Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Måling av proteinomsetningshastigheter i senescent og ikke-dele kultivert celler med metabolsk merking og massespektrometri

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63835
Automatic Translation
1, 1, 2
1Laboratory of Genetics and Genomics, National Institute on Aging Intramural Research Program, National Institutes of Health, 2Translational Gerontology Branch, National Institute on Aging Intramural Research Program, National Institutes of Health

Summary

Denne protokollen beskriver arbeidsflyten for metabolsk merking av senescent og ikke-delende celler med pulserende SILAC, umålt massespektrometrianalyse og en strømlinjeformet beregning av proteinhalvvanser.

Abstract

Voksende bevis har vist at opphopning av senescent celler i sentralnervesystemet bidrar til nevrodegenerative lidelser som Alzheimers og Parkinsons sykdommer. Cellulær senescence er en tilstand av permanent celle syklus arrestasjon som vanligvis oppstår som svar på eksponering for sub-dødelige påkjenninger. Men som andre ikke-splittende celler forblir senescentceller metabolsk aktive og utfører mange funksjoner som krever unike transkripsjons- og translasjonskrav og utbredte endringer i de intracellulære og utskilte proteomene. Forstå hvordan proteinsyntese og forfallshastigheter endres under senescence kan belyse de underliggende mekanismene for cellulær senescence og finne potensielle terapeutiske veier for sykdommer forverret av senescent celler. Dette dokumentet beskriver en metode for proteomskala evaluering av protein halveringstider i ikke-splittende celler ved hjelp av pulserende stabil isotopmerking av aminosyrer i cellekultur (pSILAC) i kombinasjon med massespektrometri. pSILAC innebærer metabolsk merking av celler med stabile tunge isotopholdige versjoner av aminosyrer. Kombinert med moderne massespektrometri tilnærminger, pSILAC muliggjør måling av proteinomsetning av hundrevis eller tusenvis av proteiner i komplekse blandinger. Etter metabolsk merking kan omsetningsdynamikken til proteiner bestemmes basert på relativ berikelse av tunge isotoper i peptider oppdaget av massespektrometri. I denne protokollen er en arbeidsflyt beskrevet for generering av senescent fibroblastkulturer og tilsvarende arresterte quiescent fibroblaster, samt et forenklet, engangspunkt pSILAC-merkingstidskurs som maksimerer dekningen av forventede proteinomsetningshastigheter. Videre presenteres en rørledning for analyse av pSILAC massespektrometridata og brukervennlig beregning av proteinforringelseshastigheter ved hjelp av regneark. Anvendelsen av denne protokollen kan utvides utover senescent celler til alle ikke-splittende dyrkede celler som nevroner.

Introduction

Senescence ble først identifisert som en tilstand av ubestemt vekst arrest utstilt av kultiverte primærceller etter å ha nådd replikert utmattelse1. Det har siden blitt vist at senescence kan oppstå som svar på mange cellulære fornærmelser, inkludert gentoksiske, mitokondrie og onkogene påkjenninger, blant andre2. Mens senescence har flere fysiologisk viktige roller, for eksempel tumorundertrykking og sårheling, er akkumulering av senescentceller under aldring forbundet med en rekke skadelige effekter på helse3, inkludert flere nevrodegenerative forhold 4,5,6. Cellulær senescence forekommer i flere hjernecelletyper, inkludert nevroner 7,8,9,10, astrocytter11, mikroglia12 og oligodendrocyttforløpere13, og bidrar til nevrodegenerasjon og kognitiv dysfunksjon. Amyloid beta oligomers, et av kjennetegnene på Alzheimers sykdom14, har vist seg å akselerere nevronal senescence 13,15,16. En økt forekomst av senescent celler har også vært forbundet med Parkinsons sykdom17, spesielt som følge av miljøstressorer11,18. Det er viktig at selektiv eliminering av senescentceller i prekliniske modeller forlenger levetiden og reduserer en rekke aldersrelaterte sykdommer 3,5,12 og forbedrer kognitive underskudd 8,11,12,13. Senescent celler har dermed dukket opp som lovende terapeutiske mål for behandling av mange aldersrelaterte forhold.

Mye av den skadelige effekten av senescentceller er forårsaket av senescence-assosiert sekretorisk fenotype (SASP), en kompleks blanding av bioaktive molekyler utskilt av senescent celler som kan forårsake lokal betennelse, angiogenese, ødeleggelse av den ekstracellulære matrisen, og forplantning av senescence i omkringliggende vev 19,20,21 . SASP representerer også et interessant biologisk fenomen av senescence fordi det krever en betydelig transkripsjons- og translasjonsinnsats under en tilstand av cellesyklusarrest. Faktisk har senescent celler vist seg å vise nedgang i ribosomet biogenese 22,23,24 som bør redusere proteinsyntesen. I stedet oversetter senescentceller robust noen proteiner, spesielt SASP-faktorer, og påvirker metabolismen av omkringliggende vev25. Dermed er det stor interesse for å forstå hvordan senescentceller som gjennomgår en permanent cellesyklusstans fortsetter å opprettholde protein homeostase, samtidig som de robust uttrykker SASP-faktorer og andre utvalgte proteiner.

Denne metoden beskriver hvordan du bruker massespektrometri og pulserende stabil isotopmerking av aminosyrer i cellekultur (pSILAC) for å globalt måle halvering av proteiner i senescentceller i proteome-bred skala. I tradisjonell SILAC er dyrkede celler helt metabolsk merket med tunge og lette ikke-radioaktive isotoper av aminosyrer for nedstrøms analyse av proteinoverflod. Denne metoden har tidligere blitt brukt til å vurdere overflodsendringer omfattende og kvantitativt i SASP av kultiverte fibroblaster26. I pSILAC er celler tilsvarende metabolsk merket med en puls av tung isotop som følger forhåndsmerking med lett isotop, og deretter høstes med ett eller flere tidsintervaller. Graden av inkorporering av tung isotop i referanse til eksisterende lysisotoper brukes deretter til å beregne relative proteinomsetningshastigheter. Vanligvis brukes isotoper av arginin og lysin fordi trypsin cleaves på disse rester; Dermed vil alle peptider fra standard fordøyelse potensielt inneholde den tunge etiketten. Par peptider som bare varierer ved tilstedeværelse eller fravær av tung lysin eller arginin er kjemisk identiske og kan differensieres og kvantifiseres av et massespektrometer. Etter massespektrometrianalyse kan peptider identifiseres som nylig syntetisert eller eksisterende basert på tilstedeværelsen eller fraværet av den isotopiske etiketten i de resulterende peptididentifikasjonene. Proteinomsetningshastigheter kan deretter bestemmes ved å tilpasse forholdet mellom tunge (13 C-15N) over lette (12 C-14N) peptider for et gitt protein til kinetiske modeller for eksponentiell vekst eller forfall27,28. pSILAC har blitt brukt i flere sammenligninger av proteinomsetningshastigheter 29,30,31,32 og er for tiden den mest omfattende og høygjennomstrømningsmetoden for måling av protein halveringstiden.

Denne protokollen beskriver utarbeidelsen av senescent celler parallelt med tilsvarende vekst-arresterte passivitetsceller i kultur, etterfulgt av metabolsk merking med pSILAC. Celler høstes deretter, homogeniseres til lysater og behandles for massespektrometrioppkjøp og analyse. Dataene hentet fra massespektrometri brukes deretter til å bestemme protein halveringstider ved hjelp av en forenklet kvantitativ metode som bruker ett enkelt tidspunkt og halveringsberegninger utført i et regneark. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan estimater av protein halveringstiden måles på en omfattende og kvantitativ måte som er mer autentisk for uforstyrrede cellulære forhold enn protokoller som bruker blokkeringer av proteinsyntese eller omsetning.

Protocol

1. Fremstilling av passiviserende celler og celler gjengitt senescent ved eksponering for ioniserende stråling (IR)

MERK: Cellulær senescence og passiviscens kan induseres ved hjelp av flere metoder, som beskrevet i detalj andre steder 33,34,35. Stimuliene som brukes til å fremkalle senescence og passiviscens kan avhenge av celletypen av interesse og det biologiske spørsmålet som undersøkes. Cellene som brukes i denne studien er kommersielt tilgjengelige.

  1. Tine humane diploide IMR-90 fibroblaster (~1 x 10 6 celler) fra en kryofil IMR-90 fibroblaster (~1 x 106 celler) fra en kryofil og tallerken dem i 20 ml DMEM supplert med 10 % fetal bovint serum (FBS) (tabell 1) på en 150 mm plate.
  2. Vokse cellene ved fysiologiske oksygenforhold (3% O2, 5% CO2, 37 °C) og utvide kulturene i 10% FBS-inneholdende medier til tilstrekkelig replikering for quiscent og senescent celler er etablert (minst 3-5 replikeringer anbefales per tilstand).
    MERK: Culturing celler ved fysiologisk (3%) oksygen er ideell for primære menneskelige fibroblastceller, men egnede kulturforhold for andre celletyper kan variere og bør bestemmes fra sak til sak.
  3. Generer senescent celler ved å utsette proliferating celler til 15 grå (Gy) av ioniserende stråling (IR).
    MERK: Intensiteten av strålingseksponering kan variere avhengig av celletype. Mens 15 Gy brukes her, er 10 Gy også en vanlig brukt stråledose for fibroblaster; andre celler, som monocytter, kan kreve en dose så lav som 5 Gy. Dosen bestemmes generelt empirisk ved å veie levedyktighet mot senescence induksjon.
    1. Eksponer cellene ved 40% -60% samløp til IR i medier som inneholder 10% FBS.
    2. Etter IR-eksponering, bytt til ferske medier som inneholder 10% FBS.
    3. Endre media (20 ml, som inneholder 10% FBS) annenhver dag i 8 dager.
      MERK: Celler utsettes for IR ved lavere samløp fordi IR-behandlede celler vil ekspandere i kulturen før de slutter å vokse. I dette eksperimentet ble celler ikke delt celler under etableringen av senescence, og mens de ble mer konfluensierende, viste de fortsatt senescent cellemarkører ved høsting. I fibroblaster utvikler den senescent fenotypen innen 7-10 dager.
  4. Generer passiviserte kontrollceller ved å endre mediet på belagte spredningsceller til medier som inneholder 0,2 % FBS (serum sult) (tabell 1).
    1. Fortsett å vokse celler som vil bli brukt til passivisen kontroll i medier som inneholder 10% FBS til dag 4 etter senescent celler er utsatt for IR, splitting når det er nødvendig.
    2. På dag 4 etter IR, endre media av passivceller til 20 ml medier som inneholder 0,2% FBS (tabell 1) og fortsette å vokse i ytterligere 6 dager, endre media hver annen dag.
      MERK: Selv i medier som inneholder 0,2% FBS, vil fibroblaster fortsette å vokse noe og kan virke sammenfallende ved slutten av høsten. Som en tommelfingerregel, ta sikte på å samle passivitetsceller når de har nådd samløp som ligner på de senescent cellekulturene.

2. Merking av celler for pulserende SILAC og høsting av lysater

  1. Endre medier på både senescent og quiescent celler (12 plater) til SILAC Light (Tabell 1) og vokse i 2 dager.
    MERK: Denne merkingen bidrar til å redusere bakgrunnsstøy siden det er en lav naturlig overflod på 13C og 15N. Dette trinnet kan hoppes over i reagensbegrensende forhold, men vil resultere i en liten overestimering av ny proteinsyntese.
  2. Erstatt medier med SILAC DMEM (tabell 1) for metabolsk merking.
    MERK: SILAC DMEM-medier er spesielt formulert for å inneholde rent lette eller tunge isotoper av arginin og lysin for metabolsk merking. De må ikke erstattes med standard DMEM-formuleringer i deltrinnene 2.2.1 eller 2.2.2.
    1. For tre senescent og tre passivitetsplater, erstatt medier med 30 ml SILAC Light (tabell 1) og vokse i 3 dager uten å bytte medium.
    2. For minimum tre senescent og tre passivitetsplater, erstatt mediet med 30 ml SILAC Heavy (tabell 1) og vokse i 3 dager uten å bytte medium.
      MERK: Det er et alternativ på dette tidspunktet å høste det som vil være de lyse cellene umiddelbart, i stedet for å merke dem i ytterligere 3 dager. For ett enkelt tidspunkt er det å foretrekke å merke tunge og lyse celler i samme periode som i denne protokollen for å minimere satsvise effekter.
  3. Løsne cellene fra kulturplater ved å tilsette 5 ml forvarmet trypsinreagens til hver tallerken og inkubere i 5 min ved 37 °C.
  4. Resuspend de frittliggende cellene i 5 ml av samme medium som brukes til kultur (enten SILAC Light eller SILAC Heavy) til et totalt volum på 10 ml.
  5. Høst cellene for utvinning av lysater og validering av senescence markører.
    1. For hver suspensjon, aliquot 0,6 x 106 av cellene i 2 ml medier som inneholder 0,2% FBS i en 6-brønns tallerken (to retter, en for SILAC Lette dyrkede celler og en for SILAC Tunge dyrkede celler) og plasser ved 37 °C for inkubering over natten.
      MERK: Disse platene (undertrinn 2.5.1) vil bli brukt til påvisning av senescence-assosiert β-galactosidase (SA-βGal) aktivitet (trinn 3.1).
    2. For hver suspensjon, aliquot 1 x 106 av cellene i et mikrocentrifuge rør og spinn ned i en bordplate sentrifuge med full hastighet i 1 min. Fjern supernatanten og resuspend pellet i 1 ml fenol; På dette trinnet kan RNA renses fullstendig som beskrevet i fenolleverandørens håndbok eller lagres på lang sikt ved -80 °C.
      FORSIKTIG: Fenol er etsende og bør håndteres utelukkende i en hette med hansker og en labfrakk.
      MERK: Den ekstraherte RNA vil bli brukt til påvisning av mRNAer som koder SASP-faktorer ved hjelp av omvendt transkripsjon (RT) etterfulgt av sanntids, kvantitativ (q) PCR-analyse (RT-qPCR) (trinn 3.2). En annen pålitelig analyse for senescence induksjon er en test for 5-etynyl dihydroksy uridin (EdU) inkorporering, noe som indikerer tilstedeværelsen av proliferating celler. Fraværet av spredning kan brukes til å bekrefte passivisens og senescence.
    3. Overfør de resterende cellene til is og spinn ned ved 300 x g og 4 °C.
  6. Fjern supernatanten og vask cellene to ganger i 1 ml kald PBS for å fjerne medier/trypsin og eksogen proteinforurensning fra fosterets bovint serum fra kulturmediet.
  7. Snurr ned cellene igjen, fjern supernatanten, og fortsett til lysis.
  8. Resuspend cellepellets i 150 μL nylaget 8 M urea 50 mM ammoniumbikarbonat Lysis Buffer (Tabell 1), og bland ved pipettering opp og ned.
  9. Soniker lysatene i en vannsonator i 2,5 min med 30 s på/av ved middels effekt ved 4 °C.
  10. Overfør lysatene til en forvarmet 95 °C varmeblokk og protese i 4 min.
  11. Snurr ned lysatene; lysates kan nå oppbevares ved -80 °C eller brukes umiddelbart til kvantifisering.
  12. Lag en 30 μL lager på 1:10 fortynning for hver lysat i Lysis Buffer.
  13. Mål proteinkonsentrasjonen med BCA Assay Kit ved hjelp av en standardkurve fremstilt i 1/10x Lysis Buffer fortynnet i ddH2O. Lysates kan nå lagres ved -80 °C på ubestemt tid.

3. Validering av senescence ved senescence-assosiert β-Galactosidase (SA-βGal) aktivitet og RT-qPCR analyse av senescence-assosiert mRNAs

MERK: Startmaterialet for disse trinnene samles inn i trinn 2.5

  1. Fra de 6-brønnsplatene som ble satt opp i substep 2.5.1, analysere celler for SA-βGal aktivitet ved hjelp av Senescence β-Galactosidase Staining kit etter produsentens protokoll. Visualiser flekker under brightfield med farge aktivert, som tidligere beskrevet36.
    MERK: SA-βGal kvantifiseres ved å sammenligne prosentandelen av positive celler (synlig blå farge) i senescent versus passiv kontrollforhold. Minimum 70% av cellene bør være SA-βGal positive for vellykket bekreftelse av senescence. Passiviserende kontrollceller bør være mindre enn 10 % positive for SA-βGal.
  2. Trekk ut RNA fra fenol suspensjon (substep 2.5.2) og analyser ved hjelp av RT-qPCR for økte nivåer av mRNAs koding SASP faktorer (IL6, CXCL8, IL1B), celle syklus markører (CDKN2A/p16, CDKN1A/p21), og andre indikatorer for senescence (tap av LMNB1 og PCNA).
    MERK: RNA er ustabil og bør derfor håndteres med RNase-fritt utstyr, ferske hansker og på is med mindre annet er angitt i protokollen.
    1. Fra fenol suspensjon, tilsett 200 μL kloroform per 1 ml fenol og spinn ned ved 12.000 x g i 15 min ved 4 °C.
    2. Fjern forsiktig den vandige fasen og tilsett 1: 1 volum isopropanol, 15 μg glykogen co-precipitant, og inkuber deretter ved 4 °C i 10 minutter for å utfelle RNA.
    3. Etter inkubasjon, pellet RNA ved sentrifugering ved 12.000 x g i 20 min ved 4 °C etterfulgt av en vask i 75% EtOH lik 1 volum fenol brukt. Resuspend RNA i 50 μL nukleasefritt destillert vann; RNA kan oppbevares ved -80 °C på ubestemt tid.
    4. Til RNA-prøver, tilsett 38 μL nukleasefritt destillert vann, 10 μL 10x DNAse reaksjonsbuffer og 2 μL DNase jeg etterfulgt av blanding.
      MERK: Å generere en felles blanding av alle reagensene i substep 3.2.3 multiplisert med antall prøver for behandling for lik fordeling til prøver er den beste praksisen.
    5. Inkuber DNase I-behandlet RNA-prøver ved 37 °C i 30 minutter.
    6. Fjern DNase fra prøvene ved hjelp av 1 volum fenol/kloroform/isoamylalkohol (25:24:1) blanding ved virveling og spinning ved maksimal hastighet i en bordplate sentrifuge i 5 min; RNA vil bli inneholdt i den vandige fasen.
    7. Gjenta deltrinnene 3.2.2 og 3.2.3 for å utfelle RNA. Resuspend i 20 μL nukleasefritt destillert vann; RNA kan oppbevares ved -80 °C på ubestemt tid.
    8. Generer cDNA fra renset RNA ved å inkubere 0,5-1,0 μg renset RNA med 200 U omvendt transkripsjon, 100 pMol tilfeldige primere og 10 mM av en dNTP-blanding i 1x reaksjonsbuffer levert med reverseasetranskripsjonen; inkuber i 10 min ved 25 °C, deretter i 30 minutter ved 50 °C, med et siste inaktiveringstrinn ved 85 °C i 5 minutter.
    9. Analyser cDNA fra RT-trinnet (deltrinn 3.2.3) fra passiviserende kontroll og senescent celler ved hjelp av sanntid, kvantitativ (q) PCR-analyse for å vurdere nivået av mRNA-markører som er kjent for å økes (CDKN2A/p16, CDKN1A/p21, IL1B, IL6 og CXCL8 mRNAer) eller reduseres (LMNB1 og PCNA mRNAer) med senescence som beskrevet andre steder. ACTB mRNA, som koder rengjøringsproteinet β-Actin, er ofte en god mRNA for å normalisere forskjeller i inngangsmaterialet. Primerne som brukes er i tabell 2.
      MERK: Relativ RT-qPCR-analyse er avhengig av antagelser om lik bindingseffektivitet mellom målprimerparene og et referanseprimerpar. Disse forutsetningene bør testes for nye primersett som beskrevet andre steder37. I tillegg bør referanseindikatorer være konstante mellom celletypene som sammenlignes, og flere tilleggsalternativer for senescent-celler er tidligere identifisertsom 38.

4. In-solution trypsin fordøyelse

MERK: Fra dette tidspunktet er det viktig å bruke massespektrometri-grade buffere, løsningsmidler og kjemikalier for å forhindre forstyrrelser fra urenheter under massespektrometrianalyse. Alle buffere skal bestå av ingredienser som er egnet til flytende kromatografi tandem massespektrometrianalyse, inkludert vann og acetonitril. Se materialtabellen for en liste over egnede kjemikalier og løsemidler.

  1. Aliquot 50 μg av hver proteinprøve i nye rør og bringer til like volumer med Lysis Buffer.
  2. Til hver prøve, legg DTT til en endelig konsentrasjon på 20 mM for å redusere disulfidbindinger.
  3. Inkuber prøvene ved 37 °C i 30 minutter med risting, og la deretter prøvene avkjøles ved romtemperatur (RT, ~10 min).
  4. Tilsett iodoacetamid i en endelig konsentrasjon på 40 mM for å irreversibelt alkylere sulhydrylgruppene som ble redusert i forrige trinn. Inkuber prøvene på RT i mørket i 30 min.
  5. Fortynn hver prøve til under 1 M Urea med en buffer som består av 50 mM ammoniumbikarbonat. Kontroller om pH er ca. 8 ved å pipettere en liten mengde prøve på pH-strimler.
  6. Tilsett 1 μg trypsin i hver prøve for 50 μg startprotein, eller ved 1:50 trypsin:proteinforhold, etter masse, hvis du fordøyer en annen proteinmengde. For eksempel vil 3 μg trypsin bli tilsatt for fordøyelsen av 150 μg protein.
  7. Inkuber prøvene over natten ved 37 °C med risting for å fordøye proteiner i peptider.
  8. Tilsett maursyre til 1%, etter volum, av hver prøve for å slukke protein fordøyelsen.
    MERK: Eksperimentet kan settes på pause her. Frys prøvene ved -80 °C og fortsett til neste trinn på et senere tidspunkt om nødvendig.

5. Prøveopprydding med fastfaseutvinning (SPE)

MERK: Denne solidfaset ekstraksjonsprotokollen krever solidfaset ekstraksjonspatroner og et vakuummanifoldoppsett. Andre tilsvarende spe-protokoller (solid-phase extraction) kan utføres etter forskerens skjønn før massespektrometrianalyse.

  1. Forbered deg på SPE ved å plassere solidfase ekstraksjonspatroner på en vakuummanifold ved hjelp av én ekstraksjonspatron for hver prøve.
    MERK: Se produsentens retningslinjer for hvor mye sorbent som skal brukes i SPE-protokollen. For 50 μg peptidprøver anbefales det å bruke 10 mg sorbentpatroner.
  2. Kondisjoner hver SPE-patron ved å tilsette 800 μL SPE Elution Buffer (tabell 1) og bruk vakuumsuging til å trekke løsningsmidlet gjennom patronen.
  3. Gjenta trinn 5.2.
  4. Likevekt hver patron ved å tilsette 800 μL SPE-vaskebuffer (tabell 1) og bruke vakuumsuging til å trekke bufferen gjennom patronene.
  5. Gjenta trinn 5.4 to ganger til i totalt tre ganger.
  6. Legg peptidprøvene i SPE-patroner og bruk vakuumsuging til å trekke prøver gjennom patronene.
    MERK: På dette tidspunktet er peptider bundet til sorbenten inne i patronene.
  7. Vask hver patron med SPE-vaskebuffer og bruk vakuumsuging til å trekke bufferen gjennom patronene.
  8. Gjenta trinn 5.7 to ganger til for totalt tre vasker.
  9. Før elution trinnet, ordne oppsamling rør i vakuummanifolden under hver patron, nøye sikre justering mellom oppsamling rør og patroner.
  10. For å unngå peptider, tilsett 800 μL SPE Elution Buffer til hver patron og elute peptider i oppsamlingsrør med vakuumsuging.
  11. Gjenta trinn 5.10 med 400 μL SPE Elution Buffer.
  12. Fjern peptidprøvene fra vakuummanifolden og tørk helt i en vakuumkonsentrator (tørking tar ca. 3 timer).
    MERK: Eksperimentet kan settes på pause her. Frys prøvene ved -80 °C og fortsett på et senere tidspunkt om nødvendig.

6. Dataavhengig oppkjøp (DDA) massespektrometrianalyse

  1. Resuspend peptidprøvene i en konsentrasjon på 400 ng/μL i en buffer som består av 0,2% maursyre i vann.
  2. For å hjelpe til med re-solubilisering av peptider, virvel prøvene i 5 min. Deretter sonikerer du prøvene i 5 min i en vannbadsonator.
  3. Pellet noen uoppløselige materialer ved sentrifugering prøver på 15,000 x g i 15 min ved 4 °C. Overfør peptid supernatanter til MS hetteglass.
  4. Legg til indekserte oppbevaringstidsstandarder (iRT) peptid i hver prøve i en konsentrasjon på 1:30 iRT:sample, etter volum.
  5. Send inn prøvene for proteomisk analyse ved hjelp av analyse av flytende kromatografi tandemmassespektrometri (LC-MS/MS).
    1. Bruk LC-MS/MS-innstillinger som anbefales for umålt analyse av massespektrometrianlegget. Eksempelinnstillinger for analyse vises i figur 3, konfigurert for analyse på et Orbitrap-massespektrometer koblet til et nanovæskekromatografisystem i nanostrømningsmodus. Et eksempel på en protokoll følger.
    2. Legg 1 μg (5 μL) av hver prøve på en fellesøyle (1 cm lang x 100 μm diameter) og vask dem med lastløsningsmiddel (tabell 1) med en strømningshastighet på 10 μL/min i 5 minutter.
    3. Last prøvene på en analytisk kolonne (50 cm lang x 100 μm diameter) med en strømningshastighet på 400 nL/min.
    4. Elute peptidene over en 90 min lineær gradient med et organisk løsningsmiddel (0,2% maursyre og 99,8% acetonitril) og uorganisk løsningsmiddel (0,2% maursyre i 99,8% vann), alt fra 5% til 35% organisk løsningsmiddel.
    5. Innhente massespektrometridata i dataavhengig modus med en kontinuerlig syklus med MS1-undersøkelsesskanninger (60 000 oppløsning, 3e6 AGC-mål, 100 ms maksimal akkumuleringstid og 400-1600 m/z-masseområde) etterfulgt av 20 dataavhengige MS2-skanninger (15 000 oppløsning, 1e5 AGC-mål, 25 ms maksimal injeksjonstid og 1,6 m/z breddeisolasjonsvinduer) med HCD-fragmentering (normalisert kollisjonsenergi på 27 %).
  6. Etter MS-anskaffelse av alle prøver, importer rå massespektrometrifiler til et programvareverktøy for massespektrometriproteomikk for identifisering og kvantifisering av peptidtoppområder.
    MERK: For identifisering av peptider og proteiner i dette eksperimentet ble mascot databasesøkeverktøyet brukt med den gjennomgåtte UniProt humane proteomsekvensdatabasen (Proteome ID: UP000005640). Følgende søkeparametere ble angitt i Mascot:
    • Kvantifisering: SILAC K+8 R+10 [MD] Enzym: Trypsin/p Fast modifikasjon: karbamidometyl (F)
    • Variable modifikasjoner: acetyl (Protein N-term), Gln->pyro-Glu (N-term Q), oksidasjon (M), Label:13C(6)15N(2) (K), Label:13C(6)15N(4) (R)
    • Peptid masse toleranse: 22:00
    • Fragment masse toleranse: 0.08 Da
    • Maksimalt antall tapte spaltinger: 2
    • Alle de uspesifiserte parameterne var standard
  7. Kvantifisere peptidtoppområdene for tunge og lette peptider i programvareverktøy for proteome-kvantifisering. For kvantifisering av toppområder i dette eksperimentet ble den gratis og åpen kildekode Skyline programvareplattformen brukt39,40. Eksporter tunge og lette peptidtoppområder for estimering av proteinhalvåret.

7. Beregning av protein halvering av liv

  1. Åpne SILAC-analysearbeidsboken (tabell 3) til det første arket med navnet 1) Rådata og lim inn UniProt-IDer, gennavn, områder med stor topp og lyse topper i de angitte kolonnene (SH = Senescent-Heavy, SL = Senescent-Light, CH = Control (quiescent)-Heavy, CL = Control (quiescent)-Light).
  2. Åpne ark 2-4 og sørg for at UniProt ID- og Gene-kolonnene samsvarer med antall proteiner identifisert fra analysen (disse eksperimentene identifiserte 841 proteiner). Resten av kolonnene fylles automatisk med data etter at de er dratt for å dekke de identifiserte proteinene.
  3. Åpne det fjerde arket med navnet 4) Analyse , og fjern rader der kolonne G og H angir at eksemplet er utenfor området. behold rader som leses innenfor området. Vulkanplottet i det femte arket vil automatisk fylles.

Representative Results

Denne protokollen beskriver en metode for globalt å sammenligne proteinhalvvanser mellom senescent og ikke-splittende, passiv kontrollceller ved hjelp av pSILAC og minimale tidspunkter. Denne protokollen beskriver generering av senescent og quiescent celler i kultur, metabolsk merking av celler med stabile isotoper av arginin og lysin over 3 dager, kvantifiserer de relative overflod av tunge og lette peptidisotoper ved massespektrometri, og en enkel og tilgjengelig beregning av protein halveringstider ved hjelp av regnearkformler (figur 1). Denne metoden er svært fleksibel og kan tilpasses mange celletyper og forhold.

Som en del av genereringen av senescentceller for denne protokollen, brukes to metoder for senescence-validering: SA-βGal-positive celler visualisert ved mikroskopi og økte nivåer av senescentmarkører kvantifisert ved hjelp av RT-qPCR-analyse. Måling av senescent markører bør gi klare forskjeller mellom passiviserende og senescent celler for sammenligninger av de to cellene populasjoner som skal anses som gyldige. For SA-βGal-aktivitet skal senescentceller vises blå mens passivitetskontrollceller ikke har noen eller svært liten farge (figur 2A). Denne analysen kan kvantifiseres ved å telle de positive, blåfargede cellene som en prosentandel av det totale antallet celler, og deretter sammenligne den prosentvise positivitetshastigheten mellom passivitetskontroll og senescentceller. Det er viktig at denne protokollen utføres samtidig for sammenligning av begge celletilstander; SA-βGal aktivitet er avhengig av pH i fargeløsningen, slik at resultatene kan variere betydelig mellom analyser og bør betraktes som et kvalitativt tiltak.

RT-qPCR-analysen av senescent markører vil vise høye nivåer av mRNAs koding SASP-faktorer (IL6, CXCL8, IL1B) og cellesyklushemmere (CDKN2A / p16, CDKN1A / p21) i de fleste senescent modeller. Selv om det forventes en viss variasjon basert på celletype, kulturtilstand og senescent induser41,42, viser de fleste senescent celler større enn fem ganger høyere nivåer av IL6, CXCL8 og CDKN1A / p21 mRNAer sammenlignet med passiv kontrollceller; Nivåene av LMNB1- og PCNA mRNAer, koding av spredningsmarkører, bør derimot være lave eller fraværende i senescentceller sammenlignet med passiviserende celler (figur 2B). Samlet sett er en betydelig prosentandel av SA-βGal positivitet og det forventede uttrykket for et panel av senescence-assosierte mRNA-markører tilstrekkelig til å bekrefte induksjon av senescence i et eksperiment.

Behandling av proteinprøver for massespektrometrianalyse består av in-solution fordøyelse (2 dager) og solidfaseutvinning (4-6 t). For å utføre umålt proteomisk analyse sendes de resulterende peptidene inn for LC-MS/MS-analyse ved hjelp av dataavhengig anskaffelse (DDA). På Orbitrap-instrumenter kan en DDA-metode spesifiseres i redigeringsprogrammet for massespektrometriinstrumenter. Massespektrometerinnstillingene som brukes i denne studien, er vist i figur 3A. Innstillinger for væskekromatografi kan også spesifiseres i metoderedigeringsprogrammet. For denne studien ble det brukt en 90 min lineær gradient med økende organisk fase (acetonitril) (figur 3B). Etter et vellykket oppkjøp skal den totale ionstrømmen (TIC) inneholde et intenst signal under den lineære gradientdelen av metoden (figur 3C). Denne protokollen beskriver en eksempelprotokoll på et Orbitrap-instrument, men beregningen av proteinhalvtider kan utføres på data hentet fra ethvert massespektrometer som ble samlet inn i DDA-modus, som er tilgjengelig på flere typer instrumenter (f.eks. Orbitraps og tid-of-flight instrumenter) og leverandører. Anskaffelsesinnstillingene vil være unike for typen og konfigurasjonen av instrumentet som brukes, og det anbefales å bruke innstillingene som foreslås av massespektrometrianlegget. Denne metoden er også kompatibel med ikke-DDA-metoder (SRM, PRM, DIA), så lenge kvantitative kromatografiske toppområder for tunge og lette topper kan trekkes ut fra rådatafilene og legges inn i regnearkformlene.

Rå masse spektrometri filer er søkt med en av de mange tilgjengelige proteomiske database søk verktøy for å identifisere peptider og proteiner. For eksempel brukte denne studien Mascot43 søkemotor. For å oppnå kromatografiske toppområder for kvantifisering av tunge og lette peptider importeres databasesøkeresultater til en proteomisk programvare som er i stand til kromatografiske toppområder som Skyline39,40. Undersøkelse av de ekstraherte ionkromatogrammer av peptider (figur 4) vil avsløre den relative andelen tunge og lette peptidsignaler. En lavere andel av tunge peptidsignaler i forhold til lett peptidsignal i senescentceller indikerer en langsommere proteinomsetningshastighet (figur 4A), og et høyere tungt peptidsignal i forhold til lys indikerer en raskere proteinomsetningshastighet (figur 4B). De umerkede prøvene skal vise lite eller ingen tungt peptidsignal. Ethvert tilsynelatende tungt peptidsignal i de umerkede prøvene betraktes som bakgrunnsstøy og vil bli trukket fra under de endelige beregningene. Kvantifisering av kromatografiske toppområder for lette og tunge peptider for alle behandlings- og merkeforhold må eksporteres for etterfølgende beregning av proteinomsetningshastigheter og statistisk analyse.

Ved å bruke enkelttidspunktanalyse er kvantifiseringen av protein halveringstider enkel å utføre og kan gjøres praktisk i regneark. I tabell 3 ble halveringstider for 695 proteiner identifisert fra massespektrometrianalysen beregnet. Fra protein-nivå tunge og lette isotop overflod for hvert protein i prøvene (inngang for 1) Raw Data sheet), en prosent tung isotop (kalt Ratio, R) beregnes deretter automatisk på arket med tittelen 2) Ratio H | H + L. På dette trinnet normaliseres R fra tunge merkede prøver ved å trekke R fra umerkede prøver for å produsere en endelig R for passivitet og senescent triplikater. Siden umerkede prøver ikke bør ha noen eksogent lagt til tung isotop, brukes de til å eliminere bakgrunnssignalet. Fra R beregnes kdeg (omsetningshastighet) ved hjelp av følgende formel:

Equation 1

Halveringstiden (H, i dager) bestemmes for hvert protein i passiviserende kontroll og senescent triplikater (ark med tittelen 3) Half-Life (dager)) ved hjelp av følgende formel:

Equation 2

Disse halveringstidene blir deretter gjennomsnittet blant passiviserende og senescent triplikater for å generere en passiv og senescent gjennomsnittlig halveringstid for hvert protein samt en p-verdi. Beregnede halveringstider filtreres deretter etter verdier som er negative, noe som oppstår når det tunge signalet fra lyse celler (bakgrunnen) er større enn det tunge signalet fra tunge celler. Denne filtreringen resulterte i 707 proteiner fra 841 identifisert med gyldige halveringstider for resultatene som presenteres her.

Halveringstiden rapporteres deretter som et logg2-forhold mellom senescent over passiv kontrollceller (log2FC) og plottet inn i en vulkanplott (figur 5). Hvis du for eksempel ser på analysearket 5), koagulasjonen II trombinreseptor (F2R) protein kan sees å ha en halveringstid i passiviserende celler på 0,51 dager (kolonne B) og en halveringstid i senescent celler på 1,07 dager (kolonne C) som ga en logg2FC på ~ 1,06 (kolonne D) med en p-verdi på 0,001.

Figure 1
Figur 1: Diagram over pSILAC-arbeidsflyt for senescent- og passivitetskontrollceller. Humane IMR-90 fibroblaster ble brukt til å forberede passiviser (lavt serum) eller senescent (IR) cellekulturer for sammenligning av protein halvering av liv. Celler ble deretter merket med SILAC Light eller SILAC Heavy media med isotopisk arginin og lysin i 3 dager. Lysater ble ekstrahert fra celler, fordøyd, avsaltet og analysert ved hjelp av massespektrometri. Tunge og lette peptidisotoper tilsvarer henholdsvis nylig syntetiserte og eksisterende peptider. Halveringstiden ble beregnet ved hjelp av en ligning for eksponentiell forfall. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Validering av senescent fenotyper ved hjelp av SA-βGal- og RT-qPCR-analyser. (A) Senescent- og passive celler re-belagt på tidspunktet for høsting i en 6-brønns plate og farget for SA-βGal ved hjelp av SA-βGal fargesett. Blå farge i cellekroppen er positiv for senescence. Bilder er tatt i brightfield med farge ved 10x forstørrelse, størrelsesmarkør i rødt. (B) RT-qPCR-analyse som sammenligner senescentceller (røde) og sykkelceller (grå) fra et ikke-relatert eksperiment. Økninger i nivåene av CDKN1A/p21, CXCL8 og IL6 mRNAer indikerer senescence, og det samme gjelder nedgangen i LMNB1 mRNA-nivåer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative metoder for dataavhengig anskaffelse (DDA) skanninger og væskekromatografi gradient av pSILAC kulturer på Q-Exactive HF orbitrap massespektrometer. (A) Anbefalte instrumentinnstillinger i instrumentprogramvaren for dataavhengig analyse av helcellelys fra et pSILAC-eksperiment. (B) Eksempel på innstillinger for strømningsmetode for flytende kromatografi. Peptider er eluted over en 90-min lineær gradient som spenner fra 5% til 35% buffer B (0,2% maursyre og 99,8% acetonitril), etterfulgt av en 10 min vask med 80% buffer B, og 25 min likevekt med 5% buffer B. (C) Et representativt totalt ionkromatogram (TIC) av et massespektrometrioppkjøp av IMR-90 fibroblastpeptider ervervet med de angitte innstillingene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representativt ekstrahert ionkromatogrammer av peptider med endret omsetning under senescence. (A) Kromatografiske toppområder i peptidet FQMTQEVVCDECPNVK++ fra proteinet DnaJ homolog subfamilie B medlem 11 (DNAJB11) i senescent og ikke-senescent celler. Etter 3 dager med SILAC inkorporerer senescentceller mindre tung isotop i dette peptidet sammenlignet med quiescent (ikke-senescent) celler, som indikert ved en reduksjon i toppområdet av tung isotopholdig peptid (blå) i forhold til lyspeptidet (rødt), noe som indikerer at dette peptidet har redusert omsetningen i senescentceller. (B) Kromatografiske toppområder i peptidet VQAQVIQETIVPK++ fra proteinet Skjøtefaktor 3a Subenhet 1 (SF3A1) i senescent og ikke-senescent celler. Etter 3 dager med SILAC inkorporerer senescentceller en høyere andel av tung isotop i dette peptidet sammenlignet med passivitetsceller (ikke-senescent), som indikert av en reduksjon i toppområdet av tung isotopholdig peptid (blå) i forhold til lyspeptidet (rødt), noe som indikerer at dette peptidet har økt omsetningen i senescentceller. De umerkede (dag 0) forholdene viser ingen inkorporering av tung isotop for begge peptider, som forventet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Sammenligning av halvering av protein i senescent og passivitetsceller bestemt av pSILAC-merking. (A) Vulkan plott som viser logg2 forholdet mellom senescent / kontroll (passivist) for hver av de 695 identifiserte proteinene; I dette eksperimentet inneholdt lys og tung merkingsmedie ingen glukose og ingen fenolrød. (B) Tabeller som viser de 10 beste proteinene med mest økt eller redusert halvering av liv i passivefleksceller kontra senescentceller (henholdsvis venstre og høyre). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Medier og buffere som brukes i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: RT-qPCR-primere som brukes i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: SILAC-analysearbeidsbok for beregning av halvering av protein, foldendringer og t-tester. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

pSILAC er en kraftig teknikk som muliggjør global kvantifisering av proteinomsetningshastigheter på tvers av flere cellulære forhold. Dette dokumentet beskriver bruken av pSILAC for å sammenligne globalt protein halveringstid mellom senescent og quiescent celler, inkludert instruksjoner for fremstilling av senescent og quiescent celler, SILAC merking og høsting, og til slutt analyse ved hjelp av DDA masse spektrometri. I tillegg er en to-trinns test beskrevet for validering av senescence fenotype ved hjelp av SA-βGal og RT-qPCR analyse av et panel av mRNAs koding senescence-assosierte proteiner. I tillegg til validering av senescence med de to tilnærmingene som er beskrevet, kan en tredje validering av senescence utføres etter massespektrometrianalyse ved å lete etter endringer i kjente senescence markører mellom senescent og quiescent celler på proteomisk nivå. Senescence-assosierte proteiner som forventes å bli forhøyet inkluderer p16, p21 og BCL2, blant andre, beskrevet andre steder44,45. I protokollen beskrevet ovenfor ble ioniserende stråling brukt til induksjon av senescence og serum sult for passiviserende celler. For induksjon av senescence er det flere alternativer tilgjengelig, og det er betydelig heterogenitet blant dem 41,42,46. For tiden er det ingen senescent metode som regnes som den "mest fysiologiske", så valget av senescent inducer er i stor grad basert på konteksten av eksperimentet. Eksperimenter med mål om å si et generelt fenomen om senescence anbefales imidlertid å bruke minst to forskjellige senescent indusere. Å diskutere omfanget av senescence paradigmer er utenfor omfanget av dette papiret, men noen vanlige metoder for å indusere senescence inkluderer å utløse DNA-skade (IR, doxorubicin, replikerende utmattelse), uttrykke onkogene proteiner (HRAS, BRAF), og forstyrre mitokondrier funksjon2.

I tillegg til valg av senescent induser, er valg av kontrollceller en like viktig vurdering. Senescent celler er per definisjon under ubestemt vekst arrest, så en sammenligning med andre vekst-arresterte celler blir ofte valgt. For pSILAC er celler som er arrestert i cellesyklusen generelt å foretrekke fordi de ikke replikerer og dermed er lettere å bruke til beregninger av proteinhalvtid47. Men siden kultiverte celler ofte vil beholde noen skilleceller, er det viktig at metodene som brukes til å indusere cellesyklusstans, gir så homogen respons som mulig for å minimere feil fra celler som fortsatt sprer seg. For å beregne proteinforringelsesrater for sykkelceller ved hjelp av pSILAC krever ytterligere beregninger for å kompensere for hvor raskt protein fortynnes i datterceller27. Imidlertid er passiv vekstarrest i seg selv ikke uten komplikasjoner. Det er to generelle metoder for cellesyklusstans: serummangel og kontakthemming48. Ikke alle celler kan gjøres passiviserende gjennom kontakthemming, selv om noen fibroblaster har vist seg å demonstrere passivens etter flere dager med dyrking49. Denne metoden brukte serummangel fordi den er mer vanlig å bruke til sammenligninger av senescentceller, selv om det krever at senescentcellen er tilsvarende serumberøvet for nøyaktige sammenligninger. Serum aktiverer mTOR-komplekset, og dermed har serummangel flere nedstrømseffekter på cellen i tillegg til cellesyklusstans50. Spesielt har senescent celler vist seg å vise en redusert SASP ved serummangel eller mTOR-hemming51,52.

Et annet viktig poeng å vurdere i pSILAC er hvor mange tidspunkter å teste. Denne protokollen samlet celler på et enkelt tidspunkt (3 dager med lett eller tung merking), noe som betydelig forenkler den resulterende analysen. Valget av tidspunkt bør være basert på eksperimentets mål. For global analyse forventes det at 3 dager vil fange opp et flertall proteiner, selv om halveringstid for kortlivede proteiner som fullstendig omsetning innen 3 dager (alt lyssignal går tapt) ikke kan måles på dette tidspunktet. Omvendt er langlivede proteiner med svært liten omsetning på 3 dager også vanskelig å kvantifisere og vises ofte som å ha ekstremt store halveringstider (i rekkefølgen av uker) som vanligvis bare er en konsekvens av svært lite tung signalakkumulering. På grunn av det ikke-lineære forholdet mellom tunge og lette peptidsignaler kontra prosentandelen av nylig syntetisert protein på kortere og lengre tidspunkter, kan kvantiseringen av halveringstider forbedres ved å legge til flere merketidspunkter. For relative sammenligninger mellom to celletilstander, som i denne protokollen, kan en omtrentlig halveringstid være tilstrekkelig, men flere tidspunkter kan brukes til å forbedre kvantitativ nøyaktighet.

Denne protokollen beskriver hvordan du utfører en umålt DDA-basert analyse av proteinomsetning. Imidlertid kan proteinomsetningsberegningene brukes generelt på enhver oppkjøpsordning som er i stand til å utlede den relative overfloden av tunge og lette peptidpar. MS2-baserte metoder som datauavhengig anskaffelse (DIA/SWATH) kan for eksempel også brukes til beregning av omsetningsrater med hell53. I tillegg kan andre instrumenterings- og programvarerørledninger enn de som er beskrevet i denne protokollen, brukes til å utføre DDA-analyse, proteinidentifikasjon og protein kvantifisering. Når du bruker programvareplattformer for protein kvantifisering som Skyline for å trekke ut peptidtoppområder, anbefales det å manuelt inspisere ekstraherte ionkromatogrammer i dokumentarbeidsområdet, identifisere topper som feilaktig ble integrert og ikke-kvantitative topper, og kuratere dokumentet deretter. En omfattende samling av opplæringsprogrammer er tilgjengelig online for Skyline (skyline.ms).

pSILAC representerer en av de mest ideelle metodene for global kvantifisering av proteinhalvliv i dyrkede celler på grunn av overlegen multipleksing (proteomdekning) og gjennomstrømning. Mens pSILAC ikke gir direkte syntese eller nedbrytning, siden endringen i lett og tungt signal skyldes en sammenløp av faktorer, er pSILAC svært nyttig for sammenligninger mellom forhold og forskjellige celletyper. Lavgjennomstrømningsmetoder faller ofte inn i to typer: 1) behandling av celler med cykloheksimid for å blokkere proteinsyntese og høste med tidsintervaller etter tilsetning for å overvåke forfall, eller 2) behandling av celler med en hemmer av proteinforfall og høsting med tidsintervaller etter tilsetning for å overvåke opphopning av protein, og dermed utlede proteinforfallshastigheter. Begrensningen av begge metodene er at slike behandlinger uunngåelig vil føre til betydelige endringer i cellulær fysiologi. I kontrast krever pSILAC ingen betydelig inngrep og har teoretisk sett ingen påvisbare effekter på cellulær fysiologi siden isotopiske aminosyrer bare varierer med en enkelt nøytron fra deres ikke-isotopiske kolleger. Dermed representerer metoden beskrevet her for pSILAC en enkel protokoll for global måling av de mest fysiologiske proteinhalvdelene i ikke-splittende celler.

Endringer i proteinomsetning har et nært forhold til aldring, aldersrelaterte sykdommer, nevrodegenerasjon og levetid54,55. Denne protokollen beskriver en metode for å forhøre disse forholdene ved å bruke stabil isotopmerking av aminosyrer i cellekulturen for å måle proteinomsetningshastigheter i senescence-celler. Imidlertid finnes det mange analoge metoder for å utføre studier i sammenheng med aldring og nevrodegenerasjon in vivo i hele organismer som mus. Faktisk har disse studiene understreket viktigheten av å måle proteinomsetningsrater i sammenheng med aldersrelaterte sykdommer 56,57,58,59.

I denne studien skilte ribosomale proteiner og proteiner som ligger i det endoplasmiske retikulumet seg ut som to kategorier proteiner med henholdsvis redusert og økt halvering av liv i senescentceller. Mens videre analyse av steady-state nivåer er nødvendig for definitive konklusjoner, disse resultatene ytterligere tyder på at senescent celler kan unikt regulere oversettelse gjennom redusert halvering av ribosomale proteiner. Fremover vil bruk av stabile isotopmerkingsmetoder for å studere forholdet mellom cellulær senescence og neurodegeneration in vivo i musemodeller være en lovende forlengelse av isotopmerkingsmetoden beskrevet av denne protokollen.

Disclosures

Forfatterne har ingen avsløringer.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) og Intramural Research Program (IRP), National Institute on Aging (NIA). N.B. ble støttet av Longevity Impetus Grants, og Office of Dietary Supplements (ODS) Scholars Program. Figur 1 ble opprettet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (LC-MS grade) Grainger AH015
Ammonium Bicarbonate Millipore-Sigma 9830
Antibiotic-Antimycotic (100x) ThermoFisher 15240062
BCA Assay Kit ThermoFisher 23227
Dithiothreotol (DTT) Sigma D9779
DMEM, high glucose, HEPES ThermoFisher 12430112
dNTP Mix ThermoFisher R0191
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated ThermoFisher 10082147
Formic Acid Sigma 27001
Gammacel 40 Exactor Best Theratronics Cesium Irradiator for cells
GlycoBlue ThermoFisher AM2238
Iodoacetamide (IAA) Sigma I1149 Light sensitive
IMR-90 primary lung fibroblasts ATCC CCL-186
iRT Kit (indexed retention time) Biognosys Ki-3002-2 Indexed Retention Time Peptide Standards
Isopropanol ThermoFisher 423835000
Mascot Matrix Science Mascot Daemon 2.8 Proteomic database searching software
Maxima Reverse Transcritase (200 U/µL) ThermoFisher EP0742
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) ThermoFisher 11140050
Nano LC System ThermoFisher ULTIM3000RSLCNANO
Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges Waters 186000383
Orbitrap Mass Spectrometer ThermoFisher Q Exactive HF Orbitrap
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0 ThermoFisher 327110025
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher 10010023
Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM ThermoFisher A33972
QuantStudio 6 Real-Time PCR System ThermoFisher
Random Hexamer Primer ThermoFisher SO142
Senescence β-Galactosidase Staining Kit Cell Signaling 9860
Skyline University of Washington Skyline-Daily v21.2.1.424 Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms
Sonicator waterbath Branson CPX-952-516R
TRIzol Reagent ThermoFisher 15596018 Referred to as phenol in text; hazardous
TRYPle Express ThermoFisher 12605010
Trypsin (sequencing grade) Promega V5113
TURBO Dnase (2U/ uL) ThermoFisher AM2238
Urea ThermoFisher 29700
Water (LC-MS grade) Grainger AH365

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hayflick, L. The cell biology of aging. Journal of Investigative Dermatology. 73 (1), 8-14 (1979).
  2. Gorgoulis, V., et al. Cellular senescence: Defining a path forward. Cell. 179 (4), 813-827 (2019).
  3. Borghesan, M., Hoogaars, W. M. H., Varela-Eirin, M., Talma, N., Demaria, M. A senescence-centric view of aging: Implications for longevity and disease. Trends in Cell Biology. 30 (10), 777-791 (2020).
  4. Martinez-Cue, C., Rueda, N. Cellular senescence in neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 16 (2020).
  5. Wissler Gerdes, E. O., et al. Cellular senescence in aging and age-related diseases: Implications for neurodegenerative diseases. International Review of Neurobiology. 155, 203-234 (2020).
  6. Baker, D. J., Petersen, R. C. Cellular senescence in brain aging and neurodegenerative diseases: evidence and perspectives. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1208-1216 (2018).
  7. Musi, N., et al. Tau protein aggregation is associated with cellular senescence in the brain. Aging Cell. 17 (6), 12840 (2018).
  8. Ogrodnik, M., et al. Obesity-induced cellular senescence drives anxiety and impairs neurogenesis. Cell Metabolism. 29 (5), 1061-1077 (2019).
  9. Chow, H. M., et al. Age-related hyperinsulinemia leads to insulin resistance in neurons and cell-cycle-induced senescence. Nature Neuroscience. 22 (11), 1806-1819 (2019).
  10. Dehkordi, S. K., et al. Profiling senescent cells in human brains reveals neurons with CDKN2D/p19 and tau neuropathology. Nature Aging. 1, 1107-1116 (2021).
  11. Chinta, S. J., et al. Cellular senescence is induced by the environmental neurotoxin paraquat and contributes to neuropathology linked to Parkinson's disease. Cell Reports. 22 (4), 930-940 (2018).
  12. Bussian, T. J., et al. Clearance of senescent glial cells prevents tau-dependent pathology and cognitive decline. Nature. 562 (7728), 578-582 (2018).
  13. Zhang, P., et al. Senolytic therapy alleviates Abeta-associated oligodendrocyte progenitor cell senescence and cognitive deficits in an Alzheimer's disease model. Nature Neuroscience. 22 (5), 719-728 (2019).
  14. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
  15. Wei, Z., et al. Amyloid beta protein aggravates neuronal senescence and cognitive deficits in 5xfad mouse model of Alzheimer's disease. Chinese Medical Journal (England). 129 (15), 1835-1844 (2016).
  16. He, N., et al. Amyloid-beta(1-42) oligomer accelerates senescence in adult hippocampal neural stem/progenitor cells via formylpeptide receptor 2. Cell Death & Disease. 4 (11), 924 (2013).
  17. van Dijk, K. D., et al. Changes in endolysosomal enzyme activities in cerebrospinal fluid of patients with Parkinson's disease. Movement Disorders: Offical Journal of Movement Disorder Society. 28 (6), 747-754 (2013).
  18. Chinta, S. J., et al. Environmental stress, ageing and glial cell senescence: a novel mechanistic link to Parkinson's disease. Journal of Internal Medicine. 273 (5), 429-436 (2013).
  19. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  20. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Patholology. 5, 99-118 (2010).
  21. Acosta, J. C., et al. A complex secretory program orchestrated by the inflammasome controls paracrine senescence. Nature Cell Biology. 15 (8), 978-990 (2013).
  22. Payea, M. J., Anerillas, C., Tharakan, R., Gorospe, M. Translational control during cellular senescence. Molecular and Cellular Biology. 41 (2), 00512 (2021).
  23. Nishimura, K., et al. Perturbation of ribosome biogenesis drives cells into senescence through 5S RNP-mediated p53 activation. Cell Reports. 10 (8), 1310-1323 (2015).
  24. Lessard, F., et al. Senescence-associated ribosome biogenesis defects contributes to cell cycle arrest through the Rb pathway. Nature Cell Biology. 20 (7), 789-799 (2018).
  25. Xu, M., et al. Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nature Medicine. 24 (8), 1246-1256 (2018).
  26. Wiley, C. D., et al. SILAC Analysis reveals increased secretion of hemostasis-related factors by senescent cells. Cell Reports. 28 (13), 3329-3337 (2019).
  27. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  28. Doherty, M. K., Hammond, D. E., Clague, M. J., Gaskell, S. J., Beynon, R. J. Turnover of the human proteome: determination of protein intracellular stability by dynamic SILAC. Journal of Proteome Research. 8 (1), 104-112 (2009).
  29. Riba, A., et al. Protein synthesis rates and ribosome occupancies reveal determinants of translation elongation rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (30), 15023-15032 (2019).
  30. Mathieson, T., et al. Systematic analysis of protein turnover in primary cells. Nature Communications. 9 (1), 689 (2018).
  31. Liu, T. Y., et al. Time-resolved proteomics extends ribosome profiling-based measurements of protein synthesis dynamics. Cell Systems. 4 (6), 636-644 (2017).
  32. Welle, K. A., et al. Time-resolved analysis of proteome dynamics by tandem mass tags and stable isotope labeling in cell culture (TMT-SILAC) hyperplexing. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (12), 3551-3563 (2016).
  33. Neri, F., Basisty, N., Desprez, P. Y., Campisi, J., Schilling, B. Quantitative proteomic analysis of the senescence-associated secretory phenotype by data-independent acquisition. Current Protocols. 1 (2), 32 (2021).
  34. Hernandez-Segura, A., Brandenburg, S., Demaria, M. Induction and validation of cellular senescence in primary human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57782 (2018).
  35. Noren Hooten, N., Evans, M. K. Techniques to Induce and quantify cellular senescence. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55533 (2017).
  36. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-βgal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  37. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  38. Hernandez-Segura, A., Rubingh, R., Demaria, M. Identification of stable senescence-associated reference genes. Aging Cell. 18 (2), 12911 (2019).
  39. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  40. Pino, L. K., et al. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).
  41. Casella, G., et al. Transcriptome signature of cellular senescence. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7294-7305 (2019).
  42. Basisty, N., et al. A proteomic atlas of senescence-associated secretomes for aging biomarker development. PLoS Biology. 18 (1), 3000599 (2020).
  43. Perkins, D. N., Pappin, D. J., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
  44. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).
  45. Kohli, J., et al. Algorithmic assessment of cellular senescence in experimental and clinical specimens. Nature Protocols. 16 (5), 2471-2498 (2021).
  46. Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking transcriptional heterogeneity in senescent cells. Current Biology: CB. 27 (17), 2652-2660 (2017).
  47. Swovick, K., et al. Interspecies differences in proteome turnover kinetics are correlated with life spans and energetic demands. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100041 (2021).
  48. Marescal, O., Cheeseman, I. M. Cellular mechanisms and regulation of quiescence. Developmental Cell. 55 (3), 259-271 (2020).
  49. Lacorazza, H. D. Cellular Quiescence. , Springer, Humana Press. New York. (2018).
  50. Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
  51. Herranz, N., et al. mTOR regulates MAPKAPK2 translation to control the senescence-associated secretory phenotype. Nature Cell Biology. 17 (9), 1205-1217 (2015).
  52. Laberge, R. M., et al. MTOR regulates the pro-tumorigenic senescence-associated secretory phenotype by promoting IL1A translation. Nature Cell Biology. 17 (8), 1049-1061 (2015).
  53. Pino, L. K., Baeza, J., Lauman, R., Schilling, B., Garcia, B. A. Improved SILAC quantification with data-independent acquisition to investigate Bortezomib-induced protein degradation. Journal of Proteome Research. 20 (4), 1918-1927 (2021).
  54. Basisty, N., Meyer, J. G., Schilling, B. Protein turnover in aging and longevity. Proteomics. 18 (5-6), 1700108 (2018).
  55. Basisty, N., Holtz, A., Schilling, B. Accumulation of "Old Proteins" and the critical need for MS-based protein turnover measurements in aging and longevity. Proteomics. 20 (5-6), 1800403 (2020).
  56. Basisty, N., et al. Mitochondrial-targeted catalase is good for the old mouse proteome, but not for the young: 'reverse' antagonistic pleiotropy. Aging Cell. 15 (4), 634-645 (2016).
  57. Dai, D. F., et al. Altered proteome turnover and remodeling by short-term caloric restriction or rapamycin rejuvenate the aging heart. Aging Cell. 13 (3), 529-539 (2014).
  58. Karunadharma, P. P., et al. Subacute calorie restriction and rapamycin discordantly alter mouse liver proteome homeostasis and reverse aging effects. Aging Cell. 14 (4), 547-557 (2015).
  59. Basisty, N. B., et al. Stable isotope labeling reveals novel insights into ubiquitin-mediated protein aggregation with age, calorie restriction, and rapamycin treatment. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 73 (5), 561-570 (2018).

Tags

Biokjemi Utgave 182 cellulær senescence massespektrometri SILAC proteinomsetning proteostase aldring nevrodegenerasjon cellekultur nedbrytning syntese stabil isotopmerking metabolsk merking
Måling av proteinomsetningshastigheter i senescent og ikke-dele kultivert celler med metabolsk merking og massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Payea, M., Gorospe, M., Basisty, N.… More

Payea, M., Gorospe, M., Basisty, N. Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (182), e63835, doi:10.3791/63835 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter