Summary
نقدم هنا بروتوكولا لقياس عدد نسخ الحمض النووي المطلق للميتوكوندريا (mt) ومستويات حذف mtDNA غير المتجانسة في الخلايا المفردة.
Abstract
الحمض النووي للميتوكوندريا الثديية (mt) هو جزيء حمض نووي صغير ، دائري ، مزدوج الخيوط ، داخل الميتوكوندريا ، يقوم بترميز 13 وحدة فرعية من سلسلة نقل الإلكترون. على عكس الجينوم النووي ثنائي الصبغيات ، تحتوي معظم الخلايا على العديد من النسخ الأخرى من mtDNA ، والتي تتراوح من أقل من 100 إلى أكثر من 200000 نسخة اعتمادا على نوع الخلية. يستخدم رقم نسخة MtDNA بشكل متزايد كعلامة حيوية لعدد من الحالات والأمراض التنكسية المرتبطة بالعمر ، وبالتالي ، أصبح القياس الدقيق لرقم نسخة mtDNA أداة رئيسية في كل من إعدادات البحث والتشخيص. يمكن أن توجد الطفرات في mtDNA ، والتي غالبا ما تحدث على شكل تعدد أشكال نيوكليوتيدات مفردة (SNPs) أو عمليات حذف ، إما في جميع نسخ mtDNA داخل الخلية (تسمى homoplasmy) أو كمزيج من نسخ mtDNA المتحورة و WT (تسمى heteroplasmy). تعد طفرات mtDNA غير المتجانسة سببا رئيسيا لأمراض الميتوكوندريا السريرية ، إما في الأمراض النادرة أو في عدد متزايد من الأمراض الشائعة المتأخرة الظهور مثل مرض باركنسون. يعد تحديد مستوى البلازما غير المتجانسة الموجودة في الخلايا خطوة حاسمة في تشخيص أمراض الميتوكوندريا النادرة وفي الأبحاث التي تهدف إلى فهم الاضطرابات الشائعة في وقت متأخر حيث قد تلعب الميتوكوندريا دورا. تم قياس عدد نسخ MtDNA والبلازما المتغايرة تقليديا عن طريق الفحوصات الكمية (q) القائمة على PCR أو التسلسل العميق. ومع ذلك ، فإن إدخال تقنية ddPCR مؤخرا قد وفر طريقة بديلة لقياس كلا المعلمتين. يوفر العديد من المزايا على الطرق الحالية ، بما في ذلك القدرة على قياس عدد نسخ mtDNA المطلق والحساسية الكافية لإجراء قياسات دقيقة من الخلايا المفردة حتى في أعداد النسخ المنخفضة. يظهر هنا بروتوكول مفصل يصف قياس عدد نسخ mtDNA في الخلايا المفردة باستخدام ddPCR ، ويشار إليه باسم PCR لتوليد القطيرات من الآن فصاعدا ، مع خيار القياس المتزامن للبلازما غير المتجانسة في الخلايا مع حذف mtDNA. كما نوقشت إمكانية توسيع هذه الطريقة لقياس التباين في الخلايا مع mtDNA SNPs.
Introduction
الحمض النووي للميتوكوندريا الثديية (mt) هو جينوم صغير (حوالي 16.5 كيلو بايت) ، وجينوم الحمض النووي الدائري الموجود في مصفوفة الميتوكوندريا التي تشفر 37 جينا ، بما في ذلك اثنين من الحمض النووي الريبي الريبي ، و 22 tRNAs ، و 13 جينا مشفرا للبروتين1. على عكس الجينوم النووي ، الذي يحتوي على نسخة واحدة (فردية) أو نسختين (ثنائي الصبغيات) من كل جين لكل خلية ، فإن mtDNA موجود في نسخ متعددة في الميتوكوندريا لكل خلية ، تتراوح من عشرات النسخ (على سبيل المثال ، الخلايا المنوية الناضجة) إلى مئات الآلاف من النسخ (على سبيل المثال ، البويضات) 2,3. نتيجة لهذه الطبيعة متعددة النسخ هي أن الطفرات في جينوم mtDNA ، والتي قد توجد على شكل تعدد أشكال أحادية النوكليوتيد (SNPs) ، أو الحذف ، أو الازدواجية ، يمكن أن تكون موجودة بمستويات متفاوتة في أي خلية معينة ، وتشكل في أي مكان من 0٪ إلى 100٪ من إجمالي عدد mtDNA في الخلية. يطلق على وجود جينومات mtDNA من النوع البري والمتحور في نفس الخلية اسم heteroplasmy ، وتعد طفرات mtDNA غير المتجانسة المسببة للأمراض سببا رئيسيا لمرض الميتوكوندريا ، مع العديد من المتلازمات العصبية الشائعة المرتبطة بطفرات mtDNA غير المتجانسة الكامنة4.
اثنين من المعلمات الرئيسية التي تسهم في احتمال حدوث طفرة mtDNA غير متجانسة تسبب المرض السريري هي مستوى heteroplasmy ورقم نسخة mtDNA. تظهر العديد من الطفرات غير المتجانسة تأثير عتبة ، حيث تصبح الأنماط الظاهرية الكيميائية الحيوية والسريرية واضحة فقط فوق مستوى معين من البلازما غير المتجانسة ، وعادة ما تكون حوالي 80٪ 5 ، وبالتالي تزداد سوءا مع زيادة التباين4. ومع ذلك ، من المهم أيضا النظر في عدد نسخ mtDNA الموجودة في الخلية ، لأن هذا سيؤثر على عدد جينومات mtDNA من النوع البري (أي "الصحي") الموجودة على مستوى معين من التباين في الجينوميا. وقد أبرزت الدراسات التي أجريت على مرضى مرض الميتوكوندريا أهمية هذا التفاعل بين الغيرية ورقم النسخة 5,6 ، وأبلغ Filograna et al. مؤخرا عن زيادة في عدد نسخ mtDNA لتخفيف الأعراض على الرغم من عدم تغيير التباين في نموذج الفئران لمرض الميتوكوندريا7.
في حين تم عمل الكثير في السنوات الأخيرة لتحسين فهم التسبب في الأمراض وانتقالها الناجم عن mtDNA heteroplasmy ، فقد تم إجراء معظم هذا العمل على مستوى الأنسجة بدلا من الخلايا ، ومقارنة متوسط مستويات الأنسجة غير المتجانسة وقياسات عدد النسخ المكتسبة من خزعات الأنسجة السائبة وعينات الدم. تسمح بعض التقنيات الراسخة ، مثل التشريح المجهري لالتقاط الليزر ، بمثل هذه القياسات على المستوى الخلوي 8,9 ؛ ومع ذلك ، فإن الانفجار الأخير لطرق تحليل الخلية الواحدة عالية الإنتاجية ، أو ما يسمى ب "Omics أحادية الخلية"10 ، قد خلق متطلبات للطرق التي يمكنها قياس معلمات mtDNA الحاسمة هذه بدقة على مستوى الخلية الواحدة.
تستفيد طريقة PCR لتوليد القطيرات من التطورات الحديثة في تكنولوجيا الموائع الدقيقة لتحسين الطرق الحالية لقياس تركيزات الحمض النووي غير المعروفة عن طريق تضخيم PCR للأمبليونات المستهدفة المحددة في عينة الحمض النووي11. على عكس qPCR ، حيث يتم تضخيم الحمض النووي للعينة في تفاعل واحد ، مع المعدل النسبي لتراكم منتج PCR بمثابة القراءة ، تقسم هذه الطريقة العينة الأولية إلى آلاف القطرات الفردية ، وبالتالي تقسيم جزيئات الحمض النووي للعينة إلى تفاعلات منفصلة مكانيا12. يستمر تفاعل PCR اللاحق في كل قطرة فردية ، حيث يتراكم منتج PCR فقط في قطرات تحتوي على الحمض النووي المستهدف. نتيجة هذا التفاعل هي إخراج رقمي في شكل مجموعة من القطرات التي تحتوي إما على نسخة من الحمض النووي المستهدف ومنتج PCR المضخم ، أو لا تحتوي على الحمض النووي المستهدف. باستخدام مجسات الحمض النووي الفلورية أو صبغة ربط الحمض النووي المزدوجة (ds) ، يمكن حساب القطرات التي تحتوي على منتج مضخم ، ويمكن استخدام نسبة القطرات "الإيجابية" إلى "السلبية" لحساب العدد المطلق لنسخ الحمض النووي التي كانت موجودة في العينة الأولية. هذا القياس المطلق ، على عكس القياس النسبي المكتسب من تفاعل qPCR ، هو العامل الرئيسي الذي يسمح باستخدام هذه المنهجية للقياس الدقيق لعدد نسخ mtDNA والبلازما المتغايرة في الخلايا المفردة11 ، وقد استخدمت العديد من الدراسات الحديثة بالفعل تقنية PCR لتوليد القطيرات لهذا الغرض13,14 . تقدم هذه المقالة طريقة لقياس عدد نسخ mtDNA وحذف heteroplasmy في خلايا مفردة من كل من أنسجة الإنسان والفأر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
اتبعت جميع التجارب إرشادات REACH وتمت الموافقة عليها من قبل هيئة المراجعة الأخلاقية لرعاية الحيوان بجامعة كامبريدج (AWERB).
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع خطوات تحضير العينات قبل توليد القطيرات في منطقة عمل نظيفة قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، من الناحية المثالية في خزانة معقمة بالأشعة فوق البنفسجية حيثما أمكن ذلك. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا معدات PCR محددة لتوليد القطرات (انظر جدول المواد) ، وبينما يجب أن تكون الطريقة العامة قابلة للتطبيق على الأنظمة الأخرى ، فمن المستحسن الرجوع إلى إرشادات الشركة المصنعة فيما يتعلق بتركيزات التمهيدي / المسبار ، وظروف ركوب الدراجات PCR ، وما إلى ذلك ، لأنها قد تختلف عن تلك الموضحة هنا. كانت خطوط الخلايا / الخلايا الأولية المستخدمة في هذه الدراسة على النحو التالي: خلايا HeLa البشرية (التي تم الحصول عليها تجاريا) ، خلايا HEK 293T البشرية (التي تم الحصول عليها تجاريا) ، الخلايا الليفية الجلدية البشرية الأولية (التي تم الحصول عليها من نيوكاسل Biobank) ، cybrids البشرية (WT & ΔH2.1 حذف15 ، التي تم الحصول عليها من C. Moraes ، جامعة ميامي) ، الخلايا الليفية الجنينية الفئران (خلدت ، من الفئران C57Bl / 6 ، التي تم الحصول عليها من J. Stewart ، جامعة نيوكاسل) ، والخلايا الجرثومية البدائية للفئران (التي تم الحصول عليها من أجنة الفئران C57Bl / 6) ، وبويضات MII للفئران (التي تم الحصول عليها من الإناث البالغة C57Bl / 6 الفئران). تم الحفاظ على جميع الخلايا المستزرعة في DMEM عالي الجلوكوز (4.5g / L) مع استكمال 10٪ مصل البقر الجنيني عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. تم عزل خلايا الفئران الأولية المستخدمة في هذه الدراسة من الحيوانات التي تم الاحتفاظ بها وفقا لقانون الحيوان (الإجراءات العلمية) لعام 1986 بموجب ترخيص مشروع وزارة الداخلية P6C97520A.
1. تصميم وتوليف مجموعات التمهيدي والتحقيق التي تستهدف تسلسل الحمض النووي ذات الأهمية
ملاحظة: يمكن أيضا إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لتوليد القطيرات باستخدام صبغة ربط dsDNA بدلا من المجسات الخاصة بالأمبليكون.
- صمم تسلسلات التمهيدي والمسبار وفقا للإرشادات المقدمة من الشركة المصنعة للنظام. ويرد في الجدول 1 تسلسلات تمهيدية ومسبار تم التحقق من صحتها ومناسبة لقياس عدد نسخ الحمض النووي MTDNA أحادي الخلية / حذف heteroplasmy في كل من الخلايا البشرية16,17 والفأر 18. عند اختيار تسلسلات مستهدفة بديلة، ضع في اعتبارك النقاط التالية.
- قم بتعدد مجموعتين من التمهيدي / المسبار في فحص PCR واحد ولكن تأكد من أن الفحصين يستخدمان مسبارا واحدا يحمل علامة FAM ومسبارا واحدا يحمل علامة HEX بحيث يمكن تمييز الأمبليكونات المستهدفة بواسطة قارئ القطرات. يقدم هذا البروتوكول فحصا للمسبار على الوجهين. مع التصميم التجريبي الدقيق ، يمكن زيادة تعدد الإرسال حتى أربعة أهداف ، ويمكن للمنصات البديلة تحقيق تعدد الإرسال عالي الأبعاد.
- عند تعدد مجموعات التمهيدي / المسبار التي تستهدف تسلسلات mtDNA منفصلة ، تأكد من عدم تداخل الأمبليكونات الناتجة عن مجموعتي التمهيدي.
- عند قياس التباين في العينات التي تحمل عمليات حذف mtDNA ، تأكد من أن أحد الأمبليكون المستهدف يقع ضمن المنطقة المحذوفة المتوقعة والآخر يقع خارج المنطقة المحذوفة المتوقعة.
ملاحظة: قد تختلف الظروف المثلى لركوب الدراجات PCR للمقايسات البديلة عن تلك المذكورة في الخطوة 5.1 ؛ راجع المناقشة للحصول على مزيد من التفاصيل حول تحسين المقايسة.
2. عزل الحمض النووي عن الخلايا المفردة
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للعينات السائبة الصغيرة التي تصل إلى 100 خلية.
- جمع الخلايا المفردة باستخدام طريقة مناسبة، مثل فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS)19 أو التشريح المجهري لالتقاط الليزر20، بأقل حجم ممكن في وعاء مناسب (على سبيل المثال، لوحة 96 بئرا). إن استخدام صبغة صلاحية الخلية قبل أو أثناء عزل الخلية الواحدة سيقلل من احتمال عزل الخلايا الميتة. فرز الخلايا المفردة مباشرة في مخزن مؤقت للتحلل إذا رغبت في ذلك وتخزينها عند -80 درجة مئوية (حتى 6 أشهر) قبل التحليل.
- قم بتحليل الخلايا في حجم صغير (<10 ميكرولتر) من مخزن مؤقت مناسب للتحلل (يتم وصف المخزن المؤقت المستخدم في هذه الدراسة في الخطوة 2.2.1).
ملاحظة: جميع البيانات التي تم الحصول عليها من الخلايا في هذه الدراسة هي من محللات أحادية الخلية أو تجمعات من 20 خلية (أحجام العينات منصوص عليها في الأساطير الشكلية). يمكن أن يتأثر التكوين الفعال لمستحلب الزيت / القطرة أثناء خطوة توليد القطيرات لبروتوكول PCR لتوليد القطيرات بشكل كبير بوجود المنظفات في العينة ؛ لذلك ، يوصى بالتحقق من توافق جميع المخازن المؤقتة لتحلل الخلايا مع توليد القطيرات عند تركيز المدخلات المقصود قبل الشروع في العينات التجريبية واستخدام أصغر حجم عملي من مخزن التحلل المؤقت. ينتج عن بروتوكول التحلل التالي تأثير ضئيل على كفاءة توليد القطيرات.- قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل الذي يحتوي على 50 mM Tris-HCl pH 8.3 و 1٪ TWEEN-20 و 200 ميكروغرام / مل Proteinase K.
- أضف 2.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى كل عينة، وأغلق اللوحة بختم لوحة لاصقة، ثم قم بالطرد المركزي للعينات عند 1000 × g لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية.
- احتضن العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على جهاز التدوير الحراري مع ضبط الغطاء الساخن على 105 درجة مئوية لمنع تكثيف السائل على غطاء اللوحة.
- أضف 7.5 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز إلى كل عينة للحصول على حجم عينة نهائي قدره 10 ميكرولتر ، وأعد إغلاق اللوحة ، ثم قم بالطرد المركزي للعينات عند 1000 × g لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية.
- احتضن على جهاز التدوير الحراري عند 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (تم ضبط الغطاء المسخن على 105 درجة مئوية) لتعطيل Proteinase K.
- قم بالطرد المركزي للعينات عند 1000 × g لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية ثم احتفظ بها على الجليد.
- انتقل إلى الخطوة 3 أدناه.
ملاحظة: يمكن تخزين محللات الخلايا عند -20 درجة مئوية قبل المتابعة في الخطوة 3 ؛ ومع ذلك ، استخدم الحمض النووي الطازج حيثما أمكن للقضاء على خطر دورات التجميد والذوبان مما يؤدي إلى تدهور الحمض النووي.
3. إعداد العينات
ملاحظة: تأكد من تضمين النسخ المتماثلة الفنية للعينات وعناصر التحكم غير النموذجية (NTCs) في كل لوحة فحص لضمان دقة النتائج. النطاق الديناميكي لفحص PCR لجيل القطيرات يصل إلى 120000 نسخة من الأمبليكون المستهدف لكل تفاعل. بالنسبة لعينات الخلية الواحدة أو الخلايا السائبة الصغيرة ، من غير المرجح أن يكون التخفيف ضروريا ، ويمكن إدخال خليط الليزات مباشرة إلى التفاعل لقياس رقم نسخة mtDNA (على سبيل المثال ، يمكن تقسيم عينة محللات من 10 ميكرولتر وتشغيلها في ثلاثة أضعاف مع إدخال 3 ميكرولتر مباشرة في كل فحص). ومع ذلك ، فإن استخدام الليزات غير المخففة من الخلايا ذات أرقام mtDNA عالية جدا (مثل البويضات) أو التي تحتوي على أعداد أكبر من الخلايا (على سبيل المثال ، 50-100) قد يتجاوز هذا النطاق الديناميكي. في مثل هذه الحالات، يلزم إجراء تخفيف تسلسلي أولي لتحديد عامل تخفيف مناسب يتجنب تشبع الفحص لهذا النوع المحدد/رقم الخلية (انظر النتائج التمثيلية لمزيد من التفاصيل).
- تذوب جميع الكواشف على الجليد والدوامة وتدور لفترة وجيزة قبل الاستخدام.
- تحضير المزيج الرئيسي (ناقص عينة الحمض النووي) على الجليد كما هو موضح في (الجدول 2).
ملاحظة: إذا كان يتم قياس أمبليكون مستهدف واحد فقط، أضف 2.55 ميكرولتر إضافية من الماء الخالي من النوكليز لكل عينة لتحقيق الحجم النهائي البالغ 22 ميكرولتر. - دوامة المزيج الرئيسي المحضر لفترة وجيزة لخلط و aliquot الحجم المطلوب (22 ميكرولتر ناقص حجم الحمض النووي المدخل) في كل بئر من لوحة PCR 96-well من جيل القطرات. ترتيب العينات في أعمدة كاملة على لوحة 96 بئرا ؛ املأ أي آبار فارغة في أعمدة غير مكتملة بمزيج رئيسي واستخدمها كNTCs.
- أضف الحمض النووي المدخلات إلى كل بئر عينة ومخزن مائي / إزالة خال من النوكليز إلى آبار NTC ليصل الحجم الإجمالي لكل منها إلى 22 ميكرولتر.
- أغلق اللوحة بختم لوحة لاصقة وضعها على شاكر عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة ، ثم جهاز طرد مركزي عند 1000 × g لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية.
- ضع الطبق على الجليد وانتقل إلى الخطوة 4.
ملاحظة: يمكن تخزين الألواح المحضرة على الجليد وحمايتها من الضوء لفترات قصيرة من الزمن (على سبيل المثال، 1-2 ساعة) قبل الشروع في توليد القطيرات.
4. توليد قطرات
ملاحظة: ارجع إلى الشكل 1A للاطلاع على مخطط سطح أداة مولد القطيرات المشار إليه في هذا القسم.
- الطاقة على مولد قطرات.
- تحقق من تحميل زجاجة من زيت توليد القطيرات إلى الموضع E من سطح الجهاز. اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة لاستبدال الزجاجة إذا طلب منك ذلك.
- انقر فوق تكوين لوحة العينة على الشاشة التي تعمل باللمس. حدد كل الأعمدة الموجودة على لوحة العينة التي تحتوي على عينات/فراغات.
ملاحظة: يعد إدخال اسم اللوحة وتفاصيل التجربة في هذه الخطوة اختياريا وغير مطلوب لمتابعة إعداد التجربة. - انقر فوق موافق لتأكيد تكوين اللوحة. سوف تضيء الأضواء البرتقالية على سطح الأداة للإشارة إلى المواقع التي تحتاج إلى تحميل المواد الاستهلاكية.
- قم بتحميل خراطيش مولد القطيرات لوضع B على سطح الجهاز بحيث تتحول جميع الأضواء إلى اللون الأخضر.
- ضع حوض نفايات ذو طرف فارغ في الموضع C على سطح الجهاز.
- قم بإزالة الأغطية من صناديق طرف الفلتر وقم بتحميلها لوضع D على مرحلة الجهاز بحيث تتحول جميع الأضواء إلى اللون الأخضر.
- قم بإزالة ختم اللوحة اللاصقة من لوحة العينة وقم بتحميله إلى الموضع F من سطح الجهاز بحيث يتحول الضوء إلى اللون الأخضر.
- ضع صفيحة فارغة من مجموعة القطرات 96 بئرا في كتلة باردة (مبردة مسبقا عند -20 درجة مئوية) وقم بتحميلها في موضع G من سطح الأداة بحيث يتحول الضوء إلى اللون الأخضر.
- انقر فوق بدء توليد القطرات على شاشة اللمس الخاصة بالأداة.
- انقر فوق بدء التشغيل على شاشة اللمس الخاصة بالأداة. سيتم إغلاق غطاء الجهاز تلقائيا. بعد التهيئة ، سيتم عرض الوقت المتبقي حتى يكتمل توليد القطرات على شاشة اللمس الخاصة بالأداة.
- بمجرد اكتمال توليد القطيرات ، تحقق من لوحة جمع العينات بصريا للتأكد من وجود طبقة مستحلب قطرات فوق مرحلة الزيت في كل بئر (الشكل 1B).
ملاحظة: إذا كانت طبقة مستحلب القطيرات غير مرئية، فلا تتابع التجربة وتحقق من وجود أي أخطاء قد تكون حدثت أثناء الخطوات السابقة للبروتوكول. - قم بمسح المواد الاستهلاكية المستخدمة من سطح الأدوات وقم بإفراغ حوض نفايات الأطراف.
- قم بتشغيل مانع تسرب اللوحة ، واضبط درجة الحرارة على 180 درجة مئوية وختم الوقت على 5 ثوان ، واسمح للماكينة بالوصول إلى درجة حرارة التشغيل.
- ضع لوحة جمع العينات في حامل لوحة مانع تسرب اللوحة وضع ختم رقائق جديد أعلى اللوحة مع توجيه الخط الأحمر لأعلى. احرص على عدم لمس الجانب السفلي من ختم الرقائق.
ملاحظة: يجب تخزين حامل اللوحة في درجة حرارة الغرفة (RT) ووضعه فقط في درج مانع تسرب اللوحة عند تطبيق ختم رقائق لمنع نقل الحرارة إلى لوحة جمع العينات. - عندما يصل مانع تسرب اللوحة إلى درجة حرارة التشغيل، اضغط على مفتاح الإخراج على شاشة اللمس الخاصة بالجهاز؛ سيتم فتح الدرج تلقائيا.
- ضع حامل اللوحة في درج مانع تسرب اللوحة واضغط على Seal. سيتم إغلاق الدرج تلقائيا ثم فتحه مرة أخرى بمجرد اكتمال الختم.
- استبدل اللوحة المختومة على الكتلة الباردة ، وأطفئ مانع تسرب اللوحة ، وانتقل على الفور إلى الخطوة 5.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، تكون القطرات غير مستقرة ، لذا تأكد من بدء خطوة PCR في غضون 1 ساعة من الانتهاء من توليد القطيرات.
5. تفاعل البوليميراز المتسلسل
- ضع لوحة جمع القطرات المختومة على جهاز تدوير PCR مجهز بكتلة بئر بعمق 96 وقم بتشغيل بروتوكول ركوب الدراجات الحرارية الموضح في الجدول 3.
ملاحظة: اضبط درجة حرارة الغطاء المسخن على 105 درجة مئوية وحجم العينة على 40 ميكرولتر. يجب أن تتضمن خطوات التشنج والتلدين / التمديد معدل ارتفاع درجة الحرارة بمقدار 2 درجة مئوية / ثانية لضمان أن الزيت لديه الوقت الكافي لتحقيق التوازن إلى درجة الحرارة الصحيحة. - انتقل إلى الخطوة 6.
ملاحظة: بمجرد اكتمال بروتوكول التدوير الحراري ، تصبح القطرات أكثر استقرارا ، ويمكن تخزين اللوحة لمدة تصل إلى 4 أيام عند 4 درجات مئوية قبل متابعة الخطوة التالية.
6. قراءة القطيرات
- قم بتشغيل قارئ القطيرات والكمبيوتر المتصل.
- تحقق من مستويات السوائل في زجاجات نفايات زيت قارئ القطيرات وقارئ القطيرات وقم بتعبئتها / إفراغها ، على التوالي ، إذا لزم الأمر.
- قم بتحميل اللوحة التي تحتوي على عينات ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل في حامل لوحة قارئ القطيرات ، وضع الغطاء أعلى الحامل وثبته في مكانه باستخدام مشابك القفل السوداء. لا تقم بإزالة غطاء الرقائق من لوحة العينة.
- اضغط على الزر فتح/إغلاق الموجود على غطاء قارئ القطيرات لفتحه.
- قم بتحميل حامل لوحة قارئ القطيرات الذي يحتوي على لوحة العينة في غرفة القارئ وحددها بشكل آمن على القاعدة المغناطيسية.
- اضغط على الزر فتح/إغلاق الموجود على غطاء قارئ القطيرات لإغلاقه.
- افتح واجهة برنامج التحليل، وحدد علامة التبويب إضافة لوحة وقم بإعداد لوحة عينة جديدة كما يلي:
- انقر فوق إضافة لوحة ثم قم بتكوين لوحة.
- في علامة التبويب معلومات اللوحة ، أدخل اسم لوحة، وحدد Supermix for Probes (بدون dUTP) من القائمة المنسدلة Supermix وأدخل اسم ملف ضمن حفظ ملف البيانات باسم.
- في علامة التبويب اختيار الآبار ، قم بتمييز الآبار المراد تحليلها وانقر فوق تضمين الآبار المحددة.
ملاحظة: الخطوات 6.7.4 – 6.7.7 اختيارية. - في علامة التبويب معلومات الآبار، حدد الآبار المراد التعليق عليها.
ملاحظة: ارجع إلى الشكل 1D للحصول على مثال على واجهة علامة التبويب معلومات البئر. - حدد القياس الكمي المباشر (DQ) من القائمة المنسدلة نوع التجربة، وقم بملء مربعات وصف العينة ونوع العينة والاسم المستهدف وإضافة ملاحظات جيدة و/أو ملاحظات اللوحة كما هو مطلوب.
- انقر على تطبيق. سيتم تطبيق المعلومات الموجودة في الحقول على الآبار المختارة.
- كرر الخطوات 6.7.4-6.7.6 حتى يتم التعليق على جميع آبار العينة.
- بمجرد اكتمال تكوين اللوحة، انقر فوق بدء التشغيل.
- عند اكتمال التشغيل، تخلص من لوحة العينة الفارغة وأفرغ زجاجة نفايات قارئ القطيرات إذا لزم الأمر.
- انتقل إلى الخطوة 7.
7. تحليل النتائج
ملاحظة: يقيس قارئ القطيرات شدة التألق في قناة FAM و HEX لكل قطرة في عينة. في الفحص الناجح ، تقع القطرات في واحدة من فئتين لكل مسبار: سلبي (بمعنى أن الهدف لم يكن موجودا في القطرة) أو إيجابي (بمعنى أن الهدف كان موجودا في القطرة). قبل تحليل العينات، تأكد من أن كل بئر يحتوي على >10000 قطرة ويحتوي على مجموعتين منفصلتين بوضوح من قطرات التألق المنخفض (السلبي) والفلور العالي (الإيجابي) في كل قناة (الشكل 2A).
- حدد علامة التبويب تحليل البيانات وافتح الملف المراد تحليله من القائمة ملفات البيانات الخاصة بي .
- انقر فوق علامة التبويب 1D Amplitude للتجارب أحادية اللون أو علامة التبويب 2D Amplitude للتجارب ذات اللونين.
- تطبيق عتبة التألق على كل قناة للتمييز بين القطرات الإيجابية والسلبية. سيحاول برنامج التحليل تطبيق عتبة تلقائية على أساس كل عينة على حدة وقناة تلو الأخرى، ولكن إذا بدا أن ذلك قد فشل، أو بدا غير دقيق، فقم بتطبيق العتبة يدويا على النحو التالي:
- حدد الآبار التي تتطلب العتبة.
- تطبيق العتبة يدويا في المسافة الواضحة بين المجموعات الموجبة والسلبية على مخطط السعة باستخدام أداة وضع خط العتبة . عند تعيين عتبات يدوية في عرض 2D ، تأكد من وضع التقاطع بحيث يتم فصل مجموعات القطرات الأربعة (سلبية مزدوجة ، FAM إيجابية واحدة ، HEX إيجابية واحدة ، وإيجابية مزدوجة) بوضوح.
ملاحظة: يمكن إجراء العتبة إما بشكل جيد أو تطبيقها على آبار متعددة في وقت واحد.
- بمجرد تطبيق عتبة لجميع العينات ، قم بتصدير النتائج كملف .csv لمزيد من التحليل بالنقر فوق علامة التبويب جدول البيانات ، والنقر فوق استيراد / تصدير وتحديد تصدير البيانات المرئية إلى CSV. أدخل اسم ملف مناسب وانقر على حفظ.
- احسب رقم نسخة mtDNA في العينة الأولية على النحو التالي:
رقم النسخة = تركيز mtDNA المستهدف × 22 × 1/جزء من إجمالي مدخلات التحلل
ملاحظة: إذا تم استخدام مسبارين من الميتوكوندريا، حساب متوسط تركيز الهدفين قبل إجراء الحساب. بالنسبة للعينات التي تحتوي على أكثر من خلية واحدة، يتم حساب رقم النسخ لكل خلية عن طريق القسمة على عدد الخلايا في العينة. من المهم استخدام قيمة "التركيز" (أي عدد النسخ لكل ميكرولتر) مضروبة في حجم العينة الأولي البالغ 22 ميكرولتر ، بدلا من قيمة "النسخ لكل 20 ميكرولتر" المحسوبة في ملف .csv ، حيث يجب أن تؤخذ في الاعتبار نسخ mtDNA المتبقية في فائض 2 ميكرولتر المطلوب من قبل مولد القطرات عند حساب رقم النسخة المطلق للعينة الأولية. - بالنسبة للخلايا التي تحمل عمليات حذف mtDNA غير المتجانسة ، احسب رقم النسخة باستخدام النتائج من هدف mtDNA خارج المنطقة المحذوفة (أي الهدف الموجود في كل من جزيئات mtDNA المحذوفة و WT). يتم حساب الحذف heteroplasmy باستخدام تركيزات الهدف داخل المنطقة المحذوفة والهدف خارج المنطقة المحذوفة على النحو التالي:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد توليد القطيرات ، تظهر طبقة واضحة من القطرات غير الشفافة تطفو فوق مرحلة النفط في كل بئر (الشكل 1 ب). يمكن أن يتأثر تكوين القطيرات سلبا بوجود المنظفات في محللات المدخلات عند إجراء التجارب على الخلايا المفردة. باستخدام بروتوكول التحلل الموصوف في 2.1.2.، يتم تحقيق غلة قطرات أعلى من المستوى الموصى به البالغ 10000 بشكل روتيني، على الرغم من وجود كمية متبقية صغيرة من TWEEN-20 في العينة النهائية (الشكل 1C). ومع ذلك ، مع المخازن المؤقتة الأخرى للتحلل ، مثل المخزن المؤقت RLT Plus ، يلاحظ انخفاض كبير في عدد القطرات المشكلة (الشكل 1C) ، والذي من المحتمل أن يؤثر سلبا على دقة قياس رقم النسخة.
بعد قراءة PCR والقطيرات ، سيتم رؤية مجموعات منفصلة بوضوح من القطرات الإيجابية والسلبية في كل قناة من القنوات المستخدمة لكل بئر عينة (الشكل 2A) ، مع آبار NTC التي تحتوي على قطرات سلبية فقط. تتضمن المشكلات المحتملة التي قد تتم مواجهتها عند تحليل النتائج ما يلي:
عدم وجود فصل واضح بين السكان الإيجابيين والسلبيين ، ووجود قطرات في الفجوة بين المجموعتين ، يطلق عليه "المطر" (الشكل 2 ب). يمكن أن يحدث هذا إذا تم استخدام درجة حرارة التلدين / التمديد غير المثلى ، خاصة في الفحوصات حيث يكون الفرق في التألق بين القطرات الإيجابية والسلبية صغيرا نسبيا. قد يساعد تشغيل تدرج درجات حرارة التلدين / التمديد في تحديد درجة الحرارة المثلى للاستخدام. بدلا من ذلك ، قد تحتاج الاشعال / المجسات إلى إعادة تصميم لتحسين أداء المقايسة.
"نطاق مزدوج" من القطرات في السكان السالبين عند استخدام طريقة عرض "سعة 1D". في بعض الحالات ، يمكن رؤية شريط مزدوج من القطرات السالبة في قناة HEX (الشكل 2Bii) ؛ هذا هو نتيجة لاختلاف مستويات التألق الخلفية بين مجموعات قطرات السالبة المزدوجة والسالبة المفردة (أي مجموعات قطرات FAM إيجابية ، سالبة HEX) ، كما هو موضح في (الشكل 2Biii) ، والذي يوضح مجموعة FAM ذات المقطع الموجب الفردي (الربع العلوي الأيسر) مع متوسط تألق أقل في قناة HEX من السكان السالبين المزدوجين (الربع السفلي الأيسر). لا تؤثر هذه القطعة الأثرية الفلورية على نتائج الفحص ، ويسمح استخدام "سعة 2D" بتحديد مجموعات القطرات الأربعة بوضوح.
عدم وجود قطرات إيجابية (الشكل 2C). بالنسبة للفحوصات التي تم التحقق من صحتها ، من المرجح أن يكون هذا بسبب خطأ أثناء إعداد العينة (على سبيل المثال ، تحلل الخلايا غير المكتمل ، والاشعال / المسبار غير الصحيح المضاف إلى المزيج الرئيسي ، وفشل فرز الخلية الواحدة ، وما إلى ذلك).
عدم وجود قطرات سالبة (الشكل 2D). يحدث هذا عندما يكون الفحص مشبعا بمدخلات الحمض النووي المستهدفة العالية ، مما يؤدي إلى احتواء كل قطرة على تسلسل مستهدف واحد أو أكثر. من المرجح أن يظهر هذا عند قياس عينات عالية من النسخ (مثل البويضات) ويمكن حلها عن طريق تخفيف الليزات قبل الخطوة 3.5. يمكن استخدام التخفيف التسلسلي للحمض النووي المدخلات (الشكل 2D) لتحديد عامل تخفيف مناسب عند مواجهة هذه المشكلة.
عند استخدام اثنين من تحقيقات mtDNA المستقلة ، يمكن تقييم سلامة عينة الحمض النووي عن طريق اختيار طريقة عرض "سعة 2D": جزيئات mtDNA السليمة تحمل كلا التسلسلين المستهدفين. لذلك ، فإن القطرات التي تحتوي على جينومات mtDNA كاملة ستكون إيجابية في كلتا القناتين (الشكل 3A). عند تحليل العينات التي تحمل عمليات حذف mtDNA ، سيكون هناك مزيج من القطرات المزدوجة الإيجابية والقطرات الإيجابية فقط للتسلسل المستهدف غير المحذوف ، حتى في العينات غير المتدهورة (الشكل 3B). عندما يتحلل mtDNA ، من المرجح أن توجد بعض التسلسلات المستهدفة على شظايا منفصلة من الحمض النووي ، وبالتالي من المرجح أن تكون القطرات إيجابية لمسبار واحد فقط ، وسيكون عدد أقل من القطرات موجبا لكليهما (الشكل 3C). يتم حساب هذه الاختلافات أثناء تحليل البيانات ، حيث يتم دائما تقدير التركيزات بشكل مستقل لكل هدف باستخدام إجمالي عدد السكان لجميع القطرات الإيجابية في قناة التألق هذه ، ثم يتم حسابها إما في المتوسط لتقدير عدد النسخ أو استخدامها لحساب التباين (انظر الخطوات 7.3.-7.4).
يمكن استخدام هذه الطريقة لقياس عدد النسخ في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا من كل من الفئران والأنسجة البشرية ، بما في ذلك خطوط الخلايا المختبرية مثل HeLa و HEK 293T والخلايا الليفية الجنينية المخلدة للفئران (MEFs) والخلايا الأولية مثل الخلايا الليفية الجلدية البشرية والخلايا الجرثومية البدائية للفئران (PGCs) (الشكل 4A). في أنواع الخلايا الجسدية التي تم اختبارها ، ينظر إلى مجموعة من أرقام النسخ من بضع مئات (على سبيل المثال ، الخلايا الليفية الجلدية) إلى عدة آلاف (على سبيل المثال ، خلايا HeLa). ولقياس دقة المقايسة، تم تحليل بويضات الفئران الناضجة، التي لديها عدد نسخ مرتفع جدا (>150,000 نسخة لكل خلية)2، وتم تقسيم التحلل الناتج بالتساوي عبر 22 تفاعلا منفصلا لكل خلية. بعد تشغيل بروتوكول PCR لتوليد القطيرات ، لوحظ اختلاف ضئيل جدا في عدد النسخ المكتشفة في كل تفاعل ، حيث أنتجت خليتان تمثيليتان (الشكل 4B) ما مجموعه 229,647 نسخة (متوسط 10,439 لكل بئر ، والانحراف المعياري 380) و 330,121 نسخة (متوسط 15,006 لكل بئر ، والانحراف المعياري 340) لكل بويضة. كانت معاملات التباين (CV) لهاتين الخليتين 3.64٪ و 2.26٪ على التوالي. لاختبار قابلية التكاثر عبر العينات البيولوجية، تم حصاد PGCs من الغدد التناسلية لأربعة فئران جنينية في اليوم 13.5 بعد الحمل، وتمت مقارنة عدد النسخ أحادية الخلية الناتجة من مجموعات الخلايا هذه عبر الأجنة المختلفة (الشكل 4C). في حين أنه من المتوقع حدوث بعض التباين البيولوجي، إلا أن متوسط عدد النسخ والانحراف المعياري ظلوا قابلين للمقارنة عبر الأجنة الأربعة التي تم اختبارها، وكانت هذه النتائج متفقة مع بيانات عدد النسخ التي تم الإبلاغ عنها سابقا في هذا النوع من الخلايا في مرحلة مماثلة من التطور الجنيني21.
بالإضافة إلى قياس عدد النسخ ، يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لقياس مستوى التباين في الخلايا القبرصية التي تحمل حذف mtDNA غير المتجانس. وهذا يتطلب استخدام مسبارين mtDNA ، أحدهما يقع داخل المنطقة المحذوفة من mtDNA والآخر يسقط خارجها (الشكل 5A). بعد التحليل ، يمكن العثور على مستوى التباين من خلال مقارنة تركيز كل مسبار لحساب نسبة النسخ التي تحتوي على كلا الهدفين (أي جينومات WT mtDNA) والنسبة التي تحتوي فقط على المسبار الذي يقع خارج المنطقة المحذوفة (أي جينومات mtDNA المحذوفة) كما هو موضح في الخطوة 7.4. نظرا لأن الهدف الموجود خارج المنطقة المحذوفة موجود في جميع نسخ mtDNA ، يمكن أيضا استخدام هذا لحساب العدد الإجمالي للنسخة من الخلية. في الخلايا ذات التباين عالي الحذف ، يتم اكتشاف نسخ قليلة نسبيا من المسبار داخل المنطقة المحذوفة (الشكل 5Bi) ، بينما في الخلايا ذات التباين منخفض الحذف ، تكون تركيزات المسبارين أكثر تشابها (الشكل 5Bii). أظهر استخدام مقايسات المسبار "الداخلة" لقياس الحذف غير المتجانس بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل لتوليد القطيرات في عينات الحمض النووي المستخرجة بكميات كبيرة دقة محسنة مقارنة بالطرق القائمة على qPCR ، ولكنه يفتقر إلى الحساسية عند التعامل مع مستويات غير متجانسة منخفضة جدا (<5٪)22 ، وبالتالي لا ينصح به في الخلايا ذات أعباء الحذف الصغيرة جدا. تضم مجموعات التمهيدي / المسبار لكل من mtDNA البشري والفأر الموصوف في الجدول 1 هدفا واحدا داخل القوس الرئيسي mtDNA وهدفا واحدا خارجه ، وبالتالي فهي مناسبة لمعظم عمليات حذف mtDNA الشائعة23,24.
| جنس | هدف | اسم التمهيدي / التحقيق | تسلسل | 5' مسبار | 3' كوينشر | ||
| بشري | ND4 | huND4_F التمهيدي | AGTGCGGAGAGTAGGGGAAGG | ||||
| huND4_R التمهيدي | ACCTTGGCTATCATCACCCGAT | ||||||
| huND4_FAM التحقيق | CAACCAGCCAGAACGCCTGAACGCA | فام | بي إتش كيو 2 | ||||
| ND1 | huND1_F التمهيدي | GGGTTCATAGTAGAAGAGCGATGG | |||||
| huND1_R التمهيدي | ACGCCATAAAACTCTTCACCAAAG | ||||||
| huND1_HEX التحقيق | ACCCGCCACATCTACCATCACCCTC | الهيكس | بي إتش كيو 1 | ||||
| فأر | ND1 | musND1_F التمهيدي | GAGCCTCAAACTCCAAATACTCACT | ||||
| musND1_R التمهيدي | GAACTGATAAAAGGATAATA GCTATGGTTACTTCA |
||||||
| musND1_FAM التحقيق | CCGTAGCCCAAACAAT | فام | بي إتش كيو 1 | ||||
| كوكس 3 | musCOX3_F التمهيدي | CCTCGTACCAACACATGATCTAGG | |||||
| musCOX3_R التمهيدي | AGTGGGACTTCTAGAGGGTTAAGTG | ||||||
| مسبار musCOX3_HEX | ACCTCCAACAGGAATTTCA | الهيكس | بي إتش كيو 1 | ||||
الجدول 1: مجموعات التمهيدي والمسبار PCR لتوليد القطيرات التي تم التحقق من صحتها للاستخدام في الخلايا البشرية والفأرية. مجموعات التمهيدي والمسبار للفحوصات التي تم التحقق منها مسبقا والتي تضخم هدفين مستقلين من mtDNA للإنسان 16,17 وخلايا الفأر18.
| مكون | الحجم لكل عينة | التركيز النهائي |
| 2X DDPCR Supermix للمجسات (بدون dUTP) | 11 ميكرولتر | 1X |
| الهدف 1 التمهيدي F (20 ميكرومتر) | 1 ميكرولتر | 900 نانومتر |
| الهدف 1 التمهيدي R (20 ميكرومتر) | 1 ميكرولتر | 900 نانومتر |
| الهدف 2 التمهيدي F (20 ميكرومتر) | 1 ميكرولتر | 900 نانومتر |
| الهدف 2 التمهيدي R (20 ميكرومتر) | 1 ميكرولتر | 900 نانومتر |
| الهدف 1 المسبار (FAM، 10 ميكرومتر) | 0.55 ميكرولتر | 250 نانومتر |
| الهدف 2 مسبار (HEX، 10 ميكرومتر) | 0.55 ميكرولتر | 250 نانومتر |
| عينة من الحمض النووي (أضيفت في الخطوة 3.4) | متغير | متغير |
| مياه خالية من النوكليز | متغير | |
| الحجم الإجمالي | 22 ميكرولتر |
الجدول 2: وصفة مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل من جيل القطيرات. مزيج التفاعل المطلوب لفحص PCR لتوليد قطرات واحدة البئر. ويمكن الاطلاع على تسلسلات التمهيدي/المسبار الموصى بها في الجدول 1؛ يمكن توسيع نطاق الوصفة عند تشغيل عينات متعددة.
| درج | درجة الحرارة (°C) | الوقت | لا. دورات |
| تنشيط الإنزيم | 95 | 10 دقائق | 1 |
| التشبع | 94 | 30 ثانية | 40 |
| التلدين / التمديد | 58 | 1 دقيقة | |
| تعطيل الإنزيم | 98 | 10 دقائق | 1 |
| مسك | 4 | انهائي | 1 |
الجدول 3: بروتوكول التدوير الحراري PCR لتوليد القطيرات. بروتوكول ركوب الدراجات لتضخيم الحمض النووي المستهدف بعد توليد القطيرات.
الشكل 1: توليد القطيرات. (أ) التخطيط التخطيطي لسطح أدوات مولد قطرات PCR لتوليد القطيرات ، المواضع على النحو التالي: A = وحدة مناولة سائلة آلية ، B = خرطوشة مولد قطرات (x3) ، C = دلو نفايات طرفية ، D = صندوق طرف مرشح (x2) ، E = حامل زيت مولد القطيرات ، F = لوحة عينة ، G = لوحة تجميع (موجودة في كتلة باردة). (ب) صورة تمثيلية لمستحلب القطيرات العائمة فوق مرحلة الزيت مباشرة بعد توليد القطيرات. (ج) تأثير المخازن المؤقتة المختلفة للتحلل على عدد القطيرات؛ مع 1٪ TWEEN-20 ، هناك انخفاض طفيف في عدد القطيرات ، في حين أن المخزن المؤقت RLT Plus يؤدي إلى انخفاض ثلاثة أضعاف تقريبا في أعداد القطيرات ، أقل بكثير من العدد الموصى به البالغ 10000 (تظهر النتائج كمتوسط لثلاثة تكرارات فنية لكل حالة مع انحرافات معيارية). (د) لقطة شاشة لعلامة التبويب معلومات البئر الخاصة بالبرنامج تعرض معلومات العينة المكتملة المطبقة على البئر A1 من قالب 96 بئرا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليلات فحص PCR لتوليد القطيرات التمثيلية تظهر النتائج المتوقعة والقضايا الشائعة. (أ) ينتج فحص مسبار mtDNA المزدوج من ثلاثة محللات HeLa أحادية الخلية تظهر مجموعات قطرات إيجابية وسالبة منفصلة بوضوح في (i) قناة FAM ، (ii) قناة HEX ، و (iii) عرض سعة 2D مجتمعة. (ب) ينتج الفحص عن أربع عينات من خلايا HeLa 20 السائبة تظهر "المطر" بين المجموعات الإيجابية والسلبية في (i) قناة FAM ، (ii) الفصل الضعيف بين القطرات الإيجابية والسالبة في قناة HEX ، و (iii) نطاق قطرات مزدوج في القطرات السالبة لقناة HEX (ii) بسبب اختلاف مستويات التألق الخلفية في المجموعات السكانية السالبة HEX ، كما رأينا في عرض السعة 2D. (ج) مثال على محللة خلية واحدة من نوع WT cybrid بدون قطرات موجبة (i) في أي من قناتي التألق ، مع اختبار WT cybrid ناجح من نفس التجربة (ii) للمقارنة. (د) نتائج تمثيلية من تخفيف تسلسلي بمقدار 10 أضعاف للأمبليكون المستهدف البشري ND1 المضخم بتفاعل البوليميراز المتسلسل بتركيز معروف ، مما يدل على تشبع PCR من جيل القطيرات فوق الحد الأعلى للفحص البالغ 120000 نسخة. RFU = وحدات التألق النسبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقييم سلامة mtDNA باستخدام طريقة عرض "السعة ثنائية الأبعاد". (أ) ينتج تفاعل البوليميراز المتسلسل التمثيلي لتوليد القطيرات من تحلل خلية واحدة من نوع WT cybrid يحتوي في الغالب على جينومات mtDNA سليمة في الغالب ، والتي يشار إليها بوجود قطرات مزدوجة إيجابية بشكل رئيسي FAM و HEX. (ب) ينتج تفاعل البوليميراز المتسلسل لتوليد القطيرات عن تحلل سيبرد أحادي الخلية من الحذف غير المتجانس، يظهر خليطا من قطرات HEX أحادية الإيجابية (تحتوي على جزيئات mtDNA محذوفة تحمل هدف HEX فقط) وقطرات FAM وHEX مزدوجة الموجب (تحتوي على جزيئات mtDNA كاملة تحمل كلا الهدفين)، مع عدد قليل جدا من قطرات FAM أحادية الإيجابية، مما يشير إلى عدم وجود تدهور كبير في mtDNA. (ج) ينتج تفاعل البوليميراز المتسلسل لتوليد القطيرات من محللات أحادية الخلية لبويضة الفأر تحتوي على خليط من قطرات FAM أحادية الإيجابية، وHEX أحادية الإيجابية، وقطرات FAM وHEX مزدوجة الإيجابية، مما يشير إلى أنه من المحتمل أن يكون بعض تحلل mtDNA قد حدث في هذه العينة. RFU = وحدات التألق النسبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تكشف قياسات عدد النسخ أحادية الخلية عن تباين بين أنواع الخلايا ولكنها تظهر قابلية تكرار قوية داخل التجارب وفيما بينها. (أ) قياسات عدد النسخ التمثيلية أحادية الخلية من مجموعة من خطوط الخلايا من كل من الأنسجة البشرية (المربعات) والفئران (المثلثات) (n = 12 خلية لكل نسيج). (ب) القياس التسلسلي لرقم النسخة في الليزات من بويضتين فرديتين للفأر؛ تم تقسيم إجمالي حجم التحلل عبر 22 تفاعلا منفصلا لتوليد قطرات PCR ؛ تمثل كل نقطة على الصندوق وقطع الشعيرات رقم النسخة الذي تم قياسه في بئر واحد. يتم الإبلاغ عن المتوسط والانحراف المعياري (SD) ومعامل التباين (CV) لكل بويضة. (ج) عدد النسخ أحادية الخلية من الخلايا الجرثومية الأولية للفئران التي تم جمعها من أربعة أجنة منفصلة في 13.5 يوما بعد الإخصاب (n = 94 خلية مفردة لكل جنين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: قياس التباين أحادي الخلية في خط سيبرد المحذوف . (أ) تخطيطي يوضح منطقة mtDNA المحذوفة في خط cybrid المستخدم في هذه الدراسة وموقع تحقيقات ND1 و ND4 mtDNA. (ب) نتائج تمثيلية من (i) محللة عالية أحادية الخلية غير متجانسة و (ii) محللة أحادية الخلية منخفضة غير متجانسة تظهر النسب المختلفة لمسبار ND4: ND1 وعدد النسخ الناتج والقياسات غير المتجانسة. RFU = وحدات التألق النسبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول الموصوف هنا قابل للتطبيق عبر مجموعة واسعة من أنواع الخلايا والأنواع بالإضافة إلى تلك التي نوقشت أعلاه ، على الرغم من أن التحسين الدقيق لتصميمات الفحص الجديدة سيكون مفتاحا لضمان الحفاظ على دقة وتكرار الطريقة عند الابتعاد عن مجموعات التمهيدي / المسبار التي تم التحقق منها مسبقا. عند العمل مع الخلايا المفردة ، من الضروري التأكد من أن جمع العينات يتم بأكبر قدر ممكن من الدقة (على سبيل المثال ، استخدام معلمات خلية واحدة صارمة عند فرز الخلايا حسب FACS) لضمان أن النتائج التي تم الحصول عليها تعكس حقا نتائج الخلايا الفردية ، وكذلك أن يتم تنفيذ جميع الأعمال التحضيرية في منطقة نظيفة قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل لتقليل خطر حدوث التلوث. كما أن التحلل الفعال للخلايا أمر بالغ الأهمية لضمان إمكانية تقسيم نسخ mtDNA بنجاح إلى قطرات منفصلة. ومع ذلك ، يجب موازنة هذا مع خطر تعطيل تكوين القطيرات عند استخدام تركيزات أعلى من المنظفات.
نظرا لأن تصميم الفحص وخطوات التحلل هي الأكثر أهمية في البروتوكول ، فهذه هي أيضا الخطوات الأكثر احتمالا التي تتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها. قد تظهر مجموعات التمهيدي / المسبار التي لا تنتج في البداية مجموعات منفصلة جيدا من القطرات الإيجابية والسلبية أداء محسنا إذا تم تحسين درجة حرارة التلدين / التمديد لبروتوكول PCR. درجة الحرارة المقترحة 58 درجة مئوية المعطاة في الخطوة 5.1. تم التحقق من صحة مجموعات التمهيدي / المسبار في (الجدول 1) ؛ ومع ذلك ، يمكن أن تختلف درجة الحرارة المثلى من 55-65 درجة مئوية ، ويمكن تشغيل PCR متدرج عبر هذا النطاق للعثور على درجة الحرارة الأنسب لمجموعات التمهيدي / المسبار الجديدة. إذا لم ينجح ذلك ، فقد يكون من الضروري إعادة تصميم الاشعال و / أو المجسات لتحسين الأداء ، في إشارة إلى إرشادات الشركة المصنعة بشأن تصميم الفحص (انظر جدول المواد).
إذا كانت ظروف التحلل مختلفة عن تلك الموضحة في الخطوة 2.1.2. مطلوبة ، ثم يجب تقييم تأثير المخزن المؤقت البديل للتحلل على توليد القطرات. قد يكون من الممكن تحسين توليد القطرات عن طريق تقليل تركيز المنظفات في مخزن التحلل العازل أو تخفيف الليزات في حجم أكبر من الماء الخالي من النوكليز ، على الرغم من أننا وجدنا أن بعض المخازن المؤقتة (على سبيل المثال ، RLT Plus buffer) لا يزال لها تأثير كبير على تكوين القطرات حتى في تركيزات منخفضة جدا. أحد الحلول الممكنة لهذه المشكلة هو إجراء تنظيف ما بعد التحلل للحمض النووي ، على سبيل المثال باستخدام حبات SPRI لربط الحمض النووي والسماح بغسل المنظفات. في حين يتم استخدام حبات SPRI لتنقية كل من الحمض النووي الجيني25 و mtDNA26 من lysates أحادية الخلية ، فإن أي فقدان لجينومات mtDNA أثناء هذه العملية سيؤثر على قياس رقم النسخة اللاحق ، ولا توجد حاليا بيانات تحدد مصدر الخطأ المحتمل هذا عند استخدام منتجات حبة SPRI المتاحة تجاريا على lysates أحادية الخلية.
تقليديا ، تم قياس عدد نسخ mtDNA والحذف heteroplasmy باستخدام اختبارات qPCR27. في حين أن المفهوم الأساسي لنهج qPCR يشبه إلى حد كبير تقنية PCR لتوليد القطيرات الموصوفة هنا ، فإن أحد العيوب الرئيسية لاستخدام qPCR هو عدم قدرته على قياس رقم النسخة المطلقة11 مباشرة. لكل عينة، يقيس qPCR قيمة عتبة الدورة (ct) - عدد دورات PCR المطلوبة للوصول إلى كمية معينة من المنتج من الحمض النووي الأولي للإدخال. وبما أن هذه العتبة تعسفية، فمن الضروري توليد منحنى قياسي من المدخلات التي تحتوي على مجموعة من التركيزات المستهدفة المعروفة قبل أن يتسنى تعيين أرقام النسخ المطلقة للعينات. على مستوى الحمض النووي السائب ، هذه العملية دقيقة للغاية ويمكن مقارنتها بتوليد القطيرات PCR في قدرتها على قياس عدد نسخ mtDNA. ومع ذلك ، في أعداد النسخ المنخفضة جدا ، مثل تلك الموجودة عادة في الخلايا المفردة ، يصبح من الصعب بشكل متزايد إنشاء منحنيات قياسية بدقة ل qPCR ، وبالتالي ، من الصعب الحصول على مقاييس دقيقة للنسخة المطلقة رقم11. وتجدر الإشارة إلى أن توليد القطيرات PCR هو حاليا أكثر تكلفة لأداء من qPCR ، مع المواد الاستهلاكية والكواشف التي تكلف ما يقرب من 2.5 مرة على أساس كل عينة ، بالإضافة إلى ارتفاع تكاليف المعدات الأولية. وهذا يعني أن تكلفة توليد قطرات PCR قد تكون باهظة بالنسبة لبعض التطبيقات عالية الإنتاجية ، وفي هذه الحالة لا يزال qPCR يمثل بديلا قابلا للتطبيق.
نظرا لأن PCR لتوليد القطيرات يقيس مباشرة عدد نسخ هدف معين موجود في عينة ، فلا يوجد شرط لمنحنى قياسي عند قياس رقم النسخة المطلق ، وبالتالي فإن طريقة PCR لتوليد القطيرات حساسة للغاية حتى مع وجود كميات صغيرة جدا من الحمض النووي المدخلات11,12. ونظرا للأهمية الناشئة لتكنولوجيات الخلية الواحدة في مجال بيولوجيا الميتوكوندريا، فإن هذا النهج القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل لتوليد القطيرات يمثل تقدما رئيسيا مقارنة بالمنهجيات السابقة ويسمح بالقياس المستمر لمعلمات الميتوكوندريا الرئيسية في بيئة الخلية الواحدة. من الممكن أيضا استخدام PCR لتوليد القطيرات لقياس عدد نسخ mtDNA في الحمض النووي المستخرج من عينات الأنسجة السائبة ؛ وهذا يتطلب قياس عدد نسخ الحمض النووي النووي بالإضافة إلى رقم نسخة mtDNA للسماح بالتطبيع إلى رقم الخلية. لذلك ، يلزم تضمين مجموعة تمهيدية / مسبار تستهدف جينا نوويا إلى جانب مجموعة تمهيدية / مسبار تستهدف mtDNA. كما هو مبين أعلاه ، على مستوى الأنسجة السائبة ، فإن PCR لتوليد القطيرات وطرق qPCR القياسية ذات دقة مماثلة ، وبالتالي ، فإن PCR لتوليد القطرات لا يوفر مزايا كبيرة على التقنيات الحالية في هذا الإعداد.
أحد القيود الرئيسية للطريقة المعروضة هنا هو عدم القدرة على قياس مستويات البلازما غير المتجانسة في الخلايا التي تحمل SNPs غير المتجانسة بدلا من حذف mtDNA ، مما يتطلب فحصا إضافيا (على سبيل المثال ، pyrosequencing أو qPCR) لقياس كل من عدد النسخ والبلازما غير المتجانسة من خلية واحدة. تم الإبلاغ عن الكشف الناجح عن SNPs التي تظهر تعبيرا خاصا بالأليل (ASE) باستخدام هذه المنصة28 ، ووصف تقرير حديث استخدام هذه الطريقة لقياس التباين في طفرة m.3243A >G MELAS الشائعة29. لذلك ، في حين يبدو أنه يمكن التغلب على هذا القيد باستخدام أزواج مسبار مصممة بعناية ، فإنه يتطلب مجموعة تمهيدية / مسبار منفصلة ليتم تصميمها / التحقق من صحتها لكل SNP فردي ، ومعلمات التصميم مقيدة أكثر بكثير بسبب الحاجة إلى مجسات لاستهداف قاعدة محددة في تسلسل mtDNA. على هذا النحو ، لم تتم محاولة دمج اكتشاف SNP في بروتوكول PCR لتوليد القطيرات الموصوف هنا.
من المهم ملاحظة أن منصات تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمية القائمة على القطيرات ، مثل النوع المستخدم في هذه الدراسة ، ليست التقنيات الوحيدة القادرة على التحديد الكمي المطلق لأهداف الحمض النووي ، كما تتوفر المنتجات التجارية التي تستخدم طرقا بديلة مثل التقسيم القائم على الألواح أيضا30. وعلاوة على ذلك، قد تثبت التكنولوجيات التي تستخدم بدائل لتفاعل البوليميراز المتسلسل، مثل التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP)31 وتضخيم البوليميراز المعاد تأليفه (RPA)32، أنها أكثر ملاءمة من تفاعل البوليميراز المتسلسل لتوليد القطيرات للاستخدام في الإعدادات السريرية.
بشكل عام ، يقدم هذا البروتوكول طريقة حساسة للغاية لقياس عدد نسخ mtDNA وحذف heteroplasmy في الخلايا المفردة ، والتي يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من أنواع الخلايا والأنواع المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا يوجد تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
شكرا للدكتور ل بوزيلوفا على مشورته بشأن التحليل الإحصائي لبيانات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتوليد القطيرات. شكرا للدكتور H Zhang على توفير البويضات المستخدمة لتوليد البيانات في الشكل 3C والشكل 4B. تم تنفيذ هذا العمل من قبل SPB في وحدة بيولوجيا الميتوكوندريا التابعة لمجلس البحوث الطبية (MC_UU_00015/9) ، جامعة كامبريدج ، وبتمويل من زمالة Wellcome Trust Principal Research Fellowship التي عقدتها PFC (212219/Z/18/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Tween-20 solution | Novex | 3005 | |
| Automated droplet-generating oil | Bio Rad | 1864110 | Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1) |
| C1000 PCR machine with deep-well block | Bio Rad | 1851197 | PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5) |
| Collection plate cooling block | Bio Rad | 12002819 | Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3) |
| ddPCR 96-well plates | Bio Rad | 12001925 | 96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3) |
| ddPCR droplet reader oil | Bio Rad | 1863004 | Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1) |
| ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio Rad | 1863023 | Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3) |
| DG32 automated droplet generator cartridges | Bio Rad | 1864108 | Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3) |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Qualified fetal bovine serum |
| Foil plate covers | Bio Rad | 1814040 | Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6) |
| HEK 293T cells | Takara | 632180 | Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen |
| HeLa cells | ECACC | 93021013 | Human cervix epitheloid carcinoma cells |
| High glucose DMEM | Gibco | 13345364 | 4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Human cybrids | University of Miami | ||
| Mouse embryonic fibroblasts | Newcastle University | Immortalized from C57Bl/6 mice | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PCR plate seals | Pierce | SP-0027 | Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6) |
| Pipet Tip Waste Bins | Bio Rad | 1864125 | Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Pipet tips for AutoDG system | Bio Rad | 1864120 | Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Primary human dermal fibroblast cells | Newcastle Biobank | ||
| Primers/Probes | IDT | N/A | Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1 |
| Proteinase K 20 mg/mL solution | Ambion | AM2546 | |
| PX1 PCR plate sealer | Bio Rad | 1814000 | Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6) |
| QX Manager software | Bio Rad | 12012172 | Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7) |
| QX200 AutoDG droplet generator | Bio Rad | 1864101 | Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4) |
| QX200 droplet reader | Bio Rad | 1864003 | Droplet reader (used in Protocol Step 6) |
| Trizma pre-set crystals pH 8.3 | Sigma | T8943-100G |
References
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Wai, T., et al. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility. Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).
- D'Erchia, A. M., et al. Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity. Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A-->G. American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).
- Liu, H., et al. Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases. PloS One. 8 (6), 67146 (2013).
- Filograna, R., et al. Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Wang, Y., et al. The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues. Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).
- Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF). American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).
- Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Herbst, A., et al. Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).
- O'Hara, R., et al. Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution. Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).
- Diaz, F., et al. Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).
- Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells. Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).
- Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis. Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).
- Perier, C., et al. Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms. Brain. 136, Pt 8 2369-2378 (2013).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Espina, V., et al.
- Cree, L. M., et al. A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes. Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).
- Belmonte, F. R., et al. Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions. Scientific Reports. 6, 25186 (2016).
- Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. Two direct repeats cause most human mtDNA deletions. Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).
- Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation. Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).
- Macaulay, I. C., et al. Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&T-seq. Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).
- Ludwig, L. S., et al. Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics. Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).
- Rooney, J. P., et al. PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species. Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).
- Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression. Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).
- Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 10821 (2020).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E.
- Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane. ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).
- Li, Z., et al. Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care. Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952 (2021).
