Summary
Tykkelsen af vævssektioner begrænsede den morfologiske undersøgelse af hudindervationen. Den nuværende protokol beskriver en unik vævsrensningsteknik til at visualisere kutane nervefibre i tykke 300 μm vævssektioner under konfokal mikroskopi.
Abstract
Hud innervering er en vigtig del af det perifere nervesystem. Selvom undersøgelsen af de kutane nervefibre har udviklet sig hurtigt, kommer det meste af forståelsen af deres fordelingsmæssige og kemiske egenskaber fra konventionel histokemisk og immunohistokemisk farvning på tynde vævssektioner. Med udviklingen af vævsrensningsteknikken er det blevet muligt at se de kutane nervefibre på tykkere vævssektioner. Denne protokol beskriver flere fluorescerende farvninger på vævssektioner i en tykkelse på 300 μm fra plantar og dorsal hud af rotte bagfod, de to typiske hårede og glatte hudsteder. Her mærker det calcitonin-genrelaterede peptid de sensoriske nervefibre, mens phalloidin og lymfekarendotelhyaluronanreceptor 1 mærker henholdsvis blod- og lymfekarrene. Under et konfokalt mikroskop blev de mærkede sensoriske nervefibre fulgt fuldstændigt på længere afstand og løb i bundter i det dybe kutane lag og freestyle i det overfladiske lag. Disse nervefibre løb parallelt med eller omringede blodkarrene, og lymfekar dannede et tredimensionelt (3D) netværk i den hårede og glatte hud. Den nuværende protokol giver en mere effektiv tilgang til at studere hudindervation end de eksisterende konventionelle metoder fra metodeperspektivet.
Introduction
Huden, det største organ i kroppen, der tjener som en vigtig grænseflade til miljøet, er tæt innerveret af mange nervefibre 1,2,3. Selvom hudindervation tidligere er blevet bredt undersøgt med forskellige histologiske metoder, såsom farvning på helmonterede hud- og vævsafsnit 4,5,6, er den detaljerede effektive demonstration af kutane nervefibre stadig en udfordring 7,8. I betragtning af dette udviklede den nuværende protokol en unik teknik til at udvise kutane nervefibre tydeligere i tykvævssektionen.
På grund af grænsen for tykkelsen af sektioner er observationen af innerverede hudnervefibre ikke præcis nok til nøjagtigt at skildre forholdet mellem calcitonin-genrelaterede peptid (CGRP) nervefibre og lokale væv og organer fra den erhvervede billedinformation. Fremkomsten af 3D-vævsrensningsteknologi giver en gennemførlig metode til at løse dette problem 9,10. Den hurtige udvikling af vævsrydningsmetoder har tilbudt mange værktøjer til undersøgelse af vævsstrukturer, hele organer, neuronale projektioner og hele dyr i nyere tid11. Det gennemsigtige hudvæv kunne afbildes i en meget tykkere sektion ved konfokal mikroskopi for at få dataene til at visualisere kutane nervefibre.
I den aktuelle undersøgelse blev plantar og dorsal hud af en rotte bagfod valgt som de to målsteder for behåret og glat hud 3,4,7. For at spore de kutane nervefibre på længere afstand blev hudvævet skåret i tykkelsen af 300 μm til immunohistokemisk og histokemisk farvning efterfulgt af vævsrensningsbehandling. CGRP blev brugt til at mærke de sensoriske nervefibre12,13. For at fremhæve de kutane nervefibre på vævsbaggrunden blev phalloidin og lymfekar endotelhyaluronanreceptor 1 (LYVE1) yderligere brugt til at mærke blodkarrene og lymfekarrene henholdsvis14,15.
Disse tilgange gav en ligetil metode, der kan anvendes til at demonstrere et højopløsningsbillede af de kutane nervefibre og også til at visualisere den rumlige sammenhæng mellem nervefibre, blodkar og lymfekar i huden, hvilket kan give meget mere information til at forstå homeostase i den normale hud og kutan ændring under de patologiske tilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité ved Institut for Akupunktur og Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (referencenummer D2018-04-13-1). Alle procedurer blev udført efter National Institutes of Health Guide for pleje og brug af forsøgsdyr (National Academy Press, Washington, DC, 1996). Tre voksne hanrotter (Sprague-Dawley, vægt 230 ± 15 g) blev anvendt i denne undersøgelse. Alle dyr blev opstaldet i en 12 timers lys/mørk cyklus med kontrolleret temperatur og fugtighed og fik fri adgang til mad og vand.
1. Perfusion og prøveforberedelse
- 250 mg/kg tribromethanolopløsning (se materialetabel) injiceres intraperitonealt i rotten for at fremkalde eutanasi.
- Når vejrtrækningen stopper, skal du bruge kirurgisk saks i rustfrit stål til at åbne rottens brysthulrum. Brug 20 G nåle til at gennemstære via venstre hjerteventrikel13 med en hastighed på 3 ml / min med 100 ml 0,9% normal saltvand efterfulgt af 250-300 ml 4% paraformaldehyd i 0,1 M phosphatbuffer (PB, pH 7,4) (figur 1A, B).
- Efter perfusion skal du bruge en skalpel til at fjerne huden på dorsum og sål fra bagpoten.
- For prøver, der kræver frossen sektion, efterfikseres vævene i 4% paraformaldehyd i 0,1 M PB i 2 timer; derefter kryobeskytte vævene i 25% saccharose i 0,1 M PB i mere end 24 timer ved 4 °C
- For prøverne med den tykke sektion, der kræver vævsrensning, efterfikseres vævene i 4% paraformaldehyd i 1x phosphatbufferet saltvand (1x PBS) i 2 timer; derefter kryobeskytte vævene i 1x PBS ved 4 °C (figur 1C–E).
2. Tredobbelt fluorescerende farvning med CGRP, phalloidin og LYVE1 efterfulgt af vævsrensningsbehandling
BEMÆRK: Tredobbelt fluorescerende farvning med CGRP, phalloidin og LYVE1 blev påført for at afsløre nervefibre, blodkar og lymfekar i behåret og glat hud på vævssektioner med en tykkelse på 300 μm efter vævsrensningsbehandling.
- 2% agarose tilberedes i 1x PBS ved opvarmning i en mikroovn i 2 minutter, indtil agarosen opløses (se materialetabel).
- Efter vask indlejres hudvævene i 2% agarose ved 37 °C, og de anbringes i fryseboksen til afkøling (figur 1F,G).
- Fastgør det monterede væv på den vibrerende mikrotom med isvandet og skær dem i en tykkelse på 500 μm i tværgående retning. Brug følgende parametre til at indstille vibrationsskæreren og finishskæringen: hastighed, 0,50 mm / s og amplitude, 1,5 mm (figur 1H-K).
- Efter udskæring fjernes agarosen fra sektionerne, og de opbevares i en seks-brønds plade med 1x PBS (pH 7.4) (figur 1L).
- Vævssektionerne inkuberes i en opløsning af 2% Triton X-100 i 1x PBS (TriX-PB) natten over ved 4 °C. Se figur 2 for følgende procedure.
- Vævssektionerne anbringes i blokeringsbufferen, og der roteres med 72 o/min på rysteren natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: Den blokerende buffersammensætning er 10% normalt æselserum, 1% Triton-X 100 og 0,2% natriumazid i 1x PBS (se materialetabel). - Vævssektionerne overføres til opløsningen indeholdende de primære antistoffer fra mus monoklonal anti-CGRP (1:500) og får polyklonal anti-LYVE1 antistof (1:500) i fortyndingsbuffer i mikrocentrifugerøret (se materialetabel), og roter på rysteren i 2 dage ved 4 °C.
BEMÆRK: Fortyndingsbuffersammensætningen er 1% normalt æselserum, 0,2% Triton-X 100 og 0,2% natriumazid i 1x PBS. - Vask vævssektionerne to gange med vaskebuffer ved stuetemperatur, og opbevar dem derefter på rysteren natten over ved 4 °C i vaskebuffer.
BEMÆRK: Vaskebuffersammensætningen er 0,2% Triton-X 100 i 0,1 M PB (pH 7,4). - Den næste dag overføres vævssektionerne til den blandede opløsning, der indeholder de sekundære antistoffer fra æsel antimus IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) og æsel anti-får IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500) samt Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000) (se Materialetabel) i et mikrocentrifugerør og drej ved 72 o / min på rysteren i 5 timer ved 4 ° C.
- Vask vævssektionerne i en seks-brønds plade med vaskebuffer i 1 time, to gange ved stuetemperatur. Opbevar vævssektionerne i vaskebufferen på rysteren natten over ved 4 °C.
- Vævssektionerne overføres til vævsrensningsreagenset (se Materialetabel, dets volumen var fem gange større end prøvevolumenet) og drej forsigtigt ved 60 o / min på rysteren i 1 time ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Efter denne behandling bliver vævssektionerne tydelige (figur 2B). - Monter de ryddede væv på diaset, cirkel vævene med en afstandsstykke, og sæt spalten fast med frisk vævsrensningsreagens og dækslip.
3. Tredobbelt fluorescerende farvning med CGRP, phalloidin og LYVE1 efter den konventionelle tilgang
BEMÆRK: Til sammenligning blev den samme farvning udført på vævssektioner med en tykkelse på 30 μm efter konventionelle teknikker.
- Skær vævssektionerne i 30 μm på en mikrotom i tværgående retning, og monter dem på diaset.
- Der tilsættes blokerende opløsning med 3% normalt æselserum og 0,3% Triton X-100 i 0,1 M PB, og sektionerne inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Blokeringsopløsningen fjernes, og sektionerne inkuberes med opløsningen indeholdende de primære antistoffer fra musens monoklonale anti-CGRP (1:500) og får polyklonalt anti-LYVE1-antistof (1:500) i fortyndingsbuffer natten over ved 4 °C.
- Den næste dag vaskes vævssektionerne med 0,1 M PB (pH 7,4) tre gange, tilsættes den blandede opløsning indeholdende de sekundære antistoffer af æsel antimus IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) og æsel anti-får IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500) samt Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000) på sektionerne og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Før mikroskopisk observation vaskes sektionerne i 0,1 M PB (pH 7,4) tre gange og dækkes derefter med dækslips i 50% glycerin.
4. Billeddannelse og analyser
- Overhold de farvede prøver under et fluorescerende mikroskop, og tag derefter billederne ved hjælp af et konfokalt mikroskop.
- Tag 30 billeder (Z-stakke), hver i 10 μm rammer, fra hver 300 μm tyk sektion og integrer et enkelt fokusbillede ved hjælp af en billedprocessor af det konfokale mikroskopisystem (se Materialetabel).
- Udfør følgende trin i billedbehandlingssoftwaren i den konfokale opsætning til tredimensionel (3D) analyse: Indstil Start Focal Plane | Indstil brændpunktsplan for end | Indstil trinstørrelse | Vælg | | til billedoptagelse Z-serien.
BEMÆRK: Excitations- og emissionsbølgelængderne for blå fluorescenssignaler var henholdsvis 401 nm og 421 nm. Excitations- og emissionsbølgelængder af grønne fluorescenssignaler var henholdsvis 499 nm og 519 nm. Excitations- og emissionsbølgelængder af røde fluorescenssignaler var henholdsvis 591 nm og 618 nm. 152 μm er diameteren af confocal pinhole (10x objektiv linse, NA: 0,4). Billedoptagelsesopløsningen var 1024 × 1024 pixels.
- Udfør følgende trin i billedbehandlingssoftwaren i den konfokale opsætning til tredimensionel (3D) analyse: Indstil Start Focal Plane | Indstil brændpunktsplan for end | Indstil trinstørrelse | Vælg | | til billedoptagelse Z-serien.
- For de konventionelle prøver (trin 3) skal du tage 30 billeder (Z-stakke) i 1 μm rammer fra hver 30 μm tyk sektion og yderligere behandle disse billeder som nævnt ovenfor (trin 4.1-4.2).
- Demonstrer billederne i mønsteret af 3D-rekonstruktion med billedbehandlingssystemet.
- Udfør 3D-rekonstruktioner ved at importere Z-stack konfokale billeder til Imaris 9.0 (cellebilledbehandlingssoftware, se Materialetabel), og opret overfladegengivelser baseret på pletintensiteter: Tilføj nye overflader | Vælg kildekanal | Bestem parametrene i den glatte indstilling af Overflader Detaljer | Bestem parametrene i tærskelindstillingen for absolut intensitet | Klassificer overflader | Afslut.
- Indhent data i overfladearealet af positive nervefibre med cellebilleddannelsessoftwaren. Vælg det gengivne billede | Statistik | Detaljeret | Specifikke værdier | Volumen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter tredobbelt fluorescerende farvning blev nervefibre, blodkar og lymfekar tydeligt mærket med henholdsvis CGRP, phalloidin og LYVE1 i den hårede og glatte hud (figur 3,4). Med clearingbehandlingen kan de CGRP-positive nervefibre, phalloidin-positive blodkar og LYVE1-positive lymfekar afbildes på en større dybde for at erhverve den komplette strukturelle information om huden (figur 3). Da disse vævsstrukturer blev yderligere rekonstrueret i et 3D-mønster, blev deres fordeling lettere at spore. Det blev vist, at de CGRP-positive nervefibre passerede gennem det subkutane væv og dermis til epidermis. Disse nervefibre løb i bundter i det subkutane væv, forgrenede sig i dermis og sluttede i epidermis (figur 3). I modsætning hertil fordeles phalloidin-positive blodkar og LYVE1-positive lymfekar i det subkutane væv og dermis (figur 3). Generelt løb de CGRP-positive nervefibre parallelt med eller omringede blodkarrene og lymfekarrene og dannede et 3D-netværk i den hårede og glatte hud.
Med den konventionelle tilgang, selvom nervefibrene, blodkarrene og lymfekarrene var tydeligt mærket med CGRP, phalloidin og LYVE1 i de tynde sektioner, er observationen af disse strukturer begrænset af skivetykkelsen og kan ikke observeres fuldstændigt (figur 4). Billeddannelsesteknikken gengav dybdegående billeder for hvert objektelement fra forskellige positive fluorescerende signaler. Efter generering af billedet blev overfladearealet af CGRP-positive nervefibre erhvervet gennem Imaris-softwaren. I sektionen med en tykkelse på 30 μm var der ingen forskel mellem behåret hud og glat hud i overfladearealet af CGRP-positive nervefibre. I de 300 μm tykke vævssektioner, sammenlignet med behåret hud, blev overfladearealet af CGRP-positive nervefibre af glat hud signifikant forøget (* P < 0,05, Kruskal-Wallis ikke-parametrisk test, n = 3, figur 5). For at sammenligne overfladearealet af positive nervefibre nøjagtigt er den 300 μm ryddede sektion bedre end den traditionelle 30 μm sektion. Til sammenligning er det muligt at få flere muligheder for et ideelt 3D-billede fra tykvævssektionen med clearingbehandlingen end i den konventionelle tynde sektion.
Figur 1: Fotografier af eksperimentelle værktøjer og nøgletrin i undersøgelsen. (A) Kirurgiske værktøjer (skalpel, saks osv.). (B) Pumpen til perfusion. (C) Plantar og dorsale sider af bagpoten efter perfusion. (D) Sål- og dorsumskinddene blev fjernet fra bagpoten. (E) Trimmet hudvæv. (F,G) Monteret hudvæv med 2% agarose ved 37 °C og 4 °C. (H) Vibrerende mikrotom. (I) Fast hudvæv på skærestøtten. (J) Indstil parametre for udskæring. (K) Proces for udskæring. (L) Repræsentative sektioner har en tykkelse på 300 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Den fluorescerende farvningsprocedure og rydning af hudvæv. (A) En repræsentation af de protokoltrin, der er involveret i denne undersøgelse. (B) Udvendig visning af hudvæv før og efter clearingbehandlingen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Rumlig korrelation af nervefibre, blodkar og lymfekar efter vævsrensningsbehandling på den tykke hudsektion. (A,B) Repræsentative billeder af den tykke del af rottebagfodens plantar og dorsale hud viser fordelingen af nervefibre, blodkar og lymfekar i den glatte (A) og hårede (B) hud. (A1-A3) Panel A blev vist separat med CGRP-mærkning (A1), Pha-mærkning (A2) og LYVE1-mærkning (A3). (A4,A5; B1,B2) Paneler (A) og (B) blev justeret i et 3D-mønster og vist med henholdsvis front (A4, B1) og bagside (A5, B2). Samme skalabjælke til alle paneler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Rumlig korrelation af nervefibre, blodkar og lymfekar på den tynde hudsektion med den konventionelle tilgang. (A,B) Repræsentative billeder af den tykke del af rottebagfodens plantar og dorsale hud viser fordelingen af nervefibre, blodkar og lymfekar i den glatte (A) og hårede (B) hud. (A1,A2; B1,B2): Paneler (A) og (B) blev justeret i et 3D-mønster og vist med henholdsvis front (A1,B1) og bagside (A2,B2). Samme skalabjælke til alle paneler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Et histogram, der viser overfladearealet af CGRP-positive nervefibre i behåret og glat hud. (A) I sektionen med en tykkelse på 30 μm var der ingen forskel mellem behåret hud og glat hud i overfladearealet af CGRP-positive nervefibre. (B) I sektionen med en tykkelse på 300 μm sammenlignet med behåret hud blev overfladearealet af CGRP-positive nervefibre i glat hud signifikant forøget (* P < 0,05, n = 3). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse giver en detaljeret demonstration af de kutane nervefibre i den hårede og glatte hud ved at bruge immunfluorescens på tykkere vævssektioner med rydningsbehandling og en 3D-visning for at forstå hudens innervering bedre. Antistofinkubationstiden på op til 1-2 dage og en rengøringsproces natten over er vigtige. Disse to nøgletrin påvirker direkte immunfluorescensfarvningseffekten af tykke sektioner. Et yderligere problem blev rejst fra valget af antistoffer, som ikke alle er egnede til tykke sektioner. Vi spekulerer i, at antistoffer med mindre molekylvægte kan være ideelle til immunfluorescensfarvning af tykke sektioner. Vanskeligheden ved antistofudvælgelse er således en stor begrænsning af denne tilgang. Det nuværende arbejde havde observeret forskellene i fordelingen af blodkar, lymfekar og nerver på behåret og hårløs hud hos rotter. For mennesker er hudstrukturen meget forskellig fra gnavere; vi ser frem til at bruge vævsrensningsteknologi til at observere og undersøge menneskelig hud i det næste trin.
Tidligere undersøgelser har gjort mange bestræbelser på at afsløre kutane nervefibre 4,5,6,7,8. I modsætning til den konventionelle vævssektionsundersøgelse er vævsrensningsteknikker, herunder CUBIC, CLARITY og vDISCO, blevet brugt i vid udstrækning til undersøgelse af hele organer og hele kroppe af dyr i de senere år 16,17,18,19. Normalt er det vanskeligt at spore de kutane nervefibre med en lang og komplet struktur i den tynde sektion 4,5,6,7,8; Til sammenligning kan vævsclearingbehandling på den store prøve tage lang tid 16,17,18,19. I betragtning af deres fordele og ulemper er denne protokol et passende valg til undersøgelse af den detaljerede struktur af de kutane nervefibre inden for den gennemsigtigt behandlede tykke sektion, hvilket er praktisk at observere og registreres under almindelig konfokal mikroskopi. Ved hjælp af denne tilgang kan man observere længere kutane nervefibre i den tykke sektion sammenlignet med den tynde sektion og spare eksperimentel tid til vævsbehandlingen sammenlignet med de store prøver med vævsrensning.
I denne undersøgelse blev de kutane nervefibre mærket med CGRP. Disse slags nervefibre tilhører C- og Aδ-sensoriske fibre, der spiller rollen som transport af nociceptive signaler og modulerende vasodilatation12,13. Da CGRP-positive nervefibre er placeret tæt på blodkar og lymfekar i det subkutane lag, blev det også foreslået at deltage i sårheling ved at forbedre angiogenese og lymfangiogenese20,21. I lighed med tidligere undersøgelser 14,20,21,22 blev phalloidin stærkt udtrykt i blodkarrene med dette tredobbelte mærkningsforsøg. Derudover er LYVE1 et integreret membranglykoprotein og anvendes effektivt som biomarkør til sortering af rotte dermale lymfatiske endotelceller 15,23,24. Ved at udnytte den tredobbelte fluorescerende farvning med CGRP, phalloidin og LYVE1 sammen med vævsrensningsteknikken præsenteres et billede i høj opløsning for bedre indsigt i netværket af nervefibre, blodkar og lymfekar i den hårede og glatte hud.
Det skal bemærkes, at kun de CGRP-positive nervefibre blev demonstreret i denne undersøgelse. Udover denne form for sensorisk nervefiber kan denne protokol også være egnet til undersøgelse af andre typer kutane nervefibre med de tilsvarende antistoffer. Da phalloidin er stærkt udtrykt i cytoskeletalkomponenten i glatte muskel- og endotelceller 21,22,25, blev de muskulære og epidermale væv ud over blodkarrene også mærket med phalloidin. Ifølge den morfologiske egenskab er det imidlertid ikke svært at identificere blodkar fra den anden slags væv.
Sammenfattende undersøger denne protokol effektivt innervering af den behårede og glatte hud på tykkere sektioner ved hjælp af en kombination af immunfluorescens med clearingbehandling. Fra det metodologiske perspektiv ville det være en fordel at undersøge de andre former for kutane nervefibre og deres rumlige sammenhæng med blodkar og lymfekar i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (projektkode nr. CI2021A03404) og National Traditional Chinese Medicine Interdisciplinary Innovation Fund (projektkode nr. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
References
- Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181 (2012).
- Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).
- Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).
- Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).
- Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
- Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
- Schwager, S., Detmar, M.
- Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).
