ऑटोइम्यून एन्सेफलाइटिस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के एंटीबॉडी-मध्यस्थता रोगों की एक नई श्रेणी है। हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स का उपयोग इन एंटीबॉडी की खोज और लक्षण वर्णन करने के लिए किया जा सकता है। यह लेख रोगियों के सीरम और मस्तिष्कमेरु द्रव में ऑटोएंटिबॉडी निर्धारित करने के लिए प्राथमिक सेल संस्कृति और इम्यूनोस्टेनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
पिछले 15 वर्षों में, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के एंटीबॉडी-मध्यस्थता रोगों की एक नई श्रेणी की विशेषता है और अब इसे “ऑटोइम्यून एन्सेफलाइटिस” (एई) के रूप में परिभाषित किया गया है। वर्तमान में 17 ज्ञात एई सिंड्रोम हैं, और सभी न्यूरोनल सेल सतह या सिनैप्टिक प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी से जुड़े हैं। नैदानिक सिंड्रोम जटिल हैं और संबंधित एंटीबॉडी के प्रकार के अनुसार भिन्न होते हैं। इन बीमारियों में से सबसे प्रसिद्ध एंटी-एन-मिथाइल डी-एस्पार्टेट रिसेप्टर (एनएमडीएआर) एन्सेफलाइटिस है, जो गंभीर स्मृति और व्यवहार हानि से जुड़ा एक प्रमुख न्यूरोसाइकियाट्रिक विकार है। संबद्ध एंटीबॉडी एन-टर्मिनल डोमेन पर एनएमडीएआर के ग्लूएन 1 सबयूनिट के साथ प्रतिक्रिया करते हैं। एई एंटीबॉडी की खोज और लक्षण वर्णन के लिए सबसे अधिक बार उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण में अलग, भ्रूण, कृंतक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की संस्कृति शामिल है। एंटीबॉडी लक्षण वर्णन की प्रक्रिया के दौरान, संस्कृति में जीवित न्यूरॉन्स रोगियों के सीरम या सीएसएफ के संपर्क में आते हैं, और प्रतिक्रियाशीलता का पता लगाने से संकेत मिलता है कि रोगी के सीरम या सीएसएफ नमूनों में न्यूरोनल सतह एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी होते हैं। हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है कि क्या रोगियों में एंटीबॉडी संभावित रूप से रोगजनक हैं, यह जांचकर कि क्या वे न्यूरॉन्स के संरचनात्मक या कार्यात्मक परिवर्तन का कारण बनते हैं। इन अध्ययनों की सफलता का स्तर संस्कृतियों की गुणवत्ता और रोगी के नमूनों की प्रतिक्रियाशीलता को प्राप्त करने और पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है। यह लेख रोगियों के सीरम या सीएसएफ में एंटीबॉडी की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के साथ संयुक्त भ्रूण चूहे हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की प्राथमिक सेल संस्कृति के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करता है। सुसंस्कृत न्यूरॉन्स और कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करके एनएमडीएआर एंटीबॉडी के संभावित रोगजनक प्रभावों की जांच करने का एक उदाहरण भी प्रस्तुत किया गया है।
ऑटोइम्यून एन्सेफलाइटिस (एई) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की बीमारियों की एक हाल ही में खोजी गई श्रेणी है जो एंटीबॉडी द्वारा मध्यस्थता करती है जो न्यूरोनल सतह या सिनैप्टिक प्रोटीन 1,2 को लक्षित करती है। नैदानिक विशेषताएं एंटीबॉडी के अनुसार भिन्न होती हैं, लेकिन आमतौर पर बिगड़ा हुआ स्मृति और अनुभूति, परिवर्तित व्यवहार और मनोवैज्ञानिक लक्षण, असामान्य आंदोलनों, नींद की शिथिलता, चेतना के स्तर में कमी और दौरे शामिल होते हैं। ये विकार सभी उम्र के व्यक्तियों को प्रभावित कर सकते हैं, कुछ प्रकार के एई मुख्य रूप से बच्चों और युवा वयस्कों को प्रभावित करते हैं2.
पिछले 15 वर्षों में, विशिष्ट न्यूरोनल सतह / अन्तर्ग्रथनी प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ 17 एई सिंड्रोम का वर्णन किया गया है (तालिका 1)। न्यूरोनल लक्ष्यों के कुछ उदाहरणों में सिनैप्टिक उत्तेजक रिसेप्टर्स एनएमडीएआर 3,4 और एएमपीएआर5, सिनैप्टिक निरोधात्मक रिसेप्टर जीएबीएबीआर6, न्यूरोनल स्रावित प्रोटीन एलजीआई 17, और सेल आसंजन अणु इगलोन 5 8 शामिलहैं। इनमें से अधिकांश एई के लिए, अध्ययनों से पता चला है कि एंटीबॉडी अपने लक्ष्य एंटीजन की संरचना या कार्य को बाधित करते हैं, दृढ़ता से रोगजनक भूमिका का समर्थन करते हैं। उदाहरण के लिए, एंटी-एनएमडीएआर एन्सेफलाइटिस में, एंटीबॉडी एनएमडीएआर के ग्लूएन 1 सबयूनिट के एन-टर्मिनल डोमेन के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, इन रिसेप्टर्स के चयनात्मक और प्रतिवर्ती आंतरिककरण का उत्पादन करते हैं जिसके परिणामस्वरूप प्रमुख न्यूरोसाइकियाट्रिक परिवर्तन 4,9,10,11 होते हैं। इस प्रकार, एक रोगी के सीरम या सीएसएफ में 17 ज्ञात एंटीबॉडी में से किसी की पहचान का उपयोग नैदानिक परीक्षण के रूप में भी किया जा सकता है जो एक विशिष्ट एई के निदान को स्थापित करता है।
इन एंटीबॉडी की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए अधिक बार उपयोग की जाने वाली तकनीकों में से एक में अलग, भ्रूण, कृंतक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की संस्कृतियों का उपयोग शामिल है। ये संस्कृतियां कई कारणों से उपयोगी हैं: भ्रूण मस्तिष्क को अलग करना आसान है और इसमें ग्लियाल कोशिकाओं का निम्न स्तर होता है, जो न्यूरोनल संस्कृतियों में संदूषण का प्रमुख स्रोतहै 12; हिप्पोकैम्पस की कोशिका आबादी सीएनएस के अधिकांश अन्य क्षेत्रों की तुलना में अपेक्षाकृत सजातीय है, पिरामिड कोशिकाएं विशाल बहुमत13,14 का प्रतिनिधित्व करती हैं; संस्कृतियों को देर से चरण के भ्रूण से तैयार किया जाता है जब पिरामिड न्यूरॉन्स की पीढ़ी पूरी हो जाती है लेकिन ग्रेन्युल कोशिकाएं अभी तक विकसित नहीं हुई हैं, जिससे संस्कृति की एकरूपता में और वृद्धि हुई है; जब सुसंस्कृत, पिरामिड न्यूरॉन्स अपनी अधिकांश मुख्य फेनोटाइपिक विशेषताओं को व्यक्त करते हैं, अच्छी तरह से विकसित डेंड्राइट बनाने में सक्षम होते हैं, और सिनैप्टिक रूप से जुड़े नेटवर्क स्थापित करते हैं जिनका उपयोग संरचनात्मक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल जांच12,13 के लिए किया जा सकता है; चूंकि एंटीबॉडी जीवित न्यूरॉन्स में प्रवेश नहीं कर सकते हैं, इसलिए जीवित संस्कृतियों का उपयोग कोशिका की सतह पर रहने वाले एंटीजेनिक लक्ष्यों की पहचान करने की अनुमति देता है; और न्यूरोनल संस्कृतियों से एंटीबॉडी-एंटीजन कॉम्प्लेक्स का इम्यूनोप्रेसिपिटेशन लक्ष्य एंटीजन 5 की पहचान के लिए अनुमति देताहै।
न्यूरोनल संस्कृतियों का उपयोग करके अध्ययन की सफलता संस्कृतियों की गुणवत्ता और रोगी के सीरम या मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) की प्रतिरक्षात्मकता का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल पर अत्यधिक निर्भर है। संस्कृतियों को प्रभावित करने वाले चर में संस्कृति के विकास से पहले हिप्पोकैम्पस के अलगाव की प्रक्रियाएं, ऊतक का पृथक्करण, चढ़ाना घनत्व, उपयोग की जाने वाली विकास सतह और मीडिया 13,15,16 की संरचना शामिल है। यह लेख फ्लोरोसेंट इम्यूनोस्टेनिंग के साथ संयुक्त भ्रूण चूहे हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की प्राथमिक सेल संस्कृति के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करता है जिसका उपयोग ज्ञात एई एंटीजन और संभावित उपन्यास सतह लक्ष्यों के खिलाफ एंटीबॉडी की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। यह जीसीएएमपी परिवार, जीसीएएमपी 5 जी से आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) व्यक्त करने वाले सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स का उपयोग करके लाइव-सेल इमेजिंग तकनीकों द्वारा एनएमडीएआर एंटीबॉडी के रोगजनक प्रभावों की जांच करने का एक उदाहरण भी प्रदान करता है।
प्रोटीन को टारगेट करें | प्रोटीन फंक्शन | सेल डिब्बे | मेन सिंड्रोम |
एनएमडीएआर | आयन चैनल | सिनैप्टिक प्रोटीन | एंटी-एनएमडीएआर इंसेफेलाइटिस |
एएमपीएआर | आयन चैनल | सिनैप्टिक प्रोटीन | लिम्बिक इंसेफेलाइटिस |
ग्लूके 2 | आयन चैनल | सिनैप्टिक प्रोटीन | मस्तिष्कशोथ |
जीएबीएएआर | आयन चैनल | सिनैप्टिक प्रोटीन | मस्तिष्कशोथ |
गैबर | मेटाबोट्रोपिक रिसेप्टर | सिनैप्टिक प्रोटीन | लिम्बिक इंसेफेलाइटिस |
एमग्लूआर1 | मेटाबोट्रोपिक रिसेप्टर | सिनैप्टिक प्रोटीन | मस्तिष्कशोथ |
एमग्लूआर 2 | मेटाबोट्रोपिक रिसेप्टर | सिनैप्टिक प्रोटीन | मस्तिष्कशोथ |
एमजीएलआर 5 | मेटाबोट्रोपिक रिसेप्टर | सिनैप्टिक प्रोटीन | मस्तिष्कशोथ |
डी 2 आर | मेटाबोट्रोपिक रिसेप्टर | सिनैप्टिक प्रोटीन | बेसल गैन्ग्लिया एन्सेफलाइटिस |
एलजीआई 1 | आसंजन अणु | कोशिका की सतह प्रोटीन | लिम्बिक इंसेफेलाइटिस |
सीएएसपीआर 2 | आसंजन अणु | कोशिका की सतह प्रोटीन | लिम्बिक इंसेफेलाइटिस |
इगलोन 5 | आसंजन अणु | कोशिका की सतह प्रोटीन | एंटी-इगलोन 5 रोग |
न्यूरेक्सिन-3α | आसंजन अणु | कोशिका की सतह प्रोटीन | मस्तिष्कशोथ |
डीएनईआर (टीआर) | ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन | कोशिका की सतह प्रोटीन | मस्तिष्कशोथ |
एसईजेड 6 एल | ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन | कोशिका की सतह प्रोटीन | मस्तिष्कशोथ |
एम्फीफिसिन | संरचनात्मक अणु | कोशिका की सतह प्रोटीन | लिम्बिक इंसेफेलाइटिस |
डीपीपीएक्स | पेप्टिडेज़ | कोशिका की सतह प्रोटीन | मस्तिष्कशोथ |
तालिका 1: न्यूरोनल सेल सतह और सिनैप्टिक प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी।
एंटीबॉडी-मध्यस्थता ऑटोइम्यूनिटी के बढ़ते क्षेत्र ने न्यूरोनल ऑटोएंटिबॉडी की पहचान के लिए अवसर की एक खिड़की खोल दी है जिसका उपयोग रोगियों के निदान और उपचार में सुधार के लिए किया जा सकता है। हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की संस्कृतियां एंटीबॉडी पहचान के लिए एक आवश्यक उपकरण हैं; इसलिए, विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल करना महत्वपूर्ण है। विचार करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम, सीमाएं और समस्या निवारण, यहां चर्चा की गई है।
इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों को तीन श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है कि क्या वे शुद्धता, एकरूपता, या हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की व्यवहार्यता को प्रभावित करते हैं।
शुद्धता – इष्टतम प्राथमिक सेल संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए, अन्वेषक को आत्मविश्वास, प्रशिक्षित और जल्दी से काम करने में सक्षम होना चाहिए, खासकर विच्छेदन के समय को कम करने के लिए। यहां तक कि अगर पिरामिड न्यूरॉन्स प्रमुख कोशिका प्रकार हैं, तो हिप्पोकैम्पस में विभिन्न प्रकार के इंटरन्यूरॉन्स14 होते हैं। न्यूनतम ग्लियाल कोशिकाओं के साथ संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए, हिप्पोकैम्पस को न्यूनतम आसपास के ऊतकों के साथ निकाला जाना चाहिए। विच्छेदन के दौरान एक काली पृष्ठभूमि का उपयोग स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत हिप्पोकैम्पस की सीमाओं की पहचान करने में मदद करता है। इसके अलावा, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि कम सेल घनत्व के परिणामस्वरूप कम पैराक्राइन समर्थन होता है और संस्कृति को बनाए रखना अधिक कठिन हो जाता है13. इसलिए इस संतुलन को ध्यान में रखना जरूरी है। यह इमेजिंग अध्ययनों में महत्वपूर्ण है जो कोशिकाओं की कम संख्या (50,000 न्यूरॉन्स प्रति 3.5 सेमी डिश) का उपयोग करते हैं। हिप्पोकैम्पस निष्कर्षण के लिए अतिरिक्त समय होने में सक्षम होने के लिए, ऊतक को संरक्षित करने वाले हाइबरनेट मीडिया का उपयोग किया जाना चाहिए17. पर्याप्त सर्जिकल उपकरणों के साथ काम करना भी आवश्यक है। उच्च परिशुद्धता उपकरण नाजुक हैं, इसलिए तकनीक की प्रजनन क्षमता को सावधानीपूर्वक संरक्षित करके सुनिश्चित किया जाना चाहिए।
समरूपता – सेल समुच्चय के बिना एक संस्कृति विकसित करने के लिए, यांत्रिक सेल पृथक्करण एक मानक 1,000 μL विंदुक के साथ एक पूर्व खींचा ग्लास पिपेट के उपयोग के संयोजन से उन्नत किया गया है।
व्यवहार्यता – इस प्रोटोकॉल में, कोई एंटीबायोटिक्स नहीं जोड़ा गया था क्योंकि वे न्यूरोनल उत्तेजना को प्रभावित करते हैं और सुसंस्कृत न्यूरॉन्स18 के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों को बदलते हैं। इसलिए, संदूषण बहुत संभावना है यदि बाँझपन के उच्चतम मानकों को बनाए नहीं रखा जाता है। तापमान भी एक महत्वपूर्ण कारक है। हिप्पोकैम्पस अलगाव के दौरान ऊतक को ठंडा रखने से चयापचय धीमा हो जाता है और कोशिका क्षरण कम हो जाता है। इसलिए, ऊतक को कोशिका पृथक्करण प्रक्रिया तक बर्फ पर रखा गया था। इसके अलावा, एंजाइमी सेल पृथक्करण के दौरान सही संतुलन खोजना महत्वपूर्ण है जो चिह्नित सेल लिसिस के बिना कोशिकाओं को अलग करता है। इस प्रोटोकॉल में, ट्रिप्सिन के साथ इनक्यूबेशन के समय और बाद में धोने के चरणों को एक उपयुक्त न्यूरोनल नेटवर्क के निर्माण की अनुमति देने के लिए पर्याप्त स्थान के साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया है।
न्यूरोनल संस्कृतियों से फ्लोरोसेंट लाइव इम्यूनोस्टेनिंग और कैल्शियम गतिविधि रिकॉर्डिंग में महत्वपूर्ण कदम भी पाए जाते हैं। रोगी के नमूनों में सेल सतह प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी की उपस्थिति का निर्धारण करने के लिए सफल लाइव इम्यूनोस्टेनिंग करने के लिए, किसी को कोशिकाओं के पारगम्यीकरण से बचना चाहिए जो एंटीबॉडी को इंट्रासेल्युलर प्रोटीन तक पहुंचने की अनुमति देगा। इसके अतिरिक्त, एंटीबॉडी के टिटर के आधार पर, इनक्यूबेशन समय और नमूना कमजोर पड़ने को तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, बहुत उच्च टिटर एंटीबॉडी पृष्ठभूमि धुंधला दे सकते हैं जो परिणामों की व्याख्या करना मुश्किल बनाता है)। कैल्शियम इमेजिंग के साथ ऑटोएंटिबॉडी के रोगजनकता मूल्यांकन को पूरा करते समय, किसी को एक मीडिया का उपयोग करने की आवश्यकता होती है जो सेलुलर गतिविधि माप के लिए इष्टतम है (उदाहरण के लिए, संस्कृति माध्यम में एमजी2 + दमन अच्छे प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण है)। इसके अलावा, प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए, पीएच संकेतक जैसे फिनोल लाल के साथ मीडिया से बचा जाना चाहिए क्योंकि यह एक गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेत का परिचय देता है।
हिप्पोकैम्पस न्यूरोनल संस्कृतियों के उपयोग की दो मुख्य सीमाएं हैं। सबसे पहले, स्थिर सेल लाइनों की तुलना में, प्राथमिक संस्कृतियों को लगातार उत्पन्न किया जाना चाहिए, और इसका तात्पर्य नियमित रूप से प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग से है। प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) लाइनें पशु मॉडल का उपयोग करने की आवश्यकता को प्रतिस्थापित कर सकती हैं, लेकिन आईपीएससी के लिए भेदभाव प्रोटोकॉल अभी भी इष्टतम नहीं हैं। दूसरे, आईपीएससी से प्राप्त न्यूरॉन्स सतह प्रोटीन के पूर्ण स्पेक्ट्रा को व्यक्त नहीं करते हैं और इसलिए, यदि उपयोग किया जाता है, तो प्रतिक्रियाशीलता की अनुपस्थिति आवश्यक रूप से नमूना19 की नकारात्मकता का संकेत नहीं देती है।
एई होने के संदेह वाले रोगियों के सीरम या सीएसएफ में ऑटोएंटिबॉडी की उपस्थिति के लिए स्क्रीन करने के तीन तरीके हैं: चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग करके ऊतक-आधारित परख (टीबीए), न्यूरोनल प्रोटीन व्यक्त करने के लिए एचईके कोशिकाओं का उपयोग करके सेल-आधारित परख (सीबीए), और हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स19 की लाइव संस्कृतियों का उपयोग करके यहां रिपोर्ट किया गया आवेदन। सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन विधि का महत्व सतह और इंट्रासेल्युलर एंटीजन के साथ प्रतिक्रियाशीलता को अलग करने की क्षमता में निहित है जिसे टीबीए द्वारा आसानी से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियां, एचईके ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं में सीबीए के विपरीत, ट्रांसफेक्टेड प्रोटीन के प्रदर्शनों की सूची तक सीमित नहीं हैं। इसके अतिरिक्त, सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स का उपयोग उपन्यास एंटीबॉडी और उनके लक्ष्य एंटीजन की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जब इम्यूनोप्रेसिपिटेशन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयुक्त किया जाता है और इसलिए, पहचानने योग्य एंटीबॉडी के स्पेक्ट्रम को व्यापक बनाता है। अंत में, यह लाइव इमेजिंग विधियों द्वारा ऑटोएंटिबॉडी के रोगजनक प्रभावों के मूल्यांकन की अनुमति देता है जो सेलुलर गतिविधि में परिवर्तन की निगरानी कर सकते हैं। अंत में, नए ऑटोएंटिबॉडी की पहचान अंततः रोगी के परिणामों में सुधार करने के लिए विशिष्ट इम्यूनोथेरेपी की दीक्षा को सक्षम बनाती है।
The authors have nothing to disclose.
हम मर्चे रिवास, मारिया मार्सल, गुस्तावो कास्त्रो, जॉर्डी कोर्टेस, अलीना हिर्शमैन और एंजेल सैंडोवल (आईसीएफओ-इंस्टीट्यूट डी सिएन्सीज़ फोटोनिक्स) और मर्सिडीज अल्बा, मारिजा राडोसेविक, डेविड सोटो, जेवियर गसुल, मार गुआस्प और लिडिया सबेटर (आईडीआईबीपीएस, अस्पताल क्लिनिक, बार्सिलोना विश्वविद्यालय) को उनके तकनीकी समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। अस्पताल क्लिनिक, बार्सिलोना विश्वविद्यालय) पांडुलिपि और सलाह की उनकी महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए। इस अध्ययन को इंस्टीट्यूटो डी सालुद कार्लोस III (आईएससीआईआईआई) द्वारा वित्त पोषित किया गया था और यूरोपीय संघ, एफआईएस (पीआई 20/00280, जेपी), फंडासियो सेलेक्स (पीएल-ए) द्वारा सह-वित्त पोषित किया गया था; मंत्री डी इकोनोमिया वाई कॉम्पिटिटिविडेड – आर एंड डी में उत्कृष्टता केंद्रों के लिए सेवेरो ओचोआ कार्यक्रम (सीईएक्स 2019-000910-एस, पीएल-ए); सीईआरसीए कार्यक्रम और लेजरलैब-यूरोप (871124, पी.एल.-ए.); मिनिस्टरियो डी सिएन्सिया और इनोवासियोन (एमसीआईएन / एईआई / 10.13039 / 501100011033, पीएल-ए); और फोंडो सोशल यूरोपो (पीआरई 2020-095721, एमसी)।
10 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-020 | |
12 mm round coverslips | Fisher | NC9708845 | |
20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | |
3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | |
6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Beaker 100 mL | Pirex | – | |
Borax | Sigma-Aldrich | B9876 | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Curved forceps | FST | 11009-13 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red | Capricorn | DMEM-HXRXA | |
Female Wistar rat (18-days pregnant) | Janvier | – | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | |
Fine-angled forceps | FST | 11251-35 | |
Fine-curved forceps | FST | 11272-30 | |
Fine-straight forceps | FST | 11251-23 | |
FITC filter cube | Nikon | Standard Series | |
Forceps | FST | 11000-12 | |
Goat anti-Human AF488 | Invitrogen | A11013 | |
HBSS | Capricorn | HBSS-1A | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hibernate-E medium | Gibco | A12476-01 | |
Horse Serum (HS) | Thermofisher | 26050088 | |
Human anti-NMDAR antibody (CSF) | Patient Sample | – | |
Human anti-NMDAR antibody (Serum) | Patient Sample | – | |
ImageJ/Fiji | NIH | v1.50i | |
Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
KCl | Sigma-Aldrich | 44675 | |
L-Glutamine | Biowest | X0550-100 | |
Mercury lamp | Nikon | C-HGFI | |
Microscope cell chamber | Custom-build | – | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9887 | |
NBQX | Tocris | 373 | |
Neurobasal without phenol red | Gibco | 12348-017 | |
NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 | |
pAAV2-CAG-GCaMP5G | VectorBiolabs | – | |
Paraformaldehyde 4% | Thermo scientific | J199943-K2 | |
Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022-100 | |
Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | |
Poly-L-Lysine (PLL) | Peptide international | OKK-35056 | |
Polystyrene ice tray | – | – | re-used cap of a polysterene box |
Precision spring-scissors | FST | 15000-08 | |
ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media) | Molecular Probes | P36941 | |
Scissors | FST | 14068-12 | |
Sodium pyruvate | Biowest | L0642-100 | |
Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Surgery scissors | FST | 14081-09 | |
Trypsin 2.5% | Gibco | 15090046 | |
Water, sterile endotoxine free | Sigma-Aldrich | W3500 |