Dissektionstechniken und histologische Probenahme des Herzens in Großtiermodellen für Herz-Kreislauf-Erkrankungen

Summary

Aufgrund der komplexen Anatomie kann ein konsistent reproduzierbares Dissektions- und Entnahmeprotokoll für Herzproben schwierig umzusetzen sein. Dieses Manuskript präsentiert die Schlüsselelemente einiger Standardprotokolle zur kardialen Dissektion und hebt sowohl die groben Untersuchungsansätze als auch die üblicherweise für histopathologische Untersuchungen verwendeten Probenahmestellen hervor.

Abstract

Die Standard-Bruttountersuchung und Probenahme sind Schlüsselelemente für die Reproduzierbarkeit und den Erfolg experimenteller Studien zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen an Großtieren. In Anbetracht der komplexen Anatomie des Herzens, der Unterschiede zwischen den Arten und der Arten von kompensatorischen und pathologischen Reaktionen sind konsistente Protokolle schwierig zu implementieren. Die Verwendung mehrerer Dissektionsprotokolle wird in der Regel an die Erfahrung des Prosektors angepasst, und persönliche Präferenzen sind weiterhin eine Quelle experimenteller und interobserver-Variabilität. Ziel ist es, die wichtigsten anatomischen Merkmale und Orientierungspunkte, Sezierprotokolle und histologischen Probenahmestandards des Herzens bei einigen häufig verwendeten Arten (einschließlich Hunden, Schweinen, Wiederkäuern und Katzen) als Modelle für Herz-Kreislauf-Erkrankungen darzustellen.

Zwei Standard-Bruttoprüfungsprotokolle werden hier vorgestellt. Erstens die Zufluss-Abfluss-Methode, die der physiologischen Blutflussrichtung durch das Herz und große Gefäße folgt (häufig bei Hunden, Wiederkäuern und Schweinen verwendet), und zweitens die Vierkammer-Dissektionstechnik (am Beispiel bei Katzen). Beide Techniken können unter bestimmten experimentellen Bedingungen an jede Art angepasst werden. Die Probenahmeprotokolle umfassen alle relevanten Bereiche (Sinusknoten, Ventrikel, interventrikuläres Septum, Vorhöfe, Klappen und Aorta) und verbessern bei ordnungsgemäßer Durchführung sowohl die Reproduzierbarkeit als auch die Zuverlässigkeit experimenteller Studien.

Introduction

Aufgrund der komplexen Anatomie und frühen Strenge, die die Beurteilung der Herzwanddicke beeinträchtigen können, ist die grobe Untersuchung des Herzens anspruchsvoll und anfällig für mehrere Technik- oder Interpretationsfehler. Dies wird durch die interspezifischen morphologischen Variationen und durch die Tatsache verstärkt, dass viele klinische, schwere Herzpathologien (einschließlich früher Fälle von koronaren Herzkrankheiten, Fibrose, Arteriitis und Amyloidose) nicht mit groben Veränderungen verbunden sind, sondern im Wesentlichen histologische Pathologien sind. Ein standardisiertes Dissektions- und histologisches Probenentnahmeprotokoll kann Konsistenz zwischen den Beobachtern und gleichzeitig Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit experimenteller Studien zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen herstellen.

Die Proben wurden von zwei Hunden (Canis lupus familiaris) (einer 3-jährigen, männlichen französischen Bulldogge und einem 8-jährigen, weiblichen Mischling), einer Katze (Felis catus) (einem 6-jährigen, männlichen Kurzhaar), einem Hausschwein (Sus scrofa domesticus) (einem 1-jährigen, männlichen Large White) und einer Kuh (Bos taurus) (einem 2 Monate alten, weiblichen Holstein) entnommen. Jede der ausgewählten Arten hat eine besondere Verwendung als kardiovaskuläres Modell für eine andere Krankheit; Zum Beispiel sind Hunde ein bevorzugtes Modell für die Arrhythmie-Modellierung; Katzen werden für hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) bevorzugt, da es sich um die Spezies mit der höchsten Prävalenz von HCM handelt; Schweine werden als Modell für akuten Myokardinfarkt verwendet; und Wiederkäuer werden als Modell für Intoxikationen verwendet, da sie Toxinen ausgesetzt sind, die auf Wiesen leicht zu finden sind¹¹.

In diesem Manuskript werden ein Nekropsieprotokoll und zwei Dissektionsprotokolle des Herzens vorgestellt, die die grobe und histologische Untersuchung des Herzens bei experimentellen Herz-Kreislauf-Erkrankungen verbessern sollen. Die beschriebenen Protokolle wurden auf der Grundlage von Informationen aus den veterinärmedizinischen Lehrbüchern 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12, Zeitschriftenliteratur 3,13,14^, offiziellen Dokumenten ¹⁵ und Webinaren¹⁶ entwickelt. ^,17. Die in dieser Studie verwendeten Proben wurden von Kadavern entnommen, die der Pathologieabteilung der USAMV Cluj-Napoca zur routinemäßigen Autopsiediagnose vorgelegt wurden.

Protocol

Das Versuchsprotokoll erhielt eine bioethische Vereinbarung (Nr. 311 von 2022) und wurde von der Bioethikkommission der Universität für Agrarwissenschaften und Veterinärmedizin Cluj-Napoca in Übereinstimmung mit den nationalen (Gesetz Nr. 43 von 2014) und europäischen (EU-Richtlinie Nr. 63 von 2010) Gesetzgebung genehmigt. Einzelheiten zu allen in diesem Protokoll verwendeten Materialien und Instrumenten finden Sie in der Materialtabelle .

1. Nekropsie-Protokoll

HINWEIS: Es wird empfohlen, für alle vorgestellten Arten dasselbe Nekropsieprotokoll zu verwenden, da der Zugang erleichtert ist als bei ^2,12. Die folgenden Schritte stellen die Nekropsie dar, die bei einem mittelgroßen Hund durchgeführt wird. Passen Sie die Schritte an, wenn Sie Nekropsien zu verschiedenen Themen durchführen.

1. Wiegen Sie das Subjekt und legen Sie es auf den Nekropsietisch auf der linken Seite (Abbildung 1A). Fahren Sie mit der äußeren Untersuchung des Subjekts fort (durch Inspektion und Palpation der Cutis und Schleimhäute, wobei alle Veränderungen in Farbe, Konsistenz und Volumen notiert werden).
2. Verwenden Sie ein Messer (oder ein Skalpell) und machen Sie einen Schnitt von 7 cm in der rechten Achselhöhle (Abbildung 1A).
3. Suchen Sie die coxofemorale Verbindung (Abbildung 1A,B). Öffnen Sie die Kapsel mit einem Messer. Schneiden Sie das Band des Oberschenkelknochens ab (Abbildung 1B).
4. Verwenden Sie das Messer, um den Hautschnitt in der Achselhöhle kranial zur Unterkiefersymphyse und kaudal zum Perineum zu verlängern (Abbildung 1B).
5. Entfernen Sie die Haut mit dem Skalpell und legen Sie die Brust- und Bauchdecke von der ventralen Mittellinie bis zur Höhe der Wirbelfortsätze frei (Abbildung 1B).
6. Erstellen Sie mit dem Skalpell und der Pinzette eine Klappe durch die Bauchdecke, ventrocaudal zum rechten Rippenbogen. Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einer Schere-folgen Sie dem kaudalen Aspekt des rechten Hypochondriums (Abbildung 1B).
7. Verlängern Sie den Schnitt kaudal entlang des rechten paralumbalen Bereichs bis zum äußeren Beckenkamm. Danach verlängern Sie den Schnitt bis zum Schambein der Linea alba.
8. Untersuchen Sie kurz die Bauchorgane in situ (indem Sie Änderungen in Farbe, Konsistenz, Volumen und Position der Organe feststellen).
9. Durchstechen Sie mit dem Skalpell und der Pinzette das Zwerchfell am höchsten Punkt (Abbildung 1B).
10. Treten Sie in die Brusthöhle ein, indem Sie den rechten Brustkorb mit zwei Längsabschnitten mit Knochenschneidzange entfernen. Schneiden Sie das parasternale knorpelige Segment der Rippen. Als nächstes schneiden Sie das dorsale Segment der Rippen, proximal zu den costovertebralen Gelenken (Abbildung 1C).
11. Untersuchen Sie das Herz in situ (Abbildung 1C). Beachten Sie die Größe, Position, Farbe, Verbindungen mit den angrenzenden Geweben und durch Palpation Änderungen in der Konsistenz⁹.
    HINWEIS: Wenn eine Thrombose oder angeborene Herzkrankheit vorliegt, muss das Herz in situ seziert werden (dieser Ansatz ermöglicht eine vollständige Untersuchung der großen Gefäße).
12. Verwenden Sie eine Schere, um die Perikardhöhle mit einem Längsschnitt von der Basis bis zur Herzspitze zu untersuchen und zu öffnen. Untersuchen Sie die Perikardhöhle und das Epikard (beachten Sie alle Veränderungen in Farbe, Konsistenz und Volumen)¹².
13. Lassen Sie das Herz mit einer Schere los, wodurch Querschnitte der Aorta, des Lungenstamms und der beiden Hohlvenen entstehen. Schneiden Sie die obere Hohlvene mindestens 1 cm über dem Eingang in das rechte Vorhof, um die Crista terminalis^11,13 zu erhalten.
14. Untersuchen Sie die äußere Kontur des Organs, das Aussehen des Epikards, das Aussehen des Myokards durch die Transparenz des Epikards und das äußere Erscheinungsbild der großen Gefäße (Abbildung 2A).
    HINWEIS: Im Allgemeinen weisen die Öffnung und Untersuchung des Perikards einige Unterschiede zwischen den Arten auf. Die Untersuchung der Perikardhöhle beginnt mit einer externen Inspektion und Beurteilung durch die Transparenz des Perikards des gesamten Perikardinhalts ^1,2. Bei einer Katze oder einem Hund enthält das Perikard typischerweise etwa 0,25 ml/kg dünne, klare, durchscheinende bis hellgelbe Flüssigkeit⁹. Wenn pathologische Ergüsse auftreten, sollten diese mit einer sterilen Spritze oder einem Vakuumröhrchen gesammelt werden.

2. Sezierprotokoll

HINWEIS: Mehrere Nekropsietechniken werden für das Herz verwendet, jede mit mehreren Vorteilen. Für dieses Protokoll wurden zwei der am häufigsten verwendeten Techniken gewählt: 1) die "Zufluss-Ausfluss-Methode", die eine bessere Untersuchung der Klappen und des Endokards ermöglicht und ein Protokoll ist, das für die meisten der Spezies 2,11,12,16 verwendet wird, und²) die "Vier-Kammer-Dissektion"/"echokardiographische Ebene" -Technik, die typischerweise für Katzen oder kleine Hunde verwendet wird ^{1, 17}.

1. Die "Zufluss-Abfluss-Methode" bei Herzdissektion 2,11,12,16
   1. Legen Sie das Herz mit dem Vorhofgesicht nach oben (Abbildung 2A).
   2. Schneiden Sie mit einer Schere und einer zahnlosen Pinzette breit von der kaudalen Hohlvene in den rechten Vorhof (Abbildung 2B). Setzen Sie den Schnitt zum rechten Ohranhang fort, um den Crista terminalis/sinoatrialen Knoten (SA-Knoten) freizulegen. Untersuchen Sie die Trikuspidalklappe aus der dorsalen Ansicht.
   3. Schneiden Sie einen Abschnitt vom rechten Vorhof bis zur Verbindung zwischen dem rechten Ventrikel und dem interventrikulären Septum ab (Abbildung 2C). Zeigen Sie die rechte atrioventrikuläre Klappe an.
   4. Schneiden Sie die rechte ventrikelfreie Wand entlang des interventrikulären Septums. Fahren Sie mit dem Abschnitt bis zum Ursprung des Lungenstamms fort (Abbildung 2C,D).
   5. Untersuchen Sie gründlich die rechten atrioventrikulären Klappen, einschließlich der Chordae tendineae, und die Papillarmuskeln (Abbildung 2D). Schneiden Sie die Chordae tendineae.
   6. Legen Sie eine Pinzette durch den Lungenstamm und schneiden Sie den Rumpf längs (Abbildung 2E). Untersuchen Sie den Lungenausflusstrakt, den Ursprung des Lungenstamms und die halbmondförmigen Klappen.
   7. Schneiden Sie den linken Vorhof von den Lungenvenen bis zur Spitze der linken Ohrmuschel ab (Abbildung 2F). Untersuchen Sie die Bikuspidalklappe (Mitralklappe) aus der dorsalen Ansicht.
   8. Legen Sie das Herz mit dem interventrikulären Septum nach unten (Abbildung 2F). Machen Sie einen großen Schnitt in der ventrikulären freien Wand von der Basis des Ventrikels bis zur Herzspitze. Zeigen Sie die linke atrioventrikuläre Klappe vollständig an.
   9. Schneiden Sie die Chordae tendineae von der Spitze der linken atrioventrikulären Klappe ab.
   10. Legen Sie eine Pinzette durch den linksventrikulären Ausflusstrakt und verwenden Sie sie als Führung, um die Aorta zu öffnen (Abbildung 2G).
   11. Verwenden Sie Kochsalzlösung, um alle Blutgerinnsel zu entfernen. Sobald alle Blutgerinnsel entfernt sind, beurteilen und vergleichen Sie das Herzgewicht mit der Körpermasse oder den Standard-Herzgewichtstabellen (Tabelle 1) ^11,13.
   12. Wiegen Sie das Herz.
   13. Wenn nur der SA-Knoten der Punkt von Interesse ist, legen Sie nach der Untersuchung des linken Ventrikels das gesamte Herz für 24 Stunden vollständig in 10% neutral-gepuffertes Formalin (NBF) und trimmen Sie den rechten Vorhof, um die Crista terminalis zu entnehmen.
       HINWEIS: Durch diese Technik können die linken und rechten Ventrikel leicht geschätzt werden. Das Verhältnis zwischen der linken und rechten Ventrikelwandstärke beträgt 3:1, mit kleinen Unterschieden je nach Art und Rasse; Für das Herz des tierischen Fötus beträgt das Verhältnis 1: 1¹².

3. Probenahmeprotokoll für die Histologie¹⁶

1. Führen Sie mit einem Skalpell zwei parallele Längsschnitte (im Abstand von ca. 5 mm) durch, die den rechten Vorhof, die Trikuspidalklappe und die rechte ventrikuläre freie Wand betreffen (Abbildung 2I).
2. Führen Sie zwei parallele Längsschnitte (im Abstand von ca. 5 mm) durch, die den linken Vorhof, die Mitralklappe, den dorsalen Papillenmuskel und den linken Ventrikel betreffen (Abbildung 2H).
3. Innerhalb des dorsalen oberen Drittels des Herzens transversal die Basis des Herzens einer Linie folgend, einschließlich des interventrikulären Septums, des rechten Vorhofs, der Aorta, der Aortenklappe und der Trikuspidalklappe (Abbildung 2J).
4. Führen Sie zwei längs parallele Schnitte durch, die die Basis der Aorta und das interventrikuläre Septum betreffen (Abbildung 2J).
5. Trimmen Sie das rechte Atrium um die Crista-Terminalis und sorgen Sie für mehrere parallele Abschnitte, die quer auf der Längsachse der Crista (etwa 3-4 mm voneinander entfernt) ausgerichtet sind, um sechs Teile des SA-Knotens zu erhalten (Abbildung 3, Abbildung 4I und Abbildung 5H).
6. Schneiden Sie die erhaltenen Gewebe in histologischen Kassetten.
   HINWEIS: Empfohlenes Blockierungsprotokoll: Schritt 3.1.-histologischer Block 1 (Abbildung 6 zeigt die resultierende Folie aus diesem Block.), Schritt 3.2.-histologischer Block 2 (Abbildung 7 zeigt die resultierende Folie aus diesem Block), Schritt 3.4.-histologischer Block 3 (Abbildung 8 zeigt die resultierende Folie aus diesem Block), Schritt 3.5.-histologischer Block 4 (Abbildung 9 zeigt die resultierende Folie aus diesem Block).
7. Tauchen Sie das Gewebe für mindestens 48 h in 10% NBF.

4. Probenahme der Koronararterien 3,10,14

1. Verwenden Sie eine Pinzette und ein Skalpell, um die Koronararterien von der kardialen parakonalen Rille zu trennen (Abbildung 4K). Fixieren Sie die Koronararterie über Nacht in 10% NBF.
2. Bei Bedarf in einer 1:1-Mischung aus 8% Ameisensäure und Salzsäure ausreichend entkalken.
3. Führen Sie mehrere Querschnitte im Abstand von 3 mm durch. Legen Sie die Abschnitte in eine Kassette und legen Sie die Kassette dann bis zum Einbetten in 10% NBF.
   HINWEIS: Schweine können als Herzmodell für Menschen verwendet werden, insbesondere wenn es um koronare Herzkrankheit geht. Daher werden zusätzliche Proben und histologische Abschnitte der Koronararterien empfohlen 3,10,14.

5. Die Dissektionstechnik "vier Kammern"/"echokardiographische Ebene" des Herzens ^1,17

HINWEIS: Die Vierkammer-Dissektionstechnik besteht aus einem Schnitt von der Basis bis zur Spitze des Herzens, um die Standardansicht¹ zu erhalten. Die "Vierkammer" -Technik wird am besten auf fixiertes Gewebe angewendet.

1. Legen Sie das ganze Herz für mindestens 48 h in 10% NBF.
2. Nachdem das Herz mindestens 48 h lang in 10% NBF fixiert wurde (Abbildung 10A), platzieren Sie zwei zahnlose gerade Dissektionszangen, eine durch die Schädelhöhle-rechte Vorhof-Trikuspidalklappe-rechte Herzkammer und die zweite durch die Lungenvene-linke Atrium-Mitralklappe-linke Herzkammer (Abbildung 10B).
3. Verwenden Sie den Abstand zwischen den Pinzettenarmen als Führung für die Schneidklinge von der Basis bis zur Spitze des Herzens (Abbildung 10C). Ist ein zusätzlicher Längsschnitt vorgesehen, der etwa 5 mm von dem in Schritt 5.2 beschriebenen Abschnitt abweicht. auf dem Herzsegment, das die Aorta umfasst.
4. Trennen Sie mit einem transversalen Schnitt die Herzbasis vollständig von der Spitze. Legen Sie jedes Gewebesegment in eine histologische Kassette.
   HINWEIS: Empfohlenes Blockierungsprotokoll: der kardiale Apex-histologische Block 5 (Abbildung 11A zeigt den resultierenden Objektträger aus diesem Block), der kardiale Basishistologische Block 6 (Abbildung 11B zeigt den resultierenden Objektträger aus diesem Block).
5. Legen Sie die Kassetten bis zum Einbetten in 10% NBF. Fixieren Sie alle Herzproben in 10% NBF (mehr als das 10-fache des Gewebevolumens), verarbeiten Sie sie routinemäßig in Paraffinwachs, Schnitt bei 4 μm Dicke, und färben Sie sie mit Hämatoxylin und Eosin-Färbung (H & E-Färbung) nach einem zuvor beschriebenen Protokoll¹⁰.
   HINWEIS: Bei Verdacht auf Myokarditis "sollte ein Stück frisches Herzgewebe unter sterilen Bedingungen mit sterilem chirurgischem Material und sterilem Probenbehälter für mikrobiologische und virale Studien aufbewahrt werden"¹³.

6. Fotografische Dokumentation

HINWEIS: Die fotografische Dokumentation ist ein optionaler Schritt in der Nekropsieuntersuchung. Foto- und Videoaufnahmen sind jedoch unerlässlich, um eine "genaue Dokumentation der normalen und abnormalen Anatomie^{" zu} haben3.

1. Für eine ordnungsgemäße fotografische Dokumentation nehmen Sie digitale Bilder auf, während Sie eine "progressive Dissektion des Herzgewebes" ^{durchführen13}. Siehe die Richtlinien für die fotografische Dokumentation und Fotografie¹⁵ die allgemeine Ansicht - vordere und hintere; eine Scheibe des Herzens; und alle vermuteten Läsionen.

Representative Results

Dieses Protokoll wurde verwendet, um anatomische Merkmale zu visualisieren und Proben für die histologische Untersuchung des Herzens in vier verschiedenen Arten (Hund, Katze, Schwein und Kuh) zu sammeln. Das Nekropsieprotokoll wurde bei jeder der oben genannten Arten wiederholt, aber nur bei Hunden veranschaulicht. Das Nekropsieprotokoll beginnt mit einer umfassenden externen Untersuchung des Körpers (Abbildung 1A) (einschließlich der Haut, der erforschbaren Lymphknoten und der äußeren Schleimhaut), der Messung des Gesamtgewichts und der Bewertung des allgemeinen Zustands des Tieres. Nach der äußeren Untersuchung wird die Nekropsie mit einer partiellen Häutung des Körpers (zur gründlichen Untersuchung der Unterhaut und der oberflächlichen Muskeln) und mit der Öffnung der Hauptkörperhöhlen fortgesetzt (Abbildung 1B-D).

Die Bauchhöhle ist typischerweise die erste, die untersucht wird (Abbildung 1C), gefolgt von einer umfangreichen In-situ-Untersuchung der Peritonealhöhle und der Bauchorgane, gefolgt von einem Schnitt des Zwerchfells und schließlich der Entfernung des rechten Hemithorax (Abbildung 1D). Durch diese Technik kann eine gute in situ Untersuchung der thorakoabdominalen Organe (einschließlich der Perikardhöhle und des Herzens) erreicht werden, die gleichzeitig eine korrekte Beurteilung der Verbindungen dieser Organe mit den lokalen Blutgefäßen, Lymphgefäßen, Bändern und Nerven ermöglicht. Die Untersuchung der Perikardhöhle erfolgt durch einen breiten Abschnitt des parietalen Perikards entlang der Längsachse des Herzens, gefolgt von der Entfernung des Herzens durch Schneiden der kardialen großen Gefäße in der Nähe des Lungenparenchyms. Auf die äußere Untersuchung des Herzens folgt die Sektion der Herzhöhlen, die eine umfangreiche Inspektion und schließlich die ordnungsgemäße Entnahme der Gewebeproben für die Histopathologie ermöglicht. Kurz werden der Ablauf und die Ergebnisse der beiden Herzdissektionstechniken, des "Blutflusses" (Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5) und der "vier Kammern" (Abbildung 10) vorgestellt.

Die "Blutfluss"-Technik wurde im Herzen von Hunden, Schweinen und Wiederkäuern angewendet (Abbildung 2, Abbildung 4 und Abbildung 5). Nachdem das Herz aus dem Körper entfernt wurde, wurde die äußere Konfiguration beobachtet (Abbildung 2A, Abbildung 4A und Abbildung 5A). Während der Dissektion sollte man die atriale Konfiguration, die Crista terminalis, beachten, die das makroskopische Identifikationselement für den sinoatrialen Knoten ist (Abbildung 2B, Abbildung 4B und Abbildung 5B). Nachdem Sie mit den Schritten des Protokolls fortgefahren sind (Abbildung 2B-G, Abbildung 4B-G und Abbildung 5B-G), ist die Dissektion abgeschlossen und das Ernteprotokoll für die Histologie kann begonnen werden (Abbildung 2H-J, Abbildung 4G-J und Abbildung 5H-K). Alternativ kann die Crista terminalis auch geerntet werden, nachdem das Herz fixiert wurde (Abbildung 3) in 10% NBF. Im Vergleich zu Hunden muss im Herzen der Schweine ein zusätzlicher Schritt durchgeführt werden - die Ernte der Koronararterie (Abbildung 4K).

Nach der Ernte wurden die Proben in 10% NBF fixiert, routinemäßig verarbeitet und in Paraffinwachs eingebettet und schließlich auf 4 μm geschnitten und von H&E gefärbt. Die histologischen Objektträger, die mit dieser Technik erhalten werden, umfassen typischerweise Folgendes: 1) das Epikard, Myokard und Endokard des rechten Vorhofs und Ventrikels, die Trikuspidalklappe und die Koronararterien für histologischen Block 1 (Abbildung 6); 2) Epikard, Myokard und Endokard des linken Vorhofs und Ventrikels, der Mitralklappe, der Koronararterien und der Herznerven für histologischen Block 2 (Abbildung 7); 3) das Myokard, das Endokard des interventrikulären Septums und das Epikard des rechten Vorhofs sowie die Trikuspidalklappe für den histologischen Block 3 (Abbildung 8); 4) mehrere Abschnitte vom SA-Knoten für histologischen Block 4 (Abbildung 9); 5) Epikard, Myokard und Endokard der Herzspitze (linker und rechter Ventrikel und interventrikuläres Septum) für histologischen Block 5 (Abbildung 11A); und 6) Epikard, Myokard und Endokard der Basis des Herzens (linke und rechte Vorhöfe, Ventrikel, interventrikuläres Septum, atrioventrikuläre Klappen und Koronararterien) für histologischen Block 6 (Abbildung 11B).

Abbildung 1: Nekropsietechnik bei einem Hund. (A) Die Platzierung des Subjekts auf der linken Seite; (B) Öffnung der Bauchhöhle; (C) Öffnung der Brusthöhle; (D) Untersuchung der Brusthöhle. 1-7 geben die Orte und die Reihenfolge der empfohlenen Einschnitte an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Dissektions- und Probenahmeprotokoll im Herzen des Hundes. (A) Äußere Konfiguration des Herzens; (B) Beginnen Sie von der Schwanzhöhle und trimmen Sie den rechten Vorhof, öffnen Sie den rechten Vorhof und beobachten Sie die Crista terminalis; (C) den rechten Ventrikel entlang der Verbindung mit dem interventrikulären Septum trimmen; Anzeige der Trikuspidalklappe; (D) nach dem Schneiden der Chordae tendineae den rechten Ventrikel untersuchen und den Schnitt entlang der parakonalen Rille fortsetzen; (E) die Pinzette durch den Lungenstamm führen und sie verwenden, um den Schnitt zu führen; untersuchen den pulmonalen Abfluss; (F) 1-Öffnung des linken Vorhofs, 2-von der Basis, geschnitten bis zur Spitze; untersuchen Sie die Mitralklappe und den linken Ventrikel; (G) die Pinzette durch die Aorta führen und sie verwenden, um den Schnitt zu führen; untersuchen die Aorta; (H) zwei Schnitte entlang des linken Herzens machen und das mittlere Stück in 10% NBF legen; (I) Machen Sie zwei Schnitte entlang des rechten Herzens, legen Sie das mittlere Stück in 10% NBF und schneiden Sie die Crista terminalis weg; (J) Schneiden Sie die Basis des Herzens weg, machen Sie zwei Schnitte entlang des Stücks und legen Sie das mittlere Stück in 10% NBF. Abkürzungen: SAN = sinoatrial node; NBF = neutral gepuffertes Formalin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Probenahme des Crista terminalis aus einem formalinfixierten Herzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Dissektions- und Probenahmeprotokoll im Schweineherz. (A) Äußere Konfiguration des Herzens; (B) Beginnen Sie von der Schwanzhöhle und schneiden Sie den rechten Vorhof, untersuchen Sie den rechten Vorhof, lokalisieren Sie die Crista terminalis und beginnen Sie, den rechten Ventrikel zu öffnen; (C) den rechten Ventrikel entlang der Verbindung mit dem interventrikulären Septum trimmen und die Trikuspidalklappe untersuchen; (D) nach dem Schneiden der Chordae tendineae untersuchen Sie den rechten Ventrikel, führen Sie die Pinzette durch den Lungenstamm und verwenden Sie sie, um den Schnitt zu führen; e) Untersuchung des Lungenabflusses; Nach dem Schneiden des linken Vorhofs schneiden Sie den linken Ventrikel von der Basis bis zur Spitze; (F) Untersuchung der Mitralklappe und des linken Ventrikels und Schneiden der Chordae tendineae; Legen Sie Pinzetten durch die Aorta und verwenden Sie sie, um den Schnitt zu führen; (G) untersuchen Sie die Aorta, machen Sie zwei Schnitte entlang des linken Herzens, legen Sie das mittlere Stück in 10% NBF; (H) zwei Schnitte entlang des rechten Herzens machen; Legen Sie das mittlere Stück in 10% NBF; (I) Schneiden Sie die Crista terminalis weg, legen Sie das Stück in 10% NBF; (J) Schneiden Sie die Basis des Herzens weg, machen Sie zwei Schnitte entlang des Stücks und legen Sie das mittlere Stück in 10% NBF; (K) Trimmen Sie die Koronararterie, fixieren Sie sie über Nacht und machen Sie dann mehrere Querschnitte in Abständen von 3 mm. Abkürzung: NBF = neutral-buffered formalin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Dissektions- und Probenahmeprotokoll im Kuhherz. (A) Äußere Konfiguration des Herzens; (B) Beginnen Sie von der Schwanzhöhle und schneiden Sie den rechten Vorhof, untersuchen Sie den rechten Vorhof, lokalisieren Sie die Crista terminalis und beginnen Sie, den rechten Ventrikel zu öffnen; (C) den rechten Ventrikel entlang der Verbindung mit dem interventrikulären Septum trimmen und die Trikuspidalklappe untersuchen; (D) den Schnitt parallel zur parakonalen Nut fortsetzen, die Pinzette durch den Lungenstamm führen und sie verwenden, um den Schnitt zu führen; (E) Untersuchung des Lungenabflusses, Beginn des Schneidens der Lungenvenen und des linken Vorhofs und dann des Schneidens des linken Ventrikels von der Basis bis zur Spitze; (F) Untersuchung der Mitralklappe und des linken Ventrikels und Schneiden der Chordae tendineae; (G) die Pinzette durch die Aorta führen, sie benutzen, um den Schnitt zu führen, und die Aorta untersuchen; (H) Schneiden Sie die Crista terminalis weg und legen Sie das Stück in 10% NBF; (I) zwei Schnitte entlang des linken Herzens machen und das mittlere Stück in 10% NBF legen; (J) machen Sie zwei Schnitte entlang des rechten Herzens und legen Sie das mittlere Stück in 10% NBF; (K) Schneiden Sie die Basis des Herzens weg, machen Sie zwei Schnitte entlang des Stücks und legen Sie das mittlere Stück in 10% NBF. Abkürzung: NBF = neutral-buffered formalin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Histologische Untersuchung des rechten Ventrikels, des rechten Vorhofs und der Trikuspidalklappe im Herzen eines Hundes. H&E-Färbung. (A) Histologische Probe des rechten Ventrikels, des rechten Vorhofs und der Trikuspidalklappe; (B) rechter Ventrikel, rechter Vorhof und Trikuspidalklappe. Maßstäbe = 500 μm; (C) rechter Ventrikel, rechter Vorhof und Koronararterien. Maßstäbe = 100 μm; (D) rechter Vorhof. Maßstabsbalken = 500 μm. Abkürzungen: H&E = Hämatoxylin und Eosin; RV = rechter Ventrikel; RA = rechter Vorhof; Ts-V = Trikuspidalklappe; CA = Koronararterie; EnC = Endokard; MC = Myokard; EpC = Epikard. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Histologische Untersuchung des linken Ventrikels, des linken Vorhofs und der Mitralklappe im Herzen eines Hundes. H&E-Färbung. (A) Histologische Probe des linken Ventrikels, des linken Vorhofs und der Mitralklappe; (B) linker Vorhof. Maßstäbe = 500 μm; (C) linker Vorhof, linker Ventrikel, Koronararterie und Nerv. Maßstäbe = 100 μm; (D) Koronararterie, Nerv. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: H&E = Hämatoxylin und Eosin; LA = linker Vorhof; LV = linker Ventrikel; Mt-V = Mitralklappe; CA = Koronararterie; EnC = Endokard; MC = Myokard; EpC = Epikard; NV = Nerv. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 8: Histologische Untersuchung des interventrikulären Septums, des rechten Vorhofs und der Trikuspidalklappe im Herzen eines Hundes. H&E-Färbung (A) Interventrikuläres Septum, rechter Vorhof und trikuspidalklappenhistologische Probe; (B) interventrikuläres Septum, rechter Vorhof und Trikuspidalklappe. Maßstabsbalken = 500 μm. Abkürzungen: H&E = Hämatoxylin und Eosin; IVS = interventrikuläres Septum; RA = rechter Vorhof; Ts-V Trikuspidalklappe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 9: Histologische Untersuchung des Sinusknotens im Herzen eines Hundes. H&E-Färbung. (A) Histologische Probe der Crista terminalis; (B) 4-fache Vergrößerung des Sinusknotens. Maßstäbe = 500 μm; (C) 20-fache Vergrößerung des Sinusknotens. Maßstäbe = 100 μm; (D) Sinusknoten 40-fache Vergrößerung. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: H&E = Hämatoxylin und Eosin; SA-Knoten = Sinusknoten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 10: Sezierprotokoll an einem formalinfixierten Herzen einer Katze. (A) Äußere Konfiguration des Herzens; (B) die Pinzette durch die Schädelhöhle und die Lungenvenen führen; die Pinzette führt den Längsschnitt von der Basis bis zur Spitze; (C) die Vierkammeransicht nach dem Schnitt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 11: Histologische Proben des Herzens einer Katze. H&E-Färbung. a) Scheitelpunkt der herzhistologischen Probe; (B) Basis der herzhistologischen Probe. Abkürzungen: H&E = Hämatoxylin und Eosin; LV = linker Ventrikel; IVS = interventrikuläres Septum; RV = rechter Ventrikel; LA = linker Vorhof; MV = Mitralklappe; TS-V = Trikuspidalklappe; RA = rechtes Atrium. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Spezies	Alter	Mittelwert %BW	(LV + S)/RV	Zitationsnummern
Katze	Neugeborene	0.77%	-	7
Katze	Erwachsene	0.33%-0.46%	2.94-4.17	8, 5, 11
Hund	Neugeborene	0.47%-0.76%	-	8, 7
Hund	Erwachsene	0.70%-0.85%	2.39-5.12	8, 6, 11
Schwein	Erwachsene	0.32%-0.48%	2.38-3.84	11
Schaf	Erwachsene	0.17%-0.65%	2.63-4.54	11
Kuh	Erwachsene	0.30%-0.66%	2.43-4.00	11

Tabelle 1: Referenzwerte für normales Herzgewicht/Körpergewichtsverhältnis und ventrikuläres Verhältnis bei Tieren. Herzmessungen für Katze, Hund, Schwein, Schaf und Kuh. Abkürzungen: BW = Körpergewicht; LV = linker Ventrikel; S = interventrikuläres Septum; RV = rechter Ventrikel.

Discussion

Bei der Durchführung des aktuellen Protokolls sollten mehrere kritische Schritte sorgfältig berücksichtigt werden, um konsistente Ergebnisse zu erzielen. Bei jungen Tieren unterscheiden sich die Herzmessungen von denen bei Erwachsenen (einschließlich der ventrikulären Wanddicke), und im Allgemeinen macht das Herz einen größeren Anteil des Körpergewichts aus^11,12. Der Grad der ventrikulären Hypertrophie kann durch Anwendung einer allgemeinen Gewichtsformel quantifiziert werden, das Verhältnis zwischen dem linken Ventrikel plus Septum dividiert durch das Gewicht des freien rechten Ventrikels, das unter normalen Bedingungen bei reifen Tieren 2,8-4,0 betragen sollte (Tabelle 1). Wenn dieses Verhältnis 4,0 übersteigt, zeigt es eine linksventrikuläre Hypertrophie an, und wenn es weniger als 2,8 ist, zeigt es eine rechtsventrikuläre Hypertrophie 4,11,12 an. Um den Wert der Kammer zu erhalten, muss die rechte ventrikuläre freie Wand entlang der interventrikulären Wand seziert und die Koronarrinne vom rechten Vorhof getrennt werden. Die Dissektion des linken Ventrikels aus dem linken Vorhof erfolgt am atrioventrikulären Ring⁴.

Das Herz wird vom Körper getrennt, indem die großen Gefäße geschnitten werden. Wenn die Abschnitte der großen Gefäße zu nahe an der Herzbasis liegen, können mehrere Strukturen beeinträchtigt werden, hauptsächlich die Vorhöfe und die Ohrmuscheln. Um den Prozess zu erleichtern, ist es notwendig, das Herz ventral vorsichtig zu ziehen, um die großen Gefäße über der Basis des Herzens richtig zu schneiden. Ein zweiter kritischer Schritt ist die Erkennung der Morphologie der Crista terminalis, einer diskreten anatomischen Struktur, die detaillierte strukturelle Kenntnisse des Herzens erfordert. Der SA-Knoten muss sorgfältig entnommen und eingebettet werden, wobei die Anordnung der Gewebeproben innerhalb der Blöcke während des histologischen Prozesses besonders berücksichtigt werden muss.

Die Modifikation der "Vierkammer"-Technik bestand darin, das histologische Blockierungsschema von einem Block auf zwei zu ändern. Die Standardmaße weit verbreiteter histologischer Kassetten und das angepasste histologische Verfahren (einschließlich der rotierenden Mikrotom-Färbestation) sind nicht geeignet, den gesamten Herzabschnitt in einem Block ohne Gewebeverzerrung unterzubringen. Obwohl die "Vierkammertechnik" die Untersuchung der Struktur der Herzkammern erleichtert, schränkt sie die Untersuchung des Leitungssystems ein. Dies ist besonders wichtig in Fällen, in denen Herzrhythmusstörungen dokumentiert sind. Wenn man bedenkt, dass die "Vierkammer"-Technik Gewebe erfordert, das in NBF fixiert ist, können mehrere zusätzliche Untersuchungen wie Bakteriologie und Molekularbiologie bis zu einem gewissen Grad beeinträchtigt werden.

Wenn es um das Herz einer Katze oder eines kleinen Hundes geht, wird ein genauer echokardiographischer Standardplan auf fixiertem Gewebe erstellt. Die Vierkammeransicht ist vor allem bei Kammerdimensionen hilfreich, wenn es Abweichungen in ventrikulären oder atrialen Größen^{gibt 1}. Zusätzlich zu den Vorteilen, die sich aus der perfekten Überlagerung des groben Trimms mit denen ergeben, die während der klinischen Untersuchung durch Echokardiographie erzielt wurden, bietet diese Technik den Vorteil, dass die meisten Schlüsselkomponenten des Herzens in nur zwei histologischen Blöcken eingeschlossen werden.

Die bei Schweinen beschriebene "Zufluss-Abfluss"-Methode wurde aus Protokollen übernommen, die im Herzen von Menschen verwendet werden, indem der Schritt der Entnahme von Koronararterien hinzugefügt wurde. Die derzeit beschriebenen Herzdissektionsprotokolle veranschaulichen Standardpunkte für die Probenahme. Wenn der Dissektor andere Läsionen als die im Protokoll behandelten beobachtet oder vermutet, sollten zusätzliche Proben aus den interessierenden Bereichen entnommen werden.

Bei der Entwicklung der aktuellen Protokolle wurden andere Methoden untersucht, wie die Methode, die einen anfänglichen Längsschnitt der wichtigsten Herzkurven¹² beinhaltet, und die "Brotlaib"/Kurzachsentechnik ^9,11. Die Technik, bei der die wichtigsten Herzkurven in Längsrichtung geschnitten werden, ist ein einfacheres Protokoll, das häufig in der biomedizinischen Ausbildung verwendet^{wird 12}. Die Kurzachsenschnitttechnik ("Brotlaibtechnik") kann mit einem kurzen Achsenschnitt¹¹ oder einer Reihe von Abschnitten von 1-2 cm Dicke von der Spitze zur Basis durchgeführt werden, wobei der atrioventrikuläre Apparat intakt bleibt⁹. Diese Technik ist am besten geeignet, wenn der Dissektor myokardiale Pathologien (einschließlich entzündlicher Pathologien und Kardiomyopathien) vermutet, aber den Nachteil einer oberflächlichen Untersuchung der Klappenkomponenten hat⁹.

Beide Techniken werden von Personen mit relativ grundlegenden Kenntnissen der Herzanatomie leicht beherrscht, aber es fehlen robuste Punkte für die histologische Probenahme und Gewichtung jeder Herzkomponente. Nach diesen Methoden erfordert der anschließende Erntevorgang mühsame Arbeit, um die interessierenden Bereiche zu identifizieren und konstante Proben zu erhalten. Bei den mit diesen Methoden sezierten Herzen erfordert das getrennte Wiegen der beiden Hälften Anstrengung, um das Verhältnis zwischen ihnen berechnen zu können. Die Kurzachsenmethode erfordert zusätzliche Schritte für die Untersuchung des Endokards und aller Komponenten, die sich an der Basis des Herzens befinden. Darüber hinaus besteht das Ernteverfahren nach diesen Methoden aus mühsamer Arbeit, um die interessierenden Bereiche zu identifizieren und konstante Proben zu erhalten.

Dieses Manuskript präsentiert die Schlüsselelemente einiger Standardprotokolle zur kardialen Dissektion und hebt sowohl die groben Untersuchungsansätze als auch die üblicherweise für histopathologische Untersuchungen verwendeten Probenahmestellen hervor. In Bezug auf die zukünftigen Anwendungen der Technik besteht der Hauptzweck des vorgestellten Protokolls darin, eine robuste Richtlinie für die Herzdissektion anzubieten, die in allen experimentellen Studien, die eine detaillierte kardiale Beurteilung erfordern, leicht verwendet werden kann.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline solution	B. BRAUN MELSUNGEN AG	W04479004	For washing all the blood, and blood clots from the heart.
10% neutral buffered formalin (NBF)	Q Path	11699404	Materials for collecting histopathology samples.
Bone cutting forceps	HELEN SRL	LS109HV	Sturdy instrument for cutting bone.
Cutting board	Ambition	86304	For an easier manipulation, and cutting the organs.
Decalcifying solution	Thermo Scientific TBD-2	6764004	1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid.
Digital camera	Canon Inc.	PowerShot SX540 HS	For photographic, and videographic documentation.
Forceps	MKD-Medicale	15-430	Dissection instruments.
Histological cassettes	Q Path	720-2215	Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm
Knife	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	Sharp blade for cutting soft tissue.
Latex gloves	MKD-Medicale	SANTEX-S	Protection equipment.
Mask	MKD-Medicale	21221	Protection equipment.
Petri dishes	MKD-Medicale	0598-1V	Materials for collecting ancillary testing samples.
Plastic recipients	Corning Gosselin	TP200-02	Materials for collecting histopathology samples.
Scale	ESPERANZA	MEEKS008	For weighing the organs.
Scale	White Deals	72	For weighing the subjects.
Scalpel	MKD-Medicale	10322E	Sharp blade for cutting soft tissue.
Scissors	MKD-Medicale	13-260	Dissection instruments.
Scrub	MKD-Medicale	410100-52	Protection equipment.
Syringes	MKD-Medicale	10573EU	Materials for collecting ancillary testing samples.