Summary
הבדיקה הביולוגית של תאי Caco-2 לזמינות ביולוגית של ברזל (Fe) מייצגת גישה חסכונית ורב-תכליתית להערכת הזמינות הביולוגית של Fe ממזונות, מוצרי מזון, תוספי מזון, ארוחות ואפילו משטרי תזונה. הוא מאומת ביסודיות למחקרים בבני אדם, ומייצג את מצב האמנות למחקרים על זמינות ביולוגית של Fe.
Abstract
הידע על הזמינות הביולוגית של Fe הוא קריטי להערכת האיכות התזונתית של Fe במזונות. מדידת הזמינות הביולוגית של Fe מוגבלת על ידי עלות, תפוקה והאזהרות הטמונות בסימון איזוטופי של המזון Fe. לפיכך, קיים צורך קריטי בגישה שהיא בעלת תפוקה גבוהה וחסכונית. הביו-אסאי של תאי Caco-2 פותח כדי לספק את הצורך הזה. הבדיקה הביולוגית של תאי Caco-2 לזמינות ביולוגית של Fe משתמשת בעיכול מדומה של קיבה ומעיים בשילוב עם תרבית של קו תאי אפיתל במעיים אנושיים המכונה Caco-2. בתאי Caco-2, ספיגת Fe מגרה את ההיווצרות התוך-תאית של פריטין, חלבון אחסון Fe שנמדד בקלות על ידי בדיקה חיסונית הקשורה לאנזים (ELISA). פריטין נוצר ביחס לספיגת Fe; לפיכך, על ידי מדידת ייצור פריטין תאי Caco-2, ניתן להעריך את ספיגת Fe במעיים מעיכול מזון מדומה לתוך האנטרוציט.
באמצעות גישה זו, המודל משכפל את השלב הראשוני העיקרי שקובע את הזמינות הביולוגית של מזון Fe. מאז הקמתה בשנת 1998, גישת מודל זו הושוותה בקפדנות לגורמים הידועים כמשפיעים על הזמינות הביולוגית של Fe האנושית. יתר על כן, הוא יושם במחקרים מקבילים, עם שלושה מחקרי יעילות אנושית המעריכים גידולים ביולוגיים של Fe. בכל המקרים, הבדיקה הביולוגית ניבאה נכונה את הכמויות היחסיות של הזמינות הביולוגית של Fe מהגורמים, היבולים והתזונה הכללית. מאמר זה מספק שיטות מפורטות על תרבית תאי Caco-2 בשילוב עם תהליך העיכול במבחנה ופריטין התאים ELISA הדרושים לביצוע הבדיקה הביולוגית של תאי Caco-2 לזמינות ביולוגית של Fe.
Introduction
כדי להבין באופן מלא את הצורך והתועלת המחקריים של בדיקת הביו-אסאי של תאי Caco-2 עבור זמינות ביולוגית של Fe, יש להבין תחילה את הגישות שהיו קיימות לפני הופעתו של מודל זה. מדידת הזמינות הביולוגית של Fe ממזון או מארוחה in vivo היא משימה מאתגרת, במיוחד כאשר יש צורך להעריך שילובים של מזון בארוחה או בדיאטה. תיוג איזוטופי היה הגישה הנפוצה ביותר למדידת הזמינות הביולוגית של Fe במהלך 50 השנים האחרונות1. תיוג איזוטופי משמש למחקרים של ארוחה אחת וארוחות מרובות והוא אינו מעשי למחקרים ארוכי טווח. איזוטופים יציבים של Fe כגון 57Fe ו- 58Fe הם הנפוצים ביותר; עם זאת, מחקרים נערכו עם רדיואיזוטופים כגון 59Fe, תוך שימוש בספירת כל הגוף2. עבור מזונות צמחיים, הסימון האיזוטופי נעשה באמצעות תיוג חיצוני או פנימי. עבור תיוג חיצוני, כמות ידועה של איזוטופ מתווספת למזון או לארוחה. לאחר מכן מערבבים את המזון, ותקופת שיווי משקל של 15-30 דקות משולבת בפרוטוקול לפני הצריכה. תרבית הידרופונית - הוספת האיזוטופ לתמיסת ההזנה כדי לשלב אותו בצמח בזמן שהוא גדל ומתפתח - נדרשת לסימון פנימי של מזונות צמחיים. היתרונות והחסרונות של כל גישה נדונים להלן.
תיוג איזוטופי חיצוני
בתחילת עד אמצע שנות ה-70 של המאה ה-20, ספיגת Fe אנושית נחקרה על ידי סימון חיצוני של Fe במזונות, כאשר כמות ידועה של איזוטופים מתווספת לכמות הידועה של Fe במזון או בארוחה, מעורבבת ומאוזנת במשך 15-30 דקות לפני המדידות. נעשה שימוש בכמויות שונות של איזוטופים חיצוניים, הנעים בין 1% ל-100% מה-Fe הפנימי, אך לרוב בטווח של 7%-30%3. תיוג חיצוני מבוסס על ההנחה שהאיזוטופ החיצוני Fe מקבל שיווי משקל מלא עם Fe הפנימי של המזון או הארוחה. לאחר מכן נמדדת ספיגת איזוטופים חיצוניים, וכל אטום של האיזוטופ החיצוני מחושב כך שייצג מספר נתון של אטומי Fe פנימיים. חישוב זה מבוסס על הסכומים הטוחנים היחסיים. בשנת 1983, מחקרי אימות מרובים של הטכניקה סוכמו במאמר סקירה4. תיקוף הטכניקה נעשה על ידי השוואה בו זמנית של אחוז הקליטה של התווית האיזוטופית החיצונית לאחוזי הקליטה של תווית איזוטופית פנימית. לפיכך, יחס בין הספיגה החיצונית לקליטה הפנימית קרוב ל-1 מצביע על כך שכל מאגר של Fe נספג באופן שווה. באותה תקופה, יחס קרוב ל-1 נחשב גם כמייצג שיווי משקל של האיזוטופ החיצוני עם Fe הפנימי של המזון או הארוחה. היחסים בין ספיגת Fe חיצונית לפנימית נעו בין ערכים ממוצעים של 0.40 ל-1.62, עם יחס ממוצע (±SD) של 1.08 ± 0.14 ב-63 השוואות. חשוב לציין כי בכל המחקרים שסוכמו בסקירה זו, אף אחד מהם לא בדק באופן ישיר את שיווי המשקל של התווית החיצונית עם Fe הפנימי. לסיכום, מחברי הסקירה סיכמו את הדברים הבאים:
"טכניקת התג החיצוני הוכחה כתקפה למספר מזונות בתנאי ניסוי מסוימים. אבל, שיטה זו עדיין לא יכולה להיחשב מוכחת לגבי כל סוגי המזונות. שיטת התג החיצוני אינה מתאימה לניטור ספיגת ברזל מתזונה המכילה צורות בלתי מסיסות של ברזל. תקפותה של טכניקה זו נשענת על ההנחה הבסיסית שהתג החיצוני מתחלף לחלוטין עם כל ברזל המזון האנדוגני. נכון לעכשיו לא ידוע כיצד צורות שונות לחלוטין של ברזל nonheme מסומנים על ידי תג חיצוני. זה חשוב לאור מחקרים שהציעו כי מעכבי ברזל עשויים להשפיע על התג החיצוני באופן שונה מאשר צורות מסוימות של ברזל nonheme במזונות. המחקר על גורמי מזון שיכולים לפגוע בחילוף איזוטופי שלם הוא דל. לפיכך, פרשנות של נתוני זמינות ביולוגית ממחקר תגים חיצוניים דורשת התחשבות במעכבי החלפה שעשויים להיות נוכחים במזון או בתזונה".
מאז 1983 פורסמו רק שני מחקרים שהעריכו את הדיוק של תיוג חיצוני שלFe 3,5. בשני המחקרים הללו, שיווי המשקל של תווית איזוטופית חיצונית הושווה ישירות ל-Fe הפנימי של המזונות, שבמחקרים אלה היו גידולי מזון בסיסיים. נבדקו זני שעועית לבנה, אדומה ושחורה, יחד עם עדשים ותירס. באמצעות טכניקות עיכול מבוססות במבחנה ומדידת מסיסות Fe ומשקעים, שני המחקרים הראו כי תיוג איזוטופי חיצוני אינו מביא באופן עקבי לשיווי משקל מלא, עם ראיות לכך שעבור זני שעועית מסוימים, חוסר שיווי המשקל יכול להיות גבוה מאוד בהתאם לכמות האיזוטופים החיצוניים וצבע ציפוי הזרעים3. למרות מסקנות מאמר הסקירה משנת 1983, מחקרי סימון חיצוניים של שעועית נמשכו 6,7,8,9,10,11,12. אף אחד מהמחקרים הללו לא כלל בדיקת שיווי המשקל של התווית החיצונית עם Fe הפנימי.
תיוג פנימי
סימון פנימי של מזון צמחי לצורך הערכת הזמינות הביולוגית של Fe מבטל את בעיות הדיוק של שיווי משקל בהתוויה חיצונית. עם זאת, גישה זו אינה יכולה להניב כמויות גדולות של חומר בגלל הדרישה של שטח חממה לתרבית הידרופונית. תרבית הידרופונית דורשת עבודה רבה, דורשת כמות גבוהה של איזוטופ יציב יקר, ולעתים קרובות גורמת לצמיחת צמחים שונה מבחינת היבול וריכוז Fe של הזרעים. בשל העלות, סימון פנימי מתאים רק למחקרים בקנה מידה קטן שמטרתם להבין מנגנונים העומדים בבסיס ספיגת Fe או גורמים המשפיעים על ספיגת Fe ממזונות. ייצור של 1-2 ק"ג של יבול מזון בסיסי עולה כ-20,000-30,000 דולר לחומרים בלבד, תלוי באיזוטופ ובגישה ההידרופונית13,14.
בהתחשב באתגרים הקשורים לתיוג איזוטופי, החוקרים ביקשו לפתח גישות חוץ גופיות. שיטות מוקדמות השתמשו במזון מדומה בקיבה ובמעיים, יחד עם מדידת מסיסות Fe או Fe dialyzability כאומדן לזמינות ביולוגית15. מחקרים כאלה מצאו במהרה כי יכולת הדיאליזה של Fe אינה מדד עקבי לזמינות ביולוגית, שכן Fe יכול להיות מסיס, קשור בחוזקה לתרכובות, ולכן אינו ניתן להחלפה, מה שמוביל להערכת יתר של זמינות ביולוגית. כדי להתמודד עם בעיות אלה, התפתחה מתודולוגיה לשימוש בקו תאי מעיים אנושיים, ובכך הוסיפה מרכיב חי ואפשרה מדידה של קליטת Fe16. תאי המעי האנושי - תאי Caco-2 - מקורם בקרצינומה אנושית של המעי הגס והיו בשימוש נרחב במחקרי ספיגת חומרים מזינים. קו תאים זה שימושי, שכן בתרבית, התאים מתמיינים לאנטרוציטים המתפקדים באופן דומה לתאי גבול המברשת של המעי הדק. מחקרים הראו כי תאי Caco-2 מציגים את הטרנספורטרים המתאימים ואת התגובה לגורמים המשפיעים על ספיגתFe 17,18.
המחקרים הראשוניים, שהשתמשו ברדיואיזוטופים למדידת ספיגת Fe בתאי Caco-2, שוכללו כדי למדוד את ספיגת Fe בהתבסס על היווצרות פריטין של תאי Caco-2. מדידת פריטין של תאי Caco-2 שיפרה את תפוקת הדגימה ושללה בעיות של טיפול ברדיואיזוטופים ושיווי משקל של Fe חיצוני עם Fe19,20 פנימי. מדידת ספיגת Fe באמצעות היווצרות פריטין אפשרה לחוקרים לחקור מגוון רחב של מזונות, כולל ארוחות מורכבות21. לפיכך, עיכול מדומה (במבחנה) בשילוב עם ספיגת Fe של תאי Caco-2 סיפקו הערכה פיזיולוגית טובה יותר של ספיגת Fe ממזונות. חשוב לציין כי מודל זה קובע בעיקר הבדלים יחסיים בזמינות הביולוגית של Fe. בדומה לקווי תאים שימושיים רבים, גם תאי Caco-2 הראו שונות בתגובתיות, אך שמרו על הבדלים יחסיים עקביים בספיגת Fe בין מזונות. טכניקה נכונה ותשומת לב קפדנית לפרטים יכולים לשפר את התגובה העקבית של היווצרות פריטין תאי בתאי Caco-2.
מודל תאי העיכול/Caco-2 במבחנה ידוע גם בשם ביו-אסאי של תאי Caco-2. בדיקה זו אומתה ביסודיות באמצעות השוואה ישירה למחקרים בבני אדם ובבעלי חיים22. בנוסף להשוואה המקבילה הישירה של הבדיקה הביולוגית לניסויים ביעילות אנושית, מודל זה הוכח כבעל תגובה דומה מבחינה איכותית בספיגת Fe לזו שלבני אדם 18,19,23. לכן, כגישה חוץ-גופית, הבדיקה הביולוגית של תאי Caco-2 מצדיקה אמינות גבוהה ככלי סינון להערכת תזונת Fe ממזונות. זה כבר מיושם באופן נרחב על מזונות רבים ומוצרי מזון 21,24,25,26,27,28.
מאז הקמתה בשנת 1998, הביו-אסאי של תאי Caco-2 קידם את תחום תזונת Fe מכיוון שהוא סייע לזהות גורמים המשפיעים על ספיגת Fe במעיים. בכך, מודל זה פיתח ושכלל מטרות מחקר למחקרים אנושיים סופיים יותר ויקרים פחות. אפשר גם לטעון שהשימוש במודל שולל את הצורך בכמה ניסויים בבני אדם.
לסיכום, ניתן למדוד את המסירה היחסית של Fe ממזון או מארוחה באמצעות הביו-אסאי של תאי Caco-2. ללא קשר לכמות Fe בארוחת הבדיקה, הבדיקה הביולוגית מגדירה את הכמות היחסית של Fe שנלקחה לתוך האנטרוציט - השלב הראשון בתהליך הספיגה. זהו הצעד החשוב ביותר בהגדרת הזמינות הביולוגית של Fe, שכן לרוב המטרה היא למדוד מתוך כוונה לשפר או, לכל הפחות, לפקח על האיכות התזונתית של Fe במזון. בהתחשב בכך שמצב הברזל מווסת על ידי ספיגה, ולכן ספיגת Fe מווסתת אצל אנשים עם מחסור ב-Fe כדי לענות על הצרכים התזונתיים, התנאים הסטנדרטיים של המודל מתוכננים כך שספיגת Fe על ידי התאים תהיה מקסימלית. בדרך זו, הבדיקה הביולוגית מספקת מדידה אמיתית של הפוטנציאל של המזון לספק Fe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כנקודת התייחסות נוחה לקוראים, המתודולוגיה הבאה מתארת את תנאי התרבות והחומרים הספציפיים הנדרשים למדידת הזמינות הביולוגית של Fe מ-20 דגימות ניסיוניות, בתוספת בקרות האיכות הנדרשות, בהרצת הבדיקה הביולוגית. הגדלת מספר הדגימות מעבר לקיבולת זו אינה מומלצת בשל הזמן הנדרש לתרביות תאים שונות ולשלבי עיכול חוץ גופיים בתוך הביו-אסאי.
1. בחירת כמות הדגימות
- עבור מזון מוצק או נוזלי, לקבוע כמות של מזון שיכול להיחשב מייצג של המדגם להיבדק.
- בבדיקת זמינות ביולוגית של Fe מזן שעועית, השתמש ב-100-150 גרם של זרעי שעועית ועבד כמות זו לדגימה הומוגנית.
- עבור דגימות נוזלים כגון מיצים מועשרים, מוצרי חלב ומשקאות ספורט, יש לוודא שהמזון מעורבב היטב לפני הדגימה.
הערה: כמות חומר זרעי השעועית שהוזכרה לעיל חיונית כדי להסביר את ההבדלים האינהרנטיים בין זרעים של יבול בסיסי זה.
2. הכנת דוגמאות
- יש לשטוף אדמה ואבק מכל דגימת מזון במים מזוקקים שעברו דה-יוניזציה לפני העיבוד.
- לעבד את כמות הדגימה המתאימה בהתאם למטרות הניסוי, כגון על ידי שיטת בישול וטחינה.
הערה: לבישול ולעיבוד, חשוב מאוד להשתמש בכלי בישול ובציוד שאינו מקור פוטנציאלי למזהמים Fe. ציוד נירוסטה אינו מזהם; עם זאת, ציוד כגון מטחנות אבן, כלי בישול מברזל יצוק וכל ציוד שאינו נירוסטה המכיל Fe יכול להוסיף כמויות משמעותיות של Fe מזהם. מטחנת קפה סטנדרטית מנירוסטה מתאימה לעתים קרובות לטחינה. - ליופיליזציה וטחינה לאבקה הומוגנית.
הערה: לאחר הומוגניות, מחקרים הראו כי שלושה שכפולים בלתי תלויים של ניתוח מספיקים לכל מזון שנמדד.- אם הומוגניות מדגם קשה להשיג, לשנות את ניסוח או עיבוד של המוצר. אם זה לא אפשרי, הוסף שכפולים אם אי-ההומוגניות אינה חמורה.
- עבור רוב המזונות המוצקים ההומוגניים, יש להשתמש ב-0.5 גרם של דגימה ליאופילית לכל שכפול. במידת הצורך, השתמש בעד 1.0 גרם דגימה לכל שכפול, אך בדוק אם יותר מ-0.5 גרם מניב יתרון במידת התגובה.
הערה: כמויות גבוהות מ-0.5 גרם של מזון מוצק עלולות לסתום את קרום הדיאליזה (ראו להלן). - השתמש 1-2 מ"ל של דגימות נוזליות.
הערה: לעתים קרובות אין צורך בליאופיליזציה עבור דגימות נוזליות.
3. תרבית תאים Caco-2
- תרבויות מלאי
- לרכוש תאי Caco-2 מספק מוסמך.
- תרבית את התאים מבקבוקוני מלאי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם אטמוספירת אוויר של 5% CO 2 (לחות קבועה) באמצעות Modified Eagle's Medium (DMEM) של Dulbecco בתוספת 25 mM HEPES (pH7.2 ), 10% (v/v) סרום בקר עוברי (FBS) ותמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית של 1%.
- ברגע שיש מספיק תאים זמינים, בדרך כלל לאחר 7-10 ימים של תרבית, זרעו את התאים בבקבוקים שאינם מצופים קולגן בצפיפות של 30,000 תאים לס"מ2.
- בחר את גודל הבקבוק בהתאם למספר התאים הזמינים הדרושים לזריעת צלחות מרובות וול.
הערה: באופן כללי, צלוחיות T225 (225 ס"מ 2) פועלות בצורה הטובה ביותר לניסויים שבהם נעשה שימוש ב-11 צלחות מולטי-וול (6-well; 9.66 ס"מ2/well) (10 צלחות להשוואות דגימות, צלחת אחת לבקרת איכות) לכל בדיקה ביולוגית. - לגדל תאים צלוחיות במשך 7 ימים, לשנות את המדיום כל יומיים, ולהשתמש ביום השביעי עבור זריעת צלחות multiwell.
הערה: מומלץ להשתמש בטווח מעברים של לא יותר מ-10-15 מעברים מרגע תחילת השימוש בתאים מתרבית מלאי ולאחר מכן נעשה בהם שימוש בסדרת ניסויים. מעברי תרביות תאים צריכים להיות מוגבלים מכיוון שטווח רחב של מעברים יכול לגרום לשינויים אדפטיביים בקו התא, ובכך לשונות בתגובת המודל.
- תרבית תאים על צלחות מרובות
- זרעו את תאי Caco-2 בצפיפות של 50,000 תאים לס"מ2 בצלחות מצופות קולגן 6 היטב.
הערה: שלב זה בדרך כלל פועל בצורה הטובה ביותר אם נעשה ביום רביעי. הצעדים הבאים יבהירו מדוע יום זה בשבוע הוא אופטימלי. - לגדל את התאים במשך 12 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם אטמוספירת אוויר של 5% CO 2 (לחות קבועה) באמצעות DMEM בתוספת 25 mM HEPES (pH7.2 ), 10% (v/v) FBS ו-1% תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית.
הערה: גידול מונולרים של התאים למשך יותר מ-12 יום עלול לגרום לצמיחת יתר של התאים. מחקרים קודמים הראו בבירור כי בתנאים אלה, ב-12 יום לאחר הזריעה, החד-שכבתי של התא בשל, מחובר היטב לצלחת, ואופטימלי בעקביות התגובה 29,30,31. גידול התאים זמן רב יותר, כגון עד 19-21 יום, גורם לצמיחת יתר של התאים, והמדיה מתרוקנת במהירות בחומרים מזינים, וכתוצאה מכך מונולרים לא בריאים. - במהלך תקופת 12 הימים, שנה את המדיום לפחות כל יומיים בלוח זמנים יומי עקבי.
- ביום ה-12 שלאחר הזריעה, החלף את מדיום התרבית ב-2 מ"ל של מדיום חיוני מינימלי (MEM [pH 7]) בתוספת 10 mM PIPES (פיפרזין-N,N'-bis-[2-חומצה אתנוסולפונית]), תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית 1%, הידרוקורטיזון (4 מ"ג/ליטר), אינסולין (5 מ"ג/ליטר), סלניום (5 מיקרוגרם/ליטר), טריודותירונין (34 מיקרוגרם/ל') וגורם גדילה אפידרמלי (20 מיקרוגרם/ל').
הערה: אם הזריעה החלה ביום רביעי, אז היום ה- 12 יהיה יום שני. - ביום שלמחרת (כלומר, היום ה-13), הסר את ה-MEM והחלף אותו ב-1 מ"ל של MEM (pH 7).
הערה: שלב זה יתרחש ביום שלישי. זה היום שבו מתחילה הבדיקה הביולוגית; לפיכך, לוח הזמנים של 13 יום מניב את היתרון של לוח זמנים שבועי עקבי, המאפשר לבדיקה הביולוגית להתנהל באופן עקבי באותו יום חול.
- זרעו את תאי Caco-2 בצפיפות של 50,000 תאים לס"מ2 בצלחות מצופות קולגן 6 היטב.
4. עיכול במבחנה
- הכנת טבעות הכנסה
- צור טבעת החדרה מעוקרת באמצעות טבעת O מסיליקון המצוידת בקרום דיאליזה שטוף חומצה (איור 1A).
הערה: יש להכין את התוספות יום אחד מראש (כלומר, יום שני, היום ה-12) של יום הבדיקה הביולוגית ולאחסן במים בטמפרטורה של 18 MΩ בטמפרטורה של 4°C עד שהן מוכנות לשימוש. - ביום הבדיקה הביולוגית (יום שלישי, יום 13), יש להוציא את התוספות מהמקרר, לנקז ולהחליף את המים ב-0.5 M HCl. השאירו אותו בטמפרטורת החדר במכסה מנוע של זרימה למינרית למשך שעה אחת לפחות לפני השימוש.
הערה: יש לבצע שלב זה לפני הסרת ה-MEM מלוחות התרבית. שטיפת חומצה של הממברנה משמשת להסרת Fe מזהם אפשרי ומעקרת את טבעת ההכנסה ואת הממברנה. - מסננים את ה-0.5 M HCl מהתוספות ושוטפים במים סטריליים של 18 MΩ. יש לאחסן במים סטריליים של 18 MΩ בטמפרטורת החדר במכסה מנוע למינרי עד שיהיה מוכן לשימוש.
- הכנס טבעת לתוך כל באר של לוחות 6 באר עם תאים Caco-2, ובכך ליצור מערכת דו-תאית. החזירו את הלוחות עם התוספות לאינקובטור.
הערה: שלב זה צריך להיעשות רק לאחר הוספת 1.0 מ"ל טרי של MEM לכל באר (ראה שלב 3.2.5.).
- צור טבעת החדרה מעוקרת באמצעות טבעת O מסיליקון המצוידת בקרום דיאליזה שטוף חומצה (איור 1A).
- הכנת תמיסת פפסין
- ביום הניסוי, הכינו את תמיסת הפפסין על ידי המסת 0.145 גרם פפסין ב-50 מ"ל של 0.1 M HCl. נערו את התמיסה בעדינות על שייקר פלטפורמה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הכנת פתרון pancreatin-מרה
- באותו יום שבו נערך הניסוי, הכינו 0.1 M NaHCO 3 על ידי המסת 2.1 גרם של NaHCO3 ב-250 מ"ל של 18 MΩ מים.
- יש לערבב 0.35 גרם פנקריאטין ו-2.1 גרם של תמצית מרה ב-175 מ"ל של 0.1 M NaHCO3.
- לאחר שהלבלב ותמצית המרה עוברים סיכה, מוסיפים 87.5 גרם של שרף חילופי קטיונים חלש (ראו טבלת חומרים) ומערבבים על ידי ניעור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- יוצקים את הפסולת לתוך עמוד גדול ואוספים את ההשרה.
- Elute את הטור עם 70 מ"ל נוספים של 0.1 M NaHCO3, איסוף נפח זה לתוך תמיסת מרה pancreatin.
הערה: מטרת השרף היא להסיר את המזהם Fe המצוי בדרך כלל בתמציות הפנקראטין-מרה.
- ליזום עיכול במבחנה .
- שקול את הדגימה בצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל (פוליפרופילן), ולאחר מכן תוספת של 10 מ"ל של מלח פיזיולוגי ב- pH 2, המכיל 140 mM NaCl ו- 5 mM KCl.
- התחל את תהליך עיכול הקיבה על ידי הוספת 0.5 מ"ל של תמיסת פפסין חזיר מוכן לדגימה ודגירה על שייקר נדנדה בסביבה נמוכה ועדינה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר תקופה זו, התחל את תהליך העיכול במעיים של כל דגימה על ידי התאמת ה- pH ל 5.5-6.0 עם 1.0 M NaHCO3.
- הוסף 2.5 מ"ל של תמיסת הפנקראטין-מרה לכל צינור דגימה והתאם את ה- pH ל- 6.9-7.0 עם 1.0 M NaHCO3.
- לאחר התאמת ה- pH, השווה את הנפח בכל צינור באמצעות תמיסה של 140 mM NaCl, 5 mM KCl (pH 6.7), מדידת משקל הצינור עם ערך יעד של 15 גרם.
הערה: עבור מזונות מסוימים, ייתכן שיהיה צורך להביא את הנפח הכולל ל -16 גרם או 17 גרם, בהתאם ליכולת האגירה של המזונות. - מעבירים 1.5 מ"ל מכל עיכול מעיים לתוך החדר העליון (כלומר, המכיל את טבעת ההחדרה עם קרום הדיאליזה) של באר מקבילה של צלחת תרבית 6 בארות המכילה את תאי Caco-2 (איור 1B).
- יש להחליף את מכסה הצלחת ולדגור בטמפרטורה של 37°C (5% CO2 אוויר) על שייקר מתנדנד ב-6 תנודות/דקה למשך שעתיים.
- הסר את טבעת ההוספה עם העיכול והוסף 1 מ"ל נוספים של MEM (pH 7) לכל באר.
- החזירו את צלחת תרבית התאים לאינקובטור (37 מעלות צלזיוס; 5% CO2 אווירת אוויר) למשך 22 שעות נוספות.
- לאחר 22 שעות, הסר את מדיום תרבית התאים והוסף 2.0 מ"ל של 18 מים MΩ למונולייר התא.
הערה: המים יעברו באופן אוסמוטי לתאים באופן אוסמוטי. - קצור את כל התא ליזאט לצינורות מיקרוצנטריפוגה סטנדרטיים מפוליפרופילן או דומה לניתוחי חלבון התא ופריטין התא הבאים.
5. מדידת פריטין תאי Caco-2 וחלבון התא
- השתמש בליזאט התא משלב 4.4.10. למדידת פריטין תאים וחלבון.
- כדי למדוד את תכולת הפריטין של תאי Caco-2, עקוב אחר הוראות הערכה (ראה טבלת החומרים), למעט הגדלת זמן הדגירה מ-30 דקות לשעתיים עבור הצמדת נוגדן נגד פריטין נגד פריטין-חזרת פרוקסידאז (HRP) של העכבר.
- כדי למדוד את חלבון התא, בצע את ההוראות המצורפות בערכת חלבון התא (ראה טבלת חומרים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זיהוי ומדידה של זמינות ביולוגית של Fe בגידולי מזון בסיסיים
אחת הסיבות העיקריות לפיתוח מודל זה הייתה לזהות גורמים המשפיעים על הזמינות הביולוגית של Fe בגידולי מזון בסיסיים ולספק כלי למגדלי צמחים שיאפשר להם לזהות ולפתח זנים עם זמינות ביולוגית משופרת של Fe. השעועית המצויה (Phaseolus vulgaris) הותקפה ברחבי העולם כגידול לביופורטיפיקציה של Fe; לפיכך, המודל יושם בהרחבה כדי להעריך את האיכות התזונתית של Fe במגוון רחב של סוגי שוק שעועית ותוכניות גידול שעועית. לדוגמה, שעועית צהובה היא סוג שוק מתעורר בארצות הברית. באזורים כמו מזרח אפריקה, הם פופולריים מאוד וידועים בבישול מהיר ונחשבים על ידי רבים כ"קלים לעיכול". מחקרים אחרונים עם הביו-אסאי של תאי Caco-2 הראו שלזנים מסוימים של שעועית צהובה יכולה להיות זמינות ביולוגית גבוהה של Fe ביחס לסוגי צבע אחרים (איור 2). במחקר זה, זני המנטקה זוהו כבעלי זמינות ביולוגית גבוהה של Fe ביחס לבקרות ייחוס של מחלקות הצבעים הלבנים והאדומים. יתר על כן, התוצאות היו עקביות לאורך שתי שנות קציר רצופות. השוואות כאלה פשוט אינן ישימות במודלים אחרים, במיוחד בדגמי in vivo , בשל העלות הגבוהה והתפוקה הנמוכה בהרבה של ניסויים בבעלי חיים ובבני אדם.
הערכת ההשפעות של עיבוד מזון על הזמינות הביולוגית של Fe
ניתן ליישם את הביו-אסאי של תאי Caco-2 גם כדי להעריך את ההשפעות של עיבוד מזון על הזמינות הביולוגית של Fe. לדוגמה, התוצאות באיור 3 הן מניתוח של שעועית ופסטה על בסיס שעועית מסוגים שונים של צבעים. התוצאות מדגימות כיצד עיבוד הפולים לקמח הגדיל את הזמינות הביולוגית של Fe מזני שעועית לבנה (סנודון, אלפנה וסמוראי) וצהובה (Canario). עבור זני החמוציות (אטנה), כליות אדומות (נץ אדום) ושחור (זנית), הזמינות הביולוגית של Fe ירדה בתכשירי קמח הפסטה. ניתוחים קשורים הראו כי עיבוד הפולים לקמח שיבש את דפנות תאי הקוטילדון של השעועית, ובכך הפך את Fe התוך-תאי לנגיש לספיגה. ספיגת הברזל עלתה בפסטה של שעועית לבנה וצהובה, שכן ציפויי הזרעים של זנים אלה לא הכילו תרכובות פוליפנוליות המעכבות זמינות ביולוגית של Fe. לעומת זאת, ציפוי הזרעים של חמוציות, כליות אדומות ושעועית שחורה מכיל רמות גבוהות של פוליפנולים מעכבים, ובכך מפחית את ספיגת Fe. תוצאות אלה מצביעות בבירור על התועלת של המודל בחשיפת גורמים שיכולים להשפיע על האיכות התזונתית של Fe, שאחרת לא היו מתגלים.
איור 1: הכנס את מערך הטבעות עבור ספיגת Fe של תא Caco-2. (A) תמונה של תאי Caco-2 וטבעת הכנסה עם קרום דיאליזה מחובר. (B) דיאגרמה של ההליך הכולל לעיכול במבחנה בשילוב עם ספיגת Fe של תא Caco-2 בתוך באר אחת של צלחת מרובת בארות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: ציוני זמינות ביולוגית של ברזל של גנוטיפים של זרעים שלמים לא ספוגים ומבושלים בפאנל מגוון של שעועית צהובה. (א) שדה עונה 2015; (ב) עונת שדה 2016. ערכים הם אמצעים (סטיית תקן) של מדידות משולשות משני שכפולי שדה לכל גנוטיפ (n = 6). גנוטיפים מסווגים על ציר ה-x לפי שיעור בישול, המדורגים מהגנוטיפ בעל הבישול המהיר ביותר לערך הבישול האיטי ביותר. *ציון זמינות ברזל נמוך משמעותית (p < 0.05) בהשוואה לערכי YBP האחרים. **ציוני זמינות ביולוגית של ברזל גבוהים משמעותית (p < 0.05) בהשוואה לגנוטיפים האחרים של YBP. נתון זה שונהמ-32. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: זמינות ביולוגית של ברזל המתבטאת ביצירת פריטין תאי Caco-2 (ננוגרם של פריטין למיליגרם של חלבון התא) של זני שעועית וספגטי על בסיס שעועית מתאימה. (A) שלושה זני שעועית לבנה וספגטי על בסיס שעועית מתאימה; (B) ארבעה זני שעועית צבעונית וספגטי על בסיס שעועית מתאימה. ערכים הם האמצעי (± סטיית תקן) של שש מדידות מכל זן. הקו הממוקף הכחול מציין את הזמינות הביולוגית של ברזל של פסטה מחיטה דורום שאינה מועשרת, מובלטת ומעובדת באותו אופן כמו ספגטי על בסיס שעועית. *ייצור פריטין תאי Caco-2 גבוה משמעותית (p ≤ 0.05) בהשוואה לפולים שלמים לאחר הבישול. **ירידה משמעותית (p ≤ 0.05) בתצורת פריטין של תאי Caco-2 בהשוואה לשעועית שלמה לאחר הבישול. נתון זה שונהמ-33. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאז הקמתה, פורסמו מחקרים רבים המתארים שיטה זו עבור bioassay תא Caco-2. התנאים הבסיסיים נותרו יחסית ללא שינוי מאז הפרסום הראשוני בשנת1998 18. עם זאת, במהלך 20 השנים האחרונות, פרטים טכניים רבים שוכללו וסטנדרטיים כדי להניב עקביות חסרת תקדים בתגובה של bioassay. היצמדות זהירה ומדויקת לתרבית התאים ולתנאי העיכול במבחנה הם המפתח לתגובה עקבית ורגישה של הבדיקה הביולוגית.
מניסיוננו באימון אנשים רבים בשימוש בשיטה זו, המאבק הנפוץ ביותר הוא התרבית הנכונה של תאי Caco-2. תרבית עקבית של מונו-שכבות בריאות היא המפתח למונו-שכבות של תאי Caco-2 בריאים ומגיבים. אם רמות החלבון בתאים אינן עקביות מאוד מבאר לבאר ואינן בטווח של חלבון התא המופיע בפרוטוקול, על החוקר לבחון מחדש את תנאי תרביות התאים לסטייה מהפרוטוקול. לחלופין, ייתכן שקיים זיהום מיקרואורגניזמים ברמה נמוכה, ייתכן שחממת תרביות התאים לא תפעל כראוי, או שמדיום תרבית התאים לא ינוסח כראוי.
תהליך העיכול במבחנה הוא מקור נוסף לבעיות פוטנציאליות. סילוק Fe מזהם מאנזימי העיכול הוא קריטי. למרות טענות היצרן, זה נבון לבדוק מעת לעת את ריכוז Fe של האנזימים ולוודא כי תהליך הסרת Fe (ראה פרוטוקול) הוא יעיל. אם קיים זיהום Fe באנזימי העיכול, בקרת איכות העיכול הבסיסית תניב ערכי פריטין בתאים מעבר לטווח המומלץ.
חוקר מנוסה ומיומן אמור להיות מסוגל לנתח 20 דגימות ניסיוניות, בתוספת בקרות האיכות, בריצה אחת של הבדיקה הביולוגית. לפיכך, יש צורך בכ-12 לוחות בעלי שש בארות עבור כל ריצה של הבדיקה הביולוגית. מספר גבוה יותר של דגימות לכל בדיקה ביולוגית אינו מומלץ מכיוון שהתזמון של טיטרציית pH במהלך תהליך העיכול יכול להיות ארוך מדי, מה שמוביל לחוסר עקביות פוטנציאלי בין זמני העיכול של הדגימה.
החסרונות של מודל זה הם מעטים יחסית. זה דורש חוקרים מיומנים מאוד בתרבית תאים ומסוגלים לתשומת לב מדויקת לפרטים ולפרוטוקול. חלל המעבדה חייב להיות נקי ממקורות של זיהום Fe, וריאגנטים וחומרים אחרים צריכים להיות מנוטרים באופן שגרתי עבור זיהום Fe. לפיכך, למשתמש צריכה להיות היכולת או הגישה למכשור למדידת ריכוז Fe. מודל זה הוא רק מדד יחסי או כמותי למחצה. עם זאת, עם שימוש נכון בבקרות ייחוס, המודל יכול לספק כמה הערכות כמותיות של קליטת Fe. ואכן, משוואת המרה של יחסי קליטה של בקרה לעומת חומר בדיקה נוצרה19.
הבדיקה הביולוגית פועלת על פי העיקרון הבא: תאי Caco-2 מייצרים יותר חלבון פריטין בתגובה לעלייה בריכוזי Fe בתאים. לכן, הזמינות הביולוגית של Fe פרופורציונלית לעלייה בייצור פריטין תאי Caco-2. עלייה זו מתבטאת ביחס של פריטין תאי לסך חלבון התא Caco-2 (ננוגרם של פריטין למיליגרם של חלבון התא הכולל) לאחר חשיפה לדגימה מעוכלת19. מדידות פריטין נעשות באמצעות ערכת ELISA (ראו טבלת חומרים) שנבדקה לתגובה בבדיקה ביולוגית זו. ריכוזי החלבון הכוללים בתאים מכמתים באמצעות ערכת בדיקת חלבונים. כאמור, בתנאים המשמשים לשיטה זו, רמות החלבון האופייניות של תאי Caco-2 בצלחת של שש בארות נעות בין 2.0 מ"ג ל-2.6 מ"ג חלבון תאי לכל באר. ערכים מחוץ לטווח זה מצביעים על תרביות תאים לא בריאות, צמיחת יתר אפשרית של תאים או טכניקת זריעת תאים לקויה. בתוך ריצה נתונה של bioassay, ערכים צריכים להשתנות רק עד 0.2 מ"ג לכל באר. יתר על כן, תחת צפיפות הזריעה ותנאי התרבית המשמשים במתודולוגיה זו, קיימת פעילות משמעותית של אנזים גבול המברשת ב-13 יום לאחר הזריעה, מה שמעיד על התבגרות של רוב, אם לא כל, החד-שכבתי של התא28,29,30. עקוב אחר מונו-שכבות של תאים לאורך 13 הימים שלפני השימוש לצורך זיהום או עקה, כגון היווצרות vacuole או פערים בהיווצרות חד-שכבתית. אם תנאים כאלה ניכרים, התאים לא צריכים להיחשב תקפים לשימוש ב bioassay.
כדי לנטר את התגובה של בדיקת הביו-אסאי Caco-2, כל ניסוי צריך להיות מופעל עם מספר בקרות איכות, כולל תקציר ריק, המכיל רק את תמיסת המלח המאוזנת מבחינה פיזיולוגית ואת אנזימי מערכת העיכול. בקרות אלה מבטיחות כי אין זיהום Fe ב bioassay. ערכי פריטין של תאי Caco-2 החשופים לעיכול הריק נעים בדרך כלל בין 1 ננוגרם ל-6 ננוגרם של חלבון תא פריטין/מ"ג. פריטין בסיסי בטווח זה מצביע גם על כך שהתאים נמצאים במצב Fe נמוך יחסית, ולכן אמורים להפגין רגישות מרבית ל-Fe זמין.
במשך 15 שנות השימוש הראשונות, בקרות איכות נוספות כללו 1) תקציר ריק עם FeCl 3 (66 μM) ו-2) תקציר ריק של FeCl 3 (66 μM) בתוספת תוספת של1.3 mM חומצה אסקורבית. ערכי פריטין לעיכול FeCl 3 היו בדרך כלל בטווח של 30-50 ננוגרם של חלבון תא פריטין/מ"ג, ותקציר FeCl3 עם חומצה אסקורבית היה בטווח של 250-400 ננוגרם של חלבון תא פריטין/מ"ג. בשנים האחרונות, התקציר הריק נותר בקרת איכות; עם זאת, עברנו לשימוש בדגימת מזון עם ובלי חומצה אסקורבית ביחס של 20:1, אסקורבט:Fe. דגימת המזון בה נעשה שימוש הייתה קמח שעועית לבנה המכיל כ-65 מיקרוגרם Fe/g של דגימה. בקרות איכות אלה נותנות טווח תגובה צר ועקבי יותר, המניב 20-30 ננוגרם של פריטין/מ"ג חלבון התא עבור קמח השעועית הלבנה ו-70-150 ננוגרם של פריטין/מ"ג של חלבון התא עבור קמח השעועית הלבנה בתוספת אסקורבט. יש לציין כי טווח הערכים החדש הוא מהערכה המוזכרת בטבלת החומרים, אשר נוטה להיות מעט נמוכה יותר מאשר ערכת Ramco ELISA המופקת כעת. נכון לפרסום כתב יד זה, רק 2-3 חודשים של נתונים נרכשו עם הערכה המוזכרת.
חשוב לזהות את התוצאות ואת תנאי תרבית התאים המעידים על ריצה לא חוקית או לא אופטימלית של הבדיקה הביולוגית. ראשית, כפי שצוין בשיטות, אם תנאי העיכול הריקים מניבים ריכוזי פריטין בתאים גבוהים מהטווח המוצע, הדבר עשוי להעיד על זיהום Fe של מדיית תרבית התאים, אנזימי העיכול או קרום הדיאליזה. ריכוזי Fe מקובלים עבור מדיית תרבית התאים ואנזימי העיכול הם <20 מיקרוגרם Fe/mL. ערכים מחוץ לטווח עבור בקרות האיכות האחרות, במיוחד אם הם בצד הנמוך, מצביעים גם הם על כך שתקפות התוצאות מוטלת בספק.
לסיכום, מודל זה רגיש מאוד ל-Fe הזמין ביולוגית, שכן תנאי תרבית התאים נועדו ליצור תאים בעלי מעמד Fe נמוך; לפיכך, המנגנונים שלהם לספיגת Fe מוסדרים מאוד. זהו מודל חזק המסוגל לתפוקה גבוהה. כל מזון או דיאטה שניתן להאכיל לבני אדם ניתן להעריך במודל זה, ולכן, bioassay יש מגוון רחב של יישומים. מגדלי צמחים יכולים להשתמש במודל זה כדי למדוד את הזמינות הביולוגית של Fe במזונות בסיסיים, ולזהות תכונות ואזורים כרומוזומליים המשפיעים על הזמינות הביולוגית של Fe. מדעני מזון יכולים ליישם את המודל כדי לקבוע פורמולציות אופטימליות ולהעריך את ההשפעות של עיבוד כדי להבטיח זמינות ביולוגית מספקת של Fe. תזונאים יכולים להשתמש במודל כדי להעריך ולנטר זמינות ביולוגית של Fe תזונתיים ממזונות בודדים, שילובי מזון ואפילו תוכניות דיאטה. הוא אומת ביסודיות לניסויים בבני אדם, וחזה נכונה את כיוון וגודל ההשפעות בכל יישום. לפיכך, על ידי שילוב של עיכול מדומה עם ספיגת Fe של תאי אפיתל במעיים, מודל זה מייצג את הצעד הראשון הקריטי בתהליך ספיגת Fe ולכן הוא מסוגל לחזות את האספקה או הזמינות הביולוגית של Fe ממזונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחבר אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
המחבר אסיר תודה על המאמצים הטכניים של יונגפיי צ'אנג ומרי בודיס. היישום המוצלח ביותר של מודל זה בתחום התזונה הוא תוצאה ישירה של מומחיותם ותשומת הלב לפרטים הקטנים. פיתוח מודל זה מומן כולו על ידי משרד החקלאות של ארצות הברית, שירות המחקר החקלאי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
References
- Fairweather-Tait, S. J., Dainty, J. Use of stable isotopes to assess the bioavailability of trace elements: a review. Food Additives Contaminants. 19 (10), 939-947 (2002).
- Hadley, K. B., Johnson, L. K., Hunt, J. R. Iron absorption by healthy women is not associated with either serum or urinary prohepcidin. American Journal of Clinical Nutrition. 84 (1), 150-155 (2006).
- Glahn, R. P., Cheng, Z., Giri, S. Extrinsic labeling of staple food crops with isotopic iron does not consistently result in full equilibration: revisiting the methodology. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9621-9628 (2015).
- Consaul, J. R., Lee, K. Extrinsic tagging in iron bioavailability research: a critical review. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 31 (4), 684-689 (1983).
- Jin, F., Cheng, Z., Rutzke, M. A., Welch, R. M., Glahn, R. P. Extrinsic labeling method may not accurately measure Fe absorption from cooked pinto beans (Phaseolus vulgaris): comparison of extrinsic and intrinsic labeling of beans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (16), 6881-6885 (2008).
- Junqueira-Franco, M. V. M., et al. Iron absorption from beans with different contents of iron, evaluated by stable isotopes. Clinical Nutrition ESPEN. 25, 121-125 (2018).
- Petry, N., Egli, I., Zeder, C., Walczyk, T., Hurrell, R. Polyphenols and phytic acid contribute to the low iron bioavailability from common beans in young women. Journal of Nutrition. 140 (11), 1977-1982 (2010).
- Petry, N., et al. Stable iron isotope studies in Rwandese women indicate that the common bean has limited potential as a vehicle for iron biofortification. Journal of Nutrition. 142 (3), 492-497 (2012).
- Petry, N., Egli, I., Campion, B., Nielsen, E., Hurrell, R. Genetic reduction of phytate in common bean (Phaseolus vulgaris L.) seeds increases iron absorption in young women. Journal of Nutrition. 143 (8), 1219-1224 (2013).
- Petry, N., et al. Phytic acid concentration influences iron bioavailability from biofortified beans in Rwandese women with low iron status. Journal of Nutrition. 144 (11), 1681-1687 (2014).
- Petry, N., Boy, E., Wirth, J. P., Hurrell, R. F. Review: The potential of the common bean (Phaseolus vulgaris) as a vehicle for iron biofortification. Nutrients. 7 (2), 1144-1173 (2015).
- Petry, N., et al. In Rwandese women with low iron status, iron absorption from low-phytic acid beans and biofortified beans is comparable, but low-phytic acid beans cause adverse gastrointestinal symptoms. Journal of Nutrition. 146 (5), 970-975 (2016).
- Donangelo, C. M., et al. Iron and zinc absorption from two bean (Phaseolus vulgaris L.) genotypes in young women. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (17), 5137-5143 (2003).
- Dellavalle, D. M., Glahn, R. P., Shaff, J. E., O'Brien, K. O. Iron absorption from an intrinsically labeled lentil meal is low but upregulated in women with poor iron status. Journal of Nutrition. 145 (10), 2253-2257 (2015).
- Miller, D. D., Schricker, B. R., Rasmussen, R. R., Van Campen, D. An in vitro method for estimation of iron availability from meals. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (10), 2248-2256 (1981).
- Glahn, R. P., Wien, E. M., Van Campen, D. R., Miller, D. D. Caco-2 cell iron uptake from meat and casein digests parallels in vivo studies: use of a novel in vitro method for rapid estimation of iron bioavailability. Journal of Nutrition. 126 (1), 332-339 (1996).
- Martini, L. A., Tchack, L., Wood, R. J. Iron treatment downregulates DMT1 and IREG1 mRNA expression in Caco-2 cells. Journal of Nutrition. 132 (4), 693-696 (2002).
- Glahn, R. P., Wortley, G. M., South, P. K., Miller, D. D. Inhibition of iron uptake by phytic acid, tannic acid, and ZnCl2: studies using an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (2), 390-395 (2002).
- Glahn, R. P., Lee, O. A., Yeung, A., Goldman, M. I., Miller, D. D. Caco-2 cell ferritin formation predicts nonradiolabeled food iron availability in an in vitro digestion/Caco-2 cell culture model. Journal of Nutrition. 128 (9), 1555-1561 (1998).
- Yun, S., Habicht, J. P., Miller, D. D., Glahn, R. P. An in vitro digestion/Caco-2 cell culture system accurately predicts the effects of ascorbic acid and polyphenolic compounds on iron bioavailability in humans. Journal of Nutrition. 134 (10), 2717-2721 (2004).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Homogenization, lyophilization or acid-extraction of meat products improves iron uptake from cereal-meat product combinations in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. British Journal of Nutrition. 101 (6), 816-821 (2009).
- Tako, E., Bar, H., Glahn, R. P. The combined application of the Caco-2 cell bioassay coupled with in vivo (Gallus gallus) feeding trial represents an effective approach to predicting Fe bioavailability in humans. Nutrients. 8 (11), 732-757 (2016).
- Engle-Stone, R., Yeung, A., Welch, R., Glahn, R. Meat and ascorbic acid can promote Fe availability from Fe-phytate but not from Fe-tannic acid complexes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (26), 10276-10284 (2005).
- Tako, E., Blair, M. W., Glahn, R. P. Biofortified red mottled beans (Phaseolus vulgaris L.) in a maize and bean diet provide more bioavailable iron than standard red mottled beans: studies in poultry (Gallus gallus) and an in vitro digestion/Caco-2 model. Nutrition Journal. 10, 113 (2011).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Chicken thigh, chicken liver, and iron-fortified wheat flour increase iron uptake in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Nutrition Research. 28 (12), 851-858 (2008).
- Beasley, J. T., et al. Metabolic engineering of bread wheat improves grain iron concentration and bioavailability. Plant Biotechnology Journal. 17 (8), 1514-1526 (2019).
- Zhu, L., Glahn, R. P., Nelson, D., Miller, D. D. Comparing soluble ferric pyrophosphate to common iron salts and chelates as sources of bioavailable iron in a Caco-2 cell culture model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 5014-5019 (2009).
- Wortley, G., Leusner, S., Good, C., Gugger, E., Glahn, R. Iron availability of a fortified processed wheat cereal: a comparison of fourteen iron forms using an in vitro digestion/human colonic adenocarcinoma (Caco-2) cell model. British Journal of Nutrition. 93 (1), 65-71 (2005).
- Jumarie, C., Malo, C. Alkaline phosphatase and peptidase activities in Caco-2 cells: differential response to triiodothyronine. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 30 (11), 753-760 (1994).
- Engle, M. J., Goetz, G. S., Alpers, D. H. Caco-2 cells express a combination of colonocyte and enterocyte phenotypes. Journal of Cellular Physiology. 174 (3), 362-369 (1998).
- Ferruzza, S., Rossi, C., Sambuy, Y., Scarino, M. L. Serum-reduced and serum-free media for differentiation of Caco-2 cells. Alternatives to Animal Experimentation. 30 (2), 159-168 (2013).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Tako, E., Glahn, R. P. The fast cooking and enhanced iron bioavailability properties of the Manteca yellow bean (Phaseolus vulgaris L). Nutrients. 10 (11), 1609 (2018).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Hooper, S. D., Hart, J. J., Glahn, R. P. Processing white or yellow dry beans (Phaseolus vulgaris L.) into a heat treated flour enhances the iron bioavailability of bean-based pastas. Journal of Functional Foods. 71, 104018 (2020).
