Summary
Аутоиммунный энцефалит – это новая категория антителоопосредованных заболеваний центральной нервной системы. Нейроны гиппокампа могут быть использованы для обнаружения и характеристики этих антител. В данной статье представлен протокол первичной клеточной культуры и иммуноокрашивания для определения аутоантител в сыворотке и спинномозговой жидкости пациентов.
Abstract
За последние 15 лет была охарактеризована новая категория опосредованных антителами заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) и теперь определяется как «аутоиммунный энцефалит» (АЭ). В настоящее время известно 17 синдромов АЭ, и все они связаны с антителами против поверхности нейрональных клеток или синаптическими белками. Клинические синдромы являются сложными и варьируются в зависимости от типа ассоциированного антитела. Наиболее известным из этих заболеваний является энцефалит анти-N-метил-D-аспартатного рецептора (NMDAR), который является заметным нервно-психическим расстройством, связанным с тяжелыми нарушениями памяти и поведения. Ассоциированные антитела реагируют с субъединицей GluN1 NMDAR в N-концевом домене. Подход, наиболее часто используемый для обнаружения и характеристики антител к АЭ, включает культуру диссоциированных, фетальных, грызуновых нейронов гиппокампа. В процессе характеристики антител живые нейроны в культуре подвергаются воздействию сыворотки или ликвора пациента, и обнаружение реактивности указывает на то, что сыворотка или образцы ликвора пациента содержат антитела против нейронных поверхностных антигенов. Культуры гиппокампа также могут быть использованы для определения того, являются ли антитела у пациентов потенциально патогенными, изучая, вызывают ли они структурные или функциональные изменения нейронов. Уровень успеха этих исследований зависит от качества культур и от протоколов, используемых для получения и обнаружения реактивности образцов пациентов. В данной статье представлен оптимизированный протокол для первичной клеточной культуры нейронов гиппокампа плодных крыс в сочетании с иммуноокрашиванием для определения наличия антител в сыворотке или ликворе пациентов. Также представлен пример того, как исследовать потенциальные патогенные эффекты антител NMDAR с использованием культивируемых нейронов и визуализации кальция.
Introduction
Аутоиммунный энцефалит (АЭ) является недавно обнаруженной категорией заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), опосредованных антителами, которые нацелены на поверхность нейронов или синаптические белки 1,2. Клинические признаки варьируются в зависимости от антитела, но обычно включают нарушение памяти и познания, измененное поведение и психиатрические симптомы, аномальные движения, дисфункцию сна, снижение уровня сознания и судороги. Эти расстройства могут поражать людей всех возрастов, причем некоторые типы AE преимущественно поражают детей и молодых людей2.
За последние 15 лет было описано 17 синдромов АЭ с антителами против специфических нейрональных поверхностных/синаптических белков (таблица 1). Несколько примеров нейрональных мишеней включают синаптические возбуждающие рецепторы NMDAR 3,4 и AMPAR5, синаптический ингибирующий рецептор GABAbR6, нейронально секретируемый белок LGI17 и молекулу клеточной адгезии IgLON58. Для большинства из этих АЭ исследования показали, что антитела нарушают структуру или функцию их целевого антигена, сильно поддерживая патогенную роль. Например, при анти-NMDAR энцефалите антитела реагируют с N-концевым доменом субъединицы GluN1 NMDAR, производя селективную и обратимую интернализацию этих рецепторов, что приводит к заметным нервно-психическим изменениям 4,9,10,11. Таким образом, идентификация любого из 17 известных антител в сыворотке или ликворе пациента также может быть использована в качестве диагностического теста, который устанавливает диагноз конкретной АЭ.
Один из методов, наиболее часто используемых для идентификации и характеристики этих антител, включает использование культур диссоциированных, фетальных, грызунов гиппокампальных нейронов. Эти культуры полезны по нескольким причинам: эмбриональный мозг легко диссоциируется и содержит низкий уровень глиальных клеток, основного источника загрязнения в нейронных культурах12; клеточная популяция гиппокампа относительно однородна по сравнению с большинством других областей ЦНС, причем пирамидальные клетки составляют подавляющее большинство13,14; культуры получают из эмбрионов поздней стадии, когда генерация пирамидных нейронов завершена, но гранулярные клетки еще не развились, что еще больше увеличивает однородность культуры; при культивировании пирамидальные нейроны выражают большую часть своих основных фенотипических особенностей, способны образовывать хорошо развитые дендриты и устанавливать синаптически связанные сети, которые могут быть использованы для структурных и электрофизиологических исследований12,13; поскольку антитела не могут проникать в живые нейроны, использование живых культур позволяет идентифицировать антигенные мишени, которые находятся на поверхности клетки; а иммунопреципитация комплекса антитело-антиген из нейрональных культур позволяет идентифицировать антиген-мишень5.
Успех исследований с использованием нейронных культур в значительной степени зависит от качества культур и протоколов, используемых для оценки иммунореактивности сыворотки или спинномозговой жидкости пациента (CSF). Переменные, которые могут влиять на культуры, включают процедуры выделения гиппокампа до развития культуры, диссоциацию ткани, плотность покрытия, используемую поверхность роста и составсреды 13,15,16. В этой статье представлен оптимизированный протокол для первичной клеточной культуры нейронов гиппокампа плодных крыс в сочетании с флуоресцентным иммуноокрашиванием, которое может быть использовано для определения наличия антител против известных антигенов AE и потенциально новых поверхностных мишеней. Он также предоставляет пример того, как исследовать патогенные эффекты антител NMDAR с помощью методов визуализации живых клеток с использованием культивируемых нейронов гиппокампа, экспрессирующих генетически закодированный индикатор кальция (GECI) из семейства GCaMP, GCaMP5G.
| Целевой белок | Функция белка | Сотовый отсек | Основной синдром |
| НМДАР | Ион Шанель | Синаптический белок | Анти-NMDAR энцефалит |
| АМПАР | Ион Шанель | Синаптический белок | Лимбический энцефалит |
| Глюк2 | Ион Шанель | Синаптический белок | Энцефалит |
| ГАБААР | Ион Шанель | Синаптический белок | Энцефалит |
| ГАБАбР | Метаботропный рецептор | Синаптический белок | Лимбический энцефалит |
| мГлюР1 | Метаботропный рецептор | Синаптический белок | Энцефалит |
| мГлюР2 | Метаботропный рецептор | Синаптический белок | Энцефалит |
| мГлуР5 | Метаботропный рецептор | Синаптический белок | Энцефалит |
| Д2Р | Метаботропный рецептор | Синаптический белок | Базальный ганглиевый энцефалит |
| ЛГИ1 | Молекула адгезии | Белок клеточной поверхности | Лимбический энцефалит |
| КАСПР2 | Молекула адгезии | Белок клеточной поверхности | Лимбический энцефалит |
| ИгЛОН5 | Молекула адгезии | Белок клеточной поверхности | Анти-IgLON5 болезнь |
| Нейрексин-3α | Молекула адгезии | Белок клеточной поверхности | Энцефалит |
| ДНЕР (Тр) | Трансмембранный белок | Белок клеточной поверхности | Энцефалит |
| ОЭЗ6Л | Трансмембранный белок | Белок клеточной поверхности | Энцефалит |
| Амфифизин | Структурная молекула | Белок клеточной поверхности | Лимбический энцефалит |
| DPPX | Пептидаза | Белок клеточной поверхности | Энцефалит |
Таблица 1: Антитела к поверхности нейрональной клетки и синаптические белки.
Protocol
Все процедуры были одобрены местным комитетом по этике Университета Барселоны в соответствии с европейскими (2010/63/UE) правилами об использовании и уходе за экспериментальными животными. Письменное информированное согласие было получено от пациентов, и исследование было одобрено местным институциональным наблюдательным советом для использования образцов человека (Hospital Clínic, HCB/2018/0192).
ПРИМЕЧАНИЕ: Текущий протокол состоит из трех частей. Первый – для установления нейронных культур, второй – для обнаружения поверхностных антител с использованием живых культур нейронов, а третий – для определения патогенности этих антител.
ЧАСТЬ 1: Создание диссоциированных, фетальных, грызунов гиппокампальных нейронных культур
1. Подготовительные этапы
- Поли-L-лизиновое покрытие поверхностей покрытия (за 3 дня до рассечения)
- Подготовьте боратный буфер, добавив 2,38 г борной кислоты и 1,27 г буры в 500 мл дистиллированной воды и помешивая в течение 15 мин до растворения. Под капотом стерилизуют буферный раствор путем фильтрации (размер пор 0,2 мкм), этикетки и хранят при комнатной температуре (RT).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор стабилен и может использоваться в течение 6 месяцев.
ВНИМАНИЕ: При приготовлении боратного буфера надевайте рекомендуемые средства индивидуальной защиты. - Приготовьте раствор поли-L-лизина (ФАПЧ) (100 мг/мл), добавив 1 г ФАПЧ к 10 мл дистиллированной воды и перемешивая до растворения. Приготовьте 500 мкл аликвот складского раствора ФАПЧ. Чтобы достичь конечной концентрации 1 мг/мл, добавляют 500 мкл аликвоты ФАПЧ к 50 мл боратного буфера и закручивают до растворения и стерилизуют раствор путем фильтрации (размер пор 0,2 мкм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор стабилен и может использоваться в течение 6 месяцев. - Подготовьте поверхности к покрытию. Используйте чехлы диаметром 12 мм для процедур иммуноокрашения и посуду со стеклянным дном для исследований, которые будут включать визуализацию живых нейронов. При использовании чехлов, автоклавируйте, а затем поместите пять обложек в каждое блюдо (диаметр 3,5 см).
ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина обшивки влияет на качество и интенсивность сигнала полученных изображений. Большинство объективов микроскопа рассчитаны на крышки No1.5. Выберите подходящие обшивки в соответствии с настройкой и методами визуализации. - Под капюшоном добавьте 1,5 мл раствора ФАПЧ в каждое блюдо (блюдо со стеклянным дном или блюдо размером 3,5 см с пятью крышками). Убедитесь, что все крышки погружены в воду и хранятся в RT в течение 24 часов.
- За 2 дня до рассечения аспирировать раствор ФАПЧ и промыть стерильной водой без эндотоксинов, убедившись, что крышки погружены в воду. Держите воду в посуде и храните в RT в течение 24 ч.
- За 1 день до рассечения аспирировать воду и заменить ее питательной средой NB + B27 (см. ниже), а посуду поместить в инкубатор при 37 °C в течение 24 ч.
- Подготовьте боратный буфер, добавив 2,38 г борной кислоты и 1,27 г буры в 500 мл дистиллированной воды и помешивая в течение 15 мин до растворения. Под капотом стерилизуют буферный раствор путем фильтрации (размер пор 0,2 мкм), этикетки и хранят при комнатной температуре (RT).
- Приготовление культуральной среды и стоковой раствора (за 1 день до вскрытия)
- Модифицированная орлиная среда Dulbecco (DMEM): До 500 мл DMEM High Glucose (4,5 г / л) без L-глутамина и фенола красного, добавьте 50 мл лошадиной сыворотки, 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10 мл L-глутамина (200 мМ), 10 мл пирувата натрия (100 мМ), 10 мл пенициллина-стрептомицина (10 000 Ед / мл). Фильтровать (размер пор 0,2 мкм) и хранить в аликвотах по 5 мл при 4 oC с плотно закрытым колпачком.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор стабилен и может использоваться в течение 1 месяца. - Нейробазальная (NB) среда, дополненная B27 (NB + B27): К 50 мл среды NB без фенольного красного цвета, добавьте 1 мл добавки B27.
- Среда Hibernate-E, дополненная B27 (Hibernate + B27): К 50 мл среды Hibernate-E добавьте 1 мл добавки B27.
- Внеклеточный физиологический раствор (EPS): к 1 л стерильной воды добавляют следующее в указанных конечных концентрациях: NaCl (140 мМ), KCl (3,5 мМ), HEPES (10 мМ), глюкозу (20 мМ) и CaCl2 (2 мМ). Перемешайте до растворения и отрегулируйте рН до 7,4, добавив NaOH (0,5 М) или HCl (0,5 М). Под капотом стерилизуют фильтрацией (размер пор 0,2 мкм) и хранят при 4 oC.
- Модифицированная орлиная среда Dulbecco (DMEM): До 500 мл DMEM High Glucose (4,5 г / л) без L-глутамина и фенола красного, добавьте 50 мл лошадиной сыворотки, 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10 мл L-глутамина (200 мМ), 10 мл пирувата натрия (100 мМ), 10 мл пенициллина-стрептомицина (10 000 Ед / мл). Фильтровать (размер пор 0,2 мкм) и хранить в аликвотах по 5 мл при 4 oC с плотно закрытым колпачком.
- Оборудование и другие лабораторные материалы (день вскрытия)
- Установите водяную баню при температуре 37 °C. Нагрейте следующие аликвоты: 50 мл HBSS и 5 мл DMEM.
- Стерилизуйте следующие инструменты, погружаясь в стакан, содержащий абсолютный этанол (рисунок 1B): щипцы, изогнутые щипцы, ножницы, тонко изогнутые щипцы, тонкие прямые щипцы, хирургические ножницы, тонкоугольные щипцы и прецизионные пружинные ножницы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы защитить инструменты, поместите мягкий материал (например, научные прецизионные салфетки) в нижней части стакана. - Заполните два лотка льдом и поместите следующие предметы.
- Лоток для льда 1 (Рисунок 1C): Поместите хирургические инструменты в стакан с абсолютным этанолом, стакан с HBSS для полоскания хирургических инструментов, 10-сантиметровую посуду с HBSS для размещения эмбрионов, 6-сантиметровую чашку с HBSS для размещения головок эмбрионов и 6-сантиметровую чашку с Hibernate + B27 для размещения мозга эмбрионов.
- Лоток для льда 2: Поместите 1 мл аликвоты трипсина 2,5% и блюдо 3,5 см с Hibernate + B27 для рассеченного гиппокампа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для этой процедуры, зависит от опыта исследователя и количества эмбрионов, подлежащих вскрытию. Поэтому лед должен оставаться замороженным в течение необходимого количества времени. Для этой цели рекомендуются полистирольные лотки.
2. Рассечение и посев (рисунок 1)
- Изоляция гиппокампа
ПРИМЕЧАНИЕ: Беременные крысы с эмбрионами в E18 подвергаются эвтаназии непосредственно перед началом протокола в соответствии с местным комитетом по этике Университета Барселоны, следуя европейским (2010/63/UE) правилам об использовании и уходе за экспериментальными животными. В этом протоколе в качестве метода эвтаназии использовалось вдыхание углекислого газа (CO2).- Рассекните крысу на уровне брюшины живота с помощью щипцов и ножниц. Извлеките матку с эмбрионами E18 и поместите ее в 10-сантиметровую посуду, которая была охлаждена на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно избегать прикрепления волос крыс к эмбрионам. Рекомендуется использовать обильное количество 70% этанола для стерилизации живота. Начиная с этого шага, работайте внутри капота на лотке для льда 1. - Откройте эмбриональные мешочки и перенесите эмбрионы в 10-сантиметровую чашку с HBSS, убедившись, что эмбрионы полностью погружены.
- Снимите головку эмбриона ножницами и поместите ее в 6-сантиметровую посуду с HBSS. Повторите этот процесс со всеми эмбрионами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание загрязнения все ткани, за исключением эмбриональных головок, должны быть выброшены в контейнер с винтовой крышкой. - Удерживайте головку эмбриона тонко изогнутыми щипцами и прокалывайте орбиты парой тонко-прямых щипцов, входящих под углом 45°, а затем выпускают тонко изогнутые щипцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Щипцы не должны проходить через мозг, поэтому важно поддерживать угол при входе. - Рассекните кожу и череп хирургическими ножницами, начиная от затылочной кости до лобной кости. Удалите мозг парой тонко изогнутых щипцов и поместите его в 6-сантиметровую тарелку с Hibernate + B27. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока все мозги не будут восстановлены.
- Стрельцы разделяют теленцефалоны тонкими прямыми щипцами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого шага, рассечение гиппокампа проводится под стереомикроскопом. Рекомендуется использовать шарнирно-сочлененные лампы так, чтобы свет освещал поверхность рассечения с боков. Также рекомендуется использовать черный фон, так как это обеспечивает большую контрастность, позволяя лучше различать гиппокамп. - Приготовьте блюдо размером 10 см, поместив капли Hibernate + B27 на расстояние 1 см (например, по кругу). Поместите один теленцефалон на каплю Hibernate + B27 и визуализируйте через рассекающий прицел (рекомендуется 1,25-кратное объективное увеличение).
- Тщательно очистите мозговые оболочки и удалите таламус, чтобы лучше визуализировать гиппокамп.
- Рассекните гиппокамп прецизионными пружинными ножницами и поместите его в тарелку размером 3,5 см с Hibernate + B27 в лотке для льда 2. Повторяйте для каждого теленцефалона до тех пор, пока не будут собраны все гиппокампы.
- Аккуратно соберите все гиппокампы пипеткой Пастера и переложите их в трубку объемом 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите минимальный объем Hibernate + B27 при сборе гиппокампа, чтобы не разбавлять трипсин.
- Рассекните крысу на уровне брюшины живота с помощью щипцов и ножниц. Извлеките матку с эмбрионами E18 и поместите ее в 10-сантиметровую посуду, которая была охлаждена на льду.
- Диссоциация клеток
- Ферментативная диссоциация гиппокампа
- В трубку объемом 50 мл, содержащую гиппокамп, добавьте 1 мл 2,5% трипсина и доведите его до объема 5 мл с HBSS. Инкубировать в течение 15 мин на водяной бане при 37 °C.
- Чтобы разбавить трипсин, добавляют 10 мл предварительно нагретого HBSS и инкубируют в течение 5 мин на водяной бане при 37 °C.
- Перенесите гиппокампы, которые теперь выглядят как слизевая масса, в трубку объемом 50 мл с микропипеткой 1000 мкл, добавьте 6 мл предварительно нагретого HBSS и инкубируйте в течение 5 минут на водяной бане при 37 °C.
- Механическая диссоциация гиппокампа
- Переложите массу на трубку объемом 2 мл с коническим дном, взяв минимальный объем. Добавьте 1 мл предварительно нагретой среды DMEM. Гомогенизируйте гранулу микропипеткой объемом 1000 мкл, осторожно аспирируя вверх и вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно избегать образования пузырьков при аспирации, так как пузырьки могут лизировать клетки. - Повторите аспирацию вверх и вниз с помощью предварительно вытянутой стеклянной пипетки (10x-20x), с ее наконечником, соприкасающимся с коническим дном трубки. Избегайте образования пузырьков. В конце этого этапа смесь должна быть полупрозрачной.
- После однородного смешивания таким образом, чтобы смесь была полупрозрачной, переложите смесь в трубку, содержащую 4 мл среды DMEM при 37 °C, и гомогенизируйте стеклянной пипеткой путем пипетки вверх и вниз.
- Переложите массу на трубку объемом 2 мл с коническим дном, взяв минимальный объем. Добавьте 1 мл предварительно нагретой среды DMEM. Гомогенизируйте гранулу микропипеткой объемом 1000 мкл, осторожно аспирируя вверх и вниз.
- Ферментативная диссоциация гиппокампа
- Посев клеток
- Подсчитайте ячейки. Количество нейронов в растворе можно подсчитать в соответствии со стандартными лабораторными процедурами.
ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах по визуализации для обнаружения антител и активности кальция концентрация 50 000 клеток на чашку размером 3,5 см является оптимальной. - Удерживая ячейки во взвешенном состоянии, извлеките расчетный объем и тарелку в посуду размером 3,5 см, содержащую покрытые ФАПЧ крышки, или в стеклянную посуду со стеклянным дном, покрытую ФАПЧ.
- Равномерно распределите клетки по посуде, мягко встряхивая в перекрестных движениях (вперед и назад, затем из стороны в сторону; повторяйте по мере необходимости) и поместите посуду в инкубатор CO2 (5%).
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать перекрестные движения, чтобы избежать оседания клеток на периферии тарелки. - Каждую неделю добавляйте примерно 1 мл NB+B27, чтобы культура не высохла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Через 2 недели (14 дней in vitro [div]) нейроны созревают и выражают все факторы, которые будут использоваться для экспериментов. Общее среднее число нейронов, полученных с помощью этого протокола, составляет примерно 2,5 х 106 нейронов, поступающих в среднем из 12 эмбрионов E18 на беременную крысу.
- Подсчитайте ячейки. Количество нейронов в растворе можно подсчитать в соответствии со стандартными лабораторными процедурами.
ЧАСТЬ 2: Использование культур нейронов гиппокампа для обнаружения антител в белках поверхности нейронных клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола демонстрирует, как культуры гиппокампа используются для идентификации антител против NMDAR в сыворотке и / или CSF пациентов с анти-NMDAR энцефалитом. Флуоресцентное иммуноокрашивание используется для визуализации реактивности в живых нейронах, но также могут быть использованы другие методы визуализации. Подходящим контролем для этого эксперимента будет сыворотка или ликвор от здорового человека. При использовании человеческих образцов имейте в виду, что может потребоваться одобрение институционального этического комитета.
3. Живое флуоресцентное иммуноокрашивание
- Используйте 14 div-клеток, которые были выращены на крышках (50 000 клеток на блюдо размером 3,5 см, содержащее пять обложек).
- Внутри вытяжки промойте крышки с предварительным нагретым до 37 °C NB.
- Добавьте образец, который в этом случае содержит анти-NMDAR антитела (используемые в качестве первичного антитела), разведенные в среде NB при 1:200 для сыворотки или 1:2 для CSF и инкубируем 1 ч при 37 °C (внутри инкубатора CO2 (5%)
- Тщательно смойте PBS 3x на RT.
- Добавьте раствор для фиксации (4% формальдегид в PBS) и инкубируйте на RT в течение 5 мин.
ВНИМАНИЕ: При обращении с 4% формальдегидом работайте внутри капота и носите рекомендуемые средства индивидуальной защиты. - Мойте 3x с PBS в течение 5 минут каждый.
- Добавьте вторичное антитело Goat anti-Human AF488 в разведении 1:1000 и инкубируйте при RT в течение 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инкубации защитите от воздействия света, покрыв алюминиевой фольгой. - Мойте 3x с PBS в течение 5 минут каждый. Промыть дистиллированной водой
- Установите крышки с помощью жидкой монтажной среды (например, антивядающего монтажного носителя с DAPI; приблизительно 7 мкл), аспирируйте любую оставшуюся жидкость и промойте дистиллированной водой. Нейроны теперь готовы к флуоресцентной визуализации.
ВНИМАНИЕ: При обращении со монтажной средой носите рекомендуемые средства индивидуальной защиты.
ЧАСТЬ 3: Демонстрация патогенных эффектов антител с помощью визуализации кальция
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола демонстрирует, как определить, оказывают ли антитела у пациентов функциональное влияние на культуры, что предполагает патогенность. Для того, чтобы повысить значимость эффектов, был использован пул ликвора от восьми пациентов. Кальциевая активность живых культур регистрировалась при химической стимуляции (NMDA + глицин) с использованием индикатора кальция флуоресценции GECI (GCaMP5G). Эти исследования требуют инвертированного флуоресцентного микроскопа с клеточной камерой, которая может поддерживать необходимые физиологические условия нейронов.
4. Визуализация кальция
- Используйте 14-18 div-клеток, которые были выращены на покровных листах (50 000 клеток на тарелку размером 3,5 см с пятью крышками)
- За 1 неделю до визуализации добавьте вирусный вектор pAAV2-CAG-GCaMP5G в 2,5 x 1010 ГК/мл к клеткам и инкубируйте в течение 5-7 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот коммерчески доступный, предварительно упакованный вектор серотипа AAV 2 чрезмерно экспрессирует генетически закодированный индикатор кальция GCaMP5G под промотором CAG. - За 1 день до визуализации добавляют образец пациента (в этом примере пул ликвора разбавляют 1:25 в NB + B27) и инкубируют в течение 24 ч. Всегда фильтруйте образцы человека (размер пор 0,2 мкм) перед использованием, чтобы избежать загрязнения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих исследований контроль ликвора от здоровых субъектов должен проводиться параллельно. - В день визуализации подготовьте установку визуализации и установите клеточную камеру микроскопа на 37 ° C, заполните полосу дистиллированной водой и вливайте 5% CO2 для поддержания физиологических условий клеток.
- В вытяжке вымойте ячейки с шага 3 с 3 мл EPS, предварительно нагретой до 37 °C
- Накройте клетки 2,45 мл EPS и перенесите их в камеру микроскопа. Добавьте NBQX (10 мкМ) для блокирования рецепторов AMPA и KA для визуализации исключительно ответа рецептора NMDA.
- В перевернутом флуоресцентном микроскопе, оснащенном ртутной лампой и кубом фильтра FITC, приобретите 2-минутный фильм с кадрами, записанными каждые 100 мс (спонтанная активность).
ПРИМЕЧАНИЕ: Использовался 20-кратный воздушный объектив NA 0,75, а изображения (512 x 512 пикселей, 16-битные оттенки серого) делались каждые 100 мс с помощью камеры sCMOS. - Приобретите второй фильм продолжительностью 4 минуты с кадрами, записанными каждые 100 мс. Вскоре после начала приема добавьте в блюдо стимулирующий раствор (NMDA [100 мкМ] + глицин [1 мкМ]).
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление среды в тарелку создаст турбулентность, которая может нарушить условия визуализации (фокус, интенсивность флуоресценции и / или неспецифический фоновый сигнал). Не добавляйте более 50 мкл раствора в заполненную тарелку объемом 2,5 мл, чтобы уменьшить вероятность таких изменений. - Используя программное обеспечение для обработки изображений (здесь использовался ImageJ), извлекайте флуоресцентный сигнал с течением времени, полученный при стимуляции, из культур, инкубированных с пациентом, и контролируйте образцы ликвора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Зонды GCaMP при связывании со свободными ионами кальция претерпевают конформационные изменения, заставляя их становиться ярче. Поэтому увеличение интенсивности флуоресценции коррелирует с притоком кальция из-за деполяризации нейронов. - Определите интересующие регионы (ROI) для анализа. Вручную сегментируйте сомы нейронов и добавьте ROI в менеджер ROI (Анализ инструментов > > Менеджер окупаемости инвестиций > Добавить). Сохраните окупаемость инвестиций в меню диспетчера ROI (Подробнее > Сохранить).
- Задайте измерения (Analyze > Set measurements) и выберите значение Средний серый. Извлеките профиль средней интенсивности флуоресценции из ячейки somas, щелкнув Дополнительно > Multi Measure, а затем сохраните таблицу, созданную в виде .xls электронной таблице.
- Выполните статистический анализ для сравнения флуоресценции между группами (CSF пациентов и CSF контроля).
Representative Results
Создание диссоциированных, фетальных, грызунов, культур гиппокампа
Протокол, представленный здесь, основан на влиятельных исследованиях по культивированию нервных клеток, выполненных Banker и Goslin15. Протокол был усовершенствован для получения нейронных культур с оптимальной морфологией, плотностью и чистотой для проведения исследований обнаружения нейронных поверхностных антител. Протокол вскрытия и посева разделен на три части (рисунок 1А). Первая часть, изоляция гиппокампа, состоит из хирургического извлечения живой ткани (рисунок 1А, левая панель). Как видно из рисунка, беременные крысы Wistar с эмбрионами E18 являются ключевым исходным материалом для успешной культуры. Как только мозг извлекается из эмбрионов E18, микрохирургия проводится под стереомикроскопом. С помощью соответствующих инструментов (рисунок 1B) и точного обращения можно отделить гиппокамп от остальной части нервной ткани. Расположение тканей в конкретных средах изображено на рисунке 1С. Вторая часть протокола состоит из диссоциации клеток гиппокампа. Он подразделяется на два этапа (рисунок 1А, средняя панель): ферментативная диссоциация и механическая диссоциация гиппокампа, в результате чего образуются неповрежденные, диссоциированные, одиночные клетки. Используя эту методологию, можно получить клеточные культуры без клеточных агрегатов, как показано на рисунке 2A-D. Третья часть протокола состоит из заполнения ячеек (рисунок 1А, правая панель). Эта часть протокола имеет решающее значение для корректировки плотности и однородности нейронной культуры в пластине. Подсчет клеток и посев 50 000 нейронов в области тарелки размером 3,5 см обеспечивает оптимальную плотность для проведения не только экспериментов по определению наличия антител к белкам поверхности нейронов клеток (рисунок 3), но и для анализа патогенности этих антител с помощью кальциевой визуализации (рисунок 4).
Рисунок 1: Визуальный протокол для первичных культур нейронов гиппокампа. (A) Блок-схема, показывающая три части протокола для подготовки диссоциированных клеточных культур нейронов гиппокампа эмбриональных крыс на E18. Протокол разделен на 1. Изоляция гиппокампа, 2. Диссоциация клеток и 3. Посев клеток. (B) Выбор рекомендуемых инструментов для изоляции гиппокампа сгруппирован в три категории: (1- Щипцы, 2 - Изогнутые щипцы, 3 - Ножницы) для сбора эмбрионов, (4 - Тонко изогнутые щипцы, 5 - Тонко-прямые щипцы, 6 - Хирургические ножницы) для извлечения мозга и (7 - Тонкоугольные щипцы, 8 - Прецизионные пружинные ножницы) для изоляции гиппокампа. (C) Схематическое изображение лотка для льда 1 с пластинами и средами, необходимыми для изоляции гиппокампа. Эмбрионы и головы помещаются в HBSS, тогда как мозг помещается в гибернированную среду + B27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Культуры нейронов гиппокампа при 18 div являются зрелыми, взаимосвязанными и экспрессируют структурные и функциональные белки.
В росте и созревании нейронных культур можно оценить две дифференцированные фазы: фазу поляризации нейрона (рисунок 2A,B) и фазу дендритного развития и построения синаптической сети (рисунок 2C,D). Клетки на 1 div равномерно распределены и прилипли к пластине, развивая вокруг тела клетки пластинку с незначительными нейритами, начинающими расширяться (рисунок 2A). После нескольких дней в культуре нейриты простираются на небольшое расстояние. Клетки демонстрируют значительную поляризацию, но чистый рост незначителен (рисунок 2B). После этой стадии синаптогенез становится заметным, и нейроны начинают соединяться. Нейронная сеть продолжает расти и становится все более сложной (рисунок 2C). При 18 div нейроны являются зрелыми и взаимосвязанными; построена нейронная сеть (рисунок 2D). Как только синаптические шипы сформированы и связаны, нейроны полностью поляризуются и экспрессируют все функциональные и структурные белки. Из многих белков, экспрессируемых зрелыми культивируемыми нейронами, нейронный рецептор NMDA (рисунок 2E) и синаптический белок PSD95 (рисунок 2F) были выбраны здесь в качестве репрезентативных маркеров. Кроме того, можно выборочно визуализировать аксоны, маркируя нейрофиламент (NF) (рисунок 2G) и визуализируя дендриты, нацеливаясь на белок MAP2 (рисунок 2H).
Рисунок 2: Временной ход созревания диссоциированных клеточных культур нейронов гиппокампа. (A-D) Фазоконтрастные изображения нейронов гиппокампа в течение первых 18 дней культивирования. (A) Нейроны при 1 деле при прикреплении к субстрату, покрытому ФАПЧ. (B) Появление малых нейритов в нейронах при 5 div. (C) Нейроны при 11 div развили длинные нейриты, которые удлиняются и приобретают аксональные характеристики. (D) Нейроны в 18 div являются зрелыми и сформировали нейронную сеть. Шкала (A-D) = 40 мкм. (E-H) Репрезентативные флуоресцентные изображения, полученные с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с использованием селективных маркеров для отображения зрелых нейронов при 18 div. Нейронные культуры были зафиксированы и иммуноокрашены антителами, которые избирательно окрашивают для (E) нейронального рецептора (NMDAR), (F) синаптического маркера (PSD95), (G) аксонального маркера (нейрофиламент, NF) и (H) дендритного маркера (MAP2). Шкала (E-H) = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Антитела в образцах пациентов реагируют с антигенами поверхности нейрональных клеток
Образцы (сыворотка и ликвор), полученные от пациентов с анти-NMDAR энцефалитом, содержат аутоантитела, которые распознают NMDAR, присутствующий на поверхности нейронов. Инкубация культур с образцами пациента производит интенсивный флуоресцентный сигнал на поверхности клетки и дендритах (рисунок 3А,С). Напротив, контрольные образцы не производят флуоресцентного сигнала при введении в нейронные культуры (рисунок 3B,D). Эти результаты показывают, как культуры могут быть использованы для скрининга образцов пациентов на антитела и могут привести к идентификации новых антител, которые нацелены на поверхность нейронных клеток.
Образец ликвора от пациента снижает внутриклеточную концентрацию кальция в NMDA-индуцированных культурах нейронов гиппокампа
Чтобы оценить влияние антител пациентов на нейронную активность (после 24 ч лечения), внутриклеточные транзиторы кальция оптически контролировали от культивируемых нейронов в режиме реального времени при NMDA-опосредованной стимуляции. Применение NMDA генерирует увеличение интенсивности флуоресценции, о чем свидетельствует изменение внутриклеточной зеленой флуоресценции (рисунок 4A и дополнительное видео 1). Нейроны, обработанные контрольным образцом ликвора, показали более высокую разницу в интенсивности флуоресценции (56%) при применении стимулятора по сравнению с клетками, обработанными образцом ликвора пациента. Были измерены различия в интенсивности флуоресценции и сопоставлены NMDA-опосредованные кривые стимуляции из данных, извлеченных из сомы клеток (рисунок 4B, C). Кривые стимуляции показывают, что в обоих сценариях наблюдался внутриклеточный приток кальция, но культуры, обработанные ликвором пациентов (серая линия), показали более низкий ответ, чем контрольные культуры (черная линия). Эти результаты демонстрируют, что антитела, присутствующие в ликворе пациентов, снижают клеточную активность из-за взаимодействия антител с NMDAR и, таким образом, вызывают патогенный эффект.
Рисунок 3: Антитела пациента реагируют с поверхностью нейрональных культур. (A,E) Сыворотка и ликвор у пациентов с анти-NMDAR энцефалитом реагируют с клеточной поверхностью живых нейронов гиппокампа крыс( (B,F), тогда как сыворотка и CSF у контрольных субъектов не показывают реактивности. Шкала (A,B,E,F) = 20 мкм. Изображение с более высоким увеличением дендрита (63x), показывающее типичную поверхностную картину реактивности для (C, G) сыворотки и ликвора пациента и (D, H) отрицательный для контрольной группы. Снимки были сделаны с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Антитела пациента уменьшают приток кальция в нейронах крыс, экспрессирующих GCaMP5G. (A) Введение стимулирующего раствора (NMDA [100 мкМ] + глицин [1 мкМ]) в культурах нейронов вызывало приток кальция, о чем свидетельствует увеличение внутриклеточной зеленой флуоресценции (пик стимуляции) по сравнению с изображением, сделанным перед стимуляцией (предварительной стимуляцией). Через 120 с интенсивность флуоресценции уменьшается и стабилизируется (постстимуляция). Культуры, получавшие ликвор пациентов, показали значительное снижение (56%) NMDA-опосредованного увеличения кальция по сравнению с ликвором контроля. Снимки были сделаны методом флуоресцентной микроскопии. Шкала бар = 20 мкм. (B) График одного из трех независимых экспериментов, представляющих интенсивность флуоресценции с течением времени (180 с) для культур, получавших ликвор контроля (черная линия) и ликвор пациента (серая линия) при стимуляции NMDA (синяя стрелка). n(CSF элементов управления) = 20 ячеек; n(Ликвор пациента) = 28 клеток. Данные представлены в виде среднего ± SEM. (C) Квадратные графики показывают медианный, 25-й и 75-й процентили. Усы указывают минимальное и максимальное значения. Оценка значимости проводилась методом двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA; p < 0,0001) и тестов Манна-Уитни U (p < 0,0001). Значение p < 0,05 считалось статистически значимым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительное видео 1: Видео, показывающее два нейрона гиппокампа, экспрессирующих GCaMP5G бок о бок: нейрон, обработанный ликвором контроля (слева), против нейрона, обработанного ликвором пациентов (справа). Применение NMDAR (стимуляция) генерирует увеличение интенсивности внутриклеточной флуоресценции в обоих случаях, но со значительно более высоким уровнем в нейроне, обработанном ликвором контроля, по сравнению с тем, который лечился ликвором пациентов. Изображения были сделаны с помощью флуоресцентной микроскопии и отредактированы с помощью ImageJ с применением таблицы подстановки (LUT) Fire. 1700 кадров (170 с); разгоняется в 5 раз. Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Растущее поле аутоиммунитета, опосредованного антителами, открыло окно возможностей для идентификации нейронных аутоантител, которые могут быть использованы для улучшения диагностики и лечения пациентов. Культуры нейронов гиппокампа являются важным инструментом для идентификации антител; поэтому важно выполнить стандартизированный протокол для получения надежных и воспроизводимых результатов. Наиболее важные шаги для рассмотрения, ограничения и устранение неполадок обсуждаются здесь.
Критические шаги этого протокола могут быть сгруппированы в три категории в зависимости от того, влияют ли они на чистоту, однородность или жизнеспособность нейронов гиппокампа.
Чистота - Чтобы получить оптимальные первичные клеточные культуры, исследователь должен быть уверенным, обученным и способным работать быстро, особенно для минимизации времени рассечения. Даже если пирамидальные нейроны являются основным типом клеток, гиппокамп содержит множество интернейронов14. Чтобы генерировать культуры с минимальным количеством глиальных клеток, гиппокамп должен быть извлечен с минимальной окружающей тканью. Использование черного фона во время рассечения помогает выявить границы гиппокампа под стереомикроскопом. Кроме того, следует учитывать, что более низкая плотность клеток приводит к меньшей паракринной поддержке и затрудняет поддержание культуры13. Поэтому важно помнить об этом балансе. Это важно в исследованиях визуализации, в которых используется небольшое количество клеток (50 000 нейронов на чашку 3,5 см). Чтобы иметь возможность иметь дополнительное время для экстракции гиппокампа, следует использовать гибернационные среды, которые сохраняют ткань17. Работа с адекватными хирургическими инструментами также имеет важное значение. Высокоточные инструменты деликатны, поэтому воспроизводимость техники должна быть обеспечена путем их тщательной защиты.
Однородность - Для разработки культуры без клеточных агрегатов механическая диссоциация клеток была модернизирована путем сочетания использования предварительно вытянутых стеклянных пипеток со стандартной пипеткой 1000 мкл.
Жизнеспособность - В этот протокол не были добавлены антибиотики, поскольку они влияют на возбудимость нейронов и изменяют электрофизиологические свойства культивируемых нейронов18. Поэтому загрязнение очень вероятно, если не соблюдаются самые высокие стандарты стерильности. Температура также является ключевым фактором. Поддержание ткани холодным во время изоляции гиппокампа замедляет метаболизм и уменьшает деградацию клеток. Таким образом, ткань держали на льду до процесса диссоциации клеток. Кроме того, крайне важно найти правильный баланс во время ферментативной диссоциации клеток, который дезагрегирует клетки без выраженного лизиса клеток. В этом протоколе сроки инкубации с трипсином и последующие этапы промывки были оптимизированы для получения отдельных клеток с достаточным пространством, позволяющим создать соответствующую нейронную сеть.
Критические шаги также обнаружены в флуоресцентных живых иммуноокрашивающих и кальциевых записях активности из нейронных культур. Чтобы выполнить успешное живое иммуноокрашивание для определения наличия антител к белкам клеточной поверхности в образцах пациентов, необходимо избегать пермеабилизации клеток, которая позволила бы антителам получить доступ к внутриклеточным белкам. Кроме того, основываясь на титре антител, время инкубации и разбавление образца должны быть соответствующим образом скорректированы (например, очень высокие титрные антитела могут давать фоновое окрашивание, что затрудняет интерпретацию результатов). При проведении оценки патогенности аутоантител с помощью кальциевой визуализации необходимо использовать среду, оптимальную для измерения клеточной активности (например, подавление Mg2+ в культуральной среде важно для хорошей производительности). Кроме того, для флуоресцентной визуализации следует избегать сред с индикаторами pH, такими как фенол красный, поскольку он вводит неспецифический фоновый сигнал.
Существует два основных ограничения использования культур нейронов гиппокампа. Во-первых, по сравнению со стабильными клеточными линиями, первичные культуры должны генерироваться непрерывно, а это подразумевает регулярное использование лабораторных животных. Индуцированные линии плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) могут заменить необходимость использования животных моделей, но протоколы дифференцировки для iPSC все еще не являются оптимальными. Во-вторых, нейроны, полученные из iPSC, не экспрессируют полные спектры поверхностных белков и, следовательно, при использовании отсутствие реактивности не обязательно подразумевает негативность образца19.
Существует три метода скрининга наличия аутоантител в сыворотке или ликворе пациентов с подозрением на наличие АЭ: тканевой анализ (TBA) с использованием ткани мозга крысы, клеточный анализ (CBA) с использованием HEK-клеток, трансфектированных для экспрессии нейронных белков, и приложение, о котором сообщается здесь с использованием живых культур нейронов гиппокампа19. Важность метода культивируемых нейронов гиппокампа заключается в его способности дифференцировать реактивность с поверхностными и внутриклеточными антигенами, которые не могут быть легко различимы по TBA. Кроме того, первичные нейрональные культуры, в отличие от ЦБА в heK трансфектированных клетках, не ограничены репертуаром трансфектированных белков. Кроме того, культивируемые нейроны гиппокампа могут быть использованы для идентификации новых антител и их целевых антигенов в сочетании с иммунопреципитацией и масс-спектрометрией и, следовательно, для расширения спектра идентифицируемых антител. Наконец, он позволяет оценить патогенные эффекты аутоантител с помощью методов визуализации в реальном времени, которые могут контролировать изменения в клеточной активности. В заключение, идентификация новых аутоантител в конечном итоге позволяет инициировать специфическую иммунотерапию для улучшения результатов лечения пациентов.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Мерче Риваса, Марию Марсаль, Густаво Кастро, Жорди Кортеса, Алину Хиршманн и Анхеля Сандовала (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) и Мерседес Альбу, Марию Радошевич, Давида Сото, Ксавье Гасулла, Мара Гуаспа и Лидию Сабатер (IDIBAPS, Hospital Clínic, Университет Барселоны) за их техническую поддержку и предоставление реагентов, а также Хосепа Далмау и Мирны Р. Розенфельд (IDIBAPS, Hospital Clínic, University of Barcelona) за критический обзор рукописи и наставничество. Это исследование финансировалось Институтом спасения Карлоса III (ISCIII) и совместно финансировалось Европейским союзом, FIS (PI20/00280, J.P.), Fundació CELLEX (P.L-A.); Ministerio de Economía y Competitividad - Программа Северо Очоа для центров передового опыта в области исследований и разработок (CEX2019-000910-S, P.L-A.); Программа CERCA и Laserlab-Europe (871124, P.L-A.); Министерство науки и инноваций (MCIN/AEI/10.13039/501100011033,.Л-А.); и Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-020 | |
| 12 mm round coverslips | Fisher | NC9708845 | |
| 20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | |
| 3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | |
| 6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Beaker 100 mL | Pirex | - | |
| Borax | Sigma-Aldrich | B9876 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Curved forceps | FST | 11009-13 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red | Capricorn | DMEM-HXRXA | |
| Female Wistar rat (18-days pregnant) | Janvier | - | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | |
| Fine-angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine-curved forceps | FST | 11272-30 | |
| Fine-straight forceps | FST | 11251-23 | |
| FITC filter cube | Nikon | Standard Series | |
| Forceps | FST | 11000-12 | |
| Goat anti-Human AF488 | Invitrogen | A11013 | |
| HBSS | Capricorn | HBSS-1A | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hibernate-E medium | Gibco | A12476-01 | |
| Horse Serum (HS) | Thermofisher | 26050088 | |
| Human anti-NMDAR antibody (CSF) | Patient Sample | - | |
| Human anti-NMDAR antibody (Serum) | Patient Sample | - | |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.50i | |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 44675 | |
| L-Glutamine | Biowest | X0550-100 | |
| Mercury lamp | Nikon | C-HGFI | |
| Microscope cell chamber | Custom-build | - | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9887 | |
| NBQX | Tocris | 373 | |
| Neurobasal without phenol red | Gibco | 12348-017 | |
| NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| pAAV2-CAG-GCaMP5G | VectorBiolabs | - | |
| Paraformaldehyde 4% | Thermo scientific | J199943-K2 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022-100 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Peptide international | OKK-35056 | |
| Polystyrene ice tray | - | - | re-used cap of a polysterene box |
| Precision spring-scissors | FST | 15000-08 | |
| ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media) | Molecular Probes | P36941 | |
| Scissors | FST | 14068-12 | |
| Sodium pyruvate | Biowest | L0642-100 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Surgery scissors | FST | 14081-09 | |
| Trypsin 2.5% | Gibco | 15090046 | |
| Water, sterile endotoxine free | Sigma-Aldrich | W3500 |
References
- Dalmau, J., Geis, C., Graus, F. Autoantibodies to synaptic receptors and neuronal cell surface proteins in autoimmune diseases of the central nervous system. Physiological Reviews. 97 (2), 839-887 (2017).
- Dalmau, J., Graus, F.
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti- N -methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Annals of Neurology. 61 (1), 25-36 (2007).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurology. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Annals of Neurology. 65, 424-434 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABAB receptor in limbic encephalitis with seizures: case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurology. 9 (1), 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurology. 9 (8), 776-785 (2010).
- Sabater, L., et al. A novel NREM and REM parasomnia with sleep breathing disorder associated with antibodies against IgLON5: a case series, pathological features, and characterization of the antigen. Lancet Neurology. 13 (6), 575-586 (2014).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. The Journal of Neuroscience. 30 (17), 5866-5875 (2010).
- Moscato, E. H., et al. Acute mechanisms underlying antibody effects in anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis. Annals of Neurology. 76 (1), 108-119 (2014).
- Planagumà, J., et al. Human N-methyl D-aspartate receptor antibodies alter memory and behaviour in mice. Brain. 138 (1), 94-109 (2015).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G.
- Benson, D. L., Watkins, F. H., Steward, O., Banker, G. Characterization of GABAergic neurons in hippocampal cell cultures. Journal of Neurocytology. 23 (5), 279-295 (1994).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. Cambridge, Massachusetts. (1998).
- Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. Journal of Visualized Experiments. (19), e895 (2008).
- Brewer, G. J., Price, P. J. Viable cultured neurons in ambient carbon dioxide and hibernation storage for a month. Neuroreport. 7 (9), 1509-1512 (1996).
- Bahrami, F., Janahmadi, M. Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture. Iranian Biomedical Journal. 17 (2), 101-106 (2013).
- Ricken, G., et al. Detection methods for autoantibodies in suspected autoimmune encephalitis. Frontiers in Neurology. 9, 841 (2018).
