Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Produktion af high-titer rekombinant Newcastle Disease Virus fra Allantoic Fluid

Published: May 25, 2022 doi: 10.3791/63817
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathobiology, University of Guelph

Summary

Her giver vi en detaljeret procedure for produktion, rensning og kvantificering af højtitrekombinant Newcastle disease-virus. Denne protokol giver konsekvent > 6 × 109 plaquedannende enheder / ml, hvilket giver virusmængder, der er passende til in vivo dyreforsøg. Yderligere kvalitetskontrol assays for at sikre sikkerhed in vivo er beskrevet.

Abstract

Newcastle disease virus (NDV), også kendt som aviær orthoavulavirus serotype-1, er en negativ sans, enkeltstrenget RNA-virus, der er udviklet både som en onkolytisk virus og en viral-vektorvaccine. NDV er et attraktivt terapeutisk og profylaktisk middel på grund af dets veletablerede omvendte genetiksystem, potente immunostimulerende egenskaber og fremragende sikkerhedsprofil. Når det administreres som en onkolytisk virus eller en viral vektorvaccine, fremkalder NDV et robust antitumor- eller antigenspecifikt immunrespons, der aktiverer både immunsystemets medfødte og adaptive arme.

I betragtning af disse ønskelige egenskaber er NDV blevet evalueret i adskillige kliniske forsøg og er en af de mest velundersøgte onkolytiske vira. I øjeblikket er der to registrerede kliniske forsøg, der involverer NDV: et, der evaluerer en rekombinant NDV-vektorvaccine til SARS-CoV-2 (NCT04871737), og et andet evaluerer en rekombinant NDV-kodning af Interleukin-12 i kombination med Durvalumab, et antiPD-L1-antistof (NCT04613492). For at lette yderligere fremskridt med denne meget lovende virale vektor er der behov for forenklede metoder til generering af høj titer, in vivo-grade, rekombinant NDV (rNDV).

Dette papir beskriver en detaljeret procedure til forstærkning af rNDV i specificeret patogenfri (SPF) embryonerede kyllingæg og rensning af rNDV fra allantoisk væske med forbedringer for at reducere tab under oprensning. Også inkluderet er beskrivelser af de anbefalede kvalitetskontrolassays, som skal udføres for at bekræfte mangel på forurenende stoffer og virusintegritet. Samlet set muliggør denne detaljerede procedure syntese, oprensning og opbevaring af højtitre, in vivo-grade, rekombinant, lentogen og mesogen NDV til brug i prækliniske undersøgelser.

Introduction

Newcastle Disease Virus, også kendt som Avian Orthoavulavirus-1, er et indhyllet aviær paramyxovirus med potentiale til at blive brugt både som en onkolytisk virus eller en viral vektorvaccine 1,2,3,4,5,6,7. Senest er NDV konstrueret til at udtrykke spike-proteinet i SARS-CoV-2 blevet karakteriseret som en effektiv intranasal vaccine i muse- og hamsterudfordringsmodeller 7,8,9. Når det anvendes som kræftimmunterapi, resulterer det i rekruttering af medfødte immunceller, specifikt naturlige dræberceller, produktion af type I interferon og generering af antitumorspecifikke T-celler 10,11,12,13. Ud over disse potente immunstimulerende egenskaber har NDV en stærk sikkerhedsprofil og et veletableret omvendt genetiksystem14,15. Disse ønskelige egenskaber har givet anledning til evaluering af NDV i adskillige prækliniske og humane kliniske forsøg (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. For yderligere at fremme denne meget lovende, immunstimulerende virale vektor er der behov for detaljerede metoder til fremstilling og rensning af højtitre, ultrarent NDV, der sikkert kan administreres in vivo.

Da NDV er et aviær paramyxovirus, forstærkes det oftest i embryonerede kyllingæg. Mens der er cellebaserede systemer til rådighed til formering af NDV, har de fleste ikke været i stand til at producere titere svarende til den, der opnås i embryonerede kyllingæg18. Ikke desto mindre er der nogle ulemper ved at producere NDV i æg, herunder det faktum, at ægbaseret produktion er langvarig og ikke let skalerbar, indkøb af store mængder SPF kyllingæg kan være problematisk, og der findes potentiale for forurening med ægallergener 13,18,19,20 . For nylig har en gruppe vist, at Vero-celler dyrket i suspension i serumfrit medium kan understøtte replikationen af NDV til titere, der kan sammenlignes med dem, der opnås i æg, før rensning21. Dette krævede imidlertid seriel passaging af virussen for at tilpasse virussen til Vero-celler, og optimering af en metode til rensning af NDV fra suspension Vero-celler er stadig påkrævet21.

Som tidligere fremhævet varierer metoder, der anvendes til rensning af in vivo-grade virus med høj titer, afhængigt af den pågældende virus22. Der er et veletableret omvendt genetiksystem til rådighed til generering af rekombinant NDV. Denne proces, der involverer anvendelse af en cDNA-klon, hjælperplasmider og en hjælpervirus, der udtrykker T7 RNA-polymerase, er tidligere beskrevet detaljeret 15,23. Denne protokol kan anvendes på enten lentogen eller mesogen NDV. Den virus, der er beskrevet i denne protokol, er en rekombinant mesogen NDV, der koder for det grønne fluorescerende protein (GFP) fra vandmændene Aequorea victoria indsat mellem virale P- og M-gener som en individuel transkriptionsenhed, da dette tidligere er blevet beskrevet som det optimale sted for udenlandsk transgenindsættelse24.

Vedlagte metoder skitserer rensningen af NDV baseret på dens størrelse, der spænder fra 100 til 500 nm, og dens densitet15. Dette har gjort det muligt at generere in vivo-grade, high-titer NDV-lagre på cirka 3 uger, fra når æggene modtages til at have en endelig titer. Teknikker, der ofte anvendes i storskala produktion af ægbaserede vira såsom tangentiel flowfiltrering, dybdefiltrering og densitetsgradient ultracentrifugering, beskrives, hvilket muliggør oversættelse af disse metoder til større produktion. Tidligere beskrevne teknikker til rensning af NDV er blevet forbedret ved inkorporering af en virusstabiliserende buffer, anvendelse af iodixanol under densitetsgradient ultracentrifugering og beskrivelse af forskellige kvalitetskontrolforanstaltninger for at sikre in vivo-kvalitet 15. Dette har gjort det muligt at rense in vivo-grade NDV, der når titere så højt som 3 × 1010 PFU / ml fra 0,8 til 1,0 L allantoisk væske.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alt arbejde, der involverer brug af dyr, blev godkendt af University of Guelph Animal Care Committee i overensstemmelse med det canadiske råd for dyrepleje. Alt arbejde udføres i et biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) laboratorium i Canada, hvor mesogen NDV er et risikogruppe 2-patogen. Alle trin, der er involveret i forstærkning og rensning af NDV, skal udføres i et biologisk sikkerhedsskab af type IIA af sikkerheds- og sterilitetshensyn.

1. Forstærkning af NDV ved hjælp af specificerede patogenfrie embryonerede kyllingæg

  1. Podning af SPF embryonerede kyllingæg
    BEMÆRK: Typisk bruges otte dusin SPF embryonerede kyllingæg til at generere en in vivo-grade batch af NDV. Bestil et eller to dusin ekstra æg for at tage højde for skader under forsendelse samt variation i levedygtighed. Embryonerede hønseæg er biologisk materiale og bør håndteres i henhold til institutionelle retningslinjer. Men da embryonerne ikke udklækkes, er det ikke nødvendigt med godkendelse fra det institutionelle dyreplejeudvalg.
    1. Efter at have modtaget SPF embryonerede kyllingæg, inkuberes i en æginkubator ved 37 ° C, 60% fugtighed i 9 dage. Sørg for, at inkubatoren er indstillet til automatisk at klippe / rotere æggene hver time.
      BEMÆRK: Æg kan opbevares ved stuetemperatur i op til 24 timer eller 4 °C i op til 72 timer; dette kan dog nedsætte embryo levedygtighed.
    2. Efter 8-11 dages inkubation (ideelt set på dag 9) tændes æggene for at bestemme embryo levedygtighed. Se efter weblignende vaskulatur (figur 1A) og embryobevægelse som indikatorer for levedygtige embryoner. Bortskaf æg, der mangler disse funktioner (figur 1B).
    3. På de levedygtige æg markeres grænsefladen mellem luftsækken og embryoet med blyant med et 'X' (figur 1A). Sørg for, at dette injektionssted ikke forårsager perforering af vaskulaturen. Returner de markerede æg til inkubatoren, mens podemidlet er tilberedt.
    4. Beregn mængden af virus, der kræves for at injicere alle SPF-embryonerede kyllingæg. Sørg for, at hvert æg modtager 100 PFU virus i et volumen på 100 μL; virusset fortyndes i phosphatbufferet saltvand (PBS) til en koncentration på 1 × 103 PFU/ml. Forbered yderligere 20% af podevæsken for at tage højde for unøjagtigheder i virusadministration.
    5. Brug en antistatisk klud til at rengøre toppen af de markerede æg med en 10% jodopløsning, fortyndet i 70% ethanol. Vent ca. 1-2 min på, at opløsningen tørrer.
    6. Gennembor forsigtigt skallen ved hjælp af et par sterile skarpe pincet. Desinficer pincetten i 70% ethanol mellem æg.
    7. Ved hjælp af en 1 ml sprøjte og en 25 G nål injiceres 100 μL af podebenet fremstillet i trin 1.1.4 i chorioallantoic hulrum (figur 1C). Gå ind med nålen i en vinkel på næsten 90° i forhold til ægget. Indsæt nålen lige i toppen af chorioallantoic membranen.
    8. Efter podning skal du bruge neglelak til at dække punkteringsstedet og returnere æggene til inkubatoren. Sørg for, at gyngeindstillingen er TÆNDT indtil 24 timer efter podning.
    9. Kontroller æglevedygtighed 24 timer efter podning. Kassér døde æg, der mangler vaskulatur i chorioallantoic membranen og embryobevægelsen (figur 1B).
      BEMÆRK: Disse æg er døde på grund af podningsprocessen og ikke fra NDV.
    10. Returner æggene til inkubatoren, hvor vipperen sætter OFF for at forhindre forurening af allantoisk væske med ægproteiner.
    11. Æggene kontrolleres hver 12.-24. time som beskrevet i trin 1.1.9 for at identificere døde æg. Flyt de æg, der dør efter 24 timer efter podning, til 4 °C for at minimere autolyse. Høst den allantoiske væske inden for 2-12 timer efter afkøling.
    12. Inkuber æggene i mindst 72 timer.
      BEMÆRK: Hvis der formeres en mesogen stamme af NDV, er den optimale inkubationstid 60-72 timer, da forlængede inkubationstider kan forringe rensningsprocessen på grund af reduceret klarhed af allantoisk væske. Dette spørgsmål er ikke så vigtigt ved formering af lentogene NDV-stammer, da de tager meget længere tid at dræbe embryoet.
    13. Efter den passende inkubationsperiode flyttes de resterende æg til 4 °C i 2-12 timer, inden allantovæsken høstes.
  2. Høstning af allantoisk væske indeholdende NDV
    1. Flyt de kølede æg ind i biosikkerhedsskabet. Rengør toppen af æggene med 70% ethanol.
    2. Brug steril pincet og kirurgisk saks til at bryde den apikale side af ægget, hvor luftsækken er placeret.
    3. Fjern skallen for at afsløre chorioallantoic membranen (figur 1D).
    4. Punkter forsigtigt membranen og skræl den tilbage for at udsætte det allantoiske hulrum (figur 1E). Sørg for, at æggeblommesækken ikke ved et uheld punkteres, da dette vil ødelægge ægget.
    5. Brug stump tang til at gribe embryoet og åbne embryonalsækken.
      BEMÆRK: Væsken inde i embryonalsækken indeholder også NDV.
    6. Tryk embryoet med tangen og opsaml den allantoiske væske ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette.
    7. Opbevar den allantoiske væske på is i 15 ml koniske rør indtil afklaring.
      BEMÆRK: Hvis den allantoiske væske er gul, er æggeblommesækken blevet kompromitteret, og den allantoiske væske skal kasseres.
    8. De koniske rør indeholdende allantoisk væske centrifugeres ved 1.500 × g i 10 minutter ved 4 °C.
    9. Pausepunkt: Aliquot den klarede allantoiske væske i 50 ml koniske rør og opbevar dem ved -80 ° C til langtidsopbevaring (f.eks. Uger til måneder), suppler væsken med saccharose til en slutkoncentration på 5% for at beskytte virussen mod de hårde virkninger af fryse-optøning. Alternativt, til kortvarig opbevaring (f.eks. 1-3 dage), supplere allantoinsyren med saccharose (endelig 5%) eller med 3x Mannitol-Lysin (ML) buffer (15% Mannitol, 3% Lysin; se supplerende tabel S1 for bufferopskrifter) for at give en endelig koncentration på 1x (5% Mannitol, 1% Lysin) inden opbevaring ved 4 ° C.

2. Rensning af NDV fra allantoisk væske

  1. Dybdefiltrering af allantoisk væske
    1. Den rensede allantoiske væske opbevares ved -80 °C og optøs ved 4 °C natten før rensningen.
    2. I et biologisk sikkerhedsskab opsættes slangen og den peristaltiske pumpe som vist i figur 2.
    3. Hvis det ikke allerede er udført, kombineres allantoisk væske med 3x ML-buffer til en slutkoncentration på 1x.
    4. Inden dybdefilteret fastgøres, steriliseres slangen ved at føre 50 ml 0,5 M NaOH gennem systemet til en affaldsbeholder.
    5. Skyl slangen ved at føre 100 ml sterilt vand af molekylær kvalitet gennem systemet og ind i affaldsbeholderen.
      BEMÆRK: Da NaOH vil inaktivere NDV, er det vigtigt, at linjerne vaskes tilstrækkeligt, inden den virusholdige allantoiske væske introduceres.
    6. Prime systemet ved at køre 50 ml PBS gennem det og stoppe pumpen, når der er ca. 5 ml PBS tilbage i røret.
    7. Fastgør dybdefilteret med en fastholdelsesklassificering på 1-3 μM til slangen, og fjern den anden hætte på den apikale side af dybdefilteret for at udlufte filteret. Begynd at køre yderligere 50 ml PBS gennem systemet.
    8. Når PBS begynder at strømme gennem udluftningen øverst på filteret, skal du lukke porten og fortsætte med at flyde PBS gennem linjerne.
      BEMÆRK: Mindre luftbobler er acceptable, men tilstedeværelsen af store mængder luft kræver, at filteret udluftes igen som beskrevet i trin 2.1.7 og 2.1.8.
    9. Pumpen stoppes, når der er ca. 5 ml PBS tilbage i røret.
    10. Udskift affaldsbeholderen med en ny steril opsamlingsbeholder, og begynd at køre allantoisk væske gennem dybdefilteret.
      BEMÆRK: Trykket må ikke overstige 10 psi, da dette resulterer i klipning af virussen. Tryk kan manipuleres ved at reducere eller øge pumpens strømningshastighed. Hvis trykket begynder at overstige 10 psi, og strømningshastigheden ikke kan reduceres yderligere, skal der anvendes et nyt dybdefilter. I dette tilfælde skal trin 2.1.6-2.1.8 udføres, inden strømmen af allantoisk væske genoptages.
    11. Når al allantoisk væske har passeret gennem filteret, skal du køre 50 ml 1x ML buffer gennem linjerne for at maksimere virusgendannelsen.
    12. Saml væsken, indtil linjerne løber tørre. Opbevar virussen natten over eller op til 36 timer ved 4 °C.
      BEMÆRK: Når virussen er blevet dybdefiltreret, skal du fortsætte rensningsprocessen inden for 36 timer efter afslutning af dybdefiltrering.
    13. Frakobl dybdefilteret, og desinficér slangen ved at køre 100 ml 0,5 M NaOH, 400 PPM blegemiddel forudvarmet til 42 °C gennem systemet inden opbevaring i 0,5 M NaOH.
  2. Tangentiel flowfiltrering til koncentrationen af NDV
    1. Kassettens komponenter som vist i figur 3A (og som vist tidligere25) samles i et biologisk sikkerhedsskab.
      BEMÆRK: Manifolden og endepladen skal vaskes i vaskemiddel og tørres inden brug. Siliciumpakningerne kan genbruges og skal opbevares i 0,5 M NaOH med kassetten.
    2. Opsætning af TFF-systemet (Tangential Flow Filtration) (også kendt som cross-flow filtration) i en 'åben' konformation (figur 3B).
      1. Hvis du bruger en kassette for første gang, skal du samle TFF-kassetten i Elution-konformationen og skylle med 100 ml sterilt vand af molekylær kvalitet (figur 3C).
      2. Når der kun er 5 ml vand tilbage i reservoirtanken, skal du sætte pumpen på pause og ændre TFF-systemopsætningen til en lukket konformation (figur 3D).
      3. Tilsæt 100 ml 0,5 M NaOH, 400 PPM blegemiddel forvarmet til 42 ° C til reservoiret og cyklus gennem systemet i 30-60 min.
      4. Sæt flowet på pause, og sæt TFF-systemet tilbage i elueringsopsætningen, og genoptag flowet for at eluere rengøringsopløsningen.
      5. Når der er ca. 5 ml tilbage i reservoiret, skal pumpen sættes på pause og tilsættes 100 ml sterilt vand af molekylær kvalitet for at skylle systemet.
      6. Når der er ca. 5 ml tilbage i reservoiret, skal pumpen sættes på pause og placere TFF-systemet i den åbne konformation (figur 3B). Fortsæt med trin 2.2.3.
    3. Steriliser kassetten og slangen ved at føre 100 ml 0,5 M NaOH gennem systemet ved hjælp af den peristaltiske pumpe. Sørg for, at trykket ikke overstiger 30 psi for at opretholde kassetteintegriteten.
    4. Sæt pumpen på pause, når der er ca. 5 ml 0,5 M NaOH tilbage i reservoiret.
    5. Tilsæt 100 ml sterilt, molekylært vand til reservoiret og genoptag at føre væsken gennem kassetten. Hvirvl reservoiret for at vaske al NaOH fra reservoirets sider for at forhindre inaktivering af virus. Gentag reservoirvasktrinnet.
    6. Når der er ca. 5 ml sterilt vand af molekylær kvalitet tilbage i reservoiret, skal pumpen sættes på pause.
    7. Der tilsættes 100 ml PBS til reservoiret, hvirvlende for at sikre, at det sterile vand af molekylær kvalitet vaskes fra siderne. Genoptag væskestrømmen gennem kassetten.
    8. Når der er ca. 5 ml tilbage i reservoiret, skal pumpen sættes på pause, tilsættes dybdefiltreret allantoisk væske til reservoiret og genoptager pumpestrømmen.
    9. Overvåg trykmåler 1 (figur 3B) for at sikre, at den ikke overstiger 10 psi for at forhindre klipning af virussen. Brug en kombination af hastigheden på den peristaltiske pumpe og brug af C-klemmer for at øge elvitationen til affald.
      BEMÆRK: Kombination af hastigheden på den peristaltiske pumpe og C-klemmer vil resultere i øget tryk.
    10. Når der er 50-100 ml allantoisk væske tilbage i reservoiret, skal pumpen sættes på pause for at udføre en bufferudveksling ved at tilføje 150-200 ml 1x ML buffer.
    11. Genoptag pumpeflowet, og kontroller igen manometer 1 (figur 3B) for at sikre, at den ikke overstiger 10 psi.
    12. Når der er 5-10 ml tilbage i reservoiret, skal pumpen sættes på pause.
    13. Luk de to affaldsledninger ved hjælp af to C-klemmer som vist i figur 3C.
    14. Frakobl retentatledningen, der fodrer reservoiret, og indsæt den i et 50 ml konisk rør (figur 3C).
    15. Genoptag pumpens flow, pause, når der er et par dråber væske tilbage i reservoirtanken.
    16. Fjern C-klemmerne fra affaldsledningerne, og sæt den retentaerede fødeledning på reservoirtanken igen (figur 3B).
    17. Tilsæt 20-25 ml 1x ML buffer og genoptag pumpestrømmen, indtil der er ca. 5 ml tilbage i reservoirtanken.
    18. Trin 2.2.13 til 2.2.16 gentages.
      BEMÆRK: En 3. eluering kan udføres ved at gentage trin 2.2.17 og 2.2.13 til 2.2.16 for at øge virusudbyttet. Imidlertid er det meste af virussen til stede i de to første elutioner.
    19. Efter afslutning af elutionerne anbringes viruset på is eller ved 4 °C.
    20. For at rense linjerne skal du opsætte systemet, så det er et lukket kredsløbsformat (figur 3D) med affaldslinjerne, der føres tilbage i reservoiret som vist i figur 3D.
    21. Fortsæt med at rengøre systemet ved at tilføje 250 ml 0,5 M NaOH, 400 PPM blegemiddel forvarmet til 42 ° C.
    22. Flow rengøringsopløsningen gennem systemet natten over.
      BEMÆRK: Hvis pumpen køres med en hastighed på 50 ml/min, skal der observeres et tryk på ca. 5 psi, når rengøringsopløsningen recirkuleres. Hvis trykket overstiger dette, er kassetten snavset, og rengøringsopløsningen skal udskiftes, og processen gentages.
    23. Eluter rengøringsløsningen ved at lede både affaldslinjer og retentate-linjen i en affaldsbeholder.
    24. Tilsæt 400-500 ml sterilt vand til reservoiret og strømmer det gennem systemet og ind i affaldsbeholderne.
    25. Når der er ca. 5 ml tilbage i reservoiret, sættes pumpen på pause og tilsættes 100-200 ml 0,5 M NaOH til reservoirtanken, hvorved opløsningen hvirvles for at vaske reservoirbeholderen.
    26. Når beholderen er næsten tom, gentages trin 2.2.23 yderligere to gange.
    27. TFF-opsætningen adskilles, og TFF-kassetten og pakningerne opbevares i et lille volumen på 0,5 M NaOH i en genlukkelig plastpose ved 4 °C.
      BEMÆRK: Slanger kan opbevares ved stuetemperatur nedsænket i 0,5 M NaOH.
  3. Iodixanol densitetsgradient ultracentrifugering
    1. Tænd ultracentrifuge, og indstil den til forkøling til 4 °C. Forkøl også den ønskede rotor ved 4 °C (se materialetabellen).
      BEMÆRK: Rotorer skal opbevares ved 4 °C.
    2. 60% iodixanolopløsningen (koncentration på købstidspunktet) anvendes til at generere 40%, 20% og 10% iodixanolopløsninger ved fortynding med PBS og 3x ML Buffer til en 1x slutkoncentration af ML-buffer.
    3. I et 13,2 ml, åbent, tyndvægget ultracentrifugerør, overlay 0,5 ml, 2,5 ml og 2,5 ml af henholdsvis 40%, 20% og 10% iodixanolopløsningerne (figur 4A).
      BEMÆRK: Hvis du vipper ultracentrifugerøret på siden og langsomt uddriver opløsningen, reduceres risikoen for at blande de to gradientlag betydeligt. Adskillelsen af hvert lag skal være tydelig, med en "halo" synlig mellem hvert lag af gradienten.
    4. Brug en markeringspen til at markere grænsefladerne for de forskellige gradientlag.
    5. Lag 6-6,5 ml af den eluterede virus fra TFF-proceduren over densitetsgradienten. Virusset tilføjes omhyggeligt som beskrevet i trin 2.3.3 for at undgå at forstyrre tæthedsgradienten.
    6. Læg ultracentrifugerørene i indsatserne til den svingende skovlrotor (se materialetabellen) ved hjælp af en åben skala for at afbalancere indsatserne inden for 0,01 g fra hinanden. Brug PBS eller ekstra virus eluent til at tage højde for vægtforskellene.
    7. Når rørene er afbalanceret, skal du lukke rørene og lægge dem i rotoren.
    8. Centrifuger i 1,5 time ved 125.000 × g ved 4 °C.
      BEMÆRK: Dette kan udføres natten over, hvis en ultracentrifuge med forsinkelsesstartfunktion er tilgængelig.
    9. Efter ultracentrifugering fjernes rørene ved hjælp af et par sterile pincet. Se efter målbåndet - et stort bånd - mellem gradienterne 10% og 20% (figur 4B).
    10. Ophæng røret over toppen af et bægerglas ved hjælp af et retortstativ.
    11. Fastgør en 18 G x 1,5 tommer nål til en 5 ml sprøjte og punkter siden af ultracentrifugerøret.
      BEMÆRK: Røret skal punkteres lidt under målbåndet, med nålen i en opadgående vinkel og skrå op, så den bevæger sig ind i målbåndet.
    12. Forlæng langsomt stemplet for at fjerne målbåndet.
      BEMÆRK: Flyt nålen rundt inden for målbåndet for at maksimere den ekstraherede virus. Pas på, at andre bånd eller snavs ikke blandes med målbåndet, og undgå at tage overskydende opløsning, da dette vil føre til brug af flere dialysekassetter.
    13. Når målbåndet er ekstraheret, fjernes nålen, og den resterende opløsning tømmes ud i affaldsbægeret. Fordel målbåndet i et 50 ml konisk rør, indtil alle bånd fra alle andre ultracentrifugerør er ekstraheret.
    14. Trin 2.3.10-2.3.13 gentages, indtil alle målbåndene er ekstraheret fra alle ultracentrifugerørene.
    15. Alternativ fremgangsmåde til udtrækning af målintervallerne som beskrevet i trin 2.3.10 til 2.3.13
      1. Fjern langsomt væsken, der ligger over målbåndet, ved hjælp af en pipette. En gang ved målbåndet ekstraheres ved hjælp af en pipette og opbevares virussen i et 50 ml konisk rør.
        BEMÆRK: Dette gør det muligt at genbruge ultracentrifugerørene.
  4. Fjernelse af iodixanol fra virusopløsning
    BEMÆRK: Det NDV-holdige bånd vises ved en iodixanoltæthed mellem 15% og 16%. Koncentrationen af iodixanol i opløsningen kan bestemmes ved at måle absorbansen ved 340 nm i forhold til en standardkurve (supplerende figur S1). Dette trin kan udelades, da der ikke blev observeret bivirkninger eller akut toksicitet, når iodixanolopløsninger af denne koncentration blev administreret til C57BL/6-mus.
    1. Prewet en 0,5-3 ml 10 kDa molekylvægt cut-off dialysekassette ved at nedsænke den i PBS i 1 min.
      BEMÆRK: Dialysemembranen skal skifte fra glat til at have et ruffled eller ujævnt udseende. Hvis volumenet af ekstraheret virus overstiger 10 ml, skal der anvendes to 0,5-3 ml dialysekassetter eller en 5-12 ml dialysekassette.
    2. Brug enten en 5 eller 10 ml sprøjte og en 18 G x 1,5 tommer stumpfyldningsnål til at opsamle virussen fra det 50 ml koniske rør.
    3. Brug sprøjten til at komme ind i dialysekassetten, pas på ikke at gennembore membranen og injicere virussen.
      BEMÆRK: Dialysekassetten kan drejes for at manipulere placeringen af luftlommen i kassetten. Luftlommen skal fjernes, inden nålen tages ud af kassetten.
    4. Fyld et 1 L bægerglas med steril 1x PBS, anbring en rørestang og dialysekassetten indeni og dæk. Der inkuberes ved 4 °C under forsigtig omrøring.
      BEMÆRK: Brug ekstruderet polystyrenskum og et elastikbånd til at fastgøre dialysekassetten, så den flyder i PBS. Kassetten kan svulme lidt på grund af ML-bufferen.
    5. Efter 1-2 timer udskiftes med frisk 1x PBS og fortsættes med at inkubere ved 4 °C i yderligere 8-10 timer under let omrøring.
      BEMÆRK: Dette kan også gøres natten over.
    6. Udskift med frisk 1x PBS igen, og inkuber ved stuetemperatur i 1-2 timer.
  5. Koncentration af virusopløsning
    1. Fjern dialysekassetten fra dialysebufferen (figur 4C), og læg den i en lille, forseglet plastpose. Tilsæt 15-25 ml 40% 20.000 MW polyethylenglycol, så dialysekassetten er helt nedsænket.
    2. Inkuberes ved stuetemperatur med rocking. Kontroller mængden af virus i kassetten med jævne mellemrum ved hjælp af en 5 eller 10 ml sprøjte og en 18 G x 1,5 tommer stumpfyldningsnål.
      BEMÆRK: Den tid, der kræves for at koncentrere virussen, varierer afhængigt af startvolumen og ønsket slutvolumen. Typisk er det endelige ønskede volumen mellem 1 og 1,5 ml uanset startvolumenet af allantoisk væske. Når du kontrollerer lydstyrken, skal du være forsigtig med ikke at bruge den samme port, da dette vil kompromittere portens integritet og kan resultere i blanding af polyethylenglycolopløsningen og virussen.
    3. Før du fjerner den koncentrerede virus fra dialysekassetten, skal du skylle kassetten kort i 1x PBS og fylde en 18 G x 1,5 tommer stumpfyldningsnål med luft.
    4. Sæt den luftfyldte sprøjte i dialysekassetten, og tryk stemplet ned. Drej apparatet, så den koncentrerede virus kan fjernes uden at fjerne noget af den indførte luft.
    5. Dispenser den koncentrerede virus i et 50 ml konisk rør, idet det dispenserede volumen noteres.
    6. Ved hjælp af samme sprøjte og nål injiceres en passende mængde 60% saccharose i dialysekassetten, således at den, når den kombineres med den tidligere fjernede virus, har en slutkoncentration på 5% saccharose.
    7. Brug behandskede fingre til at massere membranen for at løsne resterende virus, der kan have klæbet til membranen, og pas på ikke at beskadige den. Fjern noget af den overskydende luft i dialysekassetten for at lette frigørelsesprocessen.
    8. Kombiner denne vask med virussen allerede i det 50 ml koniske rør.
      BEMÆRK: Virusset er nu i 5% saccharose og klar til at blive dispenseret i 20 μL, 50 μL, 100 μL eller 200 μL alikvoter og opbevaret ved -80 °C. Alternativt kan NDV til langtidsopbevaring frysetørres og opbevares ved 4 °C som beskrevet i punkt 2.6.
  6. Lyofilisering af NDV
    1. Lyofiliser viruset aliquoted i 1,5 ml centrifugerør eller 15 ml koniske rør ved 44 × 10-3 MBAR og -52 ° C i 16 timer.
    2. De frysetørrede prøver opbevares ved 4 °C uden signifikant reduktion i viral titer.

3. Kvalitetskontrol assays

  1. Viral RNA-isolering og omvendt transkription PCR til genombekræftelse
    1. Optø en 20 μL virus aliquot. Følg den virale RNA-isolationsprotokol, der følger med sættet.
    2. Brug straks det isolerede RNA som en skabelon til omvendt transkription PCR (RT-PCR) eller opbevar det ved -80 ° C.
    3. Forbered de omvendte transkriptionsreaktioner som beskrevet i protokollen fra producenten.
    4. Brug den resulterende cDNA som en skabelon til forskellige kvalitetskontrol-PCR-reaktioner for at bekræfte NDV-patotypen (tabel 1, F-proteinprimersæt) og tilstedeværelsen af krævede genkontrolelementer (tabel 1, Transgene primersæt).
      BEMÆRK: Primere skal designes baseret på stammen af NDV, der formeres.
      1. For at sekvensere F-proteinudspaltningsstedet, den vigtigste determinant for patotype, skal du bruge F-proteinprimersættet (tabel 1). Kig efter et PCR-produkt på 435 basepar i længden.
        BEMÆRK: Her blev primere designet baseret på LaSota-stammen af NDV (Genbank-tiltrædelse AF077761.1). Det er veletableret, at optimal transgenekspression opstår, når et fremmed transgen indsættes mellem P- og M-generne24.
      2. Brug transgene primersættet til at bekræfte integriteten af genstart og genendeelementer i transgenet. Sekvenser PCR-produktet for at bekræfte genstart og genslutsekvensintegritet.
    5. Send PCR-produkterne til DNA-sekventering, og sammenlign dem med skabelonen til homologi.
  2. SDS PAGE og Coomassie farvning til påvisning af forurenende proteiner
    1. Støbt en densitetsgradient SDS PAGE gel ved først at fremstille 6% og 15% polyacrylamidopløsninger (supplerende tabel S1). Brug en 10 ml pipette til at udtage 5 ml af 15% opløsningen efterfulgt af 5 ml af 6% opløsningen.
    2. Fjern pipetten fra opløsningen, og generer en luftboble ved kortvarigt at trække luft op.
      BEMÆRK: Når luftboblen bevæger sig opad, blander dette løsningen for at oprette SDS PAGE-gradienten.
    3. Hæld opløsningen i støbeapparatet og lad det størkne i 30 minutter.
    4. I et slutvolumen på 20 μL kombineres en alikvote virus med 4xreducerende buffer (supplerende tabel S1), således at slutkoncentrationen er 1x, og der koges i 10 minutter ved 95 °C i en termocycler. Indlæs mindst 1 × 107 PFU af virussen.
    5. Nedsænk SDS-SIDEN i kørende buffer (supplerende tabel S1), og indlæs prøverne.
    6. Kør gelen ved 120 V i 1-1,5 timer.
    7. Fjern gelen fra løbebufferen, og overfør den til en mindre beholder.
    8. Tilsæt Coomassie-farvningsopløsning (supplerende tabel S1) for at dække gelen. Inkuberes ved stuetemperatur i 4-5 timer.
    9. Fjern farvningsopløsningen og tilsæt destainopløsning (Supplerende tabel S1), der inkuberes i 4-8 timer ved stuetemperatur med omrøring. Skift destain-opløsningen tre til fire gange.
      BEMÆRK: Gelen skal være klar, og dens farve skal være som den var før farvning.
    10. Afbild gelen på en kolorimetrisk indstilling. Se figur 5 for et repræsentativt billede af en Coomassie-farvet SDS PAGE-gel indeholdende prøver fra allantoisk væske og renset virus.
  3. Kvantificering af infektiøs viral titer ved median vævskultur infektiøs dosis (TCID50) og immunofluorescensassay
    BEMÆRK: Vero-celler kan bruges som et alternativ til DF1-celler; den cytopatiske virkning (CPE) er dog mindre udtalt i Vero-celler. NDV, der huser L289A-mutationen, som forbedrer fusogeniciteten, og udtrykker GFP mellem P - og M-generne , bruges i dette assay.
    1. Frø en 96-brøndplade med DF1-celler ved 20.000 celler / brønd i et volumen på 80 μL dagen før brug af DMEM suppleret med 2% føtalt bovint serum (FBS) og 125 μg / ml trypsin. Cellerne inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2.
    2. Den næste dag optø en 20 μL aliquot virus på is.
    3. Brug 1,5 ml rør til fremstilling af serielle fortyndinger. Begynd med at fortynde 10 μL af virussen med 990 μL PBS for at forberede en 10-2 fortynding. Alle andre fortyndinger, op til mindst 10-10 , fremstilles med 900 μL PBS og tilsætning af 100 μL af den foregående fortynding.
      BEMÆRK: Brug en ny pipettespids, når du bevæger dig mellem fortyndinger.
    4. Der anvendes 20 μL af hver fortynding til at inficere hver brønd i pladen med 96 brønde som vist i figur 6.
      BEMÆRK: Det endelige volumen i hver brønd vil være 100 μL.
    5. Pladen inkuberes i mindst 48 timer ved 37 °C og 5 % CO2, før der undersøges for tilstedeværelse af CPE/GFP eller foretages et indirekte immunfluorescensassay (IFA).
      BEMÆRK: Under disse kulturforhold er CPE tydelig efter 10 timer (figur 7A-D) og stiger i løbet af de næste 24 timer (figur 7E-H). Pladen kan inkuberes længere for at forbedre intensiteten af CPE, hvis den scores af GFP eller CPE.
      1. Hvis du scorer af CPE eller GFP og IKKE udfører IFA, skal du gå til trin 3.3.18.1.
    6. Hvis du udfører IFA, skylles cellerne to gange med 100 μL 1x PBS.
    7. Der tilsættes 100 μL 4% paraformaldehyd fortyndet i PBS til hver brønd og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
    8. Cellerne vaskes 3x 5 min hver med 100 μL 1x PBS, 0,1% Tween 20 (0,1% PBS-T).
    9. Permeabiliser cellerne ved tilsætning af 100 μL 0,1% NP-40 i PBS og inkuber dem ved stuetemperatur i 10 min .
    10. Cellerne vaskes 3x 5 min med 100 μL 0,1% PBS-T.
    11. Der tilsættes 100 μL blokerende buffer bestående af 5 % (V/V) normalt gedeserum fortyndet i 0,1 % PBS-T i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C.
    12. Der tilsættes 100 μL pr. brønd af anti-NDV ribonukleoproteinantistof fortyndet i 0,1 % PBS-T til 1 μg/ml, idet der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C.
    13. Cellerne vaskes 3x i 5 minutter i 100 μL 0,1% PBS-T.
    14. Tilsæt 100 μL af et AlexaFluor 488 Goat antimus sekundært antistof fortyndet i 0,1% PBS-T til 2 μg / ml. Inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
    15. Cellerne vaskes 3x i 5 minutter i 100 μL 0,1% PBS-T.
    16. Efter den sidste vask efterlades cellerne i 100 μL 0,1% PBS-T.
    17. Forestil dig brøndene ved hjælp af et omvendt fluorescerende mikroskop.
    18. Når du udfører IFA, skal du kigge efter fluorescens, der er større end den, der ses i de negative kontrolbrønde, hvilket indikerer, at brønden er positiv for NDV som vist i figur 8.
      1. Se efter tilstedeværelsen af syncytia og store, afrundede celler, der karakteriserer NDV CPE. Hvis scoringsbrønde inficeret med en virus, der udtrykker GFP, skal du kigge efter tilstedeværelsen af GFP.
    19. Indtast de relevante oplysninger i Spearman-Karber-titerberegneren26 for at bestemme virusets PFU / ml (tabel 2). Se figur 6 for et eksempel på TCID50-titerplade .
  4. Kvantificering af viral titer ved kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR)
    BEMÆRK: Et et-trins qRT-PCR-sæt anbefales for at spare tid og reducere manipulationen af prøverne. Et sondebaseret assay bruges til at øge detektionsspecificiteten for virussekvenser.
    1. Opret en standardkurve for en kendt mængde af virussekvenserne (supplerende figur S2A,B).
      BEMÆRK: Dette kan gøres ved at købe et syntetisk 500 bp dobbeltstrenget DNA-fragment af NDV L-genet. Sekvensen for et 500 bp fragment af NDV L genet kan ses i supplerende figur S2C.
    2. Konverter mængden af virus-DNA-fragmentet (normalt leveret som nanogram eller femtomoler af producenter) til antallet af molekyler eller kopier af DNA-fragment ved hjælp af Avogadros nummer og molene til molekyler formel (Eq (1)).
      Equation 1 (1)
    3. Standardkurveprøverne forberedes ved at fremstille en tifoldig fortyndingsserie af kendte virus-DNA-fragmentkopier fra 1,00 ×10 10 kopier ned til 1,00 ×10 0 kopier.
    4. For at bestemme mængden af NDV RNA i ukendte prøver skal du ekstrahere NDV RNA ved hjælp af et RNA-ekstraktionssæt. Følg den protokol, der følger med sættet. Når RNA'et er ekstraheret, skal du fortsætte med den anbefalede protokol, der leveres i et-trins qRT-PCR-kit.
    5. Kør reaktionerne i et realtids PCR-instrument med følgende temperatur- og cyklusforhold: 1) en cyklus med omvendt transkription ved 55 ° C i 10 minutter; 2) en cyklus med indledende denaturering ved 95 °C i 1 min. og 3) 40 cyklusser med denaturering (95 °C i 10 s), forlængelse (60 °C i 30 s) og fluorescerende signaloptagelse.
    6. Når qRT-PCR-analysen er afsluttet, skal du generere standardkurven baseret på standardkurveprøverne ved hjælp af PCR-instrumentsoftwaren i realtid (supplerende figur S2A, B).
      BEMÆRK: Softwaren beregner også mængden af NDV RNA i ukendte prøver baseret på standardkurven.
  5. Sikkerhedstest for akut toksicitet hos mus
    1. 1 × 108 PFU virus intravenøst via halevenen injiceres i tre 8 uger gamle BALB/C-mus for at vurdere akut toksicitet.
    2. Overvåg musene for bivirkninger såsom vægttab (>20%), bøjet kropsholdning, flæset pels, sløvhed og ændringer i åndedrættet. Vurder tre til fire gange dagligt i løbet af de første 48 timer. Da mus skal begynde at komme sig efter 48 timer, skal du overvåge dem en til to gange dagligt, indtil de er helt genoprettet.
      1. Administrer saltvand subkutant og understøttende behandling efter behov. For eksempel supplere med genopretning kost gel, jordnøddesmør, eller brug varme pucks. Afliv mus, der har nået endepunktskriterier, som beskrevet i dyrepleje institutionelle retningslinjer, ved isofluran overdosis efterfulgt af cervikal dislokation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Høstning af allantoisk væske
Da allantoisk væske høstes fra embryonerede kyllingæg, skal det fremstå klart og gennemsigtigt. Hvis væsken forekommer uigennemsigtig og gul, indikerer dette tilstedeværelsen af forurenende stoffer. Inkludering af denne allantoiske væske under rensning vil hindre rensningsprocessen, da trykket hurtigt vil stige og overstige 10 psi, hvilket resulterer i klipning af virussen og tab af infektiøs virus. Allantoisk væske, der ser blodig ud, tyder på, at æggene blev podet med for mange PFU af virus. Udbyttet fra dette parti æg vil være betydeligt lavere end forventet, og det er usandsynligt, at denne virus vil kunne anvendes in vivo. Æg podet med lentogen NDV skal stadig have vaskulatur tydelig efter 72 timer, og embryonerne bør ikke være døde, som visualiseret i figur 1. Hvis de har, tyder det på, at embryoet er blevet beskadiget eller forurenet på en eller anden måde.

Iodixanol densitetsgradient ultracentrifugering
Efter ultracentrifugering skal et højt titer, hvidt, NDV-holdigt bånd placeres mellem 10% og 20% gradienterne (figur 4B).

Coomassie plet af SDS-PAGE geler
Figur 5 viser forskellen mellem en urenset (bane 2) og renset virusbestand (bane 3). En sammenligning af de to viser et signifikant fald i intensiteten af forurenende proteinbånd og fremkomsten af dominerende NDV-bånd i den rensede virusbestand.

Kvantificering af viral titer ved TCID50
Hvis du bruger de anbefalede betingelser ved titring af en koncentreret bestand af NDV, skal CPE være tydelig efter 24 timer (figur 6). I sammenligning med en lentogen stamme NDV af lignende titer er CPE mere udtalt i den mesogene stamme på samme tidspunkt.

Analyse af akut toksicitet hos 8 uger gamle BALB/C-mus
Når 1 × 108 PFU blev administreret intravenøst, bør mus overvåges for bivirkninger såsom vægttab >20%, flæset pels, bøjet kropsholdning og unormal respiration. Inden for de første 24-36 timer vil mus begynde at tabe sig og sandsynligvis udvikle ruffede frakker og en bøjet kropsholdning. Men hvis virussen er tilstrækkelig ren, begynder mus at komme sig, som observeret ved vægtøgning og forbedring af kropsholdning og pelstilstand efter 36 timer. Mus, der ikke viser disse tegn på bedring efter 36 timer, bør fortsat overvåges nøje for endepunktskriterier. Dette er typisk sket på grund af unøjagtig tittering, potentielt på grund af aggregering af viruspartikler.

Figure 1
Figur 1: Infektion og høst af NDV fra specificerede patogenfrie embryonerede kyllingæg. (A) Weblignende vaskulatur (pile), der skal være tydelige efter 9 dages inkubation ud over embryobevægelse. 'X' betegner grænsefladen mellem chorioallantoic membranen og lufthulrummet, og hvor hullet skal oprettes til podning af ægget. (B) Billede, der viser et dødt embryo. Bemærk fraværet af weblignende vaskulatur. En mangel på embryobevægelse vil også blive observeret. (C) Diagram over komponenterne i et embryoneret kyllingæg, der viser placeringen af lufthulen, æggeblommen, fostervandet, chorioallantoisk membran og allantoisk væske. (D) Fjernelse af skallen for at udsætte choriallantoic membranen. (E) Illustrerer, hvordan allantoisk væske og embryo skal se ud efter åbningen af chorioallantoic membranen. Forkortelse: NDV = Newcastle disease virus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Skematisk oversigt over den generelle samling af det apparat, der anvendes til dybdefiltrering. Sørg for, at manometeret er installeret opstrøms for dybdefilteret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Opsætning af tangentiel flowfiltrering i dens forskellige konfigurationer. Pile viser retningen af væskestrømmen. (A) Illustration af, hvordan TFF-kassetten er samlet. (B) Skematisk af TFF-systemet i dets "åbne" konfiguration, der anvendes under rensning og koncentration af væske. (C) Skematisk over TFF-opsætningen, når der elueres væske fra systemet, som anvendt under eluering af virus og rengøringsopløsning. (D) Skematisk over TFF-systemet i dets "lukkede" konfiguration, som bruges under rengøring af TFF-systemet. Forkortelse: TFF = Filtrering af tangentiel strømning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Densitetsgradient ultracentrifugering og dialyse af koncentreret virus fra TFF. (A) Skematisk viser sammensætningen af iodixanoldensitetsgradienten. B) Virusbåndsmønster efter ultracentrifugering af virus produceret ved hjælp af ML-buffer under rensningsprocessen. Det vigtigste virusholdige bånd er betegnet med en sort oval. (C) Typisk størrelse af en dialysekassette fyldt med 10 ml virus fremstillet gennem en iodixanolgradient ved afslutningen af dialyseproceduren. Forkortelse: TFF = Filtrering af tangentiel strømning; ML = Mannitol-lysin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Coomassie-farvet SDS-PAGE gel. Gel sammenligner tilstedeværelsen af forurenende proteiner mellem urensede (bane 2) og oprensede (bane 3) mesogene NDV-lagre, når 1 × 105 PFU blev belastet. Bane 1 og 4 = molekylvægtsstige (MW). NDV HN, F0 og dens underenheder efter spaltning, F1 og F2, sammen med deres respektive molekylvægte27 er vist med hvid skrifttype. Forkortelser: SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese; NDV = Newcastle disease virus; PFU = plakdannende enheder; HN = hæmagglutinin; F0 = Fusion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Eksempel på et pladelayout med 96 brønde, der bruges til at bestemme virustitre ved TCID50. Pladen er opdelt i 12 kolonner, hvor hver kolonne repræsenterer en anden seriel fortynding. Positive brønde (som bestemt af enten CPE, transgenekspression eller IFA) er angivet med gråt. I betragtning af antallet af positive huller i dette eksempel er den forventede titer efter brug af Spearman-Karber-titerberegneren (tabel 2) angivet i både TCID50/ml og PFU/ml. Forkortelser: TCID50 = median vævskultur infektiøs dosis; CPE = cytopatisk virkning; IFA = immunfluorescensassay; PFU = plakdannende enheder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Sammenligning af CPE efter infektion af DF1-celler med lentogen eller mesogen NDV. En MOI på 0,5 blev anvendt efter 10 timers inkubation (A-D) eller 24 timers inkubation (E-H) under forskellige dyrkningsbetingelser af DMEM + 15% FBS, DMEM + 15% FBS + 5% allantoisk væske eller DMEM + 2% FBS + 125 μg / ml trypsin. Skalastænger = 200 μm. Forkortelser: CPE = cytopatisk virkning; NDV = Newcastle disease virus; MOI = mangfoldighed af infektion; FBS = føtalt bovint serum; DMEM = Dulbecco's Modificerede Eagle's medium. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Et eksempel på en situation, hvor IFA er nødvendig for at titere en lentogen NDV, der mangler et GFP-transgen. Veroceller blev dyrket i DMEM indeholdende 2% FBS og 125 μg/ml trypsin. Billeder blev taget fra 10-7 seriel fortynding. (A) Brightfield billede af inficerede celler. (B) Illustrerer det typiske udseende af farvede celler, når IFA anvendes til påvisning af virus. (C) Et flettet billede af (A) og (B). Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: IFA = immunofluorescensassay; NDV = Newcastle disease virus; GFP = grønt fluorescerende protein; FBS = føtalt bovint serum; DMEM = Dulbecco's Modificerede Eagle's medium. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: PCR- og RT-qPCR-primere til påvisning af gensegmenter for Newcastle disease-virus. Primersæt, der anvendes til specifik forstærkning af to regioner i NDV-genomet. F-proteinprimersæt resulterer i forstærkning af en region af F-proteinet, der spænder over F-proteinets spaltningssted. Transgene primer sæt forstærker den intergene region mellem phosphoprotein og matrix gener, det optimale transgene indsættelsessted. Denne tabel indeholder også primersekvenserne, der er målrettet mod det virale L-gen21 og L-gensonden, der anvendes i qRT-PCR-analysen. Forkortelser: PCR = polymerasekædereaktion; RT-qPCR = omvendt transkription kvantitativ PCR; NDV = Newcastle disease virus. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Spearmann-Karber titer lommeregner. Dette interaktive regneark indeholder den relevante arbejdsgang og ligninger til bestemmelse af viruskoncentration ved hjælp af TCID50-resultater baseret på brøndinokulum i ml, fortyndingsskema og antallet af replikater pr. Fortynding. Koncentration rapporteres som volumen i ml, der kræves for at inficere 50% af vævskulturen (TCID50) og plakdannende enheder pr. ml virussuspension. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende figur S1: Bestemmelse af iodixanolkoncentrationer. (A) Standardkurve genereret fra absorbansen af opløsninger med kendt iodixanolkoncentration ved 340 nm. (B) Standardkurven og ligningen fra (A) blev anvendt til at bestemme koncentrationen af iodixanol i opløsning efter densitetsgradient ultracentrifugering, dialyse og polyethylenglycolkoncentration. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Amplifikation og standardkurve genereret fra qRT-PCR-assay af syntetisk 500 bp dobbeltstrenget DNA-fragment af NDV L-genet. Amplifikationen (A) og standardkurven (B) blev skabt af prøver indeholdende tifold seriel fortynding (1,0 × 109 kopier til 1,0 × 100 kopier) af DNA-fragmentet. For forstærknings- og standardkurven var prøverne indeholdende 1,0 × 101 kopier og 1,0 × 100 eksemplarer under tærskelværdien og gav ikke en krydsningsværdi under 35 Cp. Den endelige standardkurve blev genereret baseret på prøver indeholdende 1,0 × 109 kopier til 1,0 × 102 kopier af DNA-fragmentet. C) DNA-sekvensen af 500 nukleotid NDV L-genfragmentet, der anvendes til at generere standardkurven i qRT-PCR-protokollen. Forkortelser: PCR = polymerasekædereaktion; RT-qPCR = omvendt transkription kvantitativ PCR; NDV = Newcastle disease virus; Cp = krydsningspunkt. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S3: Indlæsning og ekstraktion af NDV fra dialysekassetten. (A) Den typiske størrelse af en dialysekassette efter at være blevet fyldt med ca. 10 ml virusholdig opløsning isoleret fra en saccharosedensitetsgradient og afbildet ved afslutningen af dialysetrinnet. (B) Et eksempel på de opnåede resultater ved anvendelse af ultracentrifugering af iodixanoldensitetsgradient uden ML-buffertilskud. Omringet er målvirusbåndet til fjernelse. Angivet med pilene er et ekstra bånd, der kan indeholde beskadigede virioner. Bemærk, at efter inkorporering af ML-buffer i rensningsprocessen er dette bånd ikke længere tydeligt. Forkortelser: NDV = Newcastle disease virus; ML = mannitol-lysin. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S1: Indeholder de trin, der kræves til generering af western blot-opløsninger og ML-buffer, der anvendes under rensningsprocessen. Forkortelser: SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese; TEMED = tetramethylethylendiamin; ML = Mannitol-lysin. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Virus, der anvendes som terapeutiske midler i prækliniske undersøgelser, skal være stærkt oprenset for at undgå toksicitet, når de indgives in vivo15. Hvis utilsigtede midler eller forurenende stoffer ikke fjernes, kan dette føre til alvorlige bivirkninger, der negerer den terapeutiske virkning af det virale middel28. Da NDV produceres i embryonerede kyllingæg, er der flere forurenende ægproteiner, såsom ovalbumin, der skal fjernes inden dets anvendelse in vivo i prækliniske eller kliniske modeller29. Selv efter intensiv rensning findes ovalbumin stadig29. Fjernelsen af disse forurenende proteiner er en streng proces, der kræver betydelig tid og ressourcer15,22. Hvis NDV kunne produceres i et cellebaseret system ved tilstrækkeligt høje titere, der kræves til in vivo-applikationer, kan dette forenkle rensningsprocessen og forbedre oversættelsen af NDV til kliniske indstillinger. Ægbaseret produktion af onkolytisk NDV er imidlertid blevet anvendt i adskillige humane kliniske forsøg30.

På hvert trin i rensningsprocessen kan prøver stribes på blodagarplader som en yderligere kvalitetskontrolforanstaltning for at sikre fraværet af bakteriel forurening.

Trykket under dybdefiltrering bør ikke opbygges hurtigt. Dette er et tegn på proteinforurening og vil betydeligt bremse rensningsprocessen og kræve brug af yderligere dybdefiltre. Dybdefiltrering bør ikke afsluttes hurtigt; dette trin tager typisk 1-1,5 timer. Normalt resulterer hurtig afslutning af dybdefiltreringstrinnet i en lavere viral titer.

Da virussen er koncentreret, skal en "overskyet strøm" komme ind i reservoiret fra retentatatlinjen. Dette tyder på, at der er virus i den allantoiske væske, der koncentreres, når den passerer gennem kassetten.

Under både dybdefiltrering og tangentiel flowfiltreringstrin bør trykket aldrig overstige 10 psi. Overskridelse af dette tryk vil skære virussen. Tilsætningen af ML-buffer til allantoisk væske fungerer som et stabiliserende middel og antages at forhindre viral aggregering, hvilket resulterer i øget genopretning af infektiøs virus uden at gå på kompromis med filtrerbarheden.

Ovenstående metode skitserer en passende procedure til fremstilling af både lentogeniske og mesogene stammer af NDV under BSL-2-betingelser, da mesogen NDV ikke er et udvalgt middel i Canada. Dette resulterer i generering af højtitere, der er egnede til brug i dyremodeller. I lighed med andre protokoller i litteraturen, der anvender rensningsmetoder med størrelsesekskludering, såsom dybdefiltrering og TFF, begrænser disse metoder brugen af hårdere ultracentrifugeringsteknikker, hvor virusgenvinding reduceres sammenlignet med rensningsmetoder med størrelsesekskludering15.

Brugen af TFF giver et element af skalerbarhed, da TFF kan bruges til at koncentrere store startvolumener i modsætning til ultracentrifugeringsteknikker. Eksisterende NDV-rensningsteknikker forbedres i ovenstående protokol gennem substitution af saccharose til iodixanol i ultracentrifugeringstrinnet, hvilket i høj grad reducerer chancen for at miste virus på grund af kassettebrud i slutningen af dialysetrinnet og tilsætning af ML-buffer, hvilket forbedrer filtreringen og øger udbyttet.

Anvendelsen af iodixanolgradienter foretrækkes frem for saccharosegradienter, da iodixanol er mindre tyktflydende og ikke-giftig for celler og giver et "renere" slutprodukt31,32. Iodixanol reducerede signifikant niveauerne af proinflammatoriske cytokiner og kemokiner til stede efter densitetsgradient ultracentrifugering af renset virus33. Så vidt vi ved, er det første gang iodixanol er blevet brugt til rensning af NDV. Koncentrationen af iodixanol i en opløsning kan bestemmes ved at kvantificere absorbansen ved 340 nm med henvisning til en standardkurve. Denne egenskab blev brugt til at bestemme, at NDV-bånd ved ca. 15% iodixanol og for at bekræfte, at det kan fjernes ved dialyse (supplerende figur S1B). Iodixanol blev oprindeligt udviklet som et kontrastbilleddannelsesmiddel, og vi observerede ingen bivirkninger, når en 15% iodixanolopløsning blev administreret intravenøst og intranasalt til C57BL/6-mus. Dette tyder på, at dialyse til fjernelse af iodixanol muligvis ikke er påkrævet, hvilket forkorter rensningsprocessen med ca. 16 timer. Derudover er saccharose hygroskopisk, hvilket får dialysekassetten til at svulme betydeligt, hvilket begrænser det volumen, der kan injiceres, og øger risikoen for kassettebrud og tab af virus34,35. Når lige store mængder iodixanol- og saccharose-præparativvirus blev injiceret i dialysekassetter, forekom der signifikant mindre hævelse i den iodixanol-fremstillede virus (sammenlign figur 4C og supplerende figur S3A). Saccharose er imidlertid et mere egnet stabiliseringsmiddel til NDV end iodixanol. Dette førte til tilskud af iodixanolgradienten med ML-buffer. Før tilsætning af ML-buffer til rensningsprocessen var der et mere intenst bånd i 10% iodixanolgradienten observeret ud over målbåndet ved 15% (supplerende figur S3B). Dette bånd indeholder sandsynligvis beskadigede eller ufuldstændige virioner, der genereres under rensningsprocessen. Tilsætning af ML-buffer giver mulighed for bedre filtrering af NDV, samtidig med at den hygroskopiske karakter af densitetsgradientmediet minimeres, hvilket reducerer risikoen for brud på dialysekassetten. Hævelsen af dialysekassetten kan reduceres yderligere ved dialysering i 1x PBS suppleret med 5% saccharose, da det i sidste ende er det, virussen vil blive opbevaret i.

Da NDV er en negativ sans, giver enkeltstrenget RNA-virus, isolering af RNA og generering af cDNA ved hjælp af tilfældige primere og specifikke primersæt til PCR mulighed for sekventering af forskellige regioner i genomet fra en cDNA-reaktion (tabel 1). Dette er vigtigt, da det gør det muligt at bekræfte patotypen og integriteten af transgenet og dets transkriptionelle regulatoriske elementer. Spaltningsstedet for det lentogene NDV F-protein bør være monobasisk snarere end polybasisk, da NDV, der besidder polybasiske spaltningssteder, typisk er mesogene eller velogene patotyper og klassificeret som udvalgte midler36,37. Denne protokol beskriver også en pålidelig RT-qPCR-metode til kvantificering af NDV-genomer med høj kapacitet. Før det anvendes i dyremodeller og efter afslutningen af de andre kvalitetskontrolassays, bør akut toksicitet vurderes hos 8 uger gamle BALB/C-mus. Denne stamme er karakteriseret som værende mere følsom over for virusinducerede toksiciteter end andre stammer af mus15. Derudover vil dette give en vis indikation af nøjagtigheden af virustitren. For eksempel vil vægttab blive observeret, men vægten skal begynde at stige efter 36-48 timer. Hvis dette ikke er tilfældet, er det muligt, at virustitreren er højere end oprindeligt rapporteret, hvilket kan skyldes aggregering af virale partikler. Dette indledende resultat efter rensningen af en rekombinant NDV førte til inkorporering af ML-bufferen gennem hele rensningsprocessen. Denne buffer er blevet foreslået for at forbedre filtrerbarheden og genopretningen af virussen under rensningsprocesserne38.

Ved kvantificering af koncentrationen af infektiøs virus med TCID50 kan det være nødvendigt at anvende IFA for at visualisere NDV-infektion, især ved højere fortyndinger, hvor CPE muligvis ikke er indlysende, eller hvis virussen ikke udtrykker et fluorescerende reportergen (figur 8). Det primære antistof, der anvendes til IFA, er specifikt for ribonukleoproteinet af NDV, et proteinkompleks, der associeres med RNA-genomet under genomreplikation. Da NDV er en fuglevirus, er kyllingeembryo fibroblastcellelinjen, DF1, en optimal cellelinje til vurdering af virustitre. Typisk anvendes virusneg allantoisk væske som et middel til at tilvejebringe de trypsinlignende proteaser, der kræves af lentogene NDV'er til F-protein spaltning39. Brug af virusnegativ allantoisk væske kan undgås ved at supplere med 125 μg/ml trypsin, samtidig med at FBS-koncentrationen reduceres til 2 %. Dette giver et simpelt, omkostningseffektivt alternativ til virusneg allantoisk væske, mens det stadig giver de nødvendige trypsinlignende proteaser. Når man sammenligner disse to kulturbetingelser ved en MOI på 0,5 over en 24 timers tidsperiode, ser der ud til at være ringe forskel mellem de to, hvor mediet suppleret med trypsin potentielt resulterer i mere CPE (figur 7). Andre cellelinjer såsom Vero-celler kan anvendes med de samme kulturbetingelser; CPE er dog mindre udtalt. Ved hjælp af ovenstående protokol med DF1-celler skal NDV CPE være tydelig inden for 24 timer. Specifikt skal man se dannelsen af syncytia med 24 timer (figur 7E-H). Ved hjælp af den beskrevne rensningsprocedure rensede vi konsekvent NDV til titere fra 1 × 109-3 × 1010 PFU / ml fra et startvolumen på 0,8-1,0 L allantoisk væske.

Samlet set forbedrer den beskrevne protokol tidligere offentliggjorte NDV-rensningsprocedurer ved at anvende iodixanol som et densitetsgradientmedium i stedet for saccharose og ved tilsætning af ML-buffer for at forbedre filtreringen. Derudover beskriver vi en komplementær metode til titrering af NDV, inkluderer en detaljeret RT-qPCR-metode til bestemmelse af NDV-kopinummer og definerer optimale betingelser for anvendelse af trypsin i stedet for allantoisk væske under virustitrering. Selvom denne proces genererer NDV-lagre med høj titer, der kan administreres systemisk ved høje doser, involverer denne procedure flere trin, hvilket kan øge variationen blandt brugerne og introducere potentialet for forurening. En yderligere begrænsning er kravet om, at udgangsmaterialet skal være af høj kvalitet. Det er afgørende, at den allantoiske væske er fri for forurenende æggeblomme, da dette i høj grad reducerer effektiviteten af filtrerings- og størrelsesudelukkelsestrinnene. Samlet set er denne proces tidskrævende, men kan forkortes ved at udelade dialysetrinnet. Denne procedure resulterer i et større udbytte af in vivo-grade virus sammenlignet med andre oprensningsmetoder15,18. Evnen til at producere mere koncentreret NDV af højere kvalitet udvider dets muligheder for at blive brugt som et onkolytisk middel eller vaccinevektor i dyremodeller af sygdom i både prækliniske og kliniske indstillinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

J.G.E.Y var modtager af et Ontario Veterinary College PhD-stipendium og et Ontario Graduate Scholarship. Dette arbejde blev finansieret af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants til SKW (tilskud #304737) og LS (tilskud #401127).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin HyClone SH30042.02
1 mL Slip-Tip Syringe BD 309659
10 mL Luer-Lok Syringe BD 302995
10% Povidone Iodine Solution LORIS 109-08
15 mL Conical Tubes Thermo-Fisher 14955240
18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle BD 305180
18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle BD 305196
25 G x 5/8 in Needle BD 305122
2-Mercaptoethanol Thermo-Fisher 03446I-100
30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 BioRad 1610158
4% Paraformaldehyde-PBS Thermo-Fisher J19943-K2
5 mL Luer-Lok Syringe BD 309646
96 Well Tissue Culture Plate - Flat Bottom Greiner Bio One 655180
Acetic Acid, Glacial Thermo-Fisher A38-212
Agarose Froggabio A87-500G
Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse Invitrogen A11001
Allegra X-14 Centrifuge Beckman Coulter B08861
Ammonium Persulfate BioRad 161-0700
Bleach (5%) Thermo-Fisher 36-102-0599
Broad, unserrated tipped forceps Thermo-Fisher 09-753-50
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich 114405-25G
Centramate Cassette Holder PALL CM018V
ChemiDoc XRS+ BioRad 1708265
CO2 Incubator Thermo-Fisher
Coomassie Brilliant Blue R-259 Thermo-Fisher BP101-50
DF1 Cells ATCC CRL-12203
Diet Gel Recovery ClearH2O, INC 72-01-1062
Digital 1502 Sportsman Egg Incubator Berry Hill 1502W
D-Mannitol Sigma-Aldrich M4125-500G
Egg Candler Berry Hill A46
Ethanol (70%) Thermo-Fisher BP82031GAL
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O Thermo-Fisher BP2482-500
Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) Cole-Parmer 06349-50
Fetal Bovine Serum Gibco 12483-020
Fine Point High Precision Forceps Thermo-Fisher 22-327379
Fluorescent Microscope ZEISS AXIO Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein
Freeze Dry System Freezone 4.5 LABCONCO
GiBOX Gel Imager Syngene Imaging of Agarose Gels
Glycerol Thermo-Fisher G33-1
Glycine Thermo-Fisher BP381-5
High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit Thermo-Fisher 4368814
High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium Cytiva SH30022.01
Humidity Kit Berry Hill 3030
Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile)
L-Lysine Monohydrochloride Sigma-Aldrich 62929-100G-F
Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT Cole-Parmer 41507-44
Masterflex L/S Digital Drive Cole-Parmer RK-07522-20 Peristaltic Pump with digital display
Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing Cole-Parmer RK-07514-10
Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 Cole-Parmer 96420-16 BioPharm Platinum-Cured Silicone
MC Pro 5 Thermocycler Eppendorf EP950040025
Methanol Thermo-Fisher A412-4
Mini Protean Tetra Cell BioRad 1658000EDU SDS-PAGE cast and running appartus
Mouse-Anti-NDV Novus Biologicals NBP2-11633 Clone 6H12
Normal Goat Serum Abcam AB7481
NP-40 Thermo-Fisher 85124
Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K PALL OS100T02
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System Thermo-Fisher B1A
PBS 10X Solution Thermo-Fisher BP399-20
Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 Sigma-Aldrich 81300-1KG
PowePac 300 BioRad Model 1655050 - for Agarose gel electrophoresis
Q5 High Fidelity 2X Master Mix New England Biolabs M0492S
QIA Amp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904
RedSafe Thermo-Fisher 50999562
Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL Thermo-Fisher 66380
Sodium Dodecyl Sulfate Thermo-Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide (Pellets) Thermo-Fisher S318-10
Specific pathogen free eggs CFIA NA Supplier will vary depending on location
Sucrose Thermo-Fisher S5-3
Supracap 50 Depth Filter PALL SC050V100P
Surgical Scissors Thermo-Fisher 08-951-5
Sw41Ti Rotor Beckman Coulter 331362 Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7
SX4750 Rotor Beckman Coulter 369702
SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes Beckman Coulter 359472
TEMED Invitrogen 15524-010
Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) Beckman Coulter 344059
Tris Base Thermo-Fisher BP152-5
Tubing Screw Clamp PALL 88216
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379-1L
Utility Pressure Gauges Cole-Parmer 68355-06

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, S. H., Samal, S. K. Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines. Viruses. 8 (7), (2016).
  2. Kortekaas, J., et al. Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector. Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).
  3. Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies. Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).
  4. Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains. Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).
  5. Matuszewska, K., et al. Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).
  6. McAusland, T. M., et al. Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).
  7. Warner, B. M., et al. Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease. iScience. 24 (11), 103219 (2021).
  8. Sun, W., et al. Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate. EBioMedicine. 62, (2020).
  9. Sun, W., et al. A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine. Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).
  10. Xu, Q., et al. Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo. International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).
  11. Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy. Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).
  12. Ricca, J. M., et al. Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy. Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).
  13. Zamarin, D., et al. Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy. Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).
  14. Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy. Biomedicines. 7 (3), (2019).
  15. Santry, L. A., et al. Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).
  16. Cassel, W. A., Murray, D. R. A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate. Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).
  17. Plitt, T., Zamarin, D. Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations. Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).
  18. Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).
  19. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  20. Hegde, N. R. Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).
  21. Fulber, J. P. C., et al. Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures. Vaccines. 9 (11), 1335 (2021).
  22. Ungerechts, G., et al. Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018 (2016).
  23. Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830 (2013).
  24. Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression. The Journal of General Virology. 96, Pt 1 40-45 (2015).
  25. van Vloten, J. P., et al. Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).
  26. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85 (2016).
  27. Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. Structure of the Ulster strain Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase reveals auto-inhibitory interactions associated with low virulence. PLoS Pathogens. 8 (8), (2012).
  28. Sheets, R. L. Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines. Vaccine. 31 (26), 2791-2795 (2013).
  29. Chung, E. H. Vaccine allergies. Clinical and Experimental Vaccine Research. 3 (1), 50 (2014).
  30. Schirrmacher, V. Fifty years of clinical application of Newcastle disease virus: time to celebrate. Biomedicines. 4 (3), (2016).
  31. Ajamian, F., et al. CCL5 persists in RSV stocks following sucrose-gradient purification. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 169-176 (2020).
  32. Axis-Shield. Axis-Shield OptiPrepTM The ideal density gradient medium for isolation of blood cells. , (2020).
  33. Mita, A., et al. Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations. Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).
  34. Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient. Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).
  35. Zhou, Y., et al. A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation. Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).
  36. Zhao, H., Peeters, B. P. H. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).
  37. Cheng, X., et al. Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy. Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).
  38. Chen, T. -F., Jang, J. -W., Miller, J. A. STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEHÜLLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPPÉS FILTRABLES ET STABLES (84). EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , Designated Contracting States: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR 1-14 (2007).
  39. Wang, Y., et al. Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity. PLOS ONE. 12 (9), 0183923 (2017).

Tags

Kræftforskning nummer 183
Produktion af high-titer rekombinant Newcastle Disease Virus fra Allantoic Fluid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yates, J. G. E., Leacy, A., Pham, P. … More

Yates, J. G. E., Leacy, A., Pham, P. H., Zielinska, N., Tusnadi, E. A., Susta, L., Wootton, S. K. Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid. J. Vis. Exp. (183), e63817, doi:10.3791/63817 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter