Summary
Die Dicke der Gewebeschnitte schränkte die morphologische Untersuchung der Hautinnervation ein. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einzigartige Gewebereinigungstechnik zur Visualisierung von kutanen Nervenfasern in dicken 300 μm Gewebeschnitten unter konfokaler Mikroskopie.
Abstract
Hautinnervation ist ein wichtiger Teil des peripheren Nervensystems. Obwohl das Studium der kutanen Nervenfasern schnell vorangekommen ist, stammt der größte Teil des Verständnisses ihrer verteilungsbedingten und chemischen Eigenschaften aus der konventionellen histochemischen und immunhistochemischen Färbung auf dünnen Gewebeschnitten. Mit der Entwicklung der Gewebereinigungstechnik ist es möglich geworden, die Hautnervenfasern auf dickeren Gewebeschnitten zu betrachten. Das vorliegende Protokoll beschreibt die mehrfache fluoreszierende Färbung auf Gewebeschnitten mit einer Dicke von 300 μm aus der Plantar- und Rückenhaut von Rattenhinterfuß, den beiden typischen behaarten und kahlen Hautstellen. Hier markiert das Calcitonin-Gen-verwandte Peptid die sensorischen Nervenfasern, während Phalloidin und der endotheliale Hyaluronrezeptor 1 des Lymphgefäßes die Blut- bzw. Lymphgefäße markieren. Unter einem konfokalen Mikroskop wurden die markierten sensorischen Nervenfasern vollständig auf längere Distanz verfolgt, in Bündeln in der tiefen Hautschicht und Freestyle in der oberflächlichen Schicht. Diese Nervenfasern verliefen parallel zu den Blutgefäßen oder umgaben sie, und Lymphgefäße bildeten ein dreidimensionales (3D) Netzwerk in der behaarten und kahlen Haut. Das aktuelle Protokoll bietet einen effektiveren Ansatz zur Untersuchung der Hautinnervation als die bestehenden konventionellen Methoden aus methodischer Sicht.
Introduction
Die Haut, das größte Organ im Körper, das als Schlüsselschnittstelle zur Umwelt dient, wird von vielen Nervenfasern dicht innerviert 1,2,3. Obwohl die Hautinnervation zuvor mit verschiedenen histologischen Methoden, wie der Färbung auf ganzer Haut und Gewebeabschnitten 4,5,6, umfassend untersucht wurde, ist der detaillierte effektive Nachweis von Hautnervenfasern immer noch eine Herausforderung 7,8. Vor diesem Hintergrund entwickelte das vorliegende Protokoll eine einzigartige Technik, um kutane Nervenfasern im dicken Gewebeabschnitt deutlicher darzustellen.
Aufgrund der Grenze durch die Dicke der Abschnitte ist die Beobachtung von innervierten Hautnervenfasern nicht präzise genug, um die Beziehung zwischen Calcitonin-Gen-related Peptide (CGRP) Nervenfasern und lokalen Geweben und Organen aus den aufgenommenen Bildinformationen genau darzustellen. Das Aufkommen der 3D-Gewebereinigungstechnologie bietet eine praktikable Methode, um dieses Problem zu lösen 9,10. Die schnelle Entwicklung von Gewebe-Clearing-Ansätzen hat in jüngster Zeit viele Werkzeuge zur Untersuchung von Gewebestrukturen, ganzen Organen, neuronalen Projektionen und ganzen Tieren angeboten11. Das transparente Hautgewebe könnte in einem viel dickeren Abschnitt durch konfokale Mikroskopie abgebildet werden, um die Daten zur Visualisierung von kutanen Nervenfasern zu erhalten.
In der aktuellen Studie wurde die Plantar- und Rückenhaut eines Rattenhinterfußes als die beiden Zielstellen von behaarter und kahler Hautausgewählt 3,4,7. Um die Hautnervenfasern in größerer Entfernung zu verfolgen, wurde das Hautgewebe in einer Dicke von 300 μm für die immunhistochemische und histochemische Färbung geschnitten, gefolgt von einer Gewebereinigungsbehandlung. CGRP wurde verwendet, um die sensorischen Nervenfasern12,13 zu kennzeichnen. Um die kutanen Nervenfasern auf dem Gewebehintergrund hervorzuheben, wurden außerdem Phalloidin und der endotheliale Hyaluronrezeptor 1 (LYVE1) verwendet, um die Blutgefäße bzw. Lymphgefäße14,15 zu markieren.
Diese Ansätze lieferten eine einfache Methode, die angewendet werden kann, um eine hochauflösende Ansicht der kutanen Nervenfasern zu demonstrieren und auch die räumliche Korrelation zwischen den Nervenfasern, Blutgefäßen und Lymphgefäßen in der Haut zu visualisieren, was viel mehr Informationen liefern kann, um die Homöostase der normalen Haut und die Hautveränderung unter den pathologischen Bedingungen zu verstehen.
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Protocol
Die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Akupunktur und Moxibustion der China Academy of Chinese Medical Sciences genehmigt (Referenznummer D2018-04-13-1). Alle Verfahren wurden nach dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996) durchgeführt. Drei erwachsene männliche Ratten (Sprague-Dawley, Gewicht 230 ± 15 g) wurden in dieser Studie verwendet. Alle Tiere wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit untergebracht und erlaubten freien Zugang zu Nahrung und Wasser.
1. Perfusion und Probenvorbereitung
- Injizieren Sie 250 mg/kg Tribromethanollösung (siehe Materialtabelle) intraperitoneal in die Ratte, um Euthanasie zu induzieren.
- Sobald die Atmung aufhört, verwenden Sie eine chirurgische Schere aus Edelstahl, um die Brusthöhle der Ratte zu öffnen. Verwenden Sie 20-G-Nadeln, um über den linken Herzventrikel 13 mit einer Rate von 3 ml / min mit 100 ml 0,9% normaler Kochsalzlösung zu perfundieren, gefolgt von 250-300 ml 4% Paraformaldehyd in 0,1 m Phosphatpuffer (PB, pH 7,4) (Abbildung 1A, B).
- Verwenden Sie nach der Perfusion ein Skalpell, um die Haut des Rückens und der Sohle von der Hinterpfote zu entfernen.
- Für die Proben, die einen gefrorenen Abschnitt benötigen, fixieren Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PB für 2 h; dann kryoschützen Sie das Gewebe in 25% Saccharose in 0,1 M PB für mehr als 24 h bei 4 °C
- Für die Proben mit dem dicken Abschnitt, der eine Gewebereinigung erfordert, fixieren Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) für 2 h; dann kryoschützen Sie das Gewebe in 1x PBS bei 4 °C (Abbildung 1C–E).
2. Dreifach fluoreszierende Färbung mit CGRP, Phalloidin und LYVE1, gefolgt von einer Gewebereinigungsbehandlung
HINWEIS: Die dreifach fluoreszierende Färbung mit CGRP, Phalloidin und LYVE1 wurde angewendet, um die Nervenfasern, Blutgefäße und Lymphgefäße in behaarter und kahler Haut auf Gewebeabschnitten mit einer Dicke von 300 μm nach der Gewebereinigungsbehandlung freizulegen.
- Bereiten Sie 2% Agarose in 1x PBS zu, indem Sie es in einem Mikroofen für 2 Minuten erhitzen, bis sich die Agarose auflöst (siehe Materialtabelle).
- Nach dem Waschen betten Sie die Hauttücher bei 37 °C in 2% Agarose ein und legen sie zum Abkühlen in den Eiskasten (Abbildung 1F,G).
- Befestigen Sie das montierte Gewebe auf dem Vibrationsmikrotom mit dem Eiswasser und schneiden Sie es in einer Dicke von 500 μm in Querrichtung. Verwenden Sie die folgenden Parameter, um den Vibrationsschnitt einzustellen und das Schneiden abzuschließen: Geschwindigkeit 0,50 mm/s und Amplitude 1,5 mm (Abbildung 1H-K).
- Entfernen Sie nach dem Schneiden die Agarose aus den Abschnitten und lagern Sie sie in einer Platte mit sechs Vertiefungen mit 1x PBS (pH 7,4) (Abbildung 1L).
- Inkubieren Sie die Gewebeabschnitte in einer Lösung von 2% Triton X-100 in 1x PBS (TriX-PB) über Nacht bei 4 °C. Siehe Abbildung 2 für das folgende Verfahren.
- Legen Sie die Gewebeabschnitte in den Sperrpuffer und drehen Sie sie mit 72 U / min auf dem Shaker über Nacht bei 4 ° C.
HINWEIS: Die Blockierpufferzusammensetzung besteht zu 10% aus normalem Eselserum, 1% Triton-X 100 und 0,2% Natriumazid in 1x PBS (siehe Materialtabelle). - Die Gewebeabschnitte werden in die Lösung mit den primären Antikörpern des monoklonalen Anti-CGRP-Antikörpers (1:500) der Maus und des polyklonalen Anti-LYVE1-Antikörpers (1:500) im Verdünnungspuffer im Mikrozentrifugenröhrchen (siehe Materialtabelle) überführt und 2 Tage lang bei 4 °C auf dem Shaker gedreht.
HINWEIS: Die Zusammensetzung des Verdünnungspuffers beträgt 1% normales Eselserum, 0,2% Triton-X 100 und 0,2% Natriumazid in 1x PBS. - Waschen Sie die Gewebepartien zweimal mit Waschpuffer bei Raumtemperatur und halten Sie sie dann über Nacht bei 4 °C im Waschpuffer auf dem Shaker.
HINWEIS: Die Zusammensetzung des Waschpuffers beträgt 0,2% Triton-X 100 in 0,1 M PB (pH 7,4). - Am nächsten Tag die Gewebeabschnitte in die Mischlösung mit den sekundären Antikörpern von Esel-Anti-Maus-IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) und Esels-Antischaf-IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500) sowie Alexa-Flour594 Phalloidin (1:1000) (siehe Materialtabelle) in einem Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei 72 U/min auf dem Shaker 5 h bei 4 °C drehen.
- Waschen Sie die Gewebeabschnitte in einer Sechs-Well-Platte mit Waschpuffer für 1 h, zweimal, bei Raumtemperatur. Halten Sie die Gewebeabschnitte im Waschpuffer auf dem Shaker über Nacht bei 4 °C.
- Übertragen Sie die Gewebeabschnitte in das Gewebereinigungsreagenz (siehe Materialtabelle, ihr Volumen war fünfmal höher als das Probenvolumen) und drehen Sie sie mit 60 U / min auf dem Shaker sanft für 1 h bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Nach dieser Behandlung werden die Gewebeabschnitte deutlich (Abbildung 2B). - Montieren Sie das gereinigte Gewebe auf dem Objektträger, umkreisen Sie das Gewebe mit einem Abstandshalter und kleben Sie den Spalt mit frischem Gewebereinigungsreagenz und Deckglas.
3. Dreifachfluoreszierende Färbung mit CGRP, Phalloidin und LYVE1 nach dem konventionellen Ansatz
HINWEIS: Zum Vergleich: Die gleiche Färbung wurde an Gewebeschnitten mit einer Dicke von 30 μm nach herkömmlichen Techniken durchgeführt.
- Schneiden Sie die Gewebeschnitte bei 30 μm auf einem Mikrotom in Querrichtung und montieren Sie sie auf dem Objektträger.
- Fügen Sie eine Blocklösung mit 3% normalem Eselserum und 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PB hinzu und inkubieren Sie die Abschnitte für 30 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die blockierende Lösung und inkubieren Sie die Abschnitte mit der Lösung, die die primären Antikörper des monoklonalen Anti-CGRP-Antikörpers der Maus (1:500) und des polyklonalen Anti-LYVE1-Antikörpers (1:500) enthält, in Verdünnungspuffer über Nacht bei 4 °C.
- Am nächsten Tag die Gewebeschnitte dreimal mit 0,1 M PB (pH 7,4) waschen, die Mischlösung mit den sekundären Antikörpern von Esel Anti-Maus IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) und Esel Anti-Schaf IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500) sowie Alexa-Flour594 Phalloidin (1:1000) auf die Abschnitte geben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Vor der mikroskopischen Beobachtung die Abschnitte dreimal in 0,1 M PB (pH 7,4) waschen und dann mit Deckgläsern aus 50% Glycerin abdecken.
4. Bildgebung und Analysen
- Beobachten Sie die gefärbten Proben unter einem fluoreszierenden Mikroskop und nehmen Sie dann die Bilder mit einem konfokalen Mikroskop auf.
- Erfassen Sie 30 Bilder (Z-Stacks) in jeweils 10-μm-Frames aus jedem 300 μm dicken Schnitt und integrieren Sie ein einzelnes In-Fokus-Bild mit einem Bildprozessor des konfokalen Mikroskopiesystems (siehe Materialtabelle).
- Führen Sie die folgenden Schritte in der Bildverarbeitungssoftware des konfokalen Aufbaus für die dreidimensionale (3D) Analyse durch: Legen Sie die | der Startfokalebene fest Endfokalebene | einstellen Festlegen der Schrittgröße | Tiefenmuster | auswählen | zur Bilderfassung Z-Serie.
HINWEIS: Die Anregungs- und Emissionswellenlängen der blauen Fluoreszenzsignale betrugen 401 nm bzw. 421 nm. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen grüner Fluoreszenzsignale betrugen 499 nm bzw. 519 nm. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen roter Fluoreszenzsignale betrugen 591 nm bzw. 618 nm. 152 μm ist der Durchmesser des konfokalen Lochs (10x Objektivlinse, NA: 0,4). Die Bildaufnahmeauflösung betrug 1024 × 1024 Pixel.
- Führen Sie die folgenden Schritte in der Bildverarbeitungssoftware des konfokalen Aufbaus für die dreidimensionale (3D) Analyse durch: Legen Sie die | der Startfokalebene fest Endfokalebene | einstellen Festlegen der Schrittgröße | Tiefenmuster | auswählen | zur Bilderfassung Z-Serie.
- Für die herkömmlichen Proben (Schritt 3) werden 30 Bilder (Z-Stacks) in 1 μm Frames aus jedem 30 μm dicken Abschnitt aufgenommen und diese Bilder wie oben erwähnt weiter behandelt (Schritte 4.1-4.2).
- Demonstrieren Sie die Bilder im Muster der 3D-Rekonstruktion mit dem Bildverarbeitungssystem.
- Führen Sie 3D-Rekonstruktionen durch, indem Sie konfokale Z-Stack-Bilder in Imaris 9.0 importieren (Zellbildgebungssoftware, siehe Materialtabelle) und Oberflächenrenderings basierend auf Fleckenintensitäten erstellen: Neue Oberflächen | hinzufügen Quellkanal | auswählen Bestimmen Sie die Parameter in der Option "Glatt" der | "Oberflächendetails" Bestimmen Sie die Parameter in der Schwellenwertoption der absoluten Intensität | Oberflächen | klassifizieren Fertigstellen.
- Erfassen Sie Daten im Bereich positiver Nervenfasern mit der Zellbildgebungssoftware. Wählen Sie das gerenderte Bild | aus Statistiken | Detaillierte | Spezifische Werte | Volumen.
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Representative Results
Nach der dreifach fluoreszierenden Färbung wurden die Nervenfasern, Blutgefäße und Lymphgefäße in der behaarten und kahlen Haut deutlich mit CGRP, Phalloidin bzw. LYVE1 markiert (Abbildung 3,4). Mit der Clearing-Behandlung können die CGRP-positiven Nervenfasern, Phalloidin-positiven Blutgefäße und LYVE1-positiven Lymphgefäße in größerer Tiefe abgebildet werden, um die vollständige Strukturinformation der Haut zu erfassen (Abbildung 3). Als diese Gewebestrukturen in einem 3D-Muster weiter rekonstruiert wurden, wurde ihre Verteilung leichter nachvollziehbar. Es wurde gezeigt, dass die CGRP-positiven Nervenfasern durch das Unterhautgewebe und die Dermis zur Epidermis gelangten. Diese Nervenfasern verzweigten sich in Bündeln im Unterhautgewebe, verzweigten sich innerhalb der Dermis und endeten in der Epidermis (Abbildung 3). Im Gegensatz dazu sind Phalloidin-positive Blutgefäße und LYVE1-positive Lymphgefäße im Unterhautgewebe und in der Dermis verteilt (Abbildung 3). Im Allgemeinen verliefen die CGRP-positiven Nervenfasern parallel zu den Blutgefäßen und Lymphgefäßen oder umgaben sie und bildeten ein 3D-Netzwerk in der behaarten und kahlen Haut.
Beim konventionellen Ansatz waren zwar die Nervenfasern, Blutgefäße und Lymphgefäße in den dünnen Schnitten eindeutig mit CGRP, Phalloidin und LYVE1 markiert, die Beobachtung dieser Strukturen ist jedoch durch die Schichtdicke begrenzt und kann nicht vollständig beobachtet werden (Abbildung 4). Das bildgebende Verfahren renderte detaillierte Bilder für jedes Objektelement aus verschiedenen positiven Fluoreszenzsignalen. Nach der Erzeugung des Bildes wurde die Oberfläche der CGRP-positiven Nervenfasern durch die Imaris-Software erfasst. Im Abschnitt mit einer Dicke von 30 μm gab es keinen Unterschied zwischen behaarter Haut und kahler Haut im Bereich der CGRP-positiven Nervenfasern. In den 300 μm dicken Gewebeschnitten war im Vergleich zu behaarter Haut die Oberfläche der CGRP-positiven Nervenfasern der kahlen Haut signifikant vergrößert (*P < 0,05, Kruskal-Wallis nichtparametrischer Test, n = 3, Abbildung 5). Um die Oberfläche positiver Nervenfasern genau zu vergleichen, ist der gereinigte Abschnitt von 300 μm daher besser als der herkömmliche 30-μm-Abschnitt. Zum Vergleich ist es möglich, mit der Clearingbehandlung mehr Möglichkeiten für ein ideales 3D-Bild aus dem dicken Gewebeschnitt zu gewinnen als im herkömmlichen Dünnschliff.
Abbildung 1: Fotos von experimentellen Werkzeugen und Schlüsselschritten in der Studie. (A) Chirurgische Werkzeuge (Skalpell, Scheren usw.). (B) Die Pumpe für die Perfusion. (C) Plantar- und Rückenseiten der Hinterpfote nach der Perfusion. (D) Die Sohlen- und Rückenfelle wurden von der Hinterpfote entfernt. (E) Beschnittenes Hautgewebe. (F,G) Montiertes Hautgewebe mit 2% Agarose bei 37 °C und 4 °C. (H) Vibrationsmikrotom. (I) Fixiertes Hautgewebe auf dem Schneideträger. (J) Legen Sie Parameter für das Schneiden fest. (K) Prozess des Schneidens. (L) Repräsentative Abschnitte haben eine Dicke von 300 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Das fluoreszierende Färbeverfahren und die Reinigung von Hautgewebe . (A) Eine Darstellung der Protokollschritte, die an dieser Studie beteiligt sind. (B) Außenansichten des Hautgewebes vor und nach der Clearing-Behandlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Räumliche Korrelation von Nervenfasern, Blutgefäßen und Lymphgefäßen nach einer Gewebereinigungsbehandlung auf dem dicken Hautabschnitt. (A,B) Repräsentative Bilder des dicken Abschnitts der Plantar- und Rückenhaut des Rattenhinterfußs zeigen die Verteilung von Nervenfasern, Blutgefäßen und Lymphgefäßen in der kahlen (A) und behaarten (B) Haut. (A1-A3) Panel A wurde separat mit CGRP-Labeling (A1), Pha-Labeling (A2) und LYVE1-Labeling (A3) gezeigt. (A4,A5; B1,B2) Die Paneele (A) und (B) wurden in einem 3D-Muster angepasst und mit der Vorderansicht (A4, B1) bzw. der Rückseite (A5, B2) angezeigt. Gleiche Maßstabsleiste für alle Panels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Räumliche Korrelation von Nervenfasern, Blutgefäßen und Lymphgefäßen auf dem dünnen Hautschnitt mit dem konventionellen Ansatz. (A,B) Repräsentative Bilder des dicken Abschnitts der Plantar- und Rückenhaut des Rattenhinterfußs zeigen die Verteilung von Nervenfasern, Blutgefäßen und Lymphgefäßen in der kahlen (A) und behaarten (B) Haut. (A1,A2; B1, B2): Die Paneele (A) und (B) wurden in einem 3D-Muster angepasst und mit den Vorder- (A1, B1) bzw. hinteren (A2, B2) Ansichten angezeigt. Gleiche Maßstabsleiste für alle Panels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Ein Histogramm, das die Oberfläche von CGRP-positiven Nervenfasern in behaarter und kahler Haut zeigt. (A) Im Abschnitt mit einer Dicke von 30 μm gab es keinen Unterschied zwischen behaarter Haut und kahler Haut in der Oberfläche von CGRP-positiven Nervenfasern. (B) In dem Abschnitt mit einer Dicke von 300 μm war im Vergleich zu behaarter Haut die Oberfläche der CGRP-positiven Nervenfasern der kahlen Haut signifikant vergrößert (*P < 0,05, n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die vorliegende Studie liefert eine detaillierte Demonstration der kutanen Nervenfasern in der behaarten und kahlen Haut durch die Verwendung von Immunfluoreszenz auf dickeren Gewebeabschnitten mit Clearing-Behandlung und einer 3D-Ansicht, um die Hautinnervation besser zu verstehen. Die Antikörper-Inkubationszeit von bis zu 1-2 Tagen und ein Reinigungsprozess über Nacht sind wichtig. Diese beiden Schlüsselschritte wirken sich direkt auf die Immunfluoreszenzfärbungswirkung von dicken Abschnitten aus. Ein weiteres Problem ergab sich aus der Wahl der Antikörper, die nicht alle für dicke Abschnitte geeignet sind. Wir spekulieren, dass Antikörper mit kleineren Molekulargewichten ideal für die Immunfluoreszenzfärbung von dicken Abschnitten sein könnten. Daher ist die Schwierigkeit der Antikörperselektion eine wesentliche Einschränkung dieses Ansatzes. Die vorliegende Arbeit hatte die Unterschiede in der Verteilung von Blutgefäßen, Lymphgefäßen und Nerven auf behaarter und haarloser Haut von Ratten beobachtet. Für den Menschen unterscheidet sich die Hautstruktur stark von der von Nagetieren; Wir freuen uns darauf, im nächsten Schritt mit der Gewebereinigungstechnologie die menschliche Haut zu beobachten und zu erforschen.
Frühere Studien haben viele Anstrengungen unternommen, um kutane Nervenfasern 4,5,6,7,8 aufzudecken. Im Gegensatz zur herkömmlichen Gewebeschnittstudie wurden in den letzten Jahren häufig Gewebereinigungstechniken wie CUBIC, CLARITY und vDISCO zur Untersuchung ganzer Organe und ganzer Körper von Tieren eingesetzt16,17,18,19. Normalerweise ist es schwierig, die Hautnervenfasern mit einer langen und vollständigen Struktur im Dünnabschnitt 4,5,6,7,8 zu verfolgen; Im Vergleich dazu kann die Behandlung der Gewebereinigung an der großen Probe eine lange Zeit dauern16,17,18,19. In Anbetracht ihrer Vor- und Nachteile ist das vorliegende Protokoll eine geeignete Wahl, um die detaillierte Struktur der kutanen Nervenfasern innerhalb des transparent behandelten dicken Abschnitts zu untersuchen, was unter herkömmlicher konfokaler Mikroskopie beobachtet und aufgezeichnet werden kann. Mit diesem Ansatz kann man längere kutane Nervenfasern innerhalb des dicken Abschnitts im Vergleich zum dünnen Schnitt beobachten und experimentelle Zeit für die Gewebebehandlung im Vergleich zu den großformatigen Proben mit Gewebereinigung sparen.
In dieser Studie wurden die Hautnervenfasern mit CGRP markiert. Diese Art von Nervenfasern gehören zu den sensorischen C- und Aδ-Fasern und spielen die Rolle des Transports nozizeptiver Signale und der Modulation der Vasodilatation12,13. Da sich CGRP-positive Nervenfasern in der Nähe von Blutgefäßen und Lymphgefäßen in der subkutanen Schicht befinden, wurde auch vorgeschlagen, an der Wundheilung durch Verbesserung der Angiogenese und Lymphangiogenese teilzunehmen20,21. Ähnlich wie in früheren Studien 14,20,21,22 wurde Phalloidin mit diesem Triple-Labeling-Experiment stark in den Blutgefäßen exprimiert. Darüber hinaus ist LYVE1 ein integrales Membranglykoprotein und wird effektiv als Biomarker für die Sortierung der dermalen lymphatischen Endothelzellen 15,23,24 eingesetzt. Unter Ausnutzung der dreifach fluoreszierenden Färbung mit CGRP, Phalloidin und LYVE1 zusammen mit der Gewebereinigungstechnik wird ein hochauflösendes Bild für einen besseren Einblick in das Netzwerk von Nervenfasern, Blutgefäßen und Lymphgefäßen in der behaarten und kahlen Haut präsentiert.
Es ist zu beachten, dass in dieser Studie nur die CGRP-positiven Nervenfasern nachgewiesen wurden. Neben dieser Art von sensorischer Nervenfaser kann dieses Protokoll auch für die Untersuchung anderer Arten von Hautnervenfasern mit den entsprechenden Antikörpern geeignet sein. Da Phalloidin in der Zytoskelettkomponente in glatten Muskel- und Endothelzellen21,22,25 stark exprimiert wird, wurden neben den Blutgefäßen auch die Muskel- und Epidermisteile mit Phalloidin markiert. Nach dem morphologischen Merkmal ist es jedoch nicht schwierig, Blutgefäße aus der anderen Art von Geweben zu identifizieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das vorliegende Protokoll die Innervation der behaarten und kahlen Haut an dickeren Abschnitten effektiv untersucht, indem es eine Kombination aus Immunfluoreszenz mit Clearing-Behandlung verwendet. Aus methodischer Sicht wäre es von Vorteil, die anderen Arten von kutanen Nervenfasern und ihre räumliche Korrelation mit Blutgefäßen und Lymphgefäßen in Zukunft zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (Projektcode Nr. CI2021A03404) und der National Traditional Chinese Medicine Interdisciplinary Innovation Fund (Projektcode-Nr. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
References
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