Summary
Vanwege de complexe anatomie kan een consistent reproduceerbaar dissectie- en oogstprotocol voor hartmonsters een uitdaging zijn om te implementeren. Dit manuscript presenteert de belangrijkste elementen van enkele standaard cardiale dissectieprotocollen, waarbij zowel de grove onderzoeksbenaderingen als de bemonsteringslocaties die vaak worden gebruikt voor histopathologisch onderzoek worden benadrukt.
Abstract
Het standaard bruto onderzoek en de bemonstering zijn sleutelelementen in de reproduceerbaarheid en het succes van experimentele studies naar hart- en vaatziekten bij grote dieren. Gezien de complexe anatomie van het hart, interspecies verschillen en de soorten compenserende en pathologische reacties, zijn consistente protocollen een uitdaging om te implementeren. Het gebruik van meerdere dissectieprotocollen wordt meestal aangepast aan de ervaring van de prosector en persoonlijke voorkeur blijft een bron van experimentele en interobservervariabiliteit. Hier is het doel om de belangrijkste anatomische kenmerken en oriëntatiepunten, dissectieprotocollen en histologische bemonsteringsnormen van het hart in sommige veelgebruikte soorten (waaronder honden, varkens, herkauwers en katten) te presenteren als modellen van hart- en vaatziekten.
Hier worden twee standaard bruto examenprotocollen gepresenteerd. Ten eerste de instroom-uitstroommethode, die de fysiologische bloedstroomrichting door het hart en grote bloedvaten volgt (vaak gebruikt bij honden, herkauwers en varkens), en ten tweede de vierkamerdissectietechniek (geïllustreerd bij katten). Beide technieken kunnen worden aangepast aan elke soort in bepaalde experimentele omstandigheden. De bemonsteringsprotocollen omvatten alle interessegebieden (sinoatriale knoop, ventrikels, interventriculair septum, atria, kleppen en aorta) en verbeteren, indien correct uitgevoerd, zowel de reproduceerbaarheid als de betrouwbaarheid van experimentele studies.
Introduction
Vanwege de complexe anatomie en vroege strengheid, die de beoordeling van de hartwanddikte kunnen verstoren, is het grove onderzoek van het hart uitdagend en vatbaar voor verschillende techniekgerelateerde of interpretatiefouten. Dit wordt versterkt door de interspecifieke morfologische variaties en door het feit dat veel klinische, belangrijke cardiale pathologieën (waaronder vroege gevallen van coronaire hartziekten, fibrose, arteritis en amyloïdose) niet geassocieerd zijn met grove veranderingen, in wezen histologische pathologieën. Een gestandaardiseerd dissectie- en histologisch monsteroogstprotocol kan consistentie tussen waarnemers en tegelijkertijd vergelijkbaarheid en reproduceerbaarheid van experimentele studies van hart- en vaatziekten brengen.
De monsters werden verzameld van twee honden (Canis lupus familiaris) (een 3-jarige, mannelijke Franse Bulldog en een 8-jarige, vrouwelijke gemengde ras), een kat (Felis catus) (een 6-jarige, mannelijke Europese korthaar), een gedomesticeerd varken (Sus scrofa domesticus) (een 1-jarige, mannelijke Large White) en een koe (Bos taurus) (een 2 maanden oude, vrouwelijke Holstein). Elk van de gekozen soorten heeft een bijzonder gebruik als cardiovasculair model voor een andere ziekte; honden zijn bijvoorbeeld een voorkeursmodel voor aritmiemodellering; katten hebben de voorkeur voor hypertrofische cardiomyopathie (HCM), omdat het de soort is met de hoogste prevalentie van HCM; varkens worden gebruikt als model voor acuut myocardinfarct; en herkauwers worden gebruikt als model voor intoxicatie vanwege hun blootstelling aan gifstoffen die gemakkelijk te vinden zijn op weilanden11.
In dit manuscript worden één obductieprotocol en twee dissectieprotocollen van het hart gepresenteerd, ontworpen om het grove en histologische onderzoek van het hart bij experimentele hart- en vaatziekten te verbeteren. De beschreven protocollen zijn ontwikkeld op basis van informatie uit veterinaire handboeken 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12, tijdschriftliteratuur 3,13,14, officiële documenten15 en webinars16 ,17. De monsters die in deze studie werden gebruikt, werden geoogst uit kadavers die werden ingediend bij de afdeling Pathologie van de USAMV Cluj-Napoca voor routinematige autopsiediagnostiek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het experimentele protocol ontving een bio-ethische overeenkomst (nr. 311 vanaf 2022) en werd goedgekeurd door de Commissie Bio-ethiek van de Universiteit voor Landbouwwetenschappen en Diergeneeskunde Cluj-Napoca, in overeenstemming met zowel nationale (wet nr. 43 van 2014) als Europese (EU-richtlijn nr. 63 uit 2010) wetgeving. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.
1. Obductie protocol
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om hetzelfde obductieprotocol te gebruiken voor alle soorten die worden gepresenteerd vanwege de gemakkelijkere toegang die het is wanneer het wordt uitgevoerd 2,12. De volgende stappen vertegenwoordigen de obductie die wordt uitgevoerd bij een middelgrote hond. Pas de stappen aan bij het uitvoeren van obducties op verschillende onderwerpen.
- Weeg het onderwerp en plaats het op de obductietafel aan de linkerkant (figuur 1A). Ga verder met het externe onderzoek van het onderwerp (door de cutis en mucosa's te inspecteren en te palpatie, waarbij alle veranderingen in kleur, consistentie en volume worden opgemerkt).
- Gebruik een mes (of een scalpel) en maak een incisie van 7 cm in de rechter oksel (figuur 1A).
- Zoek de coxofemorale kruising (figuur 1A,B). Open de capsule met een mes. Knip het ligament van de kop van het dijbeen door (figuur 1B).
- Gebruik het mes om de huidincisie in de oksel cranial uit te breiden naar de mandibulaire symfyse en caudaal naar het perineum (figuur 1B).
- Verwijder de huid met het scalpel en stel de thoracale en buikwand vanaf de ventrale middellijn bloot aan het niveau van de werveltransversale processen (figuur 1B).
- Maak met het scalpel en de tang een flap door de buikwand, ventrocaudal naar de rechter ribbenboog. Open de buikholte met een schaar - volg het caudale aspect van het rechter hypochondrium (figuur 1B).
- Verleng de incisie caudally langs het rechter paralumbale gebied tot de externe iliacale top. Verleng daarna de incisie tot de schaamstreek van de linea alba.
- Kort, onderzoek de buikorganen in situ (door eventuele veranderingen in kleur, consistentie, volume en positie van de organen op te merken).
- Prik met het scalpel en de tang het diafragma op het hoogste punt door (figuur 1B).
- Betreed de thoracale holte door de rechter ribbenkast met twee lengtesecties te verwijderen met behulp van een botsnijdende tang. Sectie het parasternale kraakbeenachtige segment van de ribben. Sectie vervolgens het dorsale segment van de ribben, proximaal aan de costovertebrale gewrichten (figuur 1C).
- Onderzoek het hart in situ (figuur 1C). Let op de grootte, positie, kleur, verbindingen met de aangrenzende weefsels en door palpatie, eventuele veranderingen in de consistentie9.
OPMERKING: Als een trombose of aangeboren hartaandoening aanwezig is, moet het hart in situ worden ontleed (deze aanpak maakt volledig onderzoek van de grote bloedvaten mogelijk). - Gebruik een schaar om de pericardholte te onderzoeken en te openen met een lengtegedeelte van de basis tot de top van het hart. Onderzoek de pericardholte en het epicard (waarbij eventuele veranderingen in kleur, consistentie en volume worden opgemerkt)12.
- Laat het hart los met een schaar, waardoor dwarsdoorsneden van de aorta, longstam en beide vena cavae ontstaan. Sectie van de superieure vena cava minstens 1 cm boven de ingang in het rechter atrium om de crista terminalis11,13 te behouden.
- Onderzoek de uitwendige contour van het orgaan, het uiterlijk van het epicardium, het uiterlijk van het myocardium door de transparantie van het epicardium en het uiterlijk van de grote bloedvaten (figuur 2A).
OPMERKING: Over het algemeen vertonen het openen en onderzoeken van het pericardium enkele verschillen tussen de soorten. Het onderzoek van de pericardholte begint met een externe inspectie en beoordeling door de transparantie van het pericardium van de totale pericardiale inhoud 1,2. Bij een kat of hond bevat het hartzakje meestal ongeveer 0,25 ml / kg dunne, heldere, doorschijnende tot lichtgele vloeistof9. Als er pathologische effusies zijn, moeten deze worden verzameld met een steriele spuit of vacutainerbuis.
2. Dissectieprotocol
OPMERKING: Verschillende obductietechnieken worden gebruikt voor het hart, elk met verschillende voordelen. Voor dit protocol werden twee van de meest gebruikte technieken gekozen: 1) de "instroom-uitstroommethode", die een beter onderzoek van de kleppen en het endocardium mogelijk maakt en een protocol is dat wordt gebruikt voor de meeste soorten 2,11,12,16, en 2) de "vierkamerdissectie" / "echocardiografische vlak" -techniek, meestal gebruikt voor katten of kleine honden 1, 17.
- De "instroom-uitstroommethode" voor hartdissectie 2,11,12,16
- Plaats het hart met het atrium naar boven (figuur 2A).
- Gebruik een schaar en tandeloze tang om breed van de caudale vena cava naar het rechter atrium te knippen (figuur 2B). Vervolg de snede naar het rechter auriculaire aanhangsel om de crista terminalis/sinoatriale knoop (SA-knoop) bloot te leggen. Inspecteer de tricuspidalisklep vanuit het dorsale zicht.
- Snijd een gedeelte van het rechter atrium naar de kruising tussen de rechter ventrikel en het interventriculaire septum (figuur 2C). Geef de rechter atrioventriculaire klep weer.
- Sectie van de rechter ventrikel vrije wand langs het interventriculaire septum. Ga door met de sectie tot de oorsprong van de pulmonale romp (figuur 2C,D).
- Onderzoek grondig de rechter atrioventriculaire kleppen, inclusief de chordae tendineae, en de papillaire spieren (figuur 2D). Snijd de chordae tendineae.
- Plaats een tang door de longstam en snijd de romp in de lengterichting door (figuur 2E). Onderzoek het pulmonale uitstroomkanaal, de oorsprong van de pulmonale romp en de semilunaire kleppen.
- Snijd het linkeratrium van de longaders naar de punt van de linker oorschelp (figuur 2F). Inspecteer de bicuspide (mitralis) klep vanuit het dorsale zicht.
- Plaats het hart met het interventriculaire septum naar beneden gericht (figuur 2F). Maak een grote incisie in de ventriculaire vrije wand van de basis van de ventrikel naar de harttop. Geef de linker atrioventriculaire klep volledig weer.
- Snijd de chordae tendineae van de cusp van de linker atrioventriculaire klep.
- Plaats een tang door het linker ventriculaire uitstroomkanaal en gebruik deze als leidraad om de aorta te openen (figuur 2G).
- Gebruik een zoutoplossing om alle bloedstolsels te verwijderen. Zodra alle bloedstolsels zijn verwijderd, beoordeelt en vergelijkt u het hartgewicht met de lichaamsgewichtstabellen of standaard cardiale gewichtstabellen (tabel 1)11,13.
- Weeg het hart.
- Als alleen de SA-knoop het aandachtspunt is, plaats dan na het onderzoek van de linker ventrikel het hele hart volledig in 10% neutraal gebufferd formaline (NBF) gedurende 24 uur en trim het rechter atrium om de crista terminalis te bemonsteren.
OPMERKING: Door deze techniek kunnen de linker- en rechterventrikels gemakkelijk worden gewaardeerd. De verhouding tussen de linker en rechter ventriculaire wanddikte is 3:1, met kleine verschillen per soort en ras; voor het hart van de dierlijke foetus is de verhouding 1: 112.
3. Bemonsteringsprotocol voor histologie16
- Maak met een scalpel twee longitudinale, parallelle sneden (ongeveer 5 mm uit elkaar) met betrekking tot het rechter atrium, de tricuspidalisklep en de rechter ventriculaire vrije wand (figuur 2I)
- Maak twee longitudinale parallelle sneden (ongeveer 5 mm uit elkaar) met betrekking tot het linker atrium, mitralisklep, dorsale papillaire spier en linker ventrikel (figuur 2H).
- Binnen het dorsale bovenste derde deel van het hart, transversaal sectie de basis van het hart volgens een lijn, inclusief het interventriculaire septum, rechter atrium, aorta, aortaklep en tricuspidalisklep (figuur 2J).
- Maak twee longitudinale parallelle sneden met betrekking tot de basis van de aorta en het interventriculaire septum (figuur 2J).
- Trim het rechter atrium rond de crista terminalis en zorg voor verschillende parallelle secties die transversaal op de lengteas van de crista zijn georiënteerd (ongeveer 3-4 mm uit elkaar) om zes stukken van de SA-knoop te verkrijgen (figuur 3, figuur 4I en figuur 5H).
- Snijd de verkregen weefsels in histologische cassettes bij.
OPMERKING: Aanbevolen blokkeringsprotocol: stap 3.1.-histologisch blok 1 (figuur 6 toont de resulterende dia van dit blok.), stap 3.2.-histologisch blok 2 (figuur 7 toont de resulterende dia van dit blok), stap 3.4.-histologisch blok 3 (figuur 8 toont de resulterende dia van dit blok), stap 3.5.-histologisch blok 4 (figuur 9 toont de resulterende dia uit dit blok). - Dompel de weefsels onder in 10% NBF gedurende ten minste 48 uur.
4. Bemonstering van kransslagaders 3,10,14
- Gebruik een tang en een scalpel om de kransslagaders uit de cardiale paraconale groef te ontleden (figuur 4K). Fixeer de kransslagader 's nachts in 10% NBF.
- Ontkalk indien nodig voldoende in een 1:1 mengsel van 8% mierenzuur en zoutzuur.
- Maak meerdere dwarssneden met intervallen van 3 mm. Plaats de secties in een cassette en plaats de cassette vervolgens in 10% NBF totdat deze is ingesloten.
OPMERKING: Varkens kunnen worden gebruikt als een hartmodel voor mensen, vooral als het gaat om coronaire hartziekten. Daarom worden aanvullende monsters en histologische secties van kransslagaders aanbevolen 3,10,14.
5. De "vier kamers"/"echocardiografisch vlak" dissectietechniek van het hart 1,17
OPMERKING: De vierkamerdissectietechniek bestaat uit een snede van de basis naar de top van het hart om het standaardbeeld te verkrijgen1. De "vierkamer"-techniek kan het beste worden toegepast op vaste weefsels.
- Plaats het hele hart in 10% NBF gedurende ten minste 48 uur.
- Nadat het hart gedurende ten minste 48 uur in 10% NBF is gefixeerd (figuur 10A), plaatst u twee tandeloze rechte dissectietangen, één door de craniale cava-rechter atrium-tricuspidalisklep-rechter ventrikel, en de tweede door de pulmonale ader-linker atrium-mitralisklep-linker ventrikel (figuur 10B).
- Gebruik de ruimte tussen de tangarmen als leidraad voor het snijblad van de basis naar de top van het hart (figuur 10C). Zorg voor een extra lengtesectie van ongeveer 5 mm, afgezien van de sectie die in stap 5.2 is beschreven. op het hartsegment, dat de aorta omvat.
- Met een transversale incisie scheidt u de hartbasis volledig van de top. Plaats elk weefselsegment in een histologische cassette.
OPMERKING: Aanbevolen blokkeringsprotocol: het cardiale apex-histologische blok 5 (figuur 11A toont de resulterende dia van dit blok), het cardiale basis-histologische blok 6 (figuur 11B toont de resulterende dia van dit blok). - Plaats de cassettes in 10% NBF totdat ze zijn ingesloten. Fixeer alle hartmonsters in 10% NBF (meer dan 10 keer het volume weefsel), verwerk ze routinematig in paraffine, sectie op 4 μm dikte, en beits met hematoxyline en eosinekleuring (H &E-vlek) volgens een eerder beschreven protocol10.
OPMERKING: Als myocarditis wordt vermoed, "moet een stuk vers hartweefsel onder steriele omstandigheden worden bewaard met steriel chirurgisch materiaal en steriele monstercontainer voor microbiologische en virale onderzoeken"13.
6. Fotografische documentatie
OPMERKING: Fotografische documentatie is een optionele stap in het obductieonderzoek. Fotografie en video-opnames zijn echter essentieel om een "nauwkeurige documentatie van de normale en abnormale anatomie" te hebben 3.
- Voor een goede fotografische documentatie, maak digitale beelden tijdens het uitvoeren van "progressieve dissectie van hartweefsels"13. Raadpleeg de richtlijnen voor fotografische documentatie en foto15 de algemene view-anterior en posterior; een stukje van het hart; en eventuele vermoedelijke laesies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol werd gebruikt om anatomische kenmerken te visualiseren en monsters te verzamelen voor histologisch onderzoek van het hart bij vier verschillende soorten (hond, kat, varken en koe). Het obductieprotocol werd herhaald bij elk van de bovengenoemde soorten, maar alleen geïllustreerd bij honden. Het obductieprotocol begint met een uitgebreid extern onderzoek van het lichaam (figuur 1A) (inclusief de huid, verkenbare lymfeklieren en buitenslijmvlies), het meten van het totale gewicht en het scoren van de algemene toestand van het dier. Na het uitwendige onderzoek gaat de obductie verder met een gedeeltelijke skinning van het lichaam (gericht op grondig onderzoek van de subcutis en oppervlakkige spieren) en met het openen van de hoofdlichaamsholten (figuur 1B-D).
De buikholte is meestal de eerste die wordt onderzocht (figuur 1C), gevolgd door een uitgebreid in situ onderzoek van de peritoneale holte en buikorganen, gevolgd door het doorsnijden van het diafragma en ten slotte het verwijderen van de rechter hemithorax (figuur 1D). Door deze techniek kan een goed in situ onderzoek van de thoracoabdominale organen (inclusief de pericardholte en het hart) worden bereikt, waardoor tegelijkertijd een goede beoordeling van de verbindingen van deze organen met de lokale bloedvaten, lymfevaten, ligamenten en zenuwen mogelijk is. Het onderzoek van de pericardholte wordt bereikt door brede sectie van het pariëtale pericardium volgens de lengteas van het hart, gevolgd door de verwijdering van het hart door de cardiale grote vaten dicht bij het longparenchym te snijden. Het externe onderzoek van het hart wordt gevolgd door het doorsnijden van de hartholten, wat een uitgebreide inspectie en ten slotte een goede oogst van de weefselmonsters voor histopathologie mogelijk maakt. In het kort worden de procedure en de resultaten van de twee hartdissectietechnieken, de "bloedstroom" (figuur 2, figuur 3, figuur 4 en figuur 5) en de "vier kamers" (figuur 10) weergegeven.
De "bloedstroom"-techniek werd gebruikt in het hart van honden, varkens en herkauwers (figuur 2, figuur 4 en figuur 5). Nadat het hart uit het lichaam was verwijderd, werd de externe configuratie waargenomen (figuur 2A, figuur 4A en figuur 5A). Tijdens het uitvoeren van de dissectie moet men de atriale configuratie opmerken, de crista terminalis, het macroscopische identificatie-element voor de sinoatriale knoop (figuur 2B, figuur 4B en figuur 5B). Na het doorlopen van de stappen van het protocol (figuur 2B-G, figuur 4B-G en figuur 5B-G), is de dissectie voltooid en kan het oogstprotocol voor de histologie worden gestart (figuur 2H-J, figuur 4G-J en figuur 5H-K). Als alternatief kan de crista terminalis ook worden geoogst nadat het hart is gefixeerd (figuur 3) in 10% NBF. In vergelijking met honden is er een extra stap uit te voeren in het hart van de varkens - het oogsten van de kransslagader (figuur 4K).
Na het oogsten werden de monsters gefixeerd in 10% NBF, routinematig verwerkt en ingebed in paraffinewas, en uiteindelijk gesneden op 4 μm, en gekleurd door H &E. De histologische dia's verkregen door deze techniek omvatten meestal het volgende: 1) het epicardium, myocardium en endocardium van het rechter atrium en de ventrikel, de tricuspidalisklep en de kransslagaders voor histologisch blok 1 (figuur 6); 2) het epicardium, myocardium en endocardium van het linker atrium en de ventrikel, de mitralisklep, de kransslagaders en de hartzenuwen voor histologisch blok 2 (figuur 7); 3) het myocardium, het endocardium van het interventriculaire septum en het epicardium van het rechteratrium, en de tricuspidalisklep voor histologisch blok 3 (figuur 8); 4) meerdere secties van de SA-knoop voor histologisch blok 4 (figuur 9); 5) het epicardium, myocardium en endocardium van de top van het hart (linker- en rechterventrikel en interventriculair septum) voor histologisch blok 5 (figuur 11A); en 6) het epicardium, myocardium en endocardium van de basis van het hart (linker- en rechterboezems, ventrikels, interventriculair septum, atrioventriculaire kleppen en kransslagaders) voor histologisch blok 6 (figuur 11B).
Figuur 1: Obductietechniek bij een hond. (A) De plaatsing van het onderwerp aan de linkerkant; B) opening van de buikholte; C) opening van de thoracale holte; D) onderzoek van de thoracale holte. 1-7 geef de locaties en volgorde van de aanbevolen incisies aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Dissectie- en bemonsteringsprotocol in het hart van de hond. (A) Externe configuratie van het hart; (B) Begin met de caudale cava en trim het rechter atrium, open het rechter atrium en observeer de crista terminalis; C) trim de rechter ventrikel langs de overgang met het interventriculaire septum; toon de tricuspidalisklep; D) na het snijden van de chordae tendineae, de rechter ventrikel onderzoeken en de snede langs de paraconale groef voortzetten; (E) passeer de tang door de longstam en gebruik ze om de snede te begeleiden; onderzoek de pulmonale uitstroom; (F) 1-open het linker atrium, 2-van de basis, gesneden naar de top; onderzoek de mitralisklep en de linker ventrikel; (G) de tang door de aorta laten gaan en deze gebruiken om de snede te geleiden; onderzoek de aorta; (H) maak twee sneden langs het linker hart en plaats het middenstuk in 10% NBF; (I) maak twee sneden langs het rechterhart, plaats het middenstuk in 10% NBF en snijd de crista terminalis weg; (J) knip de basis van het hart weg, maak twee sneden langs het stuk en plaats het middenstuk in 10% NBF. Afkortingen: SAN = sinoatriale node; NBF = neutraal gebufferd formaline. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Bemonstering van de crista terminalis uit een formaline-vast hart. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Dissectie- en bemonsteringsprotocol in varkenshart. (A) Externe configuratie van het hart; (B) Begin met de caudale cava en sectie het rechter atrium, onderzoek het rechter atrium, lokaliseer de crista terminalis en begin met het openen van de rechter ventrikel; C) trim de rechter ventrikel langs de junctie met het interventriculaire septum en onderzoek de tricuspidalisklep; D) na het snijden van de chordae tendineae, de rechterkamer onderzoeken, de tang door de longstam plaatsen en deze gebruiken om de snede te geleiden; (E) de pulmonale uitstroom te onderzoeken; na het doorsnijden van het linker atrium, snijdt u de linker ventrikel van basis naar top; (F) de mitralisklep en de linker ventrikel onderzoeken en de chordae tendineae doorsnijden; plaats een tang door de aorta en gebruik ze om de snede te begeleiden; (G) onderzoek de aorta, maak twee sneden langs het linker hart, plaats het middenstuk in 10% NBF; (H) maak twee sneden langs het rechterhart; plaats het middenstuk in 10% NBF; (I) knip de crista terminalis weg, plaats het stuk in 10% NBF; (J) knip de basis van het hart weg, maak twee sneden langs het stuk en plaats het middelste stuk in 10% NBF; (K) snijd de kransslagader bij, bevestig deze 's nachts en maak vervolgens meerdere dwarssneden met intervallen van 3 mm. Afkorting: NBF = neutraal gebufferd formaline. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Dissectie- en bemonsteringsprotocol in het hart van de koe. (A) Externe configuratie van het hart; (B) Begin met de caudale cava en sectie het rechter atrium, onderzoek het rechter atrium, lokaliseer de crista terminalis en begin met het openen van de rechter ventrikel; C) trim de rechter ventrikel langs de junctie met het interventriculaire septum en onderzoek de tricuspidalisklep; D) de snede parallel met de paraconale groef voortzetten, de tang door de longstam laten gaan en deze gebruiken om de snede te geleiden; (E) de pulmonale uitstroom onderzoeken, beginnen met het snijden van de longaders en het linkeratrium en vervolgens doorgaan met het snijden van de linker ventrikel van de basis naar de top; (F) de mitralisklep en de linker ventrikel onderzoeken en de chordae tendineae doorsnijden; (G) passeer de tang door de aorta, gebruik ze om de snede te begeleiden en onderzoek de aorta; (H) knip de crista terminalis weg en plaats het stuk in 10% NBF; (I) maak twee sneden langs het linker hart en plaats het middenstuk in 10% NBF; (J) maak twee sneden langs het rechterhart en plaats het middenstuk in 10% NBF; (K) knip de basis van het hart weg, maak twee sneden langs het stuk en plaats het middelste stuk in 10% NBF. Afkorting: NBF = neutraal gebufferd formaline. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Histologisch onderzoek van de rechter ventrikel, het rechter atrium en de tricuspidalisklep in het hart van een hond. H&E vlekken. (A) Histologisch monster van de rechter ventrikel, het rechter atrium en de tricuspidalisklep; (B) rechter ventrikel, rechter atrium en tricuspidalisklep. Schaalstaven = 500 μm; (C) rechter ventrikel, rechter atrium en kransslagaders. Schaalstaven = 100 μm; (D) rechter atrium. Schaalstaven = 500 μm. Afkortingen: H&E = hematoxyline en eosine; RV = rechter ventrikel; RA = rechter atrium; Ts-V = tricuspidalisklep; CA = kransslagader; EnC = endocardium; MC = myocardium; EpC = epicardium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Histologisch onderzoek van de linker ventrikel, linker atrium en mitralisklep in het hart van een hond. H&E vlekken. (A) Histologisch monster van de linker ventrikel, het linker atrium en de mitralisklep; (B) linker atrium. Schaalstaven = 500 μm; (C) linker atrium, linker ventrikel, kransslagader en zenuw. Schaalstaven = 100 μm; (D) kransslagader, zenuw. Schaalstaven = 50 μm. Afkortingen: H&E = hematoxyline en eosine; LA = linker atrium; LV = linker ventrikel; Mt-V = mitralisklep; CA = kransslagader; EnC = endocardium; MC = myocardium; EpC = epicardium; NV = zenuw. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Histologisch onderzoek van het interventriculaire septum, het rechter atrium en tricuspidalisklep in het hart van een hond. H&E-kleuring (A) interventriculair septum, rechter atrium en tricuspidalisklep-histologisch monster; (B) interventriculair septum, rechter atrium en tricuspidalisklep. Schaalstaven = 500 μm. Afkortingen: H&E = hematoxyline en eosine; IVS = interventriculair septum; RA = rechter atrium; Ts-V tricuspidalisklep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Histologisch onderzoek van de sinoatriale knoop in het hart van een hond. H&E vlekken. A) histologisch monster van de crista terminalis; (B) sinoatriale knoop 4x vergroting. Schaalstaven = 500 μm; (C) sinoatriale knoop 20x vergroting. Schaalstaven = 100 μm; (D) sinoatriale knoop 40x vergroting. Schaalstaven = 50 μm. Afkortingen: H&E = hematoxyline en eosine; SA-knooppunt = sinoatriaal knooppunt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Dissectieprotocol op een formaline-vast hart van een kat. (A) Externe configuratie van het hart; B) de tang door craniale cava en longaders te laten lopen; de tang leidt het lengtegedeelte van basis naar top; C) het uitzicht op vier kamers na de snede. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11: Histologische monsters van het hart van een kat. H&E vlekken. a) apex van het hart-histologische monster; B) basis van het hart-histologische monster. Afkortingen: H&E = hematoxyline en eosine; LV = linker ventrikel; IVS = interventriculair septum; RV = rechter ventrikel; LA = linker atrium; MV = mitralisklep; TS-V = tricuspidalisklep; RA = rechter atrium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Soort | Leeftijd | Gemiddelde %BW | (LV + S)/RV | Citatienummers |
| Kat | Pasgeboren | 0.77% | - | 7 |
| Kat | Volwassene | 0.33%-0.46% | 2.94-4.17 | 8, 5, 11 |
| Hond | Pasgeboren | 0.47%-0.76% | - | 8, 7 |
| Hond | Volwassene | 0.70%-0.85% | 2.39-5.12 | 8, 6, 11 |
| Varken | Volwassene | 0.32%-0.48% | 2.38-3.84 | 11 |
| Schaap | Volwassene | 0.17%-0.65% | 2.63-4.54 | 11 |
| Koe | Volwassene | 0.30%-0.66% | 2.43-4.00 | 11 |
Tabel 1: Referentiewaarden voor de normale verhouding hartgewicht/lichaamsgewicht en ventriculaire verhouding bij dieren. Hartmetingen voor kat, hond, varken, schaap en koe. Afkortingen: BW = lichaamsgewicht; LV = linker ventrikel; S = interventriculair septum; RV = rechter ventrikel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij het uitvoeren van het huidige protocol moeten verschillende kritieke stappen zorgvuldig worden overwogen voor consistente resultaten. Bij jonge dieren verschillen hartmetingen van die bij volwassenen (inclusief ventriculaire wanddikte) en over het algemeen vertegenwoordigt het hart een groter deel van het lichaamsgewicht11,12. De mate van ventriculaire hypertrofie kan worden gekwantificeerd door een algemene gewichtsformule toe te passen, waarbij de verhouding tussen de linker ventrikel plus het septum wordt gedeeld door het vrije gewicht van de rechter ventrikel, dat onder normale omstandigheden 2,8-4,0 zou moeten zijn bij volwassen dieren (tabel 1). Als deze verhouding hoger is dan 4,0, duidt dit op linkerventrikelhypertrofie en als deze kleiner is dan 2,8, duidt dit op rechterventrikelhypertrofie 4,11,12. Om de waarde van de kamer te verkrijgen, moet de rechterventrikelvrije wand langs de interventriculaire wand worden ontleed en moet de coronaire groef worden gescheiden van het rechter atrium. De dissectie van de linker ventrikel vanuit het linker atrium wordt gemaakt bij de atrioventriculaire ring4.
Het hart wordt van het lichaam gescheiden door de grote vaten te doorsnijden. Als de delen van de grote bloedvaten te dicht bij de hartbasis liggen, kunnen verschillende structuren worden aangetast, voornamelijk de boezems en de oorschelpen. Om het proces te vergemakkelijken, is het noodzakelijk om het hart voorzichtig ventraal te trekken om de grote bloedvaten boven de basis van het hart goed te verdelen. Een tweede cruciale stap is het herkennen van de morfologie van de crista terminalis, een discrete anatomische structuur die gedetailleerde structurele kennis van het hart vereist. De SA-knoop moet zorgvuldig worden geoogst en ingebed met speciale aandacht voor de rangschikking van de weefselmonsters in de blokken tijdens het histologische proces.
De wijziging van de "vierkamer"-techniek was om het histologische blokkeringsschema te veranderen van één blok naar twee. De standaardafmetingen van breed gebruikte histologische cassettes en de aangepaste histologische procedure (inclusief het roterende microtoomkleuringsstation) zijn niet geschikt om het hele deel van het hart in één blok te passen zonder weefselvervorming. Hoewel de "vierkamer" -techniek het onderzoek van de structuur van de hartkamers vergemakkelijkt, beperkt het het onderzoek van het geleidende systeem. Dit is vooral belangrijk in gevallen waarin hartritmestoornissen worden gedocumenteerd. Verder, gezien het feit dat de "vierkamer" -techniek weefsel vereist dat in NBF is gefixeerd, kunnen verschillende aanvullende onderzoeken zoals bacteriologie en moleculaire biologie tot op zekere hoogte worden aangetast.
Als het gaat om het hart van een kat of een kleine hond, wordt een nauwkeurig standaard echocardiografisch plan verkregen op vast weefsel. Het uitzicht met vier kamers is nuttig, vooral voor kamerafmetingen, als er variaties zijn in ventriculaire of atriale maten1. Naast de voordelen met betrekking tot de perfecte superpositie van de bruto-trimming geschaafd met die verkregen tijdens klinisch onderzoek door echocardiografie, biedt deze techniek het voordeel dat de meeste belangrijke componenten van het hart in slechts twee histologische blokken worden opgenomen.
De "instroom-uitstroom" -methode beschreven bij varkens werd aangepast aan protocollen die in de harten van mensen werden gebruikt door de bemonsteringsstap van de kransslagader toe te voegen. De momenteel beschreven hartdissectieprotocollen illustreren standaardpunten voor bemonstering. Bovendien, wanneer de dissector andere laesies observeert of vermoedt dan die welke in het protocol worden behandeld, moeten aanvullende monsters worden verzameld uit de aandachtsgebieden.
Bij de ontwikkeling van de huidige protocollen werden andere methoden bestudeerd, zoals de methode waarbij de belangrijkste hartcurven12 in de lengterichting worden gesneden en de "broodbrood"/kortastechniek 9,11. De techniek met een longitudinale snede van de belangrijkste hartcurven is een eenvoudiger protocol dat vaak wordt gebruikt in het biomedisch onderwijs12. De kortassige sectietechniek ("broodbroodtechniek") kan worden uitgevoerd met één korte assectie11 of een reeks secties van 1-2 cm dikte van de top naar de basis, waardoor het atrioventriculaire apparaat intactblijft 9. Deze techniek is het meest geschikt als de dissector myocardiale pathologieën vermoedt (inclusief inflammatoire pathologieën en cardiomyopathieën), maar het nadeel heeft van een oppervlakkig onderzoek van de hartklepcomponenten9.
Beide technieken zijn gemakkelijk onder de knie te krijgen door personen met een relatief elementaire kennis van de hartanatomie, maar missen robuuste punten voor histologische bemonstering en weging van elke hartcomponent. Na het doorlopen van deze methoden, omvat de daaropvolgende oogstprocedure moeizaam werk om de interessegebieden te identificeren en constante monsters te verkrijgen. Op de harten die met deze methoden worden ontleed, vereist het afzonderlijke wegen van de twee helften inspanning om de verhouding tussen hen te kunnen berekenen. De korte-asmethode heeft extra stappen nodig voor het onderzoek van het endocardium en alle componenten aan de basis van het hart. Bovendien bestaat de oogstprocedure volgens deze methoden uit moeizaam werk om de interessegebieden te identificeren en constante monsters te verkrijgen.
Dit manuscript presenteert de belangrijkste elementen van enkele standaard cardiale dissectieprotocollen, waarbij zowel de grove onderzoeksbenaderingen als de bemonsteringslocaties die vaak worden gebruikt voor histopathologisch onderzoek worden benadrukt. Met betrekking tot de toekomstige toepassingen van de techniek is het belangrijkste doel van het gepresenteerde protocol om een robuuste richtlijn voor hartdissectie te bieden die gemakkelijk kan worden gebruikt in alle experimentele studies die een gedetailleerde cardiale beoordeling vereisen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Geen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline solution | B. BRAUN MELSUNGEN AG | W04479004 | For washing all the blood, and blood clots from the heart. |
| 10% neutral buffered formalin (NBF) | Q Path | 11699404 | Materials for collecting histopathology samples. |
| Bone cutting forceps | HELEN SRL | LS109HV | Sturdy instrument for cutting bone. |
| Cutting board | Ambition | 86304 | For an easier manipulation, and cutting the organs. |
| Decalcifying solution | Thermo Scientific TBD-2 | 6764004 | 1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid. |
| Digital camera | Canon Inc. | PowerShot SX540 HS | For photographic, and videographic documentation. |
| Forceps | MKD-Medicale | 15-430 | Dissection instruments. |
| Histological cassettes | Q Path | 720-2215 | Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm |
| Knife | TEHNO FOOD COM SERV SRL | D2006/15 | Sharp blade for cutting soft tissue. |
| Latex gloves | MKD-Medicale | SANTEX-S | Protection equipment. |
| Mask | MKD-Medicale | 21221 | Protection equipment. |
| Petri dishes | MKD-Medicale | 0598-1V | Materials for collecting ancillary testing samples. |
| Plastic recipients | Corning Gosselin | TP200-02 | Materials for collecting histopathology samples. |
| Scale | ESPERANZA | MEEKS008 | For weighing the organs. |
| Scale | White Deals | 72 | For weighing the subjects. |
| Scalpel | MKD-Medicale | 10322E | Sharp blade for cutting soft tissue. |
| Scissors | MKD-Medicale | 13-260 | Dissection instruments. |
| Scrub | MKD-Medicale | 410100-52 | Protection equipment. |
| Syringes | MKD-Medicale | 10573EU | Materials for collecting ancillary testing samples. |
References
- Ashworth, M. Pathology of Heart Disease in the Fetus, Infant and Child: Autopsy, Surgical and Molecular Pathology. , Cambridge University Press. Cambridge. (2019).
- Barone, R. Anatomie Comparée des Mammifères Domestiques: Angiologie. Vigot, , Lyon. (2011).
- Basso, C., et al. Guidelines for autopsy investigation of sudden cardiac death: 2017 update from the Association for European Cardiovascular Pathology. Virchows Archiv. 471 (6), 691-705 (2017).
- Bishop, S. P. Chapter 37 - Necropsy Techniques for the Heart and Great Vessels. Textbook of Canine and Feline Cardiology: Principles and Clinical Practice,.2nd ed. Fox, P. R., Sisson, D., Moïse, N. S. , W. B. Saunders. Philadelphia, PA. 846-848 (1999).
- Joseph, D. R. The ratio between the heart-weight and body weight in various animals. Journal of Experimental Medicine. 10 (4), 521-522 (1908).
- Keenan, C. M., Vidal, J. D. Standard morphologic evaluation of the heart in the laboratory dog and monkey. Toxicologic Pathology. 34 (1), 67-74 (2006).
- Latimer, H. B. Variability in body and organ weights in the newborn dog and cat compared with that in the adult. The Anatomical Record. 157 (3), 449-456 (1967).
- Lee, J. C., Taylor, F. N., Downing, S. E. A comparison of ventricular weights and geometry in newborn, young, and adult mammals. Journal of Applied Physiology. 38 (1), 147-150 (1975).
- McDonough, S. P., Southard, T. Necropsy Guide for Dogs, Cats, and Small Mammals. , John Wiley & Sons. 9 (2016).
- Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. Laboratory Methods in Histotechnology. , Armed Forces Institute of Pathology-American Registry of Pathology. Washington, DC. 29-58 (1992).
- Robinson, W. F., Robinson, N. A. Chapter 1 - Cardiovascular System. Jubb, Kennedy & Palmer's Pathology of Domestic Animals, 6th ed. Grant Maxie, M., Saunders, W. B. 3, 12-49 (2016).
- Tabaran, A. F. Autopsie et Medecine Legale: Guide de Travaux Pratiques. , Academic Press. 21-86 (2020).
- Autopsypathology.net. , Available from: http://autopsypathology.net/wpcontent/uploads/2016/02/rcpath_cardiacdeath_jul2015.pdf (2021).
- Pathology.ucla.edu. , Available from: http://pathology.ucla.edu/workfiles/Education/Residency%20Program/Gross%20Manual/Endomyocardial%20Biopsy%20(EMB).pdf (2021).
- Arbeitsgruppen Sudden Cardiac Death. , Available from: http://www.sgrm.ch/medizin/arbeitsgruppen/sudden-cardiac-death.html (2021).
- Toxpath.org. , Available from: https://www.toxpath.org/Trimming-N-Collection-Training.asp (2021).
- YouTube.com. , Available from: httpswwwyoutubecomwatchvxkJ2WGqi2Qw&t2494s (2021).
