Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Productie van High-titer Recombinant Newcastle Disease Virus uit Allantoic Fluid

Published: May 25, 2022 doi: 10.3791/63817
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathobiology, University of Guelph

Summary

Hier bieden we een gedetailleerde procedure voor de productie, zuivering en kwantificering van high-titer recombinant Newcastle disease virus. Dit protocol levert consequent > 6 × 109 plaquevormende eenheden/ml op, wat virushoeveelheden oplevert die geschikt zijn voor in vivo dierstudies. Aanvullende kwaliteitscontroletests om de veiligheid in vivo te waarborgen, worden beschreven.

Abstract

Newcastle disease virus (NDV), ook bekend als aviaire orthoavulavirus serotype-1, is een negatief zintuig, enkelstrengs RNA-virus dat zowel als een oncolytisch virus als een viraal gevectord vaccin is ontwikkeld. NDV is een aantrekkelijk therapeutisch en profylactisch middel vanwege het gevestigde omgekeerde geneticasysteem, krachtige immunostimulerende eigenschappen en een uitstekend veiligheidsprofiel. Bij toediening als een oncolytisch virus of een viraal gevectoreerd vaccin, lokt NDV een robuuste antitumor- of antigeenspecifieke immuunrespons uit, waardoor zowel de aangeboren als de adaptieve armen van het immuunsysteem worden geactiveerd.

Gezien deze wenselijke kenmerken is NDV geëvalueerd in tal van klinische onderzoeken en is het een van de best bestudeerde oncolytische virussen. Momenteel zijn er twee geregistreerde klinische onderzoeken met NDV: een evaluatie van een recombinant NDV-gevectoreerd vaccin voor SARS-CoV-2 (NCT04871737), en een tweede evaluatie van een recombinant NDV dat codeert voor Interleukine-12 in combinatie met Durvalumab, een antiPD-L1-antilichaam (NCT04613492). Om verdere vooruitgang van deze veelbelovende virale vector mogelijk te maken, zijn vereenvoudigde methoden nodig voor het genereren van high-titer, in vivo-grade, recombinant NDV (rNDV).

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde procedure voor het versterken van rNDV in gespecificeerde pathogeenvrije (SPF) embryonale kippeneieren en het zuiveren van rNDV uit allantoïsche vloeistof, met verbeteringen om verlies tijdens zuivering te verminderen. Ook inbegrepen zijn beschrijvingen van de aanbevolen kwaliteitscontroletests, die moeten worden uitgevoerd om het gebrek aan verontreinigingen en virusintegriteit te bevestigen. Over het algemeen maakt deze gedetailleerde procedure de synthese, zuivering en opslag van high-titer, in vivo-grade, recombinant, lentogeen en mesogene NDV mogelijk voor gebruik in preklinische studies.

Introduction

Newcastle Disease Virus, ook bekend als Avian Orthoavulavirus-1, is een omhuld aviair paramyxovirus met het potentieel om zowel als een oncolytisch virus of een viraal gevectord vaccin 1,2,3,4,5,6,7 te worden gebruikt. Meest recent is NDV ontworpen om het spike-eiwit van SARS-CoV-2 tot expressie te brengen, gekarakteriseerd als een effectief intranasaal vaccin in muis- en hamsteruitdagingsmodellen 7,8,9. Wanneer het wordt gebruikt als kankerimmunotherapie, resulteert het in de rekrutering van aangeboren immuuncellen, met name natuurlijke killercellen, productie van type I interferon en de generatie van antitumorspecifieke T-cellen 10,11,12,13. Naast deze krachtige immunostimulerende eigenschappen heeft NDV een sterk veiligheidsprofiel en een goed ingeburgerd omgekeerd genetisch systeem14,15. Deze wenselijke kenmerken hebben geleid tot de evaluatie van NDV in talrijke preklinische en humane klinische onderzoeken (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Om deze veelbelovende, immuunstimulerende virale vector verder te bevorderen, zijn gedetailleerde methoden nodig voor het produceren en zuiveren van ultrazuivere NDV met hoge titer die veilig in vivo kan worden toegediend.

Omdat NDV een vogelparamyxovirus is, wordt het meestal versterkt in embryonale kippeneieren. Hoewel er op cellen gebaseerde systemen beschikbaar zijn voor het vermeerderen van NDV, zijn de meeste niet in staat geweest om titers te produceren die vergelijkbaar zijn met die in embryonale kippeneieren18. Niettemin zijn er enkele nadelen aan het produceren van NDV in eieren, waaronder het feit dat de productie op basis van eieren lang en niet gemakkelijk schaalbaar is, het inkopen van grote hoeveelheden SPF-kippeneieren problematisch kan zijn en er bestaat het potentieel voor besmetting met ei-allergenen 13,18,19,20 . Onlangs heeft een groep aangetoond dat Vero-cellen gekweekt in suspensie in serumvrij medium de replicatie van NDV naar titers kunnen ondersteunen die vergelijkbaar zijn met die in eieren, voorafgaand aan zuivering21. Dit vereiste echter seriële passaging van het virus om het virus aan te passen aan Vero-cellen, en de optimalisatie van een methode om NDV te zuiveren van suspensie Vero-cellen is nog steeds vereist21.

Zoals eerder benadrukt, variëren de methoden die worden gebruikt voor het zuiveren van hoogtiter, in vivo-grade virus afhankelijk van het virus in vraag22. Er is een goed ingeburgerd omgekeerd genetisch systeem beschikbaar voor het genereren van recombinant NDV. Dit proces, waarbij gebruik wordt gemaakt van een cDNA-kloon, helperplasmiden en een helpervirus dat T7-RNA-polymerase tot expressie brengt, is eerder in detail beschreven15,23. Dit protocol kan worden toegepast op lentogene of mesogene NDV. Het virus dat in dit protocol wordt beschreven, is een recombinant mesogeen NDV dat codeert voor het groene fluorescerende eiwit (GFP) van de kwal Aequorea victoria die tussen virale P- en M-genen is ingebracht als een individuele transcriptie-eenheid, omdat dit eerder is beschreven als de optimale plaats voor vreemde transgene insertie24.

Ingesloten methoden schetsen de zuivering van NDV op basis van de grootte, variërend van 100 tot 500 nm, en de dichtheid15. Dit heeft het mogelijk gemaakt om in vivo-grade, high-titer NDV-bestanden in ongeveer 3 weken te genereren, vanaf het moment dat de eieren worden ontvangen tot het hebben van een laatste titer. Technieken die vaak worden gebruikt bij de grootschalige productie van op eieren gebaseerde virussen, zoals tangentiële stromingsfiltratie, dieptefiltratie en ultracentrifugatie van de dichtheidsgradiënt, worden beschreven, waardoor de vertaling van deze methoden naar grootschalige productie mogelijk wordt. Eerder beschreven technieken voor de zuivering van NDV zijn verbeterd door de opname van een virusstabiliserende buffer, het gebruik van iodixanol tijdens ultracentrifugatie van de dichtheidsgradiënt en de beschrijving van verschillende kwaliteitscontrolemaatregelen om de kwaliteit van in vivo kwaliteit te waarborgen15. Dit heeft de zuivering mogelijk gemaakt van in vivo-grade NDV die titers bereiken tot 3 × 1010 PFU / ml van 0,8 tot 1,0 l allantoïsche vloeistof.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Al het werk met betrekking tot het gebruik van dieren werd goedgekeurd door de University of Guelph Animal Care Committee in overeenstemming met de Canadian Council on Animal Care. Alle werkzaamheden worden uitgevoerd in een BioSafety Level 2 (BSL2) laboratorium in Canada waar mesogene NDV een Risicogroep 2 Pathogeen is. Alle stappen die betrokken zijn bij de versterking en zuivering van NDV moeten worden uitgevoerd in een type IIA biologische veiligheidskast voor veiligheids- en steriliteitsdoeleinden.

1. Versterking van NDV met behulp van gespecificeerde pathogeenvrije embryonale kippeneieren

  1. Inenting van SPF-embryonale kippeneieren
    OPMERKING: Doorgaans worden acht dozijn SPF-embryonale kippeneieren gebruikt om één in vivo-grade batch NDV te genereren. Bestel een of twee dozijn extra eieren om rekening te houden met schade tijdens verzending en variabiliteit in levensvatbaarheid. Embryonale kippeneieren zijn biologisch materiaal en moeten worden behandeld volgens institutionele richtlijnen. Omdat de embryo's echter niet zijn uitgebroed, is de goedkeuring van het Institutional Animal Care Committee niet vereist.
    1. Na ontvangst van SPF embryonale kippeneieren, incuberen in een eierincubator bij 37 °C, 60% vochtigheid gedurende 9 dagen. Zorg ervoor dat de incubator is ingesteld om de eieren elk uur automatisch te laten schommelen / roteren.
      OPMERKING: Eieren kunnen tot 24 uur bij kamertemperatuur of 4 °C tot 72 uur worden bewaard; dit kan echter de levensvatbaarheid van het embryo verminderen.
    2. Na 8-11 dagen incubatie (idealiter op dag 9), kaars de eieren om de levensvatbaarheid van het embryo te bepalen. Zoek naar webachtige vasculatuur (figuur 1A) en embryobeweging als indicatoren van levensvatbare embryo's. Gooi eieren weg zonder deze kenmerken (figuur 1B).
    3. Markeer op de levensvatbare eieren de interface tussen de luchtzak en het embryo in potlood met een 'X' (figuur 1A). Zorg ervoor dat deze injectieplaats geen perforatie van de vasculatuur zou veroorzaken. Breng de gemarkeerde eieren terug naar de broedmachine terwijl het entmateriaal wordt bereid.
    4. Bereken de hoeveelheid virus die nodig is om alle SPF-embryonale kippeneieren te injecteren. Zorg ervoor dat elk ei 100 PFU van het virus ontvangt in een volume van 100 μL; verdun het virus in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot een concentratie van 1 × 103 PFU/ml. Bereid een extra 20% van het entmateriaal voor om rekening te houden met onnauwkeurigheden in de virustoediening.
    5. Reinig met behulp van een antistatisch doekje de toppen van de gemarkeerde eieren met een 10% jodiumoplossing, verdund in 70% ethanol. Wacht ongeveer 1-2 minuten tot de oplossing is opgedroogd.
    6. Prik de schaal voorzichtig door met een steriel scherp pincet. Ontsmet het pincet in 70% ethanol tussen de eieren.
    7. Injecteer met een spuit van 1 ml en een naald van 25 g 100 μL van het in stap 1.1.4 bereide entmateriaal in de chorioallantoïsche holte (figuur 1C). Benader met de naald in een hoek van bijna 90° ten opzichte van het ei. Steek de naald net in de bovenkant van het chorioallantoïsche membraan.
    8. Gebruik na inenting nagellak om de punctieplaats te bedekken en breng de eieren terug naar de broedmachine. Zorg ervoor dat de schommelinstelling aan staat tot 24 uur na inenting.
    9. Controleer de levensvatbaarheid van eieren 24 uur na inenting. Gooi dode eieren weg die geen vasculatuur hebben in het chorioallantoïsche membraan en de embryobeweging (figuur 1B).
      OPMERKING: Deze eieren zijn gestorven als gevolg van het inentingsproces en niet van NDV.
    10. Breng de eieren terug naar de couveuse, waarbij de rocker OFF zet om besmetting van de allantoïsche vloeistof met ei-eiwitten te voorkomen.
    11. Controleer de eieren elke 12-24 uur zoals beschreven in stap 1.1.9 om dode eieren te identificeren. Verplaats de eieren die na 24 uur na inenting afsterven naar 4°C om de autolyse te minimaliseren. Oogst de allantoïsche vloeistof binnen 2-12 uur na het koelen.
    12. Incubeer de eieren gedurende ten minste 72 uur.
      OPMERKING: Als een mesogene stam van NDV wordt vermeerderd, is de optimale incubatietijd 60-72 uur, omdat langdurige incubatietijden het zuiveringsproces kunnen schaden vanwege de verminderde helderheid van de allantoïsche vloeistof. Dit probleem is niet zo belangrijk bij het vermeerderen van lentogene NDV-stammen, omdat ze veel langer nodig hebben om het embryo te doden.
    13. Verplaats na de juiste incubatietijd de resterende eieren gedurende 2-12 uur naar 4 °C voordat u de allantoïsche vloeistof oogst.
  2. Allantoïsche vloeistof met NDV oogsten
    1. Verplaats de gekoelde eieren in de bioveiligheidskast. Reinig de bovenkanten van de eieren met 70% ethanol.
    2. Gebruik een steriel pincet en een chirurgische schaar om de apicale kant van het ei open te breken waar de luchtzak zich bevindt.
    3. Verwijder de schaal om het chorioallantoïsche membraan te onthullen (figuur 1D).
    4. Prik het membraan voorzichtig door en pel het terug om de allantoïsche holte bloot te leggen (figuur 1E). Zorg ervoor dat de dooierzak niet per ongeluk wordt doorboord, want dit zal het ei bederven.
    5. Gebruik een stompe tang om het embryo te pakken en de embryonale zak te openen.
      OPMERKING: De vloeistof in de embryonale zak bevat ook NDV.
    6. Druk het embryo in met de tang en verzamel de allantoïsche vloeistof met behulp van een serologische pipet van 10 ml.
    7. Bewaar de allantoïsche vloeistof op ijs in 15 ml conische buizen tot opklaring.
      OPMERKING: Als de allantoïsche vloeistof geel is, is de dooierzak aangetast en moet de allantoïsche vloeistof worden weggegooid.
    8. Centrifugeer de conische buizen die de allantoïsche vloeistof bevatten bij 1.500 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    9. Pauzepunt: Aliquot de geklaarde allantoïsche vloeistof in 50 ml conische buizen en bewaar ze bij -80 ° C voor langdurige opslag (bijv. Weken tot maanden), waarbij de vloeistof wordt aangevuld met sucrose tot een uiteindelijke concentratie van 5% om het virus te beschermen tegen de harde effecten van vries-dooi. Als alternatief, voor kortdurende opslag (bijv. 1-3 dagen), vul de allantoïsche vloeistof aan met sucrose (laatste 5%) of met 3x Mannitol-Lysine (ML) buffer (15% Mannitol, 3% Lysine; zie Aanvullende tabel S1 voor bufferrecepten) om een uiteindelijke concentratie van 1x (5% Mannitol, 1% Lysine) te verkrijgen voorafgaand aan opslag bij 4 °C.

2. Zuivering van NDV uit allantoïsche vloeistof

  1. Dieptefiltratie van allantoïsche vloeistof
    1. Bewaar de geklaarde allantoïsche vloeistof bij -80 °C en ontdooi deze bij 4 °C de nacht voor het zuiveren.
    2. Plaats in een biologische veiligheidskast de slang en de peristaltische pomp zoals weergegeven in figuur 2.
    3. Indien nog niet uitgevoerd, combineer de allantoïsche vloeistof met 3x ML buffer tot een uiteindelijke concentratie van 1x.
    4. Voordat u het dieptefilter bevestigt, steriliseert u de slang door 50 ml 0,5 M NaOH door het systeem in een afvalvat te laten lopen.
    5. Spoel de slang door 100 ml steriel water van moleculaire kwaliteit door het systeem en in het afvalvat te laten lopen.
      OPMERKING: Aangezien NaOH NDV zal inactiveren, is het belangrijk dat de lijnen voldoende worden gewassen voordat de virusbevattende allantoïsche vloeistof wordt geïntroduceerd.
    6. Prime het systeem door er 50 ml PBS doorheen te laten lopen en de pomp te stoppen wanneer er nog ongeveer 5 ml PBS in de buis zit.
    7. Bevestig het dieptefilter met een retentieclassificatie van 1-3 μM aan de slang en verwijder de tweede dop aan de apicale kant van het dieptefilter om het filter te ontluchten. Begin met het uitvoeren van een extra 50 ml PBS door het systeem.
    8. Zodra PBS door de ventilatieopening aan de bovenkant van het filter begint te stromen, sluit u de poort en blijft u PBS door de leidingen stromen.
      OPMERKING: Kleine luchtbellen zijn acceptabel, maar de aanwezigheid van grote hoeveelheden lucht vereist dat het filter opnieuw wordt geventileerd zoals beschreven in stappen 2.1.7 en 2.1.8.
    9. Stop de pomp wanneer er ongeveer 5 ml PBS in de buis achterblijft.
    10. Vervang het afvalvat door een nieuw steriel opvangvat en begin met het laten lopen van allantoïsche vloeistof door het dieptefilter.
      OPMERKING: De druk mag niet hoger zijn dan 10 psi, omdat dit resulteert in het afschuiven van het virus. Druk kan worden gemanipuleerd door het debiet van de pomp te verlagen of te verhogen. Als de druk hoger begint te worden dan 10 psi en het debiet niet verder kan worden verlaagd, moet een nieuw dieptefilter worden gebruikt. In dit geval moeten stappen 2.1.6-2.1.8 worden uitgevoerd voordat de stroom van allantoïsche vloeistof wordt hervat.
    11. Zodra alle allantoïsche vloeistof door het filter is gegaan, laat u 50 ml 1x ML-buffer door de lijnen lopen om het virusherstel te maximaliseren.
    12. Vang de vloeistof op totdat de lijnen droog zijn. Bewaar het virus een nacht of tot 36 uur bij 4 °C.
      OPMERKING: Zodra het virus op diepte is gefilterd, gaat u verder met het zuiveringsproces binnen 36 uur na het voltooien van de dieptefiltratie.
    13. Koppel het dieptefilter los en ontsmet de slang door 100 ml 0,5 M NaOH, 400 PPM bleekmiddel voorgewarmd tot 42 °C door het systeem te laten lopen voordat het wordt opgeslagen in 0,5 M NaOH.
  2. Tangentiële stromingsfiltratie voor de concentratie van NDV
    1. Monteer de componenten van de cassette zoals afgebeeld in figuur 3A (en zoals eerderafgebeeld 25) in een biologische veiligheidskast.
      OPMERKING: Het spruitstuk en de eindplaat moeten voor gebruik in wasmiddel worden gewassen en gedroogd. De siliconen pakkingen zijn herbruikbaar en moeten met de cassette in 0,5 M NaOH worden bewaard.
    2. Stel het Tangential Flow Filtration (TFF) (ook wel cross-flow filtration genoemd) systeem in een 'open' conformatie in (figuur 3B).
      1. Als u een cassette voor de eerste keer gebruikt, monteer dan de TFF-cassette in de elutieconformatie en spoel met 100 ml steriel water van moleculaire kwaliteit (figuur 3C).
      2. Zodra er slechts 5 ml water overblijft in de reservoirtank, pauzeert u de pomp en wijzigt u de TFF-systeemconfiguratie in een gesloten conformatie (figuur 3D).
      3. Voeg 100 ml 0,5 M NaOH, 400 PPM bleekmiddel voorgewarmd tot 42 °C toe aan het reservoir en spoel gedurende 30-60 minuten door het systeem.
      4. Pauzeer de stroom en breng het TFF-systeem terug naar de elutie-instelling, waarbij de stroom wordt hervat om de reinigingsoplossing te elueren.
      5. Wanneer er nog ongeveer 5 ml in het reservoir zit, pauzeert u de pomp en voegt u 100 ml steriel water van moleculaire kwaliteit toe om het systeem te spoelen.
      6. Wanneer er nog ongeveer 5 ml in het reservoir zit, pauzeert u de pomp en plaatst u het TFF-systeem in de open conformatie (figuur 3B). Ga verder met stap 2.2.3.
    3. Steriliseer de cassette en de slang door 100 ml 0,5 M NaOH door het systeem te laten lopen met behulp van de peristaltische pomp. Zorg ervoor dat de druk niet hoger is dan 30 psi om de integriteit van de cassette te behouden.
    4. Pauzeer de pomp wanneer er nog ongeveer 5 ml van 0,5 M NaOH in het reservoir zit.
    5. Voeg 100 ml steriel water van moleculaire kwaliteit toe aan het reservoir en voer de vloeistof door de cassette. Draai het reservoir om alle NaOH van de zijkanten van het reservoir te wassen om inactivatie van het virus te voorkomen. Herhaal de wasstap van het reservoir.
    6. Wanneer er ongeveer 5 ml steriel water van moleculaire kwaliteit in het reservoir achterblijft, pauzeert u de pomp.
    7. Voeg 100 ml PBS toe aan het reservoir en wervel om ervoor te zorgen dat het steriele water van moleculaire kwaliteit vanaf de zijkanten wordt gewassen. Hervat de vloeistofstroom door de cassette.
    8. Wanneer er nog ongeveer 5 ml in het reservoir zit, pauzeert u de pomp, voegt u dieptegefilterde allantoïsche vloeistof toe aan het reservoir en hervat u de pompstroom.
    9. Controleer manometer 1 (figuur 3B) om ervoor te zorgen dat deze niet hoger is dan 10 psi om afschuiving van het virus te voorkomen. Gebruik een combinatie van de snelheid van de peristaltische pomp en het gebruik van C-klemmen om de elutie tot afval te verhogen.
      OPMERKING: Het combineren van de snelheid van de peristaltische pomp en C-klemmen zal resulteren in een verhoogde druk.
    10. Wanneer er 50-100 ml allantoïsche vloeistof in het reservoir achterblijft, pauzeert u de pomp om een bufferuitwisseling uit te voeren door 150-200 ml 1x ML-buffer toe te voegen.
    11. Hervat de pompstroom, controleer opnieuw manometer 1 (figuur 3B) om ervoor te zorgen dat deze niet hoger is dan 10 psi.
    12. Wanneer er nog 5-10 ml in het reservoir zit, pauzeert u de pomp.
    13. Sluit met behulp van twee C-klemmen de twee afvalleidingen zoals weergegeven in figuur 3C.
    14. Ontkoppel de retentaatlijn die het reservoir voedt en steek deze in een conische buis van 50 ml (figuur 3C).
    15. Hervat de stroom van de pomp en pauzeer wanneer er nog een paar druppels vloeistof in de reservoirtank achterblijven.
    16. Verwijder de C-klemmen van de afvalleidingen en bevestig de retentatietoevoerleiding opnieuw aan de reservoirtank (figuur 3B).
    17. Voeg 20-25 ml 1x ML buffer toe en hervat de pompstroom totdat er nog ongeveer 5 ml in de reservoirtank zit.
    18. Herhaal stap 2.2.13 tot en met 2.2.16.
      OPMERKING: Een3e elutie kan worden uitgevoerd door de stappen 2.2.17 en 2.2.13 tot en met 2.2.16 te herhalen om de virusopbrengst te verhogen. Het grootste deel van het virus is echter aanwezig in de eerste twee oplossingen.
    19. Na het beëindigen van de elutie, plaatst u het virus op ijs of bij 4 °C.
    20. Om de lijnen te reinigen, stelt u het systeem zo in dat het een gesloten lusformaat is (figuur 3D) waarbij de afvallijnen terugvoeren naar het reservoir zoals afgebeeld in figuur 3D.
    21. Ga verder met het reinigen van het systeem door 250 ml 0,5 M NaOH toe te voegen, 400 PPM bleekmiddel voorgewarmd tot 42 °C.
    22. Laat de reinigingsoplossing 's nachts door het systeem stromen.
      OPMERKING: Als de pomp tijdens het recirculeren van de reinigingsoplossing met een snelheid van 50 ml /min draait, moet een druk van ongeveer 5 psi in acht worden genomen. Als de druk dit overschrijdt, is de cassette vuil en moet de reinigingsoplossing worden vervangen en moet het proces worden herhaald.
    23. Eluteer de reinigingsoplossing door zowel afvalleidingen als de retentaatleiding in een afvalcontainer te leiden.
    24. Voeg 400-500 ml steriel water toe aan het reservoir en laat het door het systeem en in de afvalvaten stromen.
    25. Wanneer ongeveer 5 ml in het reservoir is achtergebleven, pauzeert u de pomp en voegt u 100-200 ml 0,5 M NaOH toe aan de reservoirtank, waarbij u de oplossing wervelt om de reservoircontainer te wassen.
    26. Zodra het reservoir bijna leeg is, herhaalt u stap 2.2.23 nog eens twee keer.
    27. Demonteer de TFF-opstelling en bewaar de TFF-cassette en pakkingen in een klein volume van 0,5 M NaOH in een hersluitbare plastic zak bij 4 °C.
      OPMERKING: Slangen kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur ondergedompeld in 0,5 M NaOH.
  3. Iodixanol dichtheid gradiënt ultracentrifugatie
    1. Zet de ultracentrifuge aan en zet deze op voorkoeling op 4 °C. Koel de gewenste rotor ook voor op 4 °C (zie de Materiaaltabel).
      OPMERKING: Rotors moeten bij 4 °C worden bewaard.
    2. Gebruik de voorraad 60% iodixanol-oplossing (concentratie op het moment van aankoop) om 40%, 20% en 10% iodixanol-oplossingen te genereren door te verdunnen met PBS en 3x ML Buffer tot een 1x uiteindelijke concentratie ML-buffer.
    3. In een 13,2 ml, open, dunwandige ultracentrifugebuis, overlay 0,5 ml, 2,5 ml en 2,5 ml van de 40%, 20% en 10% iodixanoloplossingen(figuur 4A).
      OPMERKING: Door de ultracentrifugebuis op zijn kant te kantelen en de oplossing langzaam uit te drijven, wordt het risico op het mengen van de twee gradiëntlagen aanzienlijk verminderd. De scheiding van elke laag moet duidelijk zijn, met een "halo" zichtbaar tussen elke laag van het verloop.
    4. Gebruik een markeerpen om de interfaces van de verschillende verlooplagen te markeren.
    5. Laag 6-6,5 ml van het geëlueerde virus uit de TFF-procedure over de dichtheidsgradiënt. Voeg het virus zorgvuldig toe zoals beschreven in stap 2.3.3 om te voorkomen dat de dichtheidsgradiënt wordt verstoord.
    6. Laad de ultracentrifugebuizen in de wisselplaten voor de zwenkbakrotor (zie de tabel met materialen) met behulp van een open schaal om de wisselplaten binnen 0,01 g van elkaar in evenwicht te brengen. Gebruik PBS of extra virus eluent om rekening te houden met de gewichtsverschillen.
    7. Zodra de buizen in balans zijn, dop je de buizen af en laad je ze in de rotor.
    8. Centrifugeer gedurende 1,5 uur bij 125.000 × g bij 4 °C.
      OPMERKING: Dit kan 's nachts worden uitgevoerd als er een ultracentrifuge met vertragingsstartmogelijkheid beschikbaar is.
    9. Verwijder na ultracentrifugatie de buisjes met een steriele tang. Zoek naar de doelband - een grote band - tussen de 10% en 20% gradiënten (figuur 4B).
    10. Hang de buis over de bovenkant van een bekerglas met behulp van een retortstandaard.
    11. Bevestig een naald van 18 G x 1,5 inch aan een spuit van 5 ml en prik de zijkant van de ultracentrifugebuis door.
      OPMERKING: De buis moet iets onder de doelband worden doorboord, met de naald in een opwaartse hoek en schuin omhoog zodat deze in de doelband zou reizen.
    12. Trek de zuiger langzaam uit om de doelband te verwijderen.
      OPMERKING: Verplaats de naald binnen de doelband om het geëxtraheerde virus te maximaliseren. Zorg ervoor dat andere banden of puin niet worden gemengd met de doelband en vermijd het nemen van overtollige oplossing, omdat dit zal leiden tot het gebruik van meer dialysecassettes.
    13. Zodra de doelband is geëxtraheerd, verwijdert u de naald en laat u de resterende oplossing in het afvalbeker afvloeien. Doseer de doelband in een conische buis van 50 ml totdat alle banden uit alle andere ultracentrifugebuizen zijn geëxtraheerd.
    14. Herhaal stap 2.3.10-2.3.13 totdat alle doelbanden uit alle ultracentrifugebuizen zijn geëxtraheerd.
    15. Alternatieve aanpak voor het extraheren van de doelbanden zoals beschreven in de stappen 2.3.10 tot en met 2.3.13
      1. Verwijder langzaam de vloeistof die de doelband bedekt met behulp van een pipet. Eenmaal bij de doelband, extract met behulp van een pipet en bewaar het virus in een conische buis van 50 ml.
        OPMERKING: Hierdoor kunnen de ultracentrifugebuizen worden hergebruikt.
  4. Verwijdering van iodixanol uit virusoplossing
    OPMERKING: De NDV-bevattende band verschijnt bij een iodixanoldichtheid tussen 15% en 16%. De concentratie van iodixanol in de oplossing kan worden bepaald door de absorptie bij 340 nm te meten ten opzichte van een standaardcurve (aanvullende figuur S1). Deze stap kan worden weggelaten omdat er geen bijwerkingen of acute toxiciteit werden waargenomen wanneer iodixanoloplossingen van deze concentratie werden toegediend aan C57BL/6-muizen.
    1. Prewet een 0,5-3 ml 10 kDa moleculair gewicht cut-off dialysecassette door deze gedurende 1 min onder te dompelen in PBS.
      OPMERKING: Het dialysemembraan moet veranderen van glad naar een gegolfd of hobbelig uiterlijk. Als het volume van het geëxtraheerde virus groter is dan 10 ml, moeten twee dialysecassettes van 0,5-3 ml of een dialysecassette van 5-12 ml worden gebruikt.
    2. Gebruik, indien van toepassing, een spuit van 5 of 10 ml en een naald van 18 G x 1,5 inch met stompe vul om het virus uit de conische buis van 50 ml te verzamelen.
    3. Gebruik de spuit om de dialysecassette in te voeren, voorzichtig te zijn om het membraan niet te doorboren en het virus te injecteren.
      OPMERKING: De dialysecassette kan worden gedraaid om de positionering van de luchtzak in de cassette te manipuleren. De luchtzak moet worden verwijderd voordat de naald uit de cassette wordt verwijderd.
    4. Vul een bekerglas van 1 L met steriele 1x PBS, plaats een roerstaaf en de dialysecassette erin en dek af. Incubeer bij 4 °C met zacht roeren.
      OPMERKING: Gebruik geëxtrudeerd polystyreenschuim en een elastische band om de dialysecassette te bevestigen, zodat deze in de PBS zal zweven. De cassette kan iets opzwellen als gevolg van de ML-buffer.
    5. Vervang na 1-2 uur door verse 1x PBS en blijf nog 8-10 uur incuberen bij 4 °C met licht roeren.
      LET OP: Dit kan ook 's nachts.
    6. Vervang nogmaals door verse 1x PBS, broedend op kamertemperatuur gedurende 1-2 uur.
  5. Concentratie van virusoplossing
    1. Verwijder de dialysecassette uit de dialysebuffer (figuur 4C) en plaats deze in een kleine, afsluitbare plastic zak. Voeg 15-25 ml 40% polyethyleenglycol van 20.000 MW toe zodat de dialysecassette volledig onder water staat.
    2. Incubeer bij kamertemperatuur met schommelen. Controleer het volume van het virus in de cassette periodiek met behulp van een spuit van 5 of 10 ml en een naald van 18 G x 1,5 inch met stompe vulnaald.
      OPMERKING: De hoeveelheid tijd die nodig is om het virus te concentreren, varieert op basis van het beginvolume en het gewenste eindvolume. Meestal ligt het uiteindelijke gewenste volume tussen 1 en 1,5 ml, ongeacht het startvolume van allantoïsche vloeistof. Let er bij het controleren van het volume op dat u niet dezelfde poort gebruikt, omdat dit de poortintegriteit in gevaar brengt en kan resulteren in het mengen van de polyethyleenglycoloplossing en het virus.
    3. Voordat u het geconcentreerde virus uit de dialysecassette verwijdert, spoelt u de cassette kort af in 1x PBS en vult u een naald van 18 G x 1,5 inch met bluntvulling met lucht.
    4. Steek de met lucht gevulde spuit in de dialysecassette en druk de zuiger in. Draai het apparaat zo dat het geconcentreerde virus kan worden verwijderd zonder de ingebrachte lucht te verwijderen.
    5. Doseer het geconcentreerde virus in een conische buis van 50 ml, waarbij het afgegeven volume wordt genoteerd.
    6. Injecteer met dezelfde spuit en naald een geschikte hoeveelheid van 60% sucrose in de dialysecassette, zodat deze, in combinatie met het eerder verwijderde virus, in een eindconcentratie van 5% sucrose is.
    7. Gebruik gehandschoende vingers om het membraan te masseren om het resterende virus dat zich mogelijk aan het membraan heeft gehecht, te verdrijven, en wees voorzichtig om het niet te beschadigen. Verwijder een deel van de overtollige lucht in de dialysecassette om het ontwrichtingsproces te vergemakkelijken.
    8. Combineer deze was met het virus al in de conische buis van 50 ml.
      OPMERKING: Het virus is nu in 5% sucrose en klaar om te worden uitgedeeld in 20 μL, 50 μL, 100 μL of 200 μL aliquots en bewaard bij -80 °C. Voor langdurige opslag kan NDV ook worden gelyofiliseerd en bij 4 °C worden bewaard, zoals beschreven in rubriek 2.6.
  6. Lyofilisatie van NDV
    1. Lyofiliseer het virus gealiquoteerd in 1,5 ml centrifugebuizen of 15 ml conische buizen op 44 × 10-3 MBAR en -52 °C gedurende 16 uur.
    2. Bewaar de gelyofiliseerde monsters bij 4 °C zonder significante vermindering van de virale titer.

3. Kwaliteitscontrole assays

  1. Virale RNA-isolatie en reverse-transcriptie PCR voor genoombevestiging
    1. Ontdooi een 20 μL virus aliquot. Volg het virale RNA-isolatieprotocol dat bij de kit is geleverd.
    2. Gebruik het geïsoleerde RNA onmiddellijk als sjabloon voor reverse-transcriptie PCR (RT-PCR) of bewaar het bij -80 °C.
    3. Bereid de reverse-transcriptiereacties voor zoals beschreven in het protocol dat door de fabrikant is verstrekt.
    4. Gebruik het resulterende cDNA als sjabloon voor verschillende PCR-reacties voor kwaliteitscontrole om het NDV-pathotype (tabel 1, F-eiwitprimerset) en de aanwezigheid van vereiste gencontrole-elementen (tabel 1, Transgene primer set) te bevestigen.
      OPMERKING: Primers moeten worden ontworpen op basis van de stam van NDV die wordt vermeerderd.
      1. Om de F-eiwitsplitsingsplaats, de belangrijkste determinant van het pathotype, te sequencen, gebruikt u de F-eiwitprimerset (tabel 1). Zoek naar een PCR-product van 435 basenparen lang.
        OPMERKING: Hier zijn primers ontworpen op basis van de LaSota-stam van NDV (Genbank toetreding AF077761.1). Het is algemeen bekend dat optimale transgenexpressie optreedt wanneer een vreemd transgen wordt ingebracht tussen de P- en M-genen24.
      2. Gebruik de transgene primer set om de integriteit van de gen start en gen eind elementen van het transgen te bevestigen. Sequentieer het PCR-product om de integriteit van de genstart en de gen-eindsequentie te bevestigen.
    5. Stuur de PCR-producten voor DNA-sequencing en vergelijk ze met de sjabloon voor homologie.
  2. SDS PAGE en Coomassie-kleuring om verontreinigende eiwitten te detecteren
    1. Giet een dichtheidsgradiënt SDS PAGE-gel door eerst 6% en 15% polyacrylamide-oplossingen te bereiden (aanvullende tabel S1). Gebruik een pipet van 10 ml om 5 ml van de 15% oplossing op te stellen, gevolgd door 5 ml van de 6% oplossing.
    2. Verwijder de pipet uit de oplossing en genereer een luchtbel door kort lucht op te zuigen.
      OPMERKING: Terwijl de luchtbel omhoog reist, mengt dit de oplossing om het SDS PAGE-verloop te maken.
    3. Doseer de oplossing in het gietapparaat en laat het gedurende 30 minuten stollen.
    4. Combineer in een laatste volume van 20 μL een aliquot virus met 4x reducerende buffer (aanvullende tabel S1) zodat de uiteindelijke concentratie 1x is en kook gedurende 10 minuten bij 95 °C in een thermocycler. Laad ten minste 1 × 107 PFU van het virus.
    5. Dompel de SDS PAGE onder in de lopende buffer (aanvullende tabel S1) en laad de monsters.
    6. Laat de gel 1-1,5 uur op 120 V lopen.
    7. Haal de gel uit de loopbuffer en breng deze over in een kleinere container.
    8. Voeg Coomassie-kleuringsoplossing (aanvullende tabel S1) toe om de gel te bedekken. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 4-5 uur.
    9. Verwijder de kleuringsoplossing en voeg destain-oplossing (aanvullende tabel S1) toe, gedurende 4-8 uur bij kamertemperatuur met agitatie. Wijzig de destain-oplossing drie tot vier keer.
      OPMERKING: De gel moet helder zijn en de kleur moet zijn zoals het was voorafgaand aan de kleuring.
    10. Afbeelding van de gel op een colorimetrische instelling. Zie figuur 5 voor een representatieve afbeelding van een Coomassie-gekleurde SDS PAGE-gel met monsters van allantoïsche vloeistof en gezuiverd virus.
  3. Kwantificering van infectieuze virale titer door mediane weefselkweek infectieuze dosis (TCID50) en immunofluorescentietest
    OPMERKING: Vero-cellen kunnen worden gebruikt als alternatief voor DF1-cellen; het cytopathische effect (CPE) is echter minder uitgesproken in Vero-cellen. NDV met de L289A-mutatie, die de fusogeniteit verbetert, en het tot expressie brengen van GFP tussen de P - en M-genen wordt in deze test gebruikt.
    1. Zaai een 96-well plaat van DF1-cellen op 20.000 cellen / put in een volume van 80 μL de dag ervoor met DMEM aangevuld met 2% foetaal runderserum (FBS) en 125 μg / ml trypsine. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2.
    2. Ontdooi de volgende dag een 20 μL aliquot virus op ijs.
    3. Gebruik buizen van 1,5 ml om seriële verdunningen te bereiden. Begin met het verdunnen van 10 μL van het virus met 990 μL PBS om een 10-2 verdunning te bereiden. Bereid alle andere verdunningen, tot minimaal 10-10 , gemaakt met 900 μL PBS en de toevoeging van 100 μL van de vorige verdunning.
      OPMERKING: Gebruik een nieuwe pipetpunt wanneer u tussen verdunningen beweegt.
    4. Gebruik 20 μL van elke verdunning om elke put van de 96-well plaat te infecteren, zoals weergegeven in figuur 6.
      OPMERKING: Het uiteindelijke volume in elke put is 100 μL.
    5. Incubeer de plaat gedurende ten minste 48 uur bij 37 °C en 5% CO2, alvorens te onderzoeken op de aanwezigheid van CPE/GFP of een indirecte immunofluorescentietest (IFA) uit te voeren.
      OPMERKING: Onder deze kweekomstandigheden is CPE duidelijk na 10 uur (figuur 7A-D), en neemt het in de komende 24 uur toe (figuur 7E-H). De plaat kan langer worden geïncubeerd om de intensiteit van CPE te verbeteren als deze wordt gescoord door GFP of CPE.
      1. Als u scoort op BASIS van CPE of GFP en GEEN IFA uitvoert, gaat u verder met stap 3.3.18.1.
    6. Spoel de cellen bij het uitvoeren van IFA tweemaal met 100 μL 1x PBS.
    7. Voeg 100 μL 4% paraformaldehyde verdund in PBS toe aan elk putje en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    8. Was de cellen 3x 5 min elk met 100 μL 1x PBS, 0,1% Tween 20 (0,1% PBS-T).
    9. Permeabiliseer de cellen door de toevoeging van 100 μL van 0,1% NP-40 in PBS en broed ze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur .
    10. Was de cellen 3x 5 min met 100 μL van 0,1% PBS-T.
    11. Voeg 100 μL blokkeringsbuffer toe, bestaande uit 5% (V/V) normaal geitenserum verdund in 0,1% PBS-T gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C.
    12. Voeg 100 μL per putje primair muis anti-NDV ribonucleoproteïne antilichaam verdund in 0,1% PBS-T tot 1 μg/ml toe, broed gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C.
    13. Was de cellen 3x gedurende 5 min in 100 μL van 0,1% PBS-T.
    14. Voeg 100 μL van een AlexaFluor 488 Goat anti-muis secundair antilichaam verdund in 0,1% PBS-T tot 2 μg / ml toe. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    15. Was de cellen 3x gedurende 5 min in 100 μL van 0,1% PBS-T.
    16. Laat na de laatste wasbeurt de cellen in 100 μL van 0,1% PBS-T.
    17. Beeld de putten af met behulp van een omgekeerde fluorescerende microscoop.
    18. Let bij het uitvoeren van IFA op fluorescentie die groter is dan die in de negatieve controleputten, wat aangeeft dat de put positief is voor NDV, zoals weergegeven in figuur 8.
      1. Zoek naar de aanwezigheid van syncytia en grote, afgeronde cellen die kenmerkend zijn voor NDV CPE. Als het scoren van putten is geïnfecteerd met een virus dat GFP tot expressie brengt, zoek dan naar de aanwezigheid van GFP.
    19. Voer de juiste informatie in de Spearman-Karber titer calculator26 in om de PFU/ml van het virus te bepalen (tabel 2). Zie figuur 6 voor een voorbeeld van de TCID50-titerplaat .
  4. Kwantificering van virale titer door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR)
    OPMERKING: Een qRT-PCR-kit in één stap wordt aanbevolen om tijd te besparen en de manipulatie van de monsters te verminderen. Een probe-gebaseerde assay wordt gebruikt om de specificiteit van detectie voor virussequenties te verhogen.
    1. Maak een standaardcurve van een bekende hoeveelheid van de virussequenties (aanvullende figuur S2A,B).
      OPMERKING: Dit kan worden gedaan door een synthetisch 500 bp dubbelstrengs DNA-fragment van het NDV L-gen te kopen. De sequentie voor een 500 bp fragment van het NDV L gen is te zien in Supplemental Figure S2C.
    2. Converteer de hoeveelheid van het virus-DNA-fragment (meestal geleverd als nanogram of femtomolen door fabrikanten) naar het aantal moleculen of kopieën van DNA-fragment met behulp van het nummer van Avogadro en de mol naar moleculen formule (Eq (1)).
      Equation 1 (1)
    3. Bereid de standaardcurvemonsters voor door een tienvoudige verdunningsreeks van bekende virus-DNA-fragmentkopieën voor te bereiden, beginnend bij 1,00 ×10 10 kopieën tot 1,00 × 100 kopieën.
    4. Om de hoeveelheid NDV-RNA in onbekende monsters te bepalen, extraheert u NDV-RNA met behulp van een RNA-extractiekit. Volg het protocol dat bij de kit is geleverd. Zodra het RNA is geëxtraheerd, gaat u verder met het aanbevolen protocol in de qRT-PCR-kit in één stap.
    5. Voer de reacties uit in een real-time PCR-instrument met de volgende temperatuur- en cyclusomstandigheden: 1) één cyclus van reverse transcriptie bij 55 °C gedurende 10 minuten; 2) één cyclus van initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 1 min; en 3) 40 cycli van denaturatie (95 °C gedurende 10 s), extensie (60 °C gedurende 30 s) en fluorescerende signaalacquisitie.
    6. Zodra de qRT-PCR-test is voltooid, genereert u de standaardcurve op basis van de standaardcurvemonsters met behulp van de real-time PCR-instrumentsoftware (Supplemental Figure S2A, B).
      OPMERKING: De software berekent ook de hoeveelheid NDV-RNA in onbekende monsters op basis van de standaardcurve.
  5. Veiligheidstesten voor acute toxiciteit bij muizen
    1. Injecteer 1 × 108 PFU van het virus intraveneus via de staartader in drie 8 weken oude BALB/C-muizen om acute toxiciteit te beoordelen.
    2. Controleer de muizen op bijwerkingen zoals gewichtsverlies (>20%), gebogen houding, gegolfde vachten, lethargie en veranderingen in de ademhaling. Beoordeel drie tot vier keer per dag gedurende de eerste 48 uur. Aangezien muizen na 48 uur moeten beginnen te herstellen, controleert u ze één tot twee keer per dag totdat ze volledig zijn hersteld.
      1. Dien zoutoplossing subcutaan en ondersteunende zorg toe indien nodig. Vul bijvoorbeeld aan met hersteldieetgel, pindakaas of gebruik warmtepucks. Euthanasie muizen die eindpuntcriteria hebben bereikt, zoals uiteengezet door de richtlijnen voor dierenverzorgingsinstellingen, door een overdosis isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Allantoïsche vloeistof oogsten
Omdat allantoïsche vloeistof wordt geoogst uit embryonale kippeneieren, moet het er helder en transparant uitzien. Als de vloeistof ondoorzichtig en geel lijkt, duidt dit op de aanwezigheid van verontreinigingen. Opname van deze allantoïsche vloeistof tijdens de zuivering zal het zuiveringsproces belemmeren, omdat de druk snel zal stijgen en 10 psi zal overschrijden, wat resulteert in het afschuiven van het virus en het verlies van infectieus virus. Allantoïsche vloeistof die bloederig lijkt, suggereert dat de eieren werden ingeënt met te veel PFU van het virus. De opbrengst van deze partij eieren zal aanzienlijk lager zijn dan verwacht en het is onwaarschijnlijk dat dit virus in vivo kan worden gebruikt. Eieren die zijn ingeënt met lentogene NDV moeten na 72 uur nog steeds een vasculatuur hebben en de embryo's mogen niet zijn gestorven, zoals gevisualiseerd in figuur 1. Als ze dat hebben gedaan, suggereert dit dat het embryo op de een of andere manier is beschadigd of besmet.

Iodixanol dichtheid gradiënt ultracentrifugatie
Na ultracentrifugatie moet een hogetiter, witte, NDV-bevattende band zich tussen de 10% en 20% gradiënten bevinden (figuur 4B).

Coomassie vlek van SDS-PAGE gels
Figuur 5 toont het verschil tussen een ongezuiverde (Lane 2) en gezuiverde virusvoorraad (Lane 3). Een vergelijking van de twee toont een significante afname van de intensiteit van besmetterende eiwitbanden en de opkomst van dominante NDV-banden in de gezuiverde virusvoorraad.

Kwantificering van virale titer door TCID50
Bij gebruik van de aanbevolen omstandigheden bij het titereren van een geconcentreerde voorraad NDV, moet cpe na 24 uur duidelijk zijn (figuur 6). In vergelijking met een lentogene stam NDV van vergelijkbare titer, is de CPE meer uitgesproken in de mesogene stam op hetzelfde tijdstip.

Acute toxiciteitsanalyse bij 8 weken oude BALB/C-muizen
Wanneer 1 × 108 PFU intraveneus werden toegediend, moeten muizen worden gecontroleerd op bijwerkingen zoals gewichtsverlies >20%, gegolfde vacht, gebogen houding en abnormale ademhaling. Binnen de eerste 24-36 uur zullen muizen beginnen af te vallen en waarschijnlijk gegolfde jassen en een gebogen houding ontwikkelen. Als het virus echter voldoende zuiver is, beginnen muizen te herstellen, zoals waargenomen door gewichtstoename en verbetering van de houding en vachtconditie na 36 uur. Muizen die deze tekenen van herstel na 36 uur niet vertonen, moeten nauwlettend worden gecontroleerd op eindpuntcriteria. Meestal is dit gebeurd vanwege onnauwkeurige tittering, mogelijk als gevolg van aggregatie van virusdeeltjes.

Figure 1
Figuur 1: Infectie en oogst van NDV uit gespecificeerde pathogeenvrije embryonale kippeneieren. (A) Webachtige vasculatuur (pijlen) die zichtbaar moeten zijn na 9 dagen incubatie naast embryobeweging. 'X' duidt op het raakvlak tussen het chorioallantoïsche membraan en de luchtholte, en waar het gat moet worden gemaakt voor inenting van het ei. (B) Afbeelding van een dood embryo. Let op de afwezigheid van webachtige vasculatuur. Een gebrek aan embryobeweging zal ook worden waargenomen. (C) Diagram van de componenten van een embryonaal kippenei met de locaties van de luchtholte, dooierzak, vruchtzak, chorioallantoïsch membraan en allantoïsche vloeistof. (D) Verwijdering van de schaal om het choriallantoïsche membraan bloot te leggen. (E) Illustreert hoe de allantoïsche vloeistof en het embryo eruit moeten zien na de opening van het chorioallantoïsche membraan. Afkorting: NDV = Newcastle disease virus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Schematische schets van de algemene vergadering van het apparaat dat wordt gebruikt voor dieptefiltratie. Zorg ervoor dat de manometer stroomopwaarts van het dieptefilter is geïnstalleerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Tangentiële stroomfiltratie-instelling in de verschillende configuraties. Pijlen geven de richting van de vloeistofstroom aan. (A) Illustratie van de wijze waarop de TFF-cassette in elkaar zit. (B) Schema van het TFF-systeem in zijn "open" configuratie dat wordt gebruikt tijdens de zuivering en concentratie van vloeistof. (C) Schematische weergave van de TFF-opstelling wanneer vloeistof uit het systeem wordt geëlueerd, zoals gebruikt tijdens de elutie van het virus en de reinigingsoplossing. D) Schema van het TFF-systeem in zijn "gesloten" configuratie, dat wordt gebruikt tijdens het reinigen van het TFF-systeem. Afkorting: TFF = Tangentiële stromingsfiltratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en dialyse van geconcentreerd virus uit TFF. (A) Schematische weergave van de samenstelling van de iodixanoldichtheidsgradiënt. B) Virusbandingspatroon na ultracentrifugatie van virus geproduceerd met ml-buffer tijdens het zuiveringsproces. De belangrijkste virusbevattende band wordt aangeduid met een zwarte ovaal. (C) Typische grootte van een dialysecassette geladen met 10 ml virus bereid via een iodixanolgradiënt aan het einde van de dialyseprocedure. Afkorting: TFF = Tangentiële stroomfiltratie; ML = Mannitol-Lysine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Coomassie-gekleurde SDS-PAGE gel. Gel vergelijkt de aanwezigheid van verontreinigende eiwitten tussen ongezuiverde (baan 2) en gezuiverde (baan 3) mesogene NDV-voorraden wanneer 1 × 105 PFU werden geladen. Banen 1 en 4 = molecuulgewichtsladder (MW). NDV HN, F0 en zijn subeenheden na splitsing, F1 en F2, samen met hun respectieve molecuulgewichten27 worden weergegeven in wit lettertype. Afkortingen: SDS-PAGE = sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; NDV = Newcastle disease virus; PFU = plaquevormende eenheden; HN = hemagglutinine; F0 = Fusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Voorbeeld van een 96-well plaat lay-out die wordt gebruikt om de virustiter te bepalen met TCID50. De plaat is verdeeld in 12 kolommen, waarbij elke kolom een andere seriële verdunning vertegenwoordigt. Positieve putten (zoals bepaald door CPE, transgene expressie of IFA) worden grijs aangegeven. Gezien het aantal positieve putten in dit voorbeeld, wordt de verwachte titer na gebruik van de Spearman-Karber titercalculator (tabel 2) weergegeven in zowel TCID50/ml als PFU/ml. Afkortingen: TCID50 = mediane weefselkweek infectieuze dosis; CPE = cytopathisch effect; IFA = immunofluorescentietest; PFU = plaquevormende eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Vergelijking van de CPE na infectie van DF1-cellen met lentogene of mesogene NDV. Een MOI van 0,5 werd gebruikt na 10 uur incubatie (A-D) of 24 uur incubatie (E-H) onder verschillende kweekomstandigheden van DMEM + 15% FBS, DMEM + 15% FBS + 5% allantoïsche vloeistof, of DMEM + 2% FBS + 125 μg / ml trypsine. Schaalstaven = 200 μm. Afkortingen: CPE = cytopathisch effect; NDV = Newcastle disease virus; MOI = veelheid van infectie; FBS = foetaal runderserum; DMEM = Dulbecco's Modified Eagle's medium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Een voorbeeld van een situatie waarin IFA nodig is om een lentogeen NDV te titereren zonder een GFP-transgen. Vero-cellen werden gekweekt in DMEM met 2% FBS en 125 μg/ml trypsine. Er zijn beelden gemaakt van de 10-7 seriële verdunning. (A) Brightfield-afbeelding van geïnfecteerde cellen. (B) Illustreert het typische uiterlijk van gekleurde cellen wanneer IFA wordt gebruikt voor het detecteren van virussen. (C) Een samengevoegde afbeelding van (A) en (B). Schaalstaven = 100 μm. Afkortingen: IFA = immunofluorescentie assay; NDV = Newcastle disease virus; GFP = groen fluorescerend eiwit; FBS = foetaal runderserum; DMEM = Dulbecco's Modified Eagle's medium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: PCR- en RT-qPCR-primers voor de detectie van virusgensegmenten voor de ziekte van Newcastle. Primersets die worden gebruikt voor de specifieke amplificatie van twee regio's van het NDV-genoom. F-eiwitprimerset resulteert in de versterking van een gebied van het F-eiwit dat de F-eiwitsplitsingsplaats omspant. Transgene primer set versterkt het intergene gebied tussen de fosfoproteïne- en matrixgenen, de optimale transgene insertieplaats. Deze tabel bevat ook de primersequenties die zich richten op het virale L-gen21 en de L-gensonde die wordt gebruikt in de qRT-PCR-test. Afkortingen: PCR = polymerasekettingreactie; RT-qPCR = reverse-transcriptie kwantitatieve PCR; NDV = Newcastle disease virus. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Spearmann-Karber titer calculator. Deze interactieve spreadsheet bevat de juiste workflow en vergelijkingen voor het bepalen van de virusconcentratie met behulp van TCID50-resultaten op basis van putinoculatie in ml, verdunningsschema en het aantal replicaties per verdunning. De concentratie wordt gerapporteerd als volume in ml dat nodig is om 50% van de weefselkweek (TCID50) en plaquevormende eenheden per ml virussuspensie te infecteren. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende figuur S1: Bepaling van de iodixanolconcentraties. (A) Standaardcurve gegenereerd uit de absorptie van oplossingen met een bekende iodixanolconcentratie bij 340 nm. (B) De standaardcurve en vergelijking van (A) werden gebruikt om de concentratie van iodixanol in oplossing te bepalen na ultracentrifugatie van dichtheidsgradiënt, dialyse en polyethyleenglycolconcentratie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: Amplificatie en standaardcurve gegenereerd door qRT-PCR-assay van synthetisch 500 bp dubbelstrengs DNA-fragment van het NDV L-gen. De versterking (A) en de standaardcurve (B) werden gemaakt van monsters met tienvoudige seriële verdunning (1,0 × 109 kopieën tot 1,0 × 100 kopieën) van het DNA-fragment. Voor de versterkings- en standaardcurve lagen de monsters met 1,0 × 101 exemplaren en 1,0 × 100 exemplaren onder de drempel en leverden zij geen grenswaarde op van minder dan 35 Cp. De uiteindelijke standaardcurve werd gegenereerd op basis van monsters met 1,0 × 109 kopieën tot 1,0 × 102 kopieën van het DNA-fragment. (C) DNA-sequentie van het 500 nucleotide NDV L-genfragment dat wordt gebruikt om de standaardcurve in het qRT-PCR-protocol te genereren. Afkortingen: PCR = polymerasekettingreactie; RT-qPCR = reverse-transcriptie kwantitatieve PCR; NDV = Newcastle disease virus; Cp = kruisingspunt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S3: Laden en extraheren van NDV uit de dialysecassette. (A) De typische grootte van een dialysecassette na te zijn geladen met ongeveer 10 ml virusbevattende oplossing, geïsoleerd uit een gradiënt van sucrosedichtheid en afgebeeld aan het einde van de dialysestap. (B) Een voorbeeld van de resultaten die zijn verkregen bij het gebruik van iodixanoldichtheidsgradiënt ultracentrifugatie zonder ML-buffersuppletie. Omcirkeld is de doelvirusband voor verwijdering. Aangegeven door de pijlen is een extra band die beschadigde virionen kan bevatten. Merk op dat na opname van ML-buffer in het zuiveringsproces, deze band niet langer zichtbaar is. Afkortingen: NDV = Newcastle disease virus; ML = mannitol-lysine. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel S1: Geeft de stappen die nodig zijn voor het genereren van western blot-oplossingen en ML-buffer die tijdens het zuiveringsproces worden gebruikt. Afkortingen: SDS-PAGE = sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; TEMED = tetramethyleendiamine; ML = Mannitol-lysine. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Virussen die in preklinisch onderzoek als therapeutisch middel worden gebruikt, moeten sterk worden gezuiverd om toxiciteit te voorkomen wanneer ze in vivo worden toegediend 15. Als onvoorziene agentia of verontreinigingen niet worden verwijderd, kan dit leiden tot ernstige bijwerkingen die het therapeutische effect van het virale middel tenietdoen28. Aangezien NDV wordt geproduceerd in embryonale kippeneieren, zijn er verschillende verontreinigende ei-eiwitten, zoals ovalbumine, die moeten worden verwijderd voordat het in vivo wordt gebruikt in preklinische of klinische modellen29. Zelfs na intensieve zuivering wordt ovalbumine nog steeds gevonden29. Het verwijderen van deze verontreinigende eiwitten is een rigoureus proces dat aanzienlijke tijd en middelen vereist 15,22. Als NDV kan worden geproduceerd in een celgebaseerd systeem met voldoende hoge titers die nodig zijn voor in vivo toepassingen, kan dit het zuiveringsproces vereenvoudigen en de vertaling van NDV naar klinische omgevingen verbeteren. De productie van oncolytische NDV op basis van eieren is echter gebruikt in tal van klinische onderzoeken bij mensen30.

Bij elke stap van het zuiveringsproces kunnen monsters op bloedarsplaten worden gestreept als een extra kwaliteitscontrolemaatregel om de afwezigheid van bacteriële besmetting te garanderen.

De druk tijdens dieptefiltratie mag zich niet snel opbouwen. Dit is een teken van eiwitverontreiniging en zal het zuiveringsproces aanzienlijk vertragen en het gebruik van extra dieptefilters vereisen. Dieptefiltratie mag niet snel worden voltooid; deze stap duurt meestal 1-1,5 uur. Meestal resulteert een snelle voltooiing van de dieptefiltratiestap in een lagere virale titer.

Naarmate het virus geconcentreerd is, zou er een "bewolkte stroom" uit de retentaatlijn in het reservoir moeten komen. Dit suggereert dat er virus in de allantoïsche vloeistof zit die wordt geconcentreerd terwijl deze door de cassette gaat.

Tijdens zowel dieptefiltratie als tangentiële stromingsfiltratiestappen mag de druk nooit hoger zijn dan 10 psi. Het overschrijden van deze druk zal het virus afschudden. De toevoeging van ML-buffer aan de allantoïsche vloeistof fungeert als een stabiliserend middel en wordt verondersteld virale aggregatie te voorkomen, wat resulteert in het verhoogde herstel van infectieus virus zonder de filterbaarheid in gevaar te brengen.

De bovenstaande methode schetst een geschikte procedure om zowel lentogene als mesogene stammen van NDV onder BSL-2-omstandigheden te produceren, aangezien mesogene NDV geen selecte agent is in Canada. Dit resulteert in het genereren van high-titer voorraden die geschikt zijn voor gebruik in diermodellen. Net als andere protocollen in de literatuur die gebruik maken van zuiveringsmethoden voor grootte-uitsluiting, zoals dieptefiltratie en TFF, beperken deze methoden het gebruik van hardere, ultracentrifugatietechnieken waarbij virusherstel wordt verminderd in vergelijking met zuiveringsmethoden met grootte-uitsluiting15.

Het gebruik van TFF biedt een element van schaalbaarheid, omdat TFF kan worden gebruikt om grote startvolumes te concentreren, in tegenstelling tot ultracentrifugatietechnieken. Bestaande NDV-zuiveringstechnieken worden in het bovenstaande protocol verbeterd door de vervanging van sucrose door iodixanol in de ultracentrifugatiestap, wat de kans op het verliezen van virus als gevolg van cassetteruptuur aan het einde van de dialysestap aanzienlijk vermindert, en de toevoeging van ML-buffer, die de filtratie verbetert en de opbrengst verhoogt.

Het gebruik van iodixanolgradiënten heeft de voorkeur boven sucrosegradiënten, omdat iodixanol minder stroperig en niet-toxisch is voor cellen en een "schoner" eindproduct oplevert31,32. Iodixanol verlaagde significant de niveaus van pro-inflammatoire cytokines en chemokines die aanwezig zijn na ultracentrifugatie van dichtheidsgradiënt van gezuiverd virus33. Voor zover wij weten, is dit de eerste keer dat iodixanol is gebruikt bij de zuivering van NDV. De concentratie van jodidinenol in een oplossing kan worden bepaald door de absorptie bij 340 nm te kwantificeren met verwijzing naar een standaardcurve. Dit kenmerk werd gebruikt om te bepalen dat NDV banden hebben bij ongeveer 15% jodidinenol en om te bevestigen dat het kan worden verwijderd door dialyse (aanvullende figuur S1B). Iodixanol werd aanvankelijk ontwikkeld als een contrastbeeldvormingsmiddel en we zagen geen bijwerkingen wanneer een 15% iodixanol-oplossing intraveneus en intranasaal werd toegediend aan C57BL/6-muizen. Dit suggereert dat dialyse om jodidinenol te verwijderen mogelijk niet nodig is, waardoor het zuiveringsproces met ongeveer 16 uur wordt verkort. Bovendien is sucrose hygroscopisch, waardoor de dialysecassette aanzienlijk opzwelt, waardoor het volume dat kan worden geïnjecteerd wordt beperkt en het risico op cassetteruptuur en verlies van virustoeneemt 34,35. Wanneer gelijke volumes joodxanol- en sucrosegeprepareerd virus in dialysecassettes werden geïnjecteerd, trad significant minder zwelling op in het met iodixanol bereide virus (vergelijk figuur 4C en aanvullende figuur S3A). Sucrose is echter een geschikter stabilisatiemiddel voor NDV dan iodixanol. Dit leidde tot de suppletie van de iodixanol gradiënt met ML buffer. Voorafgaand aan de toevoeging van ML-buffer aan het zuiveringsproces, was er een intensere band in de 10% iodixanolgradiënt waargenomen naast de doelband bij 15% (supplementale figuur S3B). Deze band bevat waarschijnlijk beschadigde of onvolledige virionen die tijdens het zuiveringsproces worden gegenereerd. Toevoeging van ML-buffer zorgt voor een betere filtratie van NDV terwijl de hygroscopische aard van het dichtheidsgradiëntmedium wordt geminimaliseerd, waardoor het risico op het scheuren van de dialysecassette wordt verminderd. De zwelling van de dialysecassette kan verder worden verminderd door dialyseren in 1x PBS aangevuld met 5% sucrose, omdat dit uiteindelijk is waar het virus in wordt opgeslagen.

Omdat NDV een negatief zintuig is, maakt enkelstrengs RNA-virus, het isoleren van RNA en het genereren van cDNA met behulp van willekeurige primers en specifieke primersets voor PCR, de sequencing van verschillende regio's van het genoom mogelijk vanuit één cDNA-reactie (tabel 1). Dit is belangrijk omdat hiermee het pathotype en de integriteit van het transgen en de transcriptionele regulerende elementen kunnen worden bevestigd. De splitsingsplaats van het lentogene NDV F-eiwit moet monobasisch zijn in plaats van polybasisch, aangezien NDV met polybasischklieven typisch mesogene of velogene pathotypen zijn en geclassificeerd als selecte middelen36,37. Dit protocol beschrijft ook een betrouwbare RT-qPCR-methode voor de high-throughput kwantificering van NDV-genomen. Voorafgaand aan het gebruik ervan in diermodellen en na de voltooiing van de andere kwaliteitscontroletests, moet acute toxiciteit worden beoordeeld bij 8 weken oude BALB/C-muizen. Deze stam wordt gekenmerkt als gevoeliger voor door virussen veroorzaakte toxiciteiten dan andere muizenstammen15. Bovendien geeft dit een indicatie van de nauwkeurigheid van de virustiter. Gewichtsverlies zal bijvoorbeeld worden waargenomen, maar het gewicht moet na 36-48 uur beginnen te stijgen. Als dit niet het geval is, is het mogelijk dat de virustiter hoger is dan aanvankelijk gemeld, wat te wijten kan zijn aan aggregatie van virale deeltjes. Dit eerste resultaat na de zuivering van een recombinant NDV leidde tot de opname van de ML-buffer gedurende het hele zuiveringsproces. Deze buffer is voorgesteld om de filterbaarheid en het herstel van het virus tijdens de zuiveringsprocessen te verbeteren38.

Bij het kwantificeren van de concentratie van infectieus virus door TCID50 kan het gebruik van IFA nodig zijn om NDV-infectie te visualiseren, vooral bij hogere verdunningen wanneer CPE mogelijk niet duidelijk is, of als het virus geen fluorescerend reportergen tot expressie brengt (figuur 8). Het primaire antilichaam dat voor IFA wordt gebruikt, is specifiek voor het ribonucleoproteïne van NDV, een eiwitcomplex dat associeert met het RNA-genoom tijdens genoomreplicatie. Omdat NDV een vogelvirus is, is de fibroblastcellijn van het kippenembryo, DF1, een optimale cellijn voor het beoordelen van virustiter. Typisch, virus-negatieve allantoïsche vloeistof wordt gebruikt als een middel om de trypsine-achtige proteasen te leveren die nodig zijn door lentogene NTV's voor F-eiwitsplitsing39. Het gebruik van virusnegatieve allantoïsche vloeistof kan worden vermeden door trypsine aan te vullen met 125 μg/ml en tegelijkertijd de FBS-concentratie te verlagen tot 2%. Dit biedt een eenvoudig, kosteneffectief alternatief voor virusnegatieve allantoïsche vloeistof, terwijl het nog steeds de trypsine-achtige proteasen biedt die nodig zijn. Bij het vergelijken van deze twee kweekcondities bij een MOI van 0,5 over een tijdspanne van 24 uur, lijkt er weinig verschil te zijn tussen de twee, waarbij het medium wordt aangevuld met trypsine mogelijk resulteert in meer CPE (figuur 7). Andere cellijnen zoals Vero-cellen kunnen worden gebruikt met dezelfde kweekomstandigheden; de CPE is echter minder uitgesproken. Met behulp van het bovenstaande protocol met DF1-cellen moet NDV CPE binnen 24 uur duidelijk zijn. In het bijzonder moet men de vorming van syncytia met 24 uur zien (figuur 7E-H). Met behulp van de beschreven zuiveringsprocedure hebben we consequent NDV gezuiverd tot titers variërend van 1 × 109-3 × 1010 PFU / ml vanaf een startvolume van 0,8-1,0 L allantoïsche vloeistof.

Over het algemeen verbetert het beschreven protocol de eerder gepubliceerde NDV-zuiveringsprocedures door iodixanol te gebruiken als een dichtheidsgradiëntmedium in plaats van sucrose en door de toevoeging van ML-buffer om de filtratie te verbeteren. Daarnaast beschrijven we een aanvullende methode voor het titeren van NDV, omvatten we een gedetailleerde RT-qPCR-methode voor het bepalen van het NDV-kopienummer en definiëren we optimale omstandigheden voor het gebruik van trypsine in plaats van allantoïsche vloeistof tijdens virustitratie. Hoewel dit proces NDV-voorraden met een hoge titer genereert die systemisch in hoge doses kunnen worden toegediend, omvat deze procedure meerdere stappen, wat de variabiliteit tussen gebruikers kan vergroten en het potentieel voor besmetting kan introduceren. Een bijkomende beperking is de eis dat het uitgangsmateriaal van hoge kwaliteit moet zijn. Het is van cruciaal belang dat de allantoïsche vloeistof vrij is van vervuilende dooier, omdat dit de efficiëntie van de filtratie- en grootte-uitsluitingsstappen aanzienlijk vermindert. Over het algemeen is dit proces tijdrovend, maar kan het worden verkort door de dialysestap weg te laten. Deze procedure resulteert in een grotere opbrengst van in vivo-grade virus in vergelijking met andere zuiveringsmethoden15,18. Het vermogen om meer geconcentreerde NDV van hogere kwaliteit te produceren, breidt zijn mogelijkheden uit om te worden gebruikt als een oncolytisch middel of vaccinvector in diermodellen van ziekte in zowel preklinische als klinische omgevingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Acknowledgments

J.G.E.Y was de ontvanger van een Ontario Veterinary College PhD Scholarship en een Ontario Graduate Scholarship. Dit werk werd gefinancierd door Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants aan SKW (grant #304737) en LS (grant #401127).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin HyClone SH30042.02
1 mL Slip-Tip Syringe BD 309659
10 mL Luer-Lok Syringe BD 302995
10% Povidone Iodine Solution LORIS 109-08
15 mL Conical Tubes Thermo-Fisher 14955240
18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle BD 305180
18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle BD 305196
25 G x 5/8 in Needle BD 305122
2-Mercaptoethanol Thermo-Fisher 03446I-100
30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 BioRad 1610158
4% Paraformaldehyde-PBS Thermo-Fisher J19943-K2
5 mL Luer-Lok Syringe BD 309646
96 Well Tissue Culture Plate - Flat Bottom Greiner Bio One 655180
Acetic Acid, Glacial Thermo-Fisher A38-212
Agarose Froggabio A87-500G
Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse Invitrogen A11001
Allegra X-14 Centrifuge Beckman Coulter B08861
Ammonium Persulfate BioRad 161-0700
Bleach (5%) Thermo-Fisher 36-102-0599
Broad, unserrated tipped forceps Thermo-Fisher 09-753-50
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich 114405-25G
Centramate Cassette Holder PALL CM018V
ChemiDoc XRS+ BioRad 1708265
CO2 Incubator Thermo-Fisher
Coomassie Brilliant Blue R-259 Thermo-Fisher BP101-50
DF1 Cells ATCC CRL-12203
Diet Gel Recovery ClearH2O, INC 72-01-1062
Digital 1502 Sportsman Egg Incubator Berry Hill 1502W
D-Mannitol Sigma-Aldrich M4125-500G
Egg Candler Berry Hill A46
Ethanol (70%) Thermo-Fisher BP82031GAL
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O Thermo-Fisher BP2482-500
Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) Cole-Parmer 06349-50
Fetal Bovine Serum Gibco 12483-020
Fine Point High Precision Forceps Thermo-Fisher 22-327379
Fluorescent Microscope ZEISS AXIO Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein
Freeze Dry System Freezone 4.5 LABCONCO
GiBOX Gel Imager Syngene Imaging of Agarose Gels
Glycerol Thermo-Fisher G33-1
Glycine Thermo-Fisher BP381-5
High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit Thermo-Fisher 4368814
High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium Cytiva SH30022.01
Humidity Kit Berry Hill 3030
Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile)
L-Lysine Monohydrochloride Sigma-Aldrich 62929-100G-F
Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT Cole-Parmer 41507-44
Masterflex L/S Digital Drive Cole-Parmer RK-07522-20 Peristaltic Pump with digital display
Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing Cole-Parmer RK-07514-10
Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 Cole-Parmer 96420-16 BioPharm Platinum-Cured Silicone
MC Pro 5 Thermocycler Eppendorf EP950040025
Methanol Thermo-Fisher A412-4
Mini Protean Tetra Cell BioRad 1658000EDU SDS-PAGE cast and running appartus
Mouse-Anti-NDV Novus Biologicals NBP2-11633 Clone 6H12
Normal Goat Serum Abcam AB7481
NP-40 Thermo-Fisher 85124
Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K PALL OS100T02
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System Thermo-Fisher B1A
PBS 10X Solution Thermo-Fisher BP399-20
Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 Sigma-Aldrich 81300-1KG
PowePac 300 BioRad Model 1655050 - for Agarose gel electrophoresis
Q5 High Fidelity 2X Master Mix New England Biolabs M0492S
QIA Amp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904
RedSafe Thermo-Fisher 50999562
Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL Thermo-Fisher 66380
Sodium Dodecyl Sulfate Thermo-Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide (Pellets) Thermo-Fisher S318-10
Specific pathogen free eggs CFIA NA Supplier will vary depending on location
Sucrose Thermo-Fisher S5-3
Supracap 50 Depth Filter PALL SC050V100P
Surgical Scissors Thermo-Fisher 08-951-5
Sw41Ti Rotor Beckman Coulter 331362 Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7
SX4750 Rotor Beckman Coulter 369702
SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes Beckman Coulter 359472
TEMED Invitrogen 15524-010
Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) Beckman Coulter 344059
Tris Base Thermo-Fisher BP152-5
Tubing Screw Clamp PALL 88216
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379-1L
Utility Pressure Gauges Cole-Parmer 68355-06

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, S. H., Samal, S. K. Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines. Viruses. 8 (7), (2016).
  2. Kortekaas, J., et al. Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector. Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).
  3. Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies. Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).
  4. Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains. Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).
  5. Matuszewska, K., et al. Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).
  6. McAusland, T. M., et al. Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).
  7. Warner, B. M., et al. Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease. iScience. 24 (11), 103219 (2021).
  8. Sun, W., et al. Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate. EBioMedicine. 62, (2020).
  9. Sun, W., et al. A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine. Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).
  10. Xu, Q., et al. Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo. International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).
  11. Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy. Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).
  12. Ricca, J. M., et al. Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy. Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).
  13. Zamarin, D., et al. Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy. Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).
  14. Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy. Biomedicines. 7 (3), (2019).
  15. Santry, L. A., et al. Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).
  16. Cassel, W. A., Murray, D. R. A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate. Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).
  17. Plitt, T., Zamarin, D. Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations. Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).
  18. Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).
  19. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  20. Hegde, N. R. Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).
  21. Fulber, J. P. C., et al. Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures. Vaccines. 9 (11), 1335 (2021).
  22. Ungerechts, G., et al. Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018 (2016).
  23. Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830 (2013).
  24. Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression. The Journal of General Virology. 96, Pt 1 40-45 (2015).
  25. van Vloten, J. P., et al. Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).
  26. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85 (2016).
  27. Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. Structure of the Ulster strain Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase reveals auto-inhibitory interactions associated with low virulence. PLoS Pathogens. 8 (8), (2012).
  28. Sheets, R. L. Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines. Vaccine. 31 (26), 2791-2795 (2013).
  29. Chung, E. H. Vaccine allergies. Clinical and Experimental Vaccine Research. 3 (1), 50 (2014).
  30. Schirrmacher, V. Fifty years of clinical application of Newcastle disease virus: time to celebrate. Biomedicines. 4 (3), (2016).
  31. Ajamian, F., et al. CCL5 persists in RSV stocks following sucrose-gradient purification. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 169-176 (2020).
  32. Axis-Shield. Axis-Shield OptiPrepTM The ideal density gradient medium for isolation of blood cells. , (2020).
  33. Mita, A., et al. Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations. Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).
  34. Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient. Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).
  35. Zhou, Y., et al. A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation. Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).
  36. Zhao, H., Peeters, B. P. H. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).
  37. Cheng, X., et al. Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy. Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).
  38. Chen, T. -F., Jang, J. -W., Miller, J. A. STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEHÜLLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPPÉS FILTRABLES ET STABLES (84). EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , Designated Contracting States: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR 1-14 (2007).
  39. Wang, Y., et al. Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity. PLOS ONE. 12 (9), 0183923 (2017).

Tags

Kankeronderzoek Nummer 183
Productie van High-titer Recombinant Newcastle Disease Virus uit Allantoic Fluid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yates, J. G. E., Leacy, A., Pham, P. … More

Yates, J. G. E., Leacy, A., Pham, P. H., Zielinska, N., Tusnadi, E. A., Susta, L., Wootton, S. K. Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid. J. Vis. Exp. (183), e63817, doi:10.3791/63817 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter