Summary
Autoimmun encephalitis er en ny kategori af antistofmedierede sygdomme i centralnervesystemet. Hippocampus neuroner kan bruges til at opdage og karakterisere disse antistoffer. Denne artikel indeholder en protokol for primær cellekultur og immunostaining til bestemmelse af autoantistoffer i serum- og cerebrospinalvæsken hos patienter.
Abstract
I løbet af de sidste 15 år er en ny kategori af antistofmedierede sygdomme i centralnervesystemet (CNS) blevet karakteriseret og er nu defineret som "autoimmun encephalitis" (AE). Der er i øjeblikket 17 kendte AE-syndromer, og alle er forbundet med antistoffer mod neuronalcelleoverfladen eller synaptiske proteiner. De kliniske syndromer er komplekse og varierer alt efter typen af associeret antistof. Den mest kendte af disse sygdomme er anti-N-methyl D-aspartatreceptor (NMDAR) encephalitis, som er en fremtrædende neuropsykiatrisk lidelse forbundet med alvorlige hukommelses- og adfærdsmæssige svækkelser. De associerede antistoffer reagerer med GluN1-underenheden af NMDAR ved N-terminaldomænet. Den tilgang, der oftest anvendes til opdagelse og karakterisering af AE-antistoffer, omfatter kulturen af dissocierede, føtale, gnaver hippocampale neuroner. Under processen med antistofkarakterisering udsættes levende neuroner i kultur for patienternes serum eller CSF, og påvisning af reaktivitet indikerer, at patientens serum- eller CSF-prøver indeholder antistoffer mod neuronale overfladeantigener. Hippocampale kulturer kan også bruges til at bestemme, om antistofferne hos patienter er potentielt patogene ved at undersøge, om de forårsager strukturelle eller funktionelle ændringer af neuronerne. Succesniveauet for disse undersøgelser afhænger af kvaliteten af kulturerne og af de protokoller, der anvendes til at opnå og detektere reaktiviteten af patientprøver. Denne artikel giver en optimeret protokol til primær cellekultur af føtale rotte hippocampale neuroner kombineret med immunostaining for at bestemme tilstedeværelsen af antistoffer i serum eller CSF hos patienter. Et eksempel på, hvordan man undersøger de potentielle patogene virkninger af NMDAR-antistoffer ved hjælp af dyrkede neuroner og calciumbilleddannelse, præsenteres også.
Introduction
Autoimmun encephalitis (AE) er en nyligt opdaget kategori af sygdomme i centralnervesystemet (CNS) medieret af antistoffer, der er målrettet mod neuronale overflade- eller synaptiske proteiner 1,2. De kliniske træk varierer afhængigt af antistoffet, men omfatter almindeligvis nedsat hukommelse og kognition, ændret adfærd og psykiatriske symptomer, unormale bevægelser, søvndysfunktion, nedsat bevidsthedsniveau og anfald. Disse lidelser kan påvirke personer i alle aldre, hvor nogle typer AE overvejende påvirker børn og unge voksne2.
I løbet af de sidste 15 år er der beskrevet 17 AE-syndromer med antistoffer mod specifikke neuronale overflade / synaptiske proteiner (tabel 1). Et par eksempler på de neuronale mål inkluderer de synaptiske excitatoriske receptorer NMDAR3,4 og AMPAR5, den synaptiske hæmmende receptor GABAbR6, det neuronale udskillede protein LGI17 og celleadhæsionsmolekylet IgLON58. For de fleste af disse AE har undersøgelser vist, at antistofferne forstyrrer strukturen eller funktionen af deres målantigen, hvilket stærkt understøtter en patogen rolle. For eksempel reagerer antistofferne i anti-NMDAR-encephalitis med det N-terminale domæne af GluN1-underenheden af NMDAR, hvilket producerer en selektiv og reversibel internalisering af disse receptorer, der resulterer i fremtrædende neuropsykiatriske ændringer 4,9,10,11. Således kan identifikationen af et af de 17 kendte antistoffer i en patients serum eller CSF også bruges som en diagnostisk test, der etablerer diagnosen af en bestemt AE.
En af de teknikker, der hyppigere anvendes til identifikation og karakterisering af disse antistoffer, omfatter brugen af kulturer af dissocierede, føtale, gnaver hippocampus neuroner. Disse kulturer er nyttige af flere grunde: embryonal hjerne er let at adskille og indeholder et lavt niveau af gliaceller, den største kilde til forurening i neuronale kulturer12; cellepopulationen i hippocampus er relativt homogen sammenlignet med de fleste andre regioner i CNS, hvor pyramideceller repræsenterer langt størstedelen13,14; kulturer fremstilles fra sene embryoner, når dannelsen af pyramidale neuroner er afsluttet, men granulatceller endnu ikke har udviklet sig, hvilket yderligere øger kulturens homogenitet; når de dyrkes, udtrykker pyramidale neuroner de fleste af deres vigtigste fænotypiske træk, er i stand til at danne veludviklede dendritter og etablere synaptisk forbundne netværk, der kan bruges til strukturelle og elektrofysiologiske undersøgelser12,13; da antistoffer ikke kan trænge ind i levende neuroner, giver brugen af levende kulturer mulighed for identifikation af antigene mål, der ligger på celleoverfladen; og immunoprecipitation af antistof-antigenkomplekset fra neuronale kulturer muliggør identifikation af målantigenet5.
Succesen med undersøgelser, der anvender neuronale kulturer, afhænger i høj grad af kvaliteten af kulturerne og de protokoller, der anvendes til at vurdere immunreaktiviteten af en patients serum eller cerebrospinalvæske (CSF). Variabler, der kan påvirke kulturerne, omfatter procedurerne for isolering af hippocampus forud for kulturudvikling, dissociation af vævet, belægningstætheden, den anvendte vækstoverflade og sammensætningen af mediet13,15,16. Denne artikel giver en optimeret protokol for primær cellekultur af føtale rotte hippocampale neuroner kombineret med fluorescerende immunostaining, der kan bruges til at bestemme tilstedeværelsen af antistoffer mod kendte AE-antigener og potentielt nye overflademål. Det giver også et eksempel på, hvordan man undersøger de patogene virkninger af NMDAR-antistoffer ved hjælp af levende cellebilleddannelsesteknikker ved hjælp af dyrkede hippocampale neuroner, der udtrykker en genetisk kodet calciumindikator (GECI) fra GCaMP-familien, GCaMP5G.
| Målprotein | Protein funktion | Cellerum | Vigtigste syndrom |
| NMDAR | Ion Chanel | Synaptisk protein | Anti-NMDAR encephalitis |
| AMPAR | Ion Chanel | Synaptisk protein | Limbisk encephalitis |
| GluK2 | Ion Chanel | Synaptisk protein | Hjernebetændelse |
| GABAaR | Ion Chanel | Synaptisk protein | Hjernebetændelse |
| GABAbR | Metabotrope receptor | Synaptisk protein | Limbisk encephalitis |
| mGluR1 | Metabotrope receptor | Synaptisk protein | Hjernebetændelse |
| mGluR2 | Metabotrope receptor | Synaptisk protein | Hjernebetændelse |
| mGluR5 | Metabotrope receptor | Synaptisk protein | Hjernebetændelse |
| D2R | Metabotrope receptor | Synaptisk protein | Basalganglier encephalitis |
| LGI1 | Adhæsionsmolekyle | Celleoverfladeprotein | Limbisk encephalitis |
| CASPR2 | Adhæsionsmolekyle | Celleoverfladeprotein | Limbisk encephalitis |
| IgLON5 | Adhæsionsmolekyle | Celleoverfladeprotein | Anti-IgLON5 sygdom |
| Neurexin-3α | Adhæsionsmolekyle | Celleoverfladeprotein | Hjernebetændelse |
| DNER (Tr) | Transmembran protein | Celleoverfladeprotein | Hjernebetændelse |
| SEZ6L | Transmembran protein | Celleoverfladeprotein | Hjernebetændelse |
| Amfiphysin | Strukturelt molekyle | Celleoverfladeprotein | Limbisk encephalitis |
| Dppx | Peptidase | Celleoverfladeprotein | Hjernebetændelse |
Tabel 1: Antistoffer mod neuronal celleoverflade og synaptiske proteiner.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af den lokale etiske komité ved Universitetet i Barcelona efter europæiske (2010/63/UE) regler om brug og pleje af forsøgsdyr. Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra patienter, og undersøgelsen blev godkendt af det lokale institutionelle klagenævn til brug af humane prøver (Hospital Clínic, HCB/2018/0192).
BEMÆRK: Der er tre dele i den nuværende protokol. Den første er til etablering af neuronale kulturer, den anden er til påvisning af overfladeantistoffer ved hjælp af levende kulturer af neuroner, og den tredje er at bestemme patogeniciteten af disse antistoffer.
DEL 1: Etablering af dissocierede, føtale, gnaver hippocampus neuronale kulturer
1. Forberedende trin
- Poly-L-lysinbelægning af pletteringsoverfladerne (3 dage før dissektion)
- Boratbufferen forberedes ved at tilsætte 2,38 g borsyre og 1,27 g borax til 500 ml destilleret vand under omrøring i 15 minutter, indtil den er opløst. Under en hætte steriliseres bufferopløsningen ved filtrering (0,2 μm porestørrelse), etiket og opbevares ved stuetemperatur (RT).
BEMÆRK: Denne løsning er stabil og kan bruges i 6 måneder.
FORSIGTIG: Når du forbereder boratbuffer, skal du bære anbefalet personligt beskyttelsesudstyr. - Stamopløsningen Poly-L-lysin (PLL) (100 mg/ml) fremstilles ved tilsætning af 1 g PLL til 10 ml destilleret vand under omrøring, indtil den er opløst. Der fremstilles 500 μL alikvoter af PLL-stamopløsning. For at nå en endelig koncentration på 1 mg/ml tilsættes 500 μL PLL-aliquot til 50 ml boratbuffer og hvirvles, indtil den er opløst, og opløsningen steriliseres ved filtrering (0,2 μm porestørrelse).
BEMÆRK: Denne løsning er stabil og kan bruges i 6 måneder. - Forbered overfladerne til belægning. Brug dæksedler med en diameter på 12 mm til immunfarvningsprocedurer og glasbundsskåle til undersøgelser, der inkluderer billeddannelse af levende neuroner. Hvis du bruger dækslips, skal du autoklave og derefter placere fem dæksedler i hver skål (3,5 cm diameter).
BEMÆRK: Tykkelsen af dækslippet påvirker kvaliteten og intensiteten af signalet fra de erhvervede billeder. De fleste mikroskopmål er designet til # 1.5 coverslips. Vælg de relevante dækslips i henhold til billedopsætningen og teknikkerne. - Under en hætte tilsættes 1,5 ml PLL-opløsning til hver skål (glasbundet skål eller 3,5 cm skål med fem dækslips). Sørg for, at alle dækslikkerne er nedsænket og opbevaret på RT i 24 timer.
- 2 dage før dissektion skal du opsuge PLL-opløsningen og vaske med sterilt endotoksinfrit vand, og sørg for, at dækslikkerne er nedsænket. Opbevar vand i opvasken og opbevar på RT i 24 timer.
- 1 dag før dissektion skal du suge vandet og erstatte det med NB + B27 kulturmedier (se nedenfor), og anbring opvasken i en inkubator ved 37 ° C i 24 timer.
- Boratbufferen forberedes ved at tilsætte 2,38 g borsyre og 1,27 g borax til 500 ml destilleret vand under omrøring i 15 minutter, indtil den er opløst. Under en hætte steriliseres bufferopløsningen ved filtrering (0,2 μm porestørrelse), etiket og opbevares ved stuetemperatur (RT).
- Fremstilling af kulturmedier og stamopløsning (1 dag før dissektion)
- Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM): Til 500 ml DMEM High Glucose (4,5 g / L) uden L-glutamin og phenolrød tilsættes 50 ml hesteserum, 50 ml føtalt bovint serum (FBS), 10 ml L-glutamin (200 mM), 10 ml natriumpyruvat (100 mM), 10 ml penicillin-streptomycin (10.000 U / ml). Der filtreres (0,2 μm porestørrelse) og opbevares i 5 ml alikvoter ved 4 oC med en tæt lukket hætte.
BEMÆRK: Denne løsning er stabil og kan bruges i 1 måned. - Neurobasal (NB) medium suppleret med B27 (NB + B27): Til 50 ml NB-medium uden phenolrød tilsættes 1 ml B27-supplement.
- Hibernate-E medium suppleret med B27 (Hibernate + B27): Til 50 ml Hibernate-E medium, tilføj 1 ml B27 supplement.
- Ekstracellulær fysiologisk opløsning (EPS): Til 1 liter sterilt vand tilsættes følgende ved de specificerede slutkoncentrationer: NaCl (140 mM), KCl (3,5 mM), HEPES (10 mM), glucose (20 mM) ogCaCl2 (2 mM). Rør, indtil den er opløst, og juster pH-værdien til 7,4 ved at tilsætte NaOH (0,5 M) eller HCI (0,5 M). Under emhætten steriliseres ved filtrering (0,2 μm porestørrelse) og opbevares ved 4 oC.
- Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM): Til 500 ml DMEM High Glucose (4,5 g / L) uden L-glutamin og phenolrød tilsættes 50 ml hesteserum, 50 ml føtalt bovint serum (FBS), 10 ml L-glutamin (200 mM), 10 ml natriumpyruvat (100 mM), 10 ml penicillin-streptomycin (10.000 U / ml). Der filtreres (0,2 μm porestørrelse) og opbevares i 5 ml alikvoter ved 4 oC med en tæt lukket hætte.
- Udstyr og andre laboratoriematerialer (dissektionsdag)
- Indstil et vandbad til 37 °C. Følgende aliquots opvarmes: 50 ml HBSS og 5 ml DMEM.
- Steriliser følgende værktøjer ved at nedsænke i et bægerglas indeholdende absolut ethanol (figur 1B): tang, buede tang, saks, fint buede tang, fin-lige tang, kirurgi saks, finvinklet tang og præcision fjeder saks.
BEMÆRK: For at beskytte værktøjerne skal du placere et blødt materiale (f.eks. videnskabelige præcisionsservietter) i bunden af bægeret. - Fyld to bakker med is og læg følgende genstande.
- Isbakke 1 (figur 1C): Anbring kirurgiske værktøjer i bægerglasset med absolut ethanol, et bægerglas med HBSS til skylning af operationsværktøjerne, en 10 cm skål med HBSS til at placere embryonerne, en 6 cm skål med HBSS til at placere embryonernes hoveder og en 6 cm skål med dvale + B27 til at placere embryonernes hjerner.
- Isbakke 2: Læg en 1 ml aliquot trypsin 2,5% og en 3,5 cm skål med dvale + B27 til den dissekerede hippocampus.
BEMÆRK: Den tid, der er nødvendig for denne procedure, afhænger af efterforskerens erfaring og antallet af embryoner, der skal dissekeres. Derfor skal isen forblive frosset i den nødvendige tid. Polystyrenbakker anbefales til dette formål.
2. Dissektion og såning (figur 1)
- Hippocampus isolation
BEMÆRK: Gravide rotter med embryoner ved E18 aflives umiddelbart før protokollen starter i overensstemmelse med den lokale etiske komité ved Universitetet i Barcelona i henhold til europæiske (2010/63 / UE) regler om brug og pleje af forsøgsdyr. I denne protokol blev indånding af kuldioxid (CO2) anvendt som metode til eutanasi.- Disseker rotten på niveauet af abdominal peritoneum ved hjælp af tang og saks. Ekstraher livmoderen med E18-embryonerne og læg den i en 10 cm skål, der er kølet på is.
BEMÆRK: Det er vigtigt at undgå, at rottehårene sætter sig fast på embryonerne. Det anbefales at bruge rigelige mængder 70% ethanol til at sterilisere maven. Fra dette trin og fremefter skal du arbejde inde i emhætten på isbakke 1. - Åbn de embryonale sække, og overfør embryonerne til 10 cm skålen med HBSS, og sørg for, at embryonerne er helt nedsænket.
- Fjern embryohovedet med en saks og læg det i 6 cm skålen med HBSS. Gentag denne proces med alle embryonerne.
BEMÆRK: For at undgå forurening skal alt væv undtagen embryohovederne kasseres i en beholder med skruelåg. - Hold embryohovedet med fint buede tang og gennembor banerne med et par fint lige tang, der kommer ind i en 45 ° vinkel, og slip derefter de fint buede tang.
OBS: Tangen må ikke gå gennem hjernen, så det er vigtigt at holde vinklen, når man kommer ind. - Disseker huden og kraniet med operationssaksen, startende fra occipitalbenet til frontbenet. Fjern hjernen med et par fint buede tang og læg den i 6 cm skålen med Hibernate + B27. Gentag denne proces, indtil alle hjerner er genoprettet.
- Skytten adskiller telencephalonerne med de fine lige tang.
BEMÆRK: Fra dette trin og fremefter udføres dissektionen af hippocampus under et stereomikroskop. Det anbefales at bruge leddelte lamper, så lyset belyser dissektionsoverfladen fra siderne. Det anbefales også at bruge en sort baggrund, da dette giver mere kontrast, hvilket gør det muligt bedre at skelne hippocampus. - Forbered en 10 cm skål ved at placere dråber dvale + B27 på 1 cm afstand (f.eks. I en cirkel). Placer en telencephalon pr. Dråbe Hibernate + B27 og visualiser gennem dissekeringsomfanget (1,25x objektiv forstørrelse anbefales).
- Skræl forsigtigt meninges og fjern thalamus for bedre at visualisere hippocampus.
- Disseker hippocampus med præcisionsfjedersaksen og læg den i 3,5 cm skålen med Hibernate + B27 i isbakke 2. Gentag for hver telencephalon, indtil alle hippocampi er samlet.
- Saml forsigtigt alle hippocampi med en Pasteur-pipette og overfør dem til et 50 ml rør.
BEMÆRK: Tag minimumsvolumenet af dvale + B27, når du samler hippocampi for ikke at fortynde trypsin.
- Disseker rotten på niveauet af abdominal peritoneum ved hjælp af tang og saks. Ekstraher livmoderen med E18-embryonerne og læg den i en 10 cm skål, der er kølet på is.
- Celle dissociation
- Enzymatisk dissociation af hippocampus
- I 50 ml røret, der indeholder hippocampi, tilsættes 1 ml 2,5% trypsin og bringes til et volumen på 5 ml med HBSS. Inkuberes i 15 minutter i vandbadet ved 37 °C.
- For at fortynde trypsinen tilsættes 10 ml forvarmet HBSS og inkuberes i 5 minutter i vandbadet ved 37 °C.
- Overfør hippocampi, der nu vises som en slimmasse, til et 50 ml rør med en 1.000 μL mikropipette, tilsæt 6 ml forvarmet HBSS, og inkuber i 5 minutter i vandbadet ved 37 ° C.
- Mekanisk dissociation af hippocampus
- Overfør massen til et 2 ml rør med konisk bund, idet du tager det minimale volumen. Tilsæt 1 ml forvarmet DMEM-medie. Homogeniser pelleten med en 1.000 μL mikropipette ved forsigtigt at aspirere op og ned.
BEMÆRK: Det er vigtigt at undgå at generere bobler, når man suger til, da bobler kan lyse cellerne. - Gentag op- og nedaspirationen med en fortrukket glaspipette (10x-20x), med spidsen i kontakt med rørets koniske bund. Undgå at generere bobler. I slutningen af dette trin skal blandingen være gennemskinnelig.
- Når blandingen er homogent blandet, således at blandingen er gennemskinnelig, overføres den til et rør indeholdende 4 ml DMEM-medier ved 37 °C og homogeniseres med en glaspipette ved at pipettere op og ned.
- Overfør massen til et 2 ml rør med konisk bund, idet du tager det minimale volumen. Tilsæt 1 ml forvarmet DMEM-medie. Homogeniser pelleten med en 1.000 μL mikropipette ved forsigtigt at aspirere op og ned.
- Enzymatisk dissociation af hippocampus
- Celle såning
- Tæl cellerne. Antallet af neuroner i opløsningen kan tælles i henhold til standardlaboratorieprocedurer.
BEMÆRK: I billeddannelsesforsøg til antistofdetektion og calciumaktivitet er en koncentration på 50.000 celler pr. 3,5 cm skål optimal. - Hold cellerne ophængt, træk det beregnede volumen og tallerkenen tilbage i 3,5 cm skåle indeholdende PLL-belagte dæksler eller i de PLL-belagte glasbundsfade.
- Fordel cellerne jævnt på opvasken ved blødt at ryste i krydsede bevægelser (frem og tilbage, derefter side til side; gentag efter behov) og læg opvasken i CO2 (5%) inkubatoren.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge krydsede bevægelser for at undgå, at cellerne sætter sig i skålens periferi. - Hver uge tilsættes ca. 1 ml NB + B27, så kulturen ikke tørrer.
BEMÆRK: Efter 2 uger (14 dage in vitro [div]) er neuronerne modne og udtrykker alle faktorer, der skal bruges til eksperimentering. Det samlede gennemsnitlige antal neuroner opnået ved hjælp af denne protokol er ca. 2,5 x 106 neuroner, der kommer fra et gennemsnit på 12 E18 embryoner pr. Gravid rotte.
- Tæl cellerne. Antallet af neuroner i opløsningen kan tælles i henhold til standardlaboratorieprocedurer.
DEL 2: Brug af hippocampus neuronale kulturer til antistofdetektion i neuronale celleoverfladeproteiner
BEMÆRK: Denne del af protokollen viser, hvordan hippocampuskulturer bruges til at identificere anti-NMDAR-antistoffer i serum og / eller CSF hos patienter med anti-NMDAR-encephalitis. Fluorescerende immunostaining bruges til at visualisere reaktiviteten i de levende neuroner, men andre visualiseringsmetoder kan også bruges. En passende kontrol til dette eksperiment ville være serum eller CSF fra et sundt individ. Når du bruger humane prøver, skal du huske på, at godkendelse fra det institutionelle etiske udvalg kan være påkrævet.
3. Levende fluorescerende immunfarvning
- Brug 14 div-celler, der er dyrket på coverslips (50.000 celler pr. 3,5 cm skål indeholdende fem dækslip).
- Inde i emhætten skylles dækslikkerne med NB forvarmet til 37 °C.
- Prøven, der i dette tilfælde indeholder anti-NMDAR-antistoffer (anvendt som primært antistof), fortyndes i NB-medier ved 1:200 for serum eller 1:2 for CSF, og inkuberes 1 time ved 37 °C (inde i CO2 (5%) inkubatoren).
- Skyl forsigtigt med PBS 3x ved RT.
- Tilsæt fikseringsopløsning (4% formaldehyd i PBS) og inkuber ved RT i 5 min.
FORSIGTIG: Ved håndtering af 4% formaldehyd skal du arbejde inde i emhætten og bære anbefalet personligt beskyttelsesudstyr. - Vask 3x med PBS i 5 min hver.
- Tilsæt sekundært antistof Gedeanti-Human AF488 ved 1:1000 fortynding og inkuber ved RT i 1 time.
BEMÆRK: Under inkubationen skal du beskytte mod lyseksponering ved at dække med aluminiumsfolie. - Vask 3x med PBS i 5 min hver. Skyl med destilleret vand
- Monter dækslikkerne med et flydende monteringsmedium (f.eks. antifading monteringsmedier med DAPI; ca. 7 μL), opsæt eventuel resterende væske og skyl med destilleret vand. Neuronerne er nu klar til fluorescensbilleddannelse.
FORSIGTIG: Når du håndterer monteringsmedium, skal du bære det anbefalede personlige beskyttelsesudstyr.
DEL 3: Påvisning af antistofpatogene virkninger ved hjælp af calciumbilleddannelse
BEMÆRK: Denne del af protokollen viser, hvordan man bestemmer, om antistofferne hos patienter har en funktionel effekt på kulturerne, hvilket tyder på patogenicitet. For at øge betydningen af virkningerne blev der anvendt en pulje af CSF fra otte patienter. Calciumaktivitet af de levende kulturer blev registreret ved kemisk stimulering (NMDA + glycin) ved anvendelse af GECI-fluorescenscalciumindikatoren (GCaMP5G). Disse undersøgelser kræver et omvendt fluorescensmikroskop med et cellekammer, der kan opretholde de krævede fysiologiske tilstande af neuronerne.
4. Calciumbilleddannelse
- Brug 14-18 div celler, der er dyrket på coverslips (50.000 celler pr. 3,5 cm skål med fem coverslips)
- 1 uge før billeddannelse tilsættes den virale vektor pAAV2-CAG-GCaMP5G ved 2,5 x 1010 GC / ml til cellerne og inkuberes i 5-7 dage.
BEMÆRK: Denne kommercielt tilgængelige, færdigpakkede AAV serotype 2 vektor overudtrykker genetisk kodet calciumindikator GCaMP5G under en CAG-promotor. - 1 dag før billeddannelse tilsættes patientprøven (i dette eksempel en CSF-pulje fortyndet 1:25 i NB + B27) og inkuberes i 24 timer. Filtrer altid humane prøver (0,2 μm porestørrelse) inden brug for at undgå kontaminering.
BEMÆRK: For disse undersøgelser skal kontrol CSF fra raske forsøgspersoner køres parallelt. - På billeddannelsesdagen skal du forberede billeddannelsesopsætningen og indstille mikroskopcellekammeret til 37 ° C, fylde banen med destilleret vand og tilføre 5% CO2 for at opretholde cellefysiologiske forhold.
- I emhætten vaskes cellerne fra trin 3 med 3 ml EPS forvarmet til 37 °C
- Dæk cellerne med 2,45 ml EPS og overfør dem til mikroskopcellekammeret. Tilføj NBQX (10 μM) for at blokere AMPA- og KA-receptorerne for udelukkende at visualisere NMDA-receptorresponset.
- I det omvendte fluorescensmikroskop udstyret med en kviksølvlampe og en FITC-filterterning erhverves en 2 minutters film med rammer optaget hver 100 ms (spontan aktivitet).
BEMÆRK: Der blev brugt et 20x NA 0.75 luftmål, og billeder (512 x 512 pixels, 16-bit gråtoner) blev taget hver 100 ms med et sCMOS-kamera. - Anskaf den anden film på 4 min med rammer optaget hver 100 ms. Kort efter start af overtagelsen tilsættes stimuleringsopløsning (NMDA [100 μM] + glycin [1 μM]) til skålen.
BEMÆRK: Tilsætning af medier i skålen vil generere turbulens, der kan forstyrre billeddannelsesforholdene (fokus, fluorescensintensitet og / eller uspecifikt baggrundssignal). Tilsæt ikke mere end 50 μL opløsning i den fyldte 2,5 ml skål for at mindske sandsynligheden for sådanne ændringer. - Ved hjælp af billedbehandlingssoftware (ImageJ blev brugt her) ekstraheres fluorescenssignalet over tid, opnået ved stimulering, fra de kulturer, der inkuberes med patienten, og kontroller CSF-prøver.
BEMÆRK: GCaMP-sonderne gennemgår en konformationsændring, når de binder til frie calciumioner, hvilket får dem til at blive lysere. Derfor korrelerer stigningen i fluorescensintensitet med en calciumtilstrømning på grund af neuronal depolarisering. - Bestem de interesseområder (ROI), der skal analyseres. Segmenter somaerne af neuroner manuelt, og tilføj ROI'erne til ROI-manageren (Analyze > Tools > ROI Manager > Add). Gem ROI fra ROI Manager-menuen (Mere > Gem).
- Angiv målingerne (Analysér > Indstil målinger), og vælg den gennemsnitlige grå værdi. Udtræk den gennemsnitlige fluorescensintensitetsprofil fra cellesomaerne ved at klikke på Mere > multimål, og gem derefter den tabel, der er genereret som et .xls regneark.
- Udfør statistiske analyser for at sammenligne fluorescensen mellem grupper (patienternes CSF vs. kontrolens CSF).
Representative Results
Etablering af dissocierede, føtale, gnaver hippocampus neuronale kulturer
Protokollen, der præsenteres her, er baseret på de indflydelsesrige undersøgelser af nervecelledyrkning udført af Banker og Goslin15. Protokollen er blevet raffineret for at opnå neuronale kulturer med optimal morfologi, tæthed og renhed til udførelse af neuronale overfladeantistofdetektionsundersøgelser. Protokollen for dissektion og såning er opdelt i tre dele (figur 1A). Den første del, hippocampus isolation, består af kirurgisk ekstraktion af det levende væv (figur 1A, venstre panel). Som det fremgår af figuren, er gravide Wistar-rotter med E18-embryoner det vigtigste udgangsmateriale til en vellykket kultur. Når hjernen er ekstraheret fra E18-embryonerne, udføres mikrokirurgi under et stereomikroskop. Med passende værktøjer (figur 1B) og præcis håndtering er det muligt at adskille hippocampus fra resten af nervevævet. Disponeringen af væv i de specifikke medier er afbildet i figur 1C. Den anden del af protokollen består af hippocampal celle dissociation. Det er opdelt i to trin (figur 1A, midterste panel): enzymatisk dissociation og mekanisk dissociation af hippocampus, hvilket resulterer i intakte, dissocierede, enkeltceller. Ved hjælp af denne metode er det muligt at opnå cellekulturer uden celleaggregater, som repræsenteret i figur 2A-D. Den tredje del af protokollen består af cellesåning (figur 1A, højre panel). Denne del af protokollen er afgørende for at justere tætheden og homogeniteten af neuronalkulturen i pladen. At tælle cellerne og så 50.000 neuroner i et område på en 3,5 cm skål giver en optimal tæthed til at udføre ikke kun eksperimenter for at bestemme tilstedeværelsen af antistoffer mod neuronale celleoverfladeproteiner (figur 3), men også for at analysere patogeniciteten af disse antistoffer med calciumbilleddannelse (figur 4).
Figur 1: Visuel protokol for primære kulturer af hippocampus neuroner. (A) Flowchart, der viser de tre dele af protokollen til fremstilling af dissocierede cellekulturer af hippocampale neuroner fra embryonale rotter ved E18. Protokollen er opdelt i 1. Hippocampus isolation, 2. Celledissociation, og 3. Celle såning. (B) Udvælgelse af anbefalede værktøjer til hippocampal isolering grupperet i tre kategorier: (1- Pincet, 2- Buet tang, 3- Saks) til embryoopsamling, (4- Finbuet tang, 5- Fin-lige tang, 6- Kirurgi saks) til hjerneekstraktion og (7- Finvinklet tang, 8- Præcisionsfjedersaks) til hippocampal isolering. (C) Skematisk gengivelse af isbakke 1 med plader og medier, der er nødvendige for hippocampusisoleringen. Embryoner og hoveder placeres i HBSS, mens hjerner placeres i dvalemedium + B27. Klik her for at se en større version af denne figur.
Kulturer af hippocampus neuroner ved 18 div er modne, sammenkoblede og udtrykker strukturelle og funktionelle proteiner
I vækst og modning af neuronale kulturer kan to differentierede faser værdsættes: neuronens polariseringsfase (figur 2A, B) og fasen med dendritisk udvikling og konstruktion af det synaptiske netværk (figur 2C, D). Celler på 1 div er jævnt fordelt og har klæbet til pladen og udviklet en lamell omkring cellekroppen med mindre neuritter, der begynder at strække sig (figur 2A). Efter nogle dage i kultur strækker neuritterne sig en kort afstand. Celler viser en betydelig polarisering, men der er lidt nettovækst (figur 2B). Efter denne fase er synaptogenese fremtrædende, og neuronerne begynder at forbinde hinanden. Det neuronale netværk fortsætter med at vokse og bliver mere komplekst (figur 2C). Ved 18 div er neuroner modne og sammenkoblede; det neuronale netværk er bygget (figur 2D). Når de synaptiske rygsøjler er dannet og forbundet, er neuroner fuldt polariserede og udtrykker alle funktionelle og strukturelle proteiner. Af de mange proteiner, der udtrykkes af modne dyrkede neuroner, er neuronreceptoren NMDA (figur 2E) og det synaptiske protein PSD95 (figur 2F) valgt her som repræsentative markører. Desuden er det muligt selektivt at visualisere axoner ved at mærke neurofilament (NF) (figur 2G) og visualisere dendritter ved at målrette MAP2-proteinet (figur 2H).
Figur 2: Tidsforløb for modning af dissocierede cellekulturer af hippocampale neuroner. (A-D) Fasekontrastbilleder af hippocampale neuroner i løbet af de første 18 dage af kulturen. (A) Neuroner ved 1 div ved fastgørelse til det PLL-belagte substrat. (B) Fremkomsten af små neuritter i neuroner ved 5 div. (C) Neuroner ved 11 div har udviklet lange neuritter, der forlænger og erhverver aksonale egenskaber. (D) Neuroner ved 18 div er modne og har dannet et neuralt netværk. Skalabar (A-D) = 40 μm. (E-H) Repræsentative fluorescerende billeder taget ved konfokal laserscanningsmikroskopi ved hjælp af selektive markører for at vise modne neuroner ved 18 div. Neuronale kulturer blev fikseret og immunostained med antistoffer, der selektivt pletter for (E) neuronal receptor (NMDAR), (F) synaptisk markør (PSD95), (G) axonal markør (neurofilament, NF) og (H) dendritisk markør (MAP2). Skalabjælke (E-H) = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Antistoffer i patientprøver reagerer med neuronale celleoverfladeantigener
Prøverne (serum og CSF) opnået fra patienter, der har anti-NMDAR encephalitis, indeholder autoantistoffer, der genkender NMDAR til stede på overfladen af neuroner. Inkubation af kulturerne med patientprøverne producerer et intenst fluorescenssignal på celleoverfladen og dendritter (figur 3A, C). I modsætning hertil producerer kontrolprøver intet fluorescenssignal, når de administreres til neuronale kulturer (figur 3 B, D). Disse resultater viser, hvordan kulturerne kan bruges til at screene patientprøver for antistoffer og kan føre til identifikation af nye antistoffer, der er målrettet mod neuronalcelleoverfladen.
CSF-prøve fra patienten nedsætter den intracellulære calciumkoncentration i NMDA-inducerede kulturer af hippocampale neuroner
For at evaluere effekten af patienternes antistoffer på den neurale aktivitet (efter 24 timers behandling) blev intracellulære calciumtransienter optisk overvåget fra de dyrkede neuroner i realtid ved NMDA-medieret stimulering. Anvendelsen af NMDA genererer en stigning i fluorescensintensiteten, som det fremgår af en ændring i den intracellulære grønne fluorescens (figur 4A og supplerende video 1). Neuroner behandlet med kontrol CSF-prøven viste en højere forskel i fluorescensintensitet (56%), når stimulatoren blev anvendt i forhold til de celler, der blev behandlet med patientens CSF-prøve. Forskellene i fluorescensintensitet blev målt, og de NMDA-medierede stimuleringskurver fra dataene ekstraheret fra cellernes soma blev sammenlignet (figur 4B, C). Stimuleringskurverne viser, at der var en intracellulær tilstrømning af calcium i begge scenarier, men de kulturer, der blev behandlet med patienternes CSF (grå linje), viste et lavere respons end de kontrolbehandlede kulturer (sort linje). Disse resultater viser, at antistofferne i patienternes CSF nedsætter den cellulære aktivitet på grund af antistoffernes interaktion med NMDAR og dermed forårsager en patogen virkning.
Figur 3: Patientantistoffer reagerer med overfladen af neuronale kulturer. (A,E) Serum og CSF fra patienter med anti-NMDAR encephalitis reagerer med celleoverfladen af levende rotte hippocampale neuroner, (B,F), mens serum og CSF fra kontrolpersoner ikke viser nogen reaktivitet. Skala bar (A, B, E, F) = 20 μm. Højere forstørrelsesbillede af en dendrit (63x), der viser det typiske overflademønster for reaktivitet for (C, G) patientens serum og CSF og (D, H) negativ for kontroller. Billeder blev taget ved konfokal laserscanningsmikroskopi. Skala bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Patientantistoffer reducerer calciumtilstrømningen i rotteneuroner, der udtrykker GCaMP5G. (A) Administration af stimuleringsopløsning (NMDA [100 μM] + glycin [1 μM]) i kulturer af neuroner udløste en calciumtilstrømning, som angivet ved at øge intracellulær grøn fluorescens (stimuleringstop) sammenlignet med billedet taget før stimuleringen (præstimulering). Efter 120 s falder fluorescensintensiteten og stabiliseres (efter stimulering). Kulturer behandlet med patienternes CSF viste en signifikant reduktion (56%) i den NMDA-medierede calciumforøgelse sammenlignet med kontrollens CSF. Billeder blev taget ved fluorescensmikroskopi. Skala bar = 20 μm. (B) Et plot af et af de tre uafhængige eksperimenter, der repræsenterer fluorescensintensiteten over tid (180 s) for de kulturer, der behandles med kontrollens CSF (sort linje) og patienternes CSF (grå linje) ved NMDA-stimulering (blå pil). n(Kontrollens CSF) = 20 celler; n(Patienternes CSF) = 28 celler. Data er repræsenteret som gennemsnit ± SEM. (C) Boksdiagrammer viser medianen, 25. og 75. percentil. Whiskers angiver minimums- og maksimumsværdierne. Vurdering af signifikans blev udført ved tovejsanalyse af varians (ANOVA; p < 0,0001) og Mann-Whitney U-test (p < 0,0001). En værdi på p < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende video 1: Video, der viser to hippocampus neuroner, der udtrykker GCaMP5G side om side: neuron behandlet med kontrolens CSF (venstre) vs. neuron behandlet med patienternes CSF (højre). Anvendelsen af NMDAR (stimulering) genererer en stigning i intracellulær fluorescensintensitet i begge tilfælde, men med et signifikant højere niveau i neuronen behandlet med kontrollens CSF end den, der behandles med patienternes CSF. Billeder blev taget ved fluorescensmikroskopi og redigeret med ImageJ ved anvendelse af opslagstabellen (LUT) Fire. 1700 rammer (170 s); accelereret 5 gange. Skala bar = 10 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Det voksende felt af antistofmedieret autoimmunitet har åbnet et vindue af muligheder for identifikation af neuronale autoantistoffer, der kan bruges til at forbedre diagnosen og behandlingen af patienter. Kulturer af hippocampus neuroner er et vigtigt redskab til antistofidentifikation; Derfor er det vigtigt at udføre en standardiseret protokol for at opnå pålidelige og reproducerbare resultater. De vigtigste trin at overveje, begrænsninger og fejlfinding diskuteres her.
De kritiske trin i denne protokol kan grupperes i tre kategorier afhængigt af om de påvirker renheden, homogeniteten eller levedygtigheden af hippocampus neuronerne.
Renhed - For at opnå optimale primære cellekulturer skal efterforskeren være selvsikker, uddannet og i stand til at arbejde hurtigt, især for at minimere dissektionstidspunktet. Selvom pyramidale neuroner er den vigtigste celletype, indeholder hippocampus en række interneuroner14. For at generere kulturer med minimale gliaceller skal hippocampus ekstraheres med det minimale omgivende væv. Brugen af en sort baggrund under dissektionen hjælper med at identificere grænserne for hippocampus under stereomikroskopet. Derudover skal det tages i betragtning, at lavere celletætheder resulterer i mindre parakrin støtte og gør det vanskeligere at opretholde kulturen13. Så det er vigtigt at huske denne balance. Dette er vigtigt i billeddannelsesundersøgelser, der bruger et lavt antal celler (50.000 neuroner pr. 3,5 cm skål). For at kunne få ekstra tid til hippocampusekstraktionen skal dvalemedier, der bevarer vævet, anvendes17. Det er også vigtigt at arbejde med passende kirurgiske værktøjer. Værktøjer med høj præcision er sarte, så teknikkens reproducerbarhed bør sikres ved omhyggeligt at beskytte dem.
Homogenitet - For at udvikle en kultur uden celleaggregater er den mekaniske celledissociation blevet opgraderet ved at kombinere brugen af en fortrukket glaspipetter med en standard 1.000 μL pipette.
Levedygtighed - I denne protokol blev der ikke tilføjet antibiotika, fordi de påvirker neuronal excitabilitet og ændrer de elektrofysiologiske egenskaber hos de dyrkede neuroner18. Derfor er forurening meget sandsynlig, hvis de højeste standarder for sterilitet ikke opretholdes. Temperatur er også en nøglefaktor. At holde vævet koldt under hippocampal isolation sænker stofskiftet og reducerer cellenedbrydningen. Vævet blev derfor holdt på is indtil celledissociationsprocessen. Desuden er det afgørende at finde den korrekte balance under den enzymatiske celledissociation, der opdeler cellerne uden markeret cellelyse. I denne protokol er timingen af inkubation med trypsin og de efterfølgende vasketrin optimeret til at opnå individuelle celler med tilstrækkelig plads til at muliggøre oprettelsen af et passende neuronalt netværk.
Kritiske trin findes også i fluorescerende levende immunostaining og calciumaktivitetsoptagelser fra neuronale kulturer. For at udføre vellykket levende immunfarvning til bestemmelse af tilstedeværelsen af antistoffer mod celleoverfladeproteiner i patientprøver skal man undgå permeabilisering af cellerne, der ville give antistofferne adgang til intracellulære proteiner. Baseret på antistoffernes titer skal inkubationstiden og prøvefortyndingen desuden justeres i overensstemmelse hermed (f.eks. kan meget høje titerantistoffer give baggrundsfarvning, der gør det vanskeligt at fortolke resultaterne). Når man udfører patogenicitetsvurderingen af autoantistofferne med calciumbilleddannelse, skal man bruge et medie, der er optimalt til cellulære aktivitetsmålinger (f.eks. Mg2+ undertrykkelse i kulturmediet er vigtigt for god ydeevne). Desuden bør medier med pH-indikatorer såsom phenolrød undgås til fluorescensbilleddannelse, da det introducerer et ikke-specifikt baggrundssignal.
Der er to hovedbegrænsninger ved brugen af hippocampale neuronale kulturer. For det første skal primære kulturer kontinuerligt genereres sammenlignet med stabile cellelinjer, og dette indebærer regelmæssig brug af forsøgsdyr. Inducerede pluripotente stamcellelinjer (iPSC) kan erstatte behovet for at bruge dyremodeller, men differentieringsprotokollerne for iPSC er stadig ikke optimale. For det andet udtrykker neuroner afledt af iPSC ikke de fulde spektre af overfladeproteiner, og derfor indebærer fraværet af reaktivitet, hvis de anvendes, ikke nødvendigvis negativiteten af prøven19.
Der er tre metoder til at screene for tilstedeværelsen af autoantistoffer i serum eller CSF hos patienter, der mistænkes for at have AE: vævsbaseret assay (TBA) ved hjælp af rottehjernevæv, cellebaseret assay (CBA) ved hjælp af HEK-celler transficeret til at udtrykke neuronale proteiner og applikationen rapporteret her ved hjælp af levende kulturer af hippocampale neuroner19. Betydningen af den dyrkede hippocampale neuronmetode ligger i dens evne til at differentiere reaktivitet med overflade- og intracellulære antigener, der ikke let kan skelnes af TBA. Desuden er primære neuronale kulturer, i modsætning til CBA i HEK transficerede celler, ikke begrænset af repertoiret af transinficerede proteiner. Derudover kan dyrkede hippocampale neuroner bruges til at identificere nye antistoffer og deres målantigener, når de kombineres med immunoprecipitation og massespektrometri og derfor udvide spektret af identificerbare antistoffer. Endelig tillader det vurdering af de patogene virkninger af autoantistofferne ved hjælp af levende billeddannelsesmetoder, der kan overvåge ændringer i cellulær aktivitet. Afslutningsvis muliggør identifikationen af nye autoantistoffer i sidste ende initiering af specifikke immunterapier for at forbedre patientresultaterne.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Merche Rivas, Maria Marsal, Gustavo Castro, Jordi Cortés, Alina Hirschmann og Angel Sandoval (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) og Mercedes Alba, Marija Radosevic, David Soto, Xavier Gasull, Mar Guap og Lidia Sabater (IDIBAPS, Hospital Clínic, University of Barcelona) for deres tekniske støtte og for at levere reagenser samt Josep Dalmau og Myrna R. Rosenfeld (IDIBAPS, Hospital Clínic, University of Barcelona) for deres kritiske gennemgang af manuskriptet og mentorskab. Denne undersøgelse blev finansieret af Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) og medfinansieret af Den Europæiske Union, FIS (PI20/00280, J.P.), Fundació CELLEX (P.L-A.); Ministerio de Economía y Competitividad - Severo Ochoa-programmet for ekspertisecentre inden for F&U (CEX2019-000910-S, P.L-A.); CERCA-programmet og Laserlab-Europe (871124, P.L-A.); Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033, P.L-A.); og Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-020 | |
| 12 mm round coverslips | Fisher | NC9708845 | |
| 20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | |
| 3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | |
| 6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Beaker 100 mL | Pirex | - | |
| Borax | Sigma-Aldrich | B9876 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Curved forceps | FST | 11009-13 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red | Capricorn | DMEM-HXRXA | |
| Female Wistar rat (18-days pregnant) | Janvier | - | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | |
| Fine-angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine-curved forceps | FST | 11272-30 | |
| Fine-straight forceps | FST | 11251-23 | |
| FITC filter cube | Nikon | Standard Series | |
| Forceps | FST | 11000-12 | |
| Goat anti-Human AF488 | Invitrogen | A11013 | |
| HBSS | Capricorn | HBSS-1A | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hibernate-E medium | Gibco | A12476-01 | |
| Horse Serum (HS) | Thermofisher | 26050088 | |
| Human anti-NMDAR antibody (CSF) | Patient Sample | - | |
| Human anti-NMDAR antibody (Serum) | Patient Sample | - | |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.50i | |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 44675 | |
| L-Glutamine | Biowest | X0550-100 | |
| Mercury lamp | Nikon | C-HGFI | |
| Microscope cell chamber | Custom-build | - | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9887 | |
| NBQX | Tocris | 373 | |
| Neurobasal without phenol red | Gibco | 12348-017 | |
| NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| pAAV2-CAG-GCaMP5G | VectorBiolabs | - | |
| Paraformaldehyde 4% | Thermo scientific | J199943-K2 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022-100 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Peptide international | OKK-35056 | |
| Polystyrene ice tray | - | - | re-used cap of a polysterene box |
| Precision spring-scissors | FST | 15000-08 | |
| ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media) | Molecular Probes | P36941 | |
| Scissors | FST | 14068-12 | |
| Sodium pyruvate | Biowest | L0642-100 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Surgery scissors | FST | 14081-09 | |
| Trypsin 2.5% | Gibco | 15090046 | |
| Water, sterile endotoxine free | Sigma-Aldrich | W3500 |
References
- Dalmau, J., Geis, C., Graus, F. Autoantibodies to synaptic receptors and neuronal cell surface proteins in autoimmune diseases of the central nervous system. Physiological Reviews. 97 (2), 839-887 (2017).
- Dalmau, J., Graus, F.
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti- N -methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Annals of Neurology. 61 (1), 25-36 (2007).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurology. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Annals of Neurology. 65, 424-434 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABAB receptor in limbic encephalitis with seizures: case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurology. 9 (1), 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurology. 9 (8), 776-785 (2010).
- Sabater, L., et al. A novel NREM and REM parasomnia with sleep breathing disorder associated with antibodies against IgLON5: a case series, pathological features, and characterization of the antigen. Lancet Neurology. 13 (6), 575-586 (2014).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. The Journal of Neuroscience. 30 (17), 5866-5875 (2010).
- Moscato, E. H., et al. Acute mechanisms underlying antibody effects in anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis. Annals of Neurology. 76 (1), 108-119 (2014).
- Planagumà, J., et al. Human N-methyl D-aspartate receptor antibodies alter memory and behaviour in mice. Brain. 138 (1), 94-109 (2015).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G.
- Benson, D. L., Watkins, F. H., Steward, O., Banker, G. Characterization of GABAergic neurons in hippocampal cell cultures. Journal of Neurocytology. 23 (5), 279-295 (1994).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. Cambridge, Massachusetts. (1998).
- Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. Journal of Visualized Experiments. (19), e895 (2008).
- Brewer, G. J., Price, P. J. Viable cultured neurons in ambient carbon dioxide and hibernation storage for a month. Neuroreport. 7 (9), 1509-1512 (1996).
- Bahrami, F., Janahmadi, M. Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture. Iranian Biomedical Journal. 17 (2), 101-106 (2013).
- Ricken, G., et al. Detection methods for autoantibodies in suspected autoimmune encephalitis. Frontiers in Neurology. 9, 841 (2018).
