 材料表）。 - 将组织切片转移到含有小鼠单克隆抗CGRP（1：500）和绵羊多克隆抗LYVE1抗体（1：500）的一抗的溶液中，在微量离心管的稀释缓冲液中（参见 材料表），并在4°C下在摇床上旋转2天。
注意：稀释缓冲液组成为1%正常驴血清，0.2%Triton-X 100和0.2%叠氮化钠在1x PBS中。 - 在室温下用洗涤缓冲液洗涤组织切片两次，然后将其保持在振荡器上以4°C在洗涤缓冲液中过夜。
注意：洗涤缓冲液成分为 0.2% Triton-X 100，单位为 0.1 M PB （pH 7.4）。 - 第二天，将组织切片转移到含有驴抗小鼠IgG H&L Alexa-Flour488（1：500）和驴抗羊IgG H&L Alexa-Flour405（1：500）以及Alexa-Flour594鬼菁（1：1000）的混合溶液中（参见 材料表），并在4°C下在摇床上以72rpm旋转5小时。
- 在室温下用洗涤缓冲液在六孔板中洗涤组织切片1小时，两次。将组织切片保存在振荡器上的洗涤缓冲液中，在4°C下过夜。
- 将组织切片转移到组织清除试剂中（参见 材料表，其体积是样品体积的五倍），并在室温下在振荡器上以60rpm轻轻旋转1小时。
注意：在此处理后，组织切片变得清晰（图2B）。 - 将清除的组织安装在载玻片上，用垫片圈住组织，并用新鲜的组织清除试剂和盖玻片粘住间隙。
3. 使用CGRP、鬼菁素和LYVE1进行三重荧光染色，遵循常规方法
注意：作为比较，按照常规技术对厚度为30μm的组织切片进行了相同的染色。
- 在横向切片机上以30μm的比例切片组织切片，并将其安装在载玻片上。
- 在0.1M PB中加入含有3%正常驴血清和0.3%Triton X-100的封闭溶液，并在室温下孵育切片30分钟。
- 取出封闭溶液，并将切片与含有小鼠单克隆抗CGRP（1：500）和绵羊多克隆抗LYVE1抗体（1：500）的一抗原抗体的溶液在4°C的稀释缓冲液中孵育过夜。
- 第二天，用0.1 M PB（pH 7.4）洗涤组织切片三次，加入含有驴抗小鼠IgG H&L Alexa-Flour488（1：500）和驴抗羊IgG H&L Alexa-Flour405（1：500）的混合溶液，并在切片上孵育1小时。
- 在显微镜观察之前，用0.1 M PB（pH 7.4）洗涤切片三次，然后用50%甘油的盖玻片覆盖它们。
4. 成像和分析
- 在荧光显微镜下观察染色的样品，然后使用共聚焦显微镜拍摄图像。
- 从每个300μm厚的部分捕获30张图像（Z轴堆叠），每张图像在10μm帧中，并使用共聚焦显微镜系统的图像处理器集成单个聚焦图像（参见 材料表）。
- 在共聚焦设置的图像处理软件中执行以下步骤以进行三维（3D）分析： 设置“开始焦平面”|设置“结束”焦平面|设置步长|选择深度图案|图像捕获|Z 系列。
注意：蓝色荧光信号的激发和发射波长分别为401 nm和421 nm。绿色荧光信号的激发和发射波长分别为499 nm和519 nm。红色荧光信号的激发和发射波长分别为591 nm和618 nm。152μm是共聚焦针孔的直径（10x物镜，NA：0.4）。图像捕获分辨率为1024×1024像素。
- 在共聚焦设置的图像处理软件中执行以下步骤以进行三维（3D）分析： 设置“开始焦平面”|设置“结束”焦平面|设置步长|选择深度图案|图像捕获|Z 系列。
- 对于常规样品（步骤3），从每个30μm厚的切片中以1μm帧捕获30张图像（Z-堆栈），并如上所述进一步处理这些图像（步骤4.1-4.2）。
- 使用图像处理系统以3D重建模式演示图像。
- 通过将 Z-stack 共聚焦图像导入 Imaris 9.0（细胞成像软件，参见 材质表）来执行 3D 重建，并根据污渍强度创建表面渲染： 添加新表面|选择源通道|确定“曲面详图”|的平滑选项中的参数确定“绝对强度”阈值选项中的参数|对表面进行分类 |完成。
- 使用细胞成像软件获取正神经纤维表面积的数据。 选择渲染的图像|统计|详细|特定值|音量。
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Representative Results
三重荧光染色后，神经纤维，血管和淋巴管分别在毛茸茸和光滑的皮肤中用CGRP，鬼臼素和LYVE1清楚地标记（图3，4）。通过清除治疗，可以在更深的深度对CGRP阳性神经纤维，鬼臼肽阳性血管和LYVE1阳性淋巴管进行成像，以获得皮肤的完整结构信息（图3）。当这些组织结构以3D模式进一步重建时，它们的分布变得更容易追踪。结果表明，CGRP阳性神经纤维通过皮下组织和真皮到达表皮。这些神经纤维在皮下组织中成束运行，在真皮内分支，并在表皮中终止（图3）。相反，鬼臼阳性血管和LYVE1阳性淋巴管分布在皮下组织和真皮中（图3）。通常，CGRP阳性神经纤维平行或包围血管和淋巴管，在毛茸茸的皮肤中形成3D网络。
使用常规方法，尽管神经纤维，血管和淋巴管在薄片中用CGRP，鬼脙肽和LYVE1清楚地标记，但这些结构的观察受到切片厚度的限制，无法完全观察到（图4）。成像技术从不同的正荧光信号中为每个物体项目呈现深入的图像。生成图像后，通过Imaris软件获得CGRP阳性神经纤维的表面积。在厚度为30μm的切片中，CGRP阳性神经纤维表面积的毛茸茸的皮肤和光滑的皮肤之间没有差异。在300μm厚的组织切片中，与毛茸茸的皮肤相比，光滑皮肤CGRP阳性神经纤维的表面积显着增加（*P <0.05，Kruskal-Wallis非参数试验，n = 3， 图5）。因此，为了准确比较正神经纤维的表面积，300μm的清除部分优于传统的30μm部分。相比之下，与传统的薄切片相比，通过清除处理可以从厚组织切片中获得更多理想的3D图像的机会。
图1：实验工具和研究中关键步骤的照片（A）手术工具（手术刀，剪刀等）。（二）灌注泵。（C）灌注后后足底和后爪背侧。（D）从后爪上取下鞋底和背毛。（E）修剪过的皮肤组织。（F，G）在37°C和4°C下用2%琼脂糖安装皮肤组织。（I）将皮肤组织固定在切割支撑物上。（J） 设置切片参数。（K） 切片过程。（L）代表性截面的厚度为300μm，请点击此处查看此图的大图。
图2：荧光染色程序和皮肤组织的清除（A）本研究中涉及的方案步骤的表示。（B）清除治疗前后皮肤组织的外视图。请点击此处查看此图的大图。
图3：在厚皮肤部分进行组织清除治疗后神经纤维，血管和淋巴管的空间相关性（A，B）大鼠后足底和背侧皮肤厚部分的代表图像显示神经纤维，血管和淋巴管在光滑（A）和毛茸茸（B）皮肤中的分布。（A1-A3）图A分别显示了CGRP标签（A1），相位标签（A2）和LYVE1标签（A3）。（A4，A5;B1，B2）面板（A）和（B）以3D模式进行调整，并分别与正面（A4，B1）和背面（A5，B2）视图一起显示。所有面板的比例尺相同。请点击此处查看此图的大图。
图4：薄皮肤部分神经纤维，血管和淋巴管的空间相关性与传统方法 （A，B）大鼠后足底和背侧皮肤厚部分的代表图像显示神经纤维，血管和淋巴管在光滑（A）和毛茸茸（B）皮肤中的分布。（A1，A2; B1，B2）：面板 （A） 和 （B） 以 3D 模式进行调整，并分别与正面 （A1，B1） 和背面 （A2，B2） 视图一起显示。所有面板的比例尺相同。 请点击此处查看此图的大图。
图5：显示毛茸茸和光滑皮肤中CGRP阳性神经纤维表面积的直方图 （A）在厚度为30μm的部分中，毛茸茸的皮肤和光滑的皮肤在CGRP阳性神经纤维的表面积中没有差异。（B）在厚度为300 μm的切片中，与毛茸茸的皮肤相比，松弛皮肤CGRP阳性神经纤维的表面积显著增加（*P <0.05，n = 3）。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
本研究通过在较厚的组织切片上使用免疫荧光进行清除处理和3D视图以更好地了解皮肤神经支配，详细演示了毛茸茸和光滑皮肤中的皮肤神经纤维。长达1-2天的抗体孵育时间和过夜清洁过程非常重要。这两个关键步骤直接影响厚切片的免疫荧光染色效果。抗体的选择提出了另一个问题，并非所有抗体都适用于厚切片。我们推测，分子量较小的抗体可能是厚切片免疫荧光染色的理想选择。因此，抗体选择的难度是这种方法的主要局限性。本研究已经观察到大鼠毛茸茸和无毛皮肤上血管，淋巴管和神经分布的差异。对于人类来说，皮肤结构与啮齿动物的皮肤结构非常不同;我们期待在下一步中使用组织清除技术来观察和研究人体皮肤。
以前的研究已经做出了许多努力来揭示皮肤神经纤维4，5，6，7，8。与传统的组织切片研究相比，近年来，包括立方体，CLARITY和vDISCO在内的组织清除技术已被广泛用于研究动物的整个器官和整个身体16，17，18，19。通常，很难在薄片4，5，6，7，8中追踪具有长而完整结构的皮肤神经纤维;相对而言，对大尺寸样品进行组织清除处理可能需要很长时间16、17、18、19。考虑到它们的优缺点，本方案是检查透明处理厚切片内皮肤神经纤维的详细结构的适当选择，便于在普通共聚焦显微镜下观察和记录。利用这种方法，与薄切片相比，可以观察到厚切片内更长的皮肤神经纤维，并且与具有组织清除的大尺寸样品相比，节省了组织治疗的实验时间。
在这项研究中，皮肤神经纤维被标记为CGRP。这些神经纤维属于C和Aδ感觉纤维，起到传递伤害性信号和调节血管舒张的作用12，13。由于CGRP阳性神经纤维位于皮下层的血管和淋巴管附近，因此还建议通过改善血管生成和淋巴管生成来参与伤口愈合20，21。与之前的研究14，20，21，22类似，鬼瘠瘩素通过这种三重标记实验在血管中强烈表达。此外，LYVE1是一种整体膜糖蛋白，并被有效地用作分选大鼠真皮淋巴内皮细胞15，23，24的生物标志物。利用CGRP，鬼疽素和LYVE1的三重荧光染色以及组织清除技术，呈现高分辨率图像，以更好地了解毛茸茸和光滑皮肤中的神经纤维，血管和淋巴管网络。
需要注意的是，本研究仅证明了CGRP阳性神经纤维。除了这种感觉神经纤维外，该方案还可能适用于检查具有相应抗体的其他类型的皮肤神经纤维。此外，由于鬼臼蛋白在光滑的肌肉和内皮细胞21，22，25中的细胞骨架成分中高度表达，因此除了血管外，肌肉和表皮组织也用鬼牙脒标记。然而，根据形态学特征，从另一种组织中识别血管并不困难。
总之，本方案通过使用免疫荧光与清除治疗的组合，有效地探索了较厚切片上毛茸茸和光滑的皮肤的神经支配。从方法论的角度来看，研究其他种类的皮肤神经纤维及其与血管和淋巴管的空间相关性将是有益的。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究由中国中医科学院创新基金（项目代码：20199）资助。CI2021A03404）和国家中医药交叉创新基金（项目代码：2021A03404）。ZYYCXTD-D-202202）.。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
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