Summary
Der Caco-2-Zell-Bioassay für die Bioverfügbarkeit von Eisen (Fe) stellt einen kostengünstigen und vielseitigen Ansatz zur Beurteilung der Fe-Bioverfügbarkeit von Lebensmitteln, Lebensmittelprodukten, Nahrungsergänzungsmitteln, Mahlzeiten und sogar Diäten dar. Es wurde gründlich für Humanstudien validiert und stellt den Stand der Technik für Studien zur Fe-Bioverfügbarkeit dar.
Abstract
Das Wissen über die Bioverfügbarkeit von Fe ist entscheidend für die Beurteilung der Ernährungsqualität von Fe in Lebensmitteln. Die In-vivo-Messung der Fe-Bioverfügbarkeit ist durch Kosten, Durchsatz und die Vorbehalte begrenzt, die der Isotopenmarkierung des Lebensmittels Fe innewohnen. Daher besteht ein kritischer Bedarf an einem Ansatz, der mit hohem Durchsatz und kostengünstig ist. Der Caco-2-Zellbioassay wurde entwickelt, um diesen Bedarf zu decken. Der Caco-2-Zell-Bioassay für die Fe-Bioverfügbarkeit verwendet eine simulierte Magen- und Darmverdauung in Verbindung mit der Kultur einer menschlichen Darmepithelzelllinie, die als Caco-2 bekannt ist. In Caco-2-Zellen stimuliert die Fe-Aufnahme die intrazelluläre Bildung von Ferritin, einem Fe-Speicherprotein, das leicht mit einem Enzym-gebundenen Immunassay (ELISA) gemessen werden kann. Ferritin bildet sich proportional zur Fe-Aufnahme; So kann man durch die Messung der Caco-2-Zellferritinproduktion die intestinale Fe-Aufnahme aus simulierten Nahrungsverdauungen in die Enterozyten beurteilen.
Über diesen Ansatz repliziert das Modell den wichtigsten ersten Schritt, der die Bioverfügbarkeit von Lebensmittel-Fe bestimmt. Seit seiner Einführung im Jahr 1998 wurde dieser Modellansatz rigoros mit Faktoren verglichen, von denen bekannt ist, dass sie die menschliche Fe-Bioverfügbarkeit beeinflussen. Darüber hinaus wurde es in parallelen Studien angewendet, wobei drei Wirksamkeitsstudien am Menschen biofortifizierte Fe-Pflanzen bewerteten. In allen Fällen sagte der Bioassay die relativen Mengen an Fe-Bioverfügbarkeit aus den Faktoren, den Kulturen und der Gesamternährung korrekt voraus. Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden zur Caco-2-Zellkultur in Verbindung mit dem In-vitro-Verdauungsprozess und dem Zellferritin-ELISA, der für die Durchführung des Caco-2-Zell-Bioassays für die Fe-Bioverfügbarkeit erforderlich ist.
Introduction
Um den Forschungsbedarf und Nutzen des Caco-2-Zell-Bioassays für die Fe-Bioverfügbarkeit vollständig zu verstehen, müssen zunächst die Ansätze verstanden werden, die vor dem Aufkommen dieses Modells vorhanden waren. Die Messung der Fe-Bioverfügbarkeit aus einem Lebensmittel oder einer Mahlzeit in vivo ist eine anspruchsvolle Aufgabe, insbesondere wenn Kombinationen von Lebensmitteln in einer Mahlzeit oder Diät bewertet werden müssen. Die Isotopenmarkierung war in den letzten 50 Jahren der gebräuchlichste Ansatz zur Messung der Fe-Bioverfügbarkeit1. Die Isotopenmarkierung wird für Einzelmahlzeiten- und Mehrmahlzeitenstudien verwendet und ist für Langzeitstudien unpraktisch. Stabile Isotope von Fe wie 57Fe und 58Fe werden am häufigsten verwendet; Es wurden jedoch Studien mit Radioisotopen wie 59Fe durchgeführt, wobei die Ganzkörperzählung verwendet wurde2. Für pflanzliche Lebensmittel wurde die Isotopenmarkierung über extrinsische oder intrinsische Markierung durchgeführt. Für die extrinsische Markierung wird dem Lebensmittel oder der Mahlzeit eine bekannte Menge an Isotop zugesetzt. Das Essen wird dann gemischt und eine 15-30-minütige Äquilibrierungsperiode wird vor dem Verzehr in das Protokoll aufgenommen. Hydroponische Kultur - Hinzufügen des Isotops zur Nährlösung, um es in die Pflanze einzubauen, während sie wächst und sich entwickelt - ist für die intrinsische Kennzeichnung von pflanzlichen Lebensmitteln erforderlich. Die Vor- und Nachteile der einzelnen Ansätze werden im Folgenden erörtert.
Extrinsische Isotopenmarkierung
In den frühen bis mittleren 1970er Jahren wurde die menschliche Fe-Absorption durch extrinsische Markierung von Fe in Lebensmitteln untersucht, wobei eine bekannte Menge an Isotop zu der bekannten Menge an Fe in der Nahrung oder Mahlzeit hinzugefügt, gemischt und für 15-30 min vor den Messungen ausgeglichen wird. Es wurden verschiedene Mengen extrinsischer Isotope verwendet, die von 1% bis 100% des intrinsischen Fe reichen, aber am häufigsten im Bereich von 7% -30%3. Die extrinsische Markierung basiert auf der Annahme, dass das extrinsische Fe-Isotop vollständig mit dem intrinsischen Fe des Lebensmittels oder der Mahlzeit ausgeglichen wird. Die extrinsische Isotopenabsorption wird dann gemessen, und jedes Atom des extrinsischen Isotops wird berechnet, um eine bestimmte Anzahl von intrinsischen Fe-Atomen darzustellen. Diese Berechnung basiert auf den relativen molaren Mengen. Im Jahr 1983 wurden mehrere Validierungsstudien der Technik in einem Übersichtspapier4 zusammengefasst. Die Validierung der Technik erfolgte durch gleichzeitigen Vergleich der prozentualen Absorption der extrinsischen Isotopenmarkierung mit der prozentualen Absorption einer intrinsischen Isotopenmarkierung. Somit deutet ein Verhältnis der extrinsischen zur intrinsischen Absorption nahe 1 darauf hin, dass jeder Fe-Pool gleichmäßig absorbiert wurde. Zu dieser Zeit wurde ein Verhältnis nahe 1 auch als Gleichgewicht des extrinsischen Isotops mit dem intrinsischen Fe des Lebensmittels oder der Mahlzeit angesehen. Das Verhältnis von extrinsischer zu intrinsischer Fe-Absorption reichte von Mittelwerten von 0,40 bis 1,62, mit einem mittleren (±SD) Verhältnis von 1,08 ± 0,14 in 63 Vergleichen. Es ist wichtig anzumerken, dass in allen in diesem Review zusammengefassten Studien keine direkt das Gleichgewicht der extrinsischen Markierung mit dem intrinsischen Fe getestet hat. Zusammenfassend kamen die Autoren des Reviews zu folgendem Schluss:
"Die extrinsische Tag-Technik hat sich für mehrere Lebensmittel unter bestimmten experimentellen Bedingungen bewährt. Diese Methode kann jedoch noch nicht in Bezug auf alle Arten von Lebensmitteln als bewährt angesehen werden. Die extrinsische Tag-Methode ist nicht geeignet, um die Eisenaufnahme aus einer Diät zu überwachen, die unlösliche Formen von Eisen enthält. Die Gültigkeit dieser Technik beruht auf der Grundannahme, dass der extrinsische Tag vollständig mit allen endogenen Nicht-Häm-Lebensmitteln austauscht. Derzeit ist nicht bekannt, wie vollständig die verschiedenen Formen von Nichthämeisen durch ein extrinsisches Etikett gekennzeichnet sind. Dies ist wichtig angesichts von Studien, die darauf hindeuten, dass Eiseninhibitoren die extrinsische Markierung anders beeinflussen können als einige Formen von Nicht-Häm-Eisen in Lebensmitteln. Die Erforschung von Lebensmittelfaktoren, die einen vollständigen Isotopenaustausch beeinträchtigen können, ist spärlich. Daher erfordert die Interpretation von Bioverfügbarkeitsdaten aus der extrinsischen Tag-Forschung die Berücksichtigung von Austauschinhibitoren, die in der Nahrung oder Ernährung vorhanden sein können. "
Seit 1983 wurden nur zwei Studien veröffentlicht, die die Genauigkeit der extrinsischen Markierung von Fe 3,5 untersuchten. In beiden Studien wurde das Gleichgewicht einer extrinsischen Isotopenmarkierung direkt mit dem intrinsischen Fe der Lebensmittel verglichen, die in diesen Studien Grundnahrungsmittel waren. Getestet wurden weiße, rote und schwarze Bohnensorten sowie Linsen und Mais. Unter Verwendung etablierter In-vitro-Aufschlusstechniken und der Messung der Fe-Löslichkeit und -Fällung zeigten beide Studien, dass die extrinsische Isotopenmarkierung nicht konsistent zu einem vollständigen Gleichgewicht führt, mit dem Hinweis, dass bei einigen Bohnensorten das Ungleichgewicht in Abhängigkeit von der Menge des extrinsischen Isotops und der Farbe der Samenhülle sehr hoch sein kann3. Trotz der Schlußfolgerungen der Übersichtsarbeit von 1983 wurden die extrinsischen Kennzeichnungsstudien von Bohnen fortgesetzt 6,7,8,9,10,11,12. Keine dieser Studien beinhaltete das Testen des Gleichgewichts der extrinsischen Markierung mit dem intrinsischen Fe.
Intrinsische Markierung
Die intrinsische Markierung von Pflanzennahrung zur Beurteilung der Fe-Bioverfügbarkeit eliminiert die Genauigkeitsprobleme des Gleichgewichts bei der extrinsischen Markierung. Dieser Ansatz kann jedoch keine großen Mengen an Material liefern, da Gewächshausfläche für die hydroponische Kultur benötigt wird. Hydroponische Kultur ist arbeitsintensiv, erfordert eine hohe Menge an teuren stabilen Isotopen und führt oft zu einem Pflanzenwachstum, das sich in Bezug auf Ertrag und Samen-Fe-Konzentration unterscheidet. Aufgrund der Kosten eignet sich die intrinsische Kennzeichnung nur für kleine Studien, die darauf abzielen, die Mechanismen zu verstehen, die der Fe-Aufnahme zugrunde liegen, oder Faktoren, die die Fe-Aufnahme aus Lebensmitteln beeinflussen. Die Produktion von 1-2 kg eines Grundnahrungsmittels kostet allein für Materialien etwa 20.000 bis 30.000 US-Dollar, abhängig vom isotopischen und hydroponischen Ansatz13,14.
Angesichts der Herausforderungen, die mit der Isotopenmarkierung verbunden sind, versuchten die Forscher, In-vitro-Ansätze zu entwickeln. Frühe Methoden verwendeten simulierte Magen- und Darmnahrung, gekoppelt mit der Messung der Fe-Löslichkeit oder Fe-Dialysierbarkeit als Schätzung der Bioverfügbarkeit15. Solche Studien fanden schnell heraus, dass die Fe-Dialysierbarkeit kein konsistentes Maß für die Bioverfügbarkeit war, da Fe löslich, eng an Verbindungen gebunden und daher nicht austauschbar sein kann, was zu einer Überschätzung der Bioverfügbarkeit führt. Um diese Probleme anzugehen, entwickelte sich eine Methodik zur Nutzung einer menschlichen Darmzelllinie, wodurch eine lebende Komponente hinzugefügt wurde und die Messung der Fe-Aufnahme ermöglichtwurde 16. Die menschlichen Darmzellen - Caco-2-Zellen - stammen aus einem menschlichen Kolonkarzinom und wurden häufig in Nährstoffaufnahmestudien verwendet. Diese Zelllinie ist nützlich, da sich die Zellen in Kultur in Enterozyten differenzieren, die ähnlich wie die Bürstenrandzellen des Dünndarms funktionieren. Studien haben gezeigt, dass Caco-2-Zellen die entsprechenden Transporter und Reaktionen auf Faktoren zeigen, die die Fe-Aufnahme beeinflussen17,18.
Die ersten Studien, die Radioisotope zur Messung der Fe-Aufnahme in Caco-2-Zellen verwendeten, wurden verfeinert, um die Fe-Aufnahme basierend auf der Caco-2-Zellferritinbildung zu messen. Die Messung von Caco-2-Zellferritin verbesserte den Probendurchsatz und beseitigte Probleme der Radioisotopenhandhabung und des Gleichgewichts von extrinsischem Fe mit intrinsischem Fe 19,20. Die Messung der Fe-Aufnahme über die Ferritinbildung ermöglichte es den Forschern, eine breite Palette von Lebensmitteln zu untersuchen, einschließlich komplexer Mahlzeiten21. So lieferte die simulierte (in vitro) Verdauung in Verbindung mit der Fe-Aufnahme von Caco-2-Zellen eine bessere physiologische Beurteilung der Fe-Aufnahme aus der Nahrung. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Modell in erster Linie relative Unterschiede in der Fe-Bioverfügbarkeit bestimmt. Wie viele nützliche Zelllinien haben Caco-2-Zellen auch Variabilität in der Reaktionsfähigkeit gezeigt, aber konsistente relative Unterschiede in der Fe-Aufnahme zwischen Lebensmitteln beibehalten. Die richtige Technik und sorgfältige Liebe zum Detail können die konsistente Reaktion auf die Zellferritinbildung in Caco-2-Zellen verbessern.
Das In-vitro-Verdauungs-/Caco-2-Zellmodell wird auch als Caco-2-Zell-Bioassay bezeichnet. Dieser Assay wurde durch direkten Vergleich mit Human- und Tierstudien gründlich validiert22. Zusätzlich zum direkten parallelen Vergleich des Bioassays mit Wirksamkeitsstudien am Menschen zeigte dieses Modell eine qualitativ ähnliche Reaktion auf die Fe-Aufnahme wie beim Menschen18,19,23. Daher verdient der Caco-2-Zell-Bioassay als In-vitro-Ansatz eine hohe Glaubwürdigkeit als Screening-Tool zur Bewertung der Fe-Ernährung aus Lebensmitteln. Es wurde weit verbreitet auf zahlreiche Lebensmittel und Lebensmittel 21,24,25,26,27,28 angewendet.
Seit seiner Einführung im Jahr 1998 hat der Caco-2-Zellbioassay das Gebiet der Fe-Ernährung vorangebracht, da er dazu beigetragen hat, Faktoren zu identifizieren, die die intestinale Fe-Aufnahme beeinflussen. Auf diese Weise hat dieses Modell Forschungsziele für definitivere und kostengünstigere Studien am Menschen entwickelt und verfeinert. Man könnte auch argumentieren, dass die Verwendung des Modells die Notwendigkeit einiger menschlicher Versuche negiert.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die relative Abgabe von Fe aus einem Lebensmittel oder einer Mahlzeit mit dem Caco-2-Zell-Bioassay gemessen werden kann. Unabhängig von der Menge an Fe in der Testmahlzeit definiert der Bioassay die relative Menge an Fe, die in den Enterozyten aufgenommen wird - der erste Schritt des Absorptionsprozesses. Dies ist der wichtigste Schritt bei der Definition der Fe-Bioverfügbarkeit, da das Ziel meistens darin besteht, die Nährwertqualität von Fe in einem Lebensmittel zu verbessern oder zumindest zu überwachen. Da der Eisenstatus durch Absorption reguliert wird und somit die Fe-Aufnahme bei Personen mit Fe-Mangel hochreguliert wird, um den Ernährungsbedarf zu decken, sind die Standardbedingungen des Modells so konzipiert, dass die Fe-Aufnahme durch die Zellen maximal ist. Auf diese Weise liefert der Bioassay ein echtes Maß für das Potenzial der Nahrung, Fe zu liefern.
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Protocol
HINWEIS: Als praktischer Anhaltspunkt für die Leser beschreibt die folgende Methodik die spezifischen Kulturbedingungen und Materialien, die für die Messung der Fe-Bioverfügbarkeit von 20 experimentellen Proben erforderlich sind, sowie die erforderlichen Qualitätskontrollen in einem Durchlauf des Bioassays. Eine Erhöhung der Anzahl der Proben über diese Kapazität hinaus wird aufgrund der Zeit, die für verschiedene Zellkultur- und In-vitro-Verdauungsschritte innerhalb des Bioassays benötigt wird, nicht empfohlen.
1. Auswahl der Probenmenge
- Bestimmen Sie bei festen oder flüssigen Lebensmitteln eine Menge an Lebensmitteln, die als repräsentativ für die zu testende Probe angesehen werden kann.
- Verwenden Sie beim Testen auf Fe-Bioverfügbarkeit aus einer Bohnensorte 100-150 g Bohnensamen und verarbeiten Sie diese Menge zu einer homogenen Probe.
- Stellen Sie bei flüssigen Proben wie angereicherten Säften, Milchprodukten und Sportgetränken sicher, dass die Lebensmittel vor der Probenahme gut gemischt sind.
HINWEIS: Die oben erwähnte Menge an Bohnensamenmaterial ist unerlässlich, um die inhärenten Unterschiede zwischen Samen dieser Grundnahrungsmittel zu berücksichtigen.
2. Vorbereitung der Proben
- Spülen Sie Erde und Staub von jeder Lebensmittelprobe vor der Verarbeitung mit destilliert-entionisiertem Wasser ab.
- Verarbeiten Sie die geeignete Probenmenge gemäß den experimentellen Zielen, z. B. durch Kochmethode und Mahlen.
HINWEIS: Zum Kochen und Verarbeiten ist es wichtig, Kochgeschirr und Ausrüstung zu verwenden, die keine potenzielle Quelle für Verunreinigungen Fe darstellen. Edelstahlgeräte kontaminieren nicht; Geräte wie Steinmühlenmühlen, gusseisernes Kochgeschirr und alle Nicht-Edelstahlgeräte, die Fe enthalten, können jedoch erhebliche Mengen an Verunreinigungen Fe hinzufügen. Eine handelsübliche Edelstahl-Kaffeemühle ist oft ausreichend zum Mahlen. - Lyophilisieren und zu einem homogenen Pulver mahlen.
HINWEIS: Nach der Homogenisierung hat die Forschung gezeigt, dass drei unabhängige Replikationen der Analyse für jedes gemessene Lebensmittel ausreichend sind.- Wenn die Probenhomogenität schwer zu erreichen ist, überarbeiten Sie die Formulierung oder Verarbeitung des Produkts. Wenn dies nicht möglich ist, fügen Sie Replikationen hinzu, wenn die Inhomogenität nicht schwerwiegend ist.
- Verwenden Sie für die meisten homogenen festen Lebensmittel 0,5 g lyophilisierte Probe pro Replikat. Verwenden Sie bei Bedarf bis zu 1,0 g Probe pro Replikat, prüfen Sie jedoch, ob mehr als 0,5 g einen Vorteil für den Grad der Reaktion bringen.
HINWEIS: Mengen über 0,5 g fester Nahrung können die Dialysemembran verstopfen (siehe unten). - Verwenden Sie 1-2 ml flüssige Proben.
HINWEIS: Eine Lyophilisation ist für flüssige Proben oft nicht erforderlich.
3. Caco-2-Zellkultur
- Bestandskulturen
- Erwerben Sie Caco-2-Zellen von einem zertifizierten Lieferanten.
- Kultur der Zellen aus Standardfläschchen bei 37 °C in einem Inkubator mit einer 5%CO2-Luftatmosphäre (konstante Luftfeuchtigkeit) unter Verwendung von Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM), ergänzt mit 25 mM HEPES (pH 7,2), 10% (v/v) fetalem Rinderserum (FBS) und 1% antibiotisch-antimykotischer Lösung.
- Sobald genügend Zellen verfügbar sind, normalerweise nach 7-10 Tagen Kultur, säen Sie die Zellen in nicht kollagenbeschichteten Kolben mit einer Dichte von 30.000 Zellen / cm2.
- Wählen Sie die Kolbengröße in Abhängigkeit von der Anzahl der verfügbaren Zellen, die für die Aussaat von Multiwell-Platten benötigt werden.
HINWEIS: Im Allgemeinen eignen sich die T225-Kolben (225 cm 2) am besten für Experimente, bei denen 11 Multiwell-Platten (6-Well; 9,66 cm2/Well) (10 Platten für Probenvergleiche, 1 Platte für Qualitätskontrollen) pro Bioassay verwendet werden. - Züchten Sie die Zellen 7 Tage lang in Kolben, wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag und verwenden Sie es am 7. Tag zur Aussaat der Multiwell-Platten.
HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Passagebereich von nicht mehr als 10-15 Passagen zu verwenden, wenn die Zellen aus der Stammkultur gestartet und anschließend in einer Reihe von Experimenten verwendet werden. Zellkulturpassagen sollten begrenzt werden, da ein breites Spektrum von Passagen zu adaptiven Veränderungen in der Zelllinie und damit zu Variabilität in der Reaktion des Modells führen kann.
- Zellkultur auf Multiwell-Platten
- Säen Sie die Caco-2-Zellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen / cm2 in 6-Well-Kollagenplatten.
HINWEIS: Dieser Schritt funktioniert normalerweise am besten, wenn er an einem Mittwoch ausgeführt wird. Die folgenden Schritte machen deutlich, warum dieser Wochentag optimal ist. - Die Zellen werden 12 Tage lang bei 37 °C in einem Inkubator mit einer 5%CO2-Luftatmosphäre (konstante Luftfeuchtigkeit) mit DMEM gezüchtet, ergänzt mit 25 mM HEPES (pH 7,2), 10% (v/v) FBS und 1% antibiotisch-antimykotischer Lösung.
HINWEIS: Die Kultivierung der Zellmonoschichten länger als 12 Tage kann zu einer Zellüberwucherung führen. Frühere Forschungen haben eindeutig gezeigt, dass unter diesen Bedingungen 12 Tage nach der Aussaat die Zellmonoschicht reif ist, gut an der Platte befestigt und optimal in der Konsistenz der Antwort ist 29,30,31. Ein längeres Wachstum der Zellen, z. B. bis zu 19-21 Tage, führt zu einer Überwucherung der Zellen, und die Medien erschöpfen sich schnell an Nährstoffen, was zu ungesunden Monoschichten führt. - Während des 12-tägigen Zeitraums wechseln Sie das Medium mindestens alle 2 Tage nach einem konsistenten Tagesplan.
- Am 12. Tag nach der Aussaat ersetzen Sie das Kulturmedium durch 2 ml Minimum Essential Medium (MEM [pH 7]), ergänzt mit 10 mM PIPES (Piperazin-N,N'-bis-[2-ethansulfonsäure]), 1% Antibiotika-Antimykotikum-Lösung, Hydrocortison (4 mg/L), Insulin (5 mg/L), Selen (5 μg/L), Trijodthyronin (34 μg/L) und epidermalem Wachstumsfaktor (20 μg/L).
HINWEIS: Wenn die Aussaat an einem Mittwoch begonnen wurde, wäre der 12. Tag ein Montag. - Am folgenden Tag (d. h. Tag 13) entfernen Sie das MEM und ersetzen Sie es durch 1 ml MEM (pH 7).
HINWEIS: Dieser Schritt würde an einem Dienstag stattfinden. Dies ist der Tag, an dem der Bioassay beginnt; Somit bietet der 13-Tage-Zeitplan den Vorteil eines konsistenten Wochenplans, so dass der Bioassay konsistent am selben Wochentag durchgeführt werden kann.
- Säen Sie die Caco-2-Zellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen / cm2 in 6-Well-Kollagenplatten.
4. In-vitro-Verdauung
- Vorbereitung von Einlegeringen
- Erstellen Sie einen sterilisierten Einlegering aus einem Silikon-O-Ring, der mit einer säuregewaschenen Dialysemembran ausgestattet ist (Abbildung 1A).
HINWEIS: Bereiten Sie die Einsätze 1 Tag vor (d. h. Montag, Tag 12) des Tages des Bioassays vor und lagern Sie sie in 18 MΩ Wasser bei 4 °C, bis sie gebrauchsfertig sind. - Am Tag des Biotests (Dienstag, Tag 13) die Einsätze aus dem Kühlschrank nehmen, abtropfen lassen und das Wasser durch 0,5 M HCl ersetzen. Lassen Sie es vor Gebrauch mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer Laminar-Flow-Haube.
HINWEIS: Dieser Schritt sollte durchgeführt werden, bevor das MEM von den Kulturplatten entfernt wird. Das Säurewaschen der Membran dient dazu, eventuell kontaminierendes Fe zu entfernen und den Einlegering und die Membran zu sterilisieren. - Die 0,5 M HCl von den Einsätzen abtropfen lassen und mit sterilem 18 MΩ Wasser abspülen. In sterilem 18 MΩ Wasser bei Raumtemperatur in einer Laminar-Flow-Haube lagern, bis sie gebrauchsfertig ist.
- Stecken Sie einen Ring in jede Vertiefung der 6-Well-Platten mit Caco-2-Zellen, wodurch ein Zwei-Kammer-System entsteht. Bringen Sie die Platten mit den Einsätzen in den Inkubator zurück.
HINWEIS: Dieser Schritt sollte durchgeführt werden, nachdem frische 1,0 ml MEM in jede Vertiefung gegeben wurden (siehe Schritt 3.2.5.).
- Erstellen Sie einen sterilisierten Einlegering aus einem Silikon-O-Ring, der mit einer säuregewaschenen Dialysemembran ausgestattet ist (Abbildung 1A).
- Herstellung von Pepsinlösung
- Bereiten Sie am Tag des Experiments die Pepsinlösung vor, indem Sie 0,145 g Pepsin in 50 ml 0,1 M HCl auflösen. Schütteln Sie die Lösung vorsichtig auf einem Plattformschüttler für 30 min bei Raumtemperatur.
- Herstellung von Pankreatin-Gallenlösung
- Am selben Tag wie das Experiment 0,1 M NaHCO3 herstellen, indem 2,1 g NaHCO3 in 250 ml 18 MΩ Wasser gelöst werden.
- Mischen Sie 0,35 g Pankreatin und 2,1 g Gallenextrakt in 175 ml 0,1 M NaHCO3.
- Sobald das Pankreatin und der Gallenextrakt gelöst sind, fügen Sie 87,5 g eines schwachen Kationenaustauscherharzes hinzu (siehe Materialtabelle) und mischen Sie durch Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur.
- Gießen Sie die Gülle in eine große Säule und sammeln Sie das Eluat.
- Eluieren Sie die Säule mit zusätzlichen 70 ml 0,1 M NaHCO3 und sammeln Sie dieses Volumen in der Pankreatin-Gallenlösung.
HINWEIS: Der Zweck des Harzes ist es, Verunreinigungen Fe zu entfernen, die üblicherweise in den Pankreatin-Gallen-Extrakten vorkommen.
- Initiieren Sie die In-vitro-Verdauung .
- Die Probe wird in einem sterilen 50-ml-Zentrifugenröhrchen (Polypropylen) abgewogen, gefolgt von der Zugabe von 10 ml physiologischer Kochsalzlösung bei pH 2, die 140 mM NaCl und 5 mM KCl enthält.
- Leiten Sie den Magenverdauungsprozess ein, indem Sie 0,5 ml der vorbereiteten Schweinepepsinlösung in die Probe geben und auf einem Schaukelschüttler bei einer niedrigen, sanften Einstellung für 1 h bei 37 °C inkubieren.
- Nach dieser Zeit beginnen Sie den Darmverdauungsprozess jeder Probe, indem Sie den pH-Wert auf 5,5-6,0 mit 1,0 M NaHCO3 einstellen.
- Fügen Sie 2,5 ml der Pankreatin-Galle-Lösung zu jedem Probenröhrchen hinzu und stellen Sie den pH-Wert mit 1,0 M NaHCO3 auf 6,9-7,0 ein.
- Sobald der pH-Wert eingestellt ist, gleichen Sie das Volumen in jedem Röhrchen mit 140 mM NaCl, 5 mM KCl (pH 6,7) Lösung aus und messen Sie das Gewicht des Röhrchens mit einem Zielwert von 15 g.
HINWEIS: Für einige Lebensmittel muss das Gesamtvolumen möglicherweise auf 16 g oder 17 g gebracht werden, abhängig von der Pufferkapazität der Lebensmittel. - 1,5 ml jedes Darmverdaus werden in die obere Kammer (d. h. mit dem Einlegering mit der Dialysemembran) einer entsprechenden Vertiefung der 6-Well-Kulturplatte mit den Caco-2-Zellen überführt (Abbildung 1B).
- Plattenabdeckung wieder einsetzen und bei 37 °C (5%CO2-Luftatmosphäre ) auf einem Schaukelschüttler bei 6 Schwingungen/min für 2 h inkubieren.
- Entfernen Sie den Einlegering mit dem Aufschluss und geben Sie zusätzlich 1 ml MEM (pH 7) in jede Vertiefung.
- Die Zellkulturplatte wird für weitere 22 h in den Inkubator (37 °C; 5%CO2-Luftatmosphäre ) zurückgeführt.
- Nach 22 h das Zellkulturmedium entfernen und 2,0 ml 18 MΩ Wasser in die Zellmonoschicht geben.
HINWEIS: Das Wasser lysiert die Zellen osmotisch. - Ernten Sie das gesamte Zelllysat in Standard-Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen oder ähnliches für nachfolgende Zellprotein- und Zellferritinanalysen.
5. Messung von Caco-2-Zellferritin und Zellprotein
- Verwenden Sie das Zelllysat aus Schritt 4.4.10. zur Messung von Zellferritin und Protein.
- Um den Ferritingehalt der Caco-2-Zellen zu messen, befolgen Sie die Anweisungen des Kits (siehe Materialtabelle), mit Ausnahme der Erhöhung der Inkubationszeit von 30 min auf 2 h für das Maus-Antiferritin-Antikörper-Meerrettichperoxidase (HRP)-Konjugat.
- Um das Zellprotein zu messen, befolgen Sie die Anweisungen im Zellprotein-Kit (siehe Materialtabelle).
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Representative Results
Identifizierung und Messung der Fe-Bioverfügbarkeit in Grundnahrungsmitteln
Einer der Hauptgründe für die Entwicklung dieses Modells war die Identifizierung von Faktoren, die die Bioverfügbarkeit von Fe in Grundnahrungsmitteln beeinflussen, und die Bereitstellung eines Werkzeugs für Pflanzenzüchter, das es ihnen ermöglichen würde, Sorten mit verbesserter Fe-Bioverfügbarkeit zu identifizieren und zu entwickeln. Die gemeine Bohne (Phaseolus vulgaris) wurde weltweit als Nutzpflanze für die Fe-Biofortifikation eingesetzt; Daher wurde das Modell umfassend angewendet, um die Ernährungsqualität von Fe in einer breiten Palette von Bohnenmarktklassen und Bohnenzuchtprogrammen zu bewerten. Zum Beispiel sind gelbe Bohnen eine aufstrebende Marktklasse in den Vereinigten Staaten. In Regionen wie Ostafrika sind sie sehr beliebt und weithin als schnell kochend bekannt und werden von vielen als "leicht verdaulich" angesehen. Jüngste Studien mit dem Caco-2-Zellbioassay haben gezeigt, dass bestimmte Sorten gelber Bohnen im Vergleich zu anderen Farbklassen eine hohe Fe-Bioverfügbarkeit aufweisen können (Abbildung 2). In dieser Studie wurden die Manteca-Sorten als hoch in der Fe-Bioverfügbarkeit im Vergleich zu Referenzkontrollen der weißen und rot gesprenkelten Farbklassen identifiziert. Darüber hinaus waren die Ergebnisse über zwei aufeinanderfolgende Erntejahre hinweg konsistent. Solche Vergleiche sind in anderen Modellen, insbesondere in vivo-Modellen , aufgrund der hohen Kosten und des viel geringeren Durchsatzes von Tier- und Humanversuchen einfach nicht durchführbar.
Bewertung der Auswirkungen der Lebensmittelverarbeitung auf die Bioverfügbarkeit von Fe
Der Caco-2-Zellbioassay kann auch angewendet werden, um die Auswirkungen der Lebensmittelverarbeitung auf die Bioverfügbarkeit von Fe zu bewerten. Die Ergebnisse in Abbildung 3 stammen beispielsweise aus einer Analyse von Bohnen und Bohnennudeln mehrerer Farbklassen. Die Ergebnisse zeigen, wie die Verarbeitung der Bohnen zu einem Mehl die Bioverfügbarkeit von weißen (Snowdon, Alpena und Samurai) und gelben (Canario) Bohnensorten erhöhte. Für die Cranberry- (Ätna), roten Nieren- (Red Hawk) und schwarzen (Zenith) Sorten nahm die Bioverfügbarkeit von Fe in den Nudelmehlzubereitungen ab. Verwandte Analysen zeigten, dass die Verarbeitung der Bohnen zu einem Mehl die Keimzellwände der Bohnen störte und so das intrazelluläre Fe für die Aufnahme zugänglich machte. Die Eisenaufnahme nahm in den weißen und gelben Bohnennudeln zu, da die Samenhüllen dieser Sorten keine polyphenolischen Verbindungen enthielten, die die Bioverfügbarkeit von Fe hemmen. Im Gegensatz dazu enthalten die Samenhüllen von Cranberry, roter Niere und schwarzen Bohnen einen hohen Gehalt an hemmenden Polyphenolen, wodurch die Fe-Aufnahme verringert wird. Diese Ergebnisse zeigen deutlich die Nützlichkeit des Modells bei der Aufdeckung von Faktoren, die die Ernährungsqualität von Fe beeinflussen können, die sonst unentdeckt bleiben würden.
Abbildung 1: Einsetzen des Ringaufbaus für die Fe-Aufnahme von Caco-2-Zellen. (A) Bild von Caco-2-Zellen und Einführungsring mit angebrachter Dialysemembran. (B) Diagramm des Gesamtverfahrens für den In-vitro-Aufschluss in Verbindung mit der Aufnahme von Caco-2-Zell-Fe in einer einzigen Vertiefung der Multi-Well-Platte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Eisen-Bioverfügbarkeitswerte von ungetränkten und gekochten Vollsaat-Genotypen in einem vielfältigen Panel gelber Bohnen. a) Feldsaison 2015; (B) Feldsaison 2016. Werte sind Mittelwerte (Standardabweichung) von dreifachen Messungen aus zwei Feldreplikaten pro Genotyp (n = 6). Genotypen werden auf der x-Achse nach Kochkurs kategorisiert, vom Genotyp mit dem schnellsten Kochen bis zum langsamsten Kocheintrag. *Signifikant niedriger (p < 0,05) Eisenbioverfügbarkeitswert als die anderen YBP-Einträge. **Signifikant höhere (p < 0,05) Eisenbioverfügbarkeitswerte als die anderen YBP-Genotypen. Diese Zahl wurde von32 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Eisenbioverfügbarkeit ausgedrückt als Caco-2-Zellferritinbildung (Nanogramm Ferritin pro Milligramm Zellprotein) von Bohnensorten und den entsprechenden Spaghetti auf Bohnenbasis. (A) drei weiße Bohnensorten und die entsprechenden Spaghetti auf Bohnenbasis; (B) vier farbige Bohnensorten und die entsprechenden Spaghetti auf Bohnenbasis. Werte sind die Mittelwerte (± Standardabweichung) von sechs Messungen jeder Sorte. Die blaue Bindestrichlinie zeigt die Eisenbioverfügbarkeit einer nicht angereicherten Hartweizennudelkontrolle an, die auf die gleiche Weise wie die Spaghetti auf Bohnenbasis extrudiert, gekocht und verarbeitet wird. *Signifikant (p ≤ 0,05) höhere Caco-2-Zellferritinbildung als ganze Bohnen nach dem Kochen. **Signifikant (p ≤ 0,05) geringere Caco-2-Zellferritinbildung als ganze Bohnen nach dem Kochen. Diese Zahl wurde von33 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Seit seiner Einführung wurden zahlreiche Studien veröffentlicht, die diese Methode für den Caco-2-Zell-Bioassay beschreiben. Die Rahmenbedingungen sind seit der Erstveröffentlichung 1998 relativ unverändert geblieben18. In den letzten 20 Jahren wurden jedoch zahlreiche technische Details verfeinert und standardisiert, um eine beispiellose Konsistenz in der Reaktion des Bioassays zu erzielen. Die sorgfältige und präzise Einhaltung der Zellkultur und der In-vitro-Verdauungsbedingungen sind der Schlüssel zur konsistenten und sensitiven Reaktion des Bioassays.
Aus unserer Erfahrung bei der Ausbildung zahlreicher Personen in der Anwendung dieser Methode ist der häufigste Kampf die richtige Kultur der Caco-2-Zellen. Eine konsistente Kultur gesunder Monoschichten ist der Schlüssel zu gesunden und ansprechenden Caco-2-Zellmonoschichten. Wenn die Zellproteinspiegel von gut zu gut und nicht innerhalb des im Protokoll aufgeführten Zellproteinbereichs liegen, sollte der Prüfer die Zellkulturbedingungen erneut auf Abweichungen vom Protokoll überprüfen. Alternativ kann eine schwache Kontamination mit Mikroorganismen vorliegen, der Zellkulturinkubator funktioniert möglicherweise nicht ordnungsgemäß oder das Zellkulturmedium ist möglicherweise nicht richtig formuliert.
Der In-vitro-Verdauungsprozess ist eine weitere Quelle potenzieller Probleme. Die Entfernung von Verunreinigung Fe aus den Verdauungsenzymen ist von entscheidender Bedeutung. Trotz der Angaben des Herstellers ist es ratsam, die Fe-Konzentration der Enzyme regelmäßig zu überprüfen und sicherzustellen, dass der Fe-Entfernungsprozess (siehe Protokoll) wirksam ist. Wenn Fe-Kontamination in den Verdauungsenzymen vorhanden ist, liefert die Baseline-Verdauungsqualitätskontrolle Zellferritinwerte, die über dem empfohlenen Bereich liegen.
Ein erfahrener und geschulter Prüfer sollte in der Lage sein, 20 experimentelle Proben plus die Qualitätskontrollen in einem einzigen Durchlauf des Bioassays zu analysieren. Daher werden für jeden Durchlauf des Bioassays etwa 12 Sechs-Well-Platten benötigt. Eine höhere Anzahl von Proben pro Bioassay wird nicht empfohlen, da der Zeitpunkt für die pH-Titration während des Aufschlussprozesses zu lang sein kann, was zu möglichen Inkonsistenzen zwischen den Probenaufschlusszeiten führt.
Die Nachteile dieses Modells sind relativ gering. Es erfordert Forscher, die in der Zellkultur hochqualifiziert sind und in der Lage sind, präzise auf Details und Protokolle zu achten. Der Laborraum muss frei von Quellen der Fe-Kontamination sein, und Reagenzien und andere Materialien sollten routinemäßig auf Fe-Kontamination überwacht werden. Daher sollte der Benutzer die Fähigkeit oder den Zugang zu Instrumenten zur Messung der Fe-Konzentration haben. Dieses Modell ist nur ein relatives oder semi-quantitatives Maß. Bei richtiger Verwendung von Referenzkontrollen kann das Modell jedoch einige quantitative Schätzungen der Fe-Absorption liefern. Tatsächlich wurde eine Konversionsgleichung der Absorptionsverhältnisse von Kontroll- und Testmaterial erstellt19.
Der Bioassay funktioniert nach folgendem Prinzip: Caco-2-Zellen produzieren als Reaktion auf einen Anstieg der zellulären Fe-Konzentrationen mehr Ferritinprotein. Daher ist die Fe-Bioverfügbarkeit proportional zum Anstieg der Caco-2-Zellferritinproduktion. Dieser Anstieg wird als Verhältnis von Zellferritin zu Gesamt-Caco-2-Zellprotein (Nanogramm Ferritin pro Milligramm Gesamtzellprotein) nach Exposition gegenüber einer verdauten Probe ausgedrückt19. Ferritinmessungen werden mit einem ELISA-Kit (siehe Materialtabelle) durchgeführt, das in diesem Bioassay auf Ansprechen getestet wurde. Die Gesamtzellproteinkonzentrationen werden mit einem Protein-Assay-Kit quantifiziert. Wie bereits erwähnt, reichen die typischen Caco-2-Zellproteingehalte in einer Sechs-Well-Platte unter den für diese Methode verwendeten Bedingungen zwischen 2,0 mg und 2,6 mg Zellprotein pro Well. Werte außerhalb dieses Bereichs deuten auf ungesunde Zellkulturen, ein mögliches Überwachsen von Zellen oder eine schlechte Zellaussaattechnik hin. Innerhalb eines bestimmten Durchlaufs des Bioassays sollten die Werte nur bis zu 0,2 mg pro Vertiefung variieren. Darüber hinaus gibt es unter den in dieser Methodik verwendeten Aussaatdichten und Kulturbedingungen eine erhebliche Aktivität des Pinselrandenzyms 13 Tage nach der Aussaat, was auf eine Reifung der meisten, wenn nicht der gesamten Zellmonoschicht28,29,30 hinweist. Überwachen Sie Zellmonoschichten während der 13 Tage vor der Verwendung auf Kontamination oder Stress, wie Vakuolenbildung oder Lücken in der Monoschichtbildung. Wenn solche Bedingungen offensichtlich sind, sollten die Zellen nicht als gültig für die Verwendung im Bioassay angesehen werden.
Um die Reaktionsfähigkeit des Caco-2-Bioassays zu überwachen, sollte jedes Experiment mit mehreren Qualitätskontrollen durchgeführt werden, einschließlich eines Blindverdauens, der nur die physiologisch ausgewogene Kochsalzlösung und die gastrointestinalen Enzyme enthält. Diese Kontrollen stellen sicher, dass es keine Fe-Kontamination im Bioassay gibt. Die Ferritinwerte von Caco-2-Zellen, die dem Blindverdau ausgesetzt sind, liegen typischerweise zwischen 1 ng und 6 ng Ferritin/mg-Zellprotein. Baseline-Ferritin in diesem Bereich zeigt auch an, dass sich die Zellen in einem relativ niedrigen Fe-Status befinden und daher eine maximale Empfindlichkeit gegenüber verfügbarem Fe aufweisen sollten.
Für die ersten 15 Jahre der Anwendung umfassten zusätzliche Qualitätskontrollen 1) einen Blindaufschluss mit FeCl 3 (66 μM) und 2) einen Blindaufschluss von FeCl 3 (66 μM) sowie die Zugabe von1,3 mM Ascorbinsäure. Ferritinwerte für den FeCl 3-Verdauungsbereich lagen typischerweise im Bereich von 30-50 ng Ferritin/mg Zellprotein, und der FeCl3-Aufschluss mit Ascorbinsäure lag im Bereich von 250-400 ng Ferritin/mg Zellprotein. In den letzten Jahren bleibt der Blindverdau eine Qualitätskontrolle; Wir sind jedoch auf die Verwendung einer Lebensmittelprobe mit und ohne Ascorbinsäure im Verhältnis 20:1, Ascorbat:Fe, umgestiegen. Die verwendete Lebensmittelprobe war ein weißes Bohnenmehl, das etwa 65 μg Fe/g Probe enthält. Diese Qualitätskontrollen ergeben einen engeren und konsistenteren Reaktionsbereich, der 20-30 ng Ferritin/mg Zellprotein für das weiße Bohnenmehl und 70-150 ng Ferritin/mg Zellprotein für das weiße Bohnenmehl plus Ascorbat ergibt. Es sollte beachtet werden, dass der neue Wertebereich aus dem referenzierten Kit in der Materialtabelle stammt, das tendenziell etwas niedriger ist als das inzwischen nicht mehr existierende Ramco ELISA-Kit. Zum Zeitpunkt der Veröffentlichung dieses Manuskripts wurden nur 2-3 Monate Daten mit dem referenzierten Kit erfasst.
Es ist wichtig, die Ergebnisse und Zellkulturbedingungen zu erkennen, die auf einen ungültigen oder suboptimalen Verlauf des Bioassays hinweisen. Erstens, wie in den Methoden angegeben, wenn die Blindverdauungsbedingungen Zellferritinkonzentrationen ergeben, die höher sind als der vorgeschlagene Bereich, könnte dies auf eine Fe-Kontamination der Zellkulturmedien, der Verdauungsenzyme oder der Dialysemembran hinweisen. Akzeptable Fe-Konzentrationen für die Zellkulturmedien und die Verdauungsenzyme liegen bei <20 μg Fe/ml. Werte außerhalb des Bereichs für die anderen Qualitätskontrollen, insbesondere wenn sie niedrig sind, deuten ebenfalls darauf hin, dass die Aussagekraft der Ergebnisse fragwürdig ist.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Modell sehr empfindlich auf bioverfügbares Fe reagiert, da die Zellkulturbedingungen darauf ausgelegt sind, Zellen mit niedrigem Fe-Status zu erzeugen; daher sind ihre Mechanismen für die Fe-Aufnahme stark hochreguliert. Es handelt sich um ein robustes Modell, das einen hohen Durchsatz ermöglicht. Jedes Lebensmittel oder jede Diät, die an Menschen verfüttert werden kann, kann in diesem Modell bewertet werden, und daher hat der Bioassay ein breites Anwendungsspektrum. Pflanzenzüchter können dieses Modell verwenden, um die Fe-Bioverfügbarkeit in Grundnahrungsmitteln zu messen und Merkmale und chromosomale Regionen zu identifizieren, die die Bioverfügbarkeit von Fe beeinflussen. Lebensmittelwissenschaftler können das Modell anwenden, um optimale Formulierungen zu bestimmen und die Auswirkungen der Verarbeitung zu bewerten, um eine angemessene Bioverfügbarkeit von Fe sicherzustellen. Ernährungswissenschaftler können das Modell verwenden, um die Bioverfügbarkeit von Fe aus einzelnen Lebensmitteln, Lebensmittelkombinationen und sogar Diätplänen zu bewerten und zu überwachen. Es wurde gründlich für Versuche am Menschen validiert und prognostiziert die Richtung und das Ausmaß der Auswirkungen in jeder Anwendung korrekt. Durch die Kombination der simulierten Verdauung mit der Fe-Aufnahme von Darmepithelzellen stellt dieses Modell den entscheidenden ersten Schritt im Fe-Absorptionsprozess dar und ist daher in der Lage, die Abgabe oder Bioverfügbarkeit von Fe aus Lebensmitteln vorherzusagen.
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Disclosures
Der Autor hat keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Der Autor ist zutiefst dankbar für die technischen Bemühungen von Yongpei Chang und Mary Bodis. Die äußerst erfolgreiche Anwendung dieses Modells im Bereich der Ernährung ist ein direktes Ergebnis ihrer Expertise und Liebe zum Detail. Die Entwicklung dieses Modells wurde vollständig vom United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
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