Summary
Burada, tek hücrelerde mutlak mitokondriyal (mt) DNA kopya sayısını ve mtDNA delesyon heteroplazmi seviyelerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Memeli mitokondriyal (mt) DNA'sı, elektron taşıma zincirinin 13 alt birimini kodlayan küçük, dairesel, çift sarmallı, mitokondriyal bir DNA molekülüdür. Diploid nükleer genomun aksine, çoğu hücre, hücre tipine bağlı olarak 100'den az ila 200.000'den fazla kopya arasında değişen mtDNA'nın çok daha fazla kopyasını içerir. MtDNA kopya sayısı, yaşa bağlı bir dizi dejeneratif durum ve hastalık için bir biyobelirteç olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır ve bu nedenle, mtDNA kopya sayısının doğru ölçümü hem araştırma hem de teşhis ortamlarında önemli bir araç haline gelmektedir. Genellikle tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler) veya delesyonlar olarak ortaya çıkan mtDNA'daki mutasyonlar, hücre içindeki mtDNA'nın tüm kopyalarında (homoplazmi olarak adlandırılır) veya mutasyona uğramış ve WT mtDNA kopyalarının (heteroplazmi olarak adlandırılır) bir karışımı olarak bulunabilir. Heteroplazmik mtDNA mutasyonları, nadir hastalıklarda veya Parkinson hastalığı gibi giderek artan sayıda yaygın geç başlangıçlı hastalıkta klinik mitokondriyal patolojinin önemli bir nedenidir. Hücrelerde bulunan heteroplazmi seviyesinin belirlenmesi, nadir görülen mitokondriyal hastalıkların tanısında ve mitokondrinin rol oynayabileceği yaygın geç başlangıçlı bozuklukları anlamayı amaçlayan araştırmalarda kritik bir adımdır. MtDNA kopya sayısı ve heteroplazmi geleneksel olarak kantitatif (q) PCR tabanlı testler veya derin dizileme ile ölçülmüştür. Bununla birlikte, ddPCR teknolojisinin yakın zamanda tanıtılması, her iki parametreyi ölçmek için alternatif bir yöntem sağlamıştır. Mutlak mtDNA kopya sayısını ölçme yeteneği ve düşük kopya sayılarında bile tek hücrelerden doğru ölçümler yapmak için yeterli hassasiyet de dahil olmak üzere mevcut yöntemlere göre çeşitli avantajlar sunar. Burada, ddPCR kullanılarak tek hücrelerde mtDNA kopya sayısının ölçümünü açıklayan ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır, bundan böyle damlacık üretimi PCR olarak adlandırılacaktır ve mtDNA delesyonlu hücrelerde heteroplazmilerin eşzamanlı olarak ölçülmesi seçeneği sunulmaktadır. Bu yöntemin mtDNA SNP'li hücrelerde heteroplazmiyi ölçmek için genişletilmesi olasılığı da tartışılmaktadır.
Introduction
Memeli mitokondriyal (mt) DNA'sı, iki rRNA, 22 tRNA ve 13 protein kodlayan gen 1'den oluşan 37 geni kodlayan mitokondriyal matriste bulunan küçük (yaklaşık 16.5 Kb), dairesel bir DNA genomudur. Hücre başına her genin bir (haploid) veya iki (diploid) kopyasını içeren nükleer genomun aksine, mtDNA, her hücrenin mitokondrisinde, onlarca kopyadan (örneğin, olgun spermatositler) yüz binlerce kopyaya (örneğin, oositler) kadar değişen çoklu kopyalarda bulunur2,3. Bu çok kopyalı doğanın bir sonucu, mtDNA genomundaki tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler), delesyonlar veya duplikasyonlar olarak var olabilen mutasyonların, herhangi bir hücrede değişen seviyelerde bulunabilmesidir ve hücrenin toplam mtDNA popülasyonunun% 0 ila% 100'ünü oluşturur. Aynı hücrede vahşi tip ve mutant mtDNA genomlarının varlığı heteroplazmi olarak adlandırılır ve patojenik heteroplazmik mtDNA mutasyonları, altta yatan heteroplazmik mtDNA mutasyonlarına bağlı birkaç yaygın nörolojik sendromla mitokondriyal hastalığın önemli bir nedenidir4.
Klinik hastalığa neden olan heteroplazmik mtDNA mutasyonu olasılığına katkıda bulunan iki anahtar parametre, heteroplazmi seviyesi ve mtDNA kopya sayısıdır. Birçok heteroplazmik mutasyon bir eşik etkisi gösterir, biyokimyasal ve klinik fenotipler sadece belirli bir heteroplazmi seviyesinin üzerinde, tipik olarak% 80 civarında5 belirginleşir ve daha sonra heteroplazmi daha da arttıkça kötüleşir4. Bununla birlikte, hücrede bulunan mtDNA'nın kopyalarının sayısını da dikkate almak önemlidir, çünkü bu, belirli bir heteroplazmi seviyesinde bulunan vahşi tip (yani 'sağlıklı') mtDNA genomlarının sayısını etkileyecektir. Mitokondriyal hastalık hastalarında yapılan çalışmalar, heteroplazmi ile kopya sayısı5,6 arasındaki bu etkileşimin önemini vurgulamıştır ve Filograna ve ark. yakın zamanda, mitokondriyal hastalığın bir fare modelinde değişmemiş heteroplazmiye rağmen semptomları hafifleten mtDNA kopya sayısında bir artış olduğunu bildirmiştir7.
Son yıllarda mtDNA heteroplazmisinin neden olduğu hastalıkların patogenezi ve iletiminin anlaşılmasını geliştirmek için çok şey yapılmış olsa da, bu çalışmanın çoğu, ortalama doku heteroplazmi seviyelerini ve toplu doku biyopsilerinden ve kan örneklerinden elde edilen kopya sayısı ölçümlerini karşılaştırarak, hücrelerden ziyade dokular düzeyinde gerçekleştirilmiştir. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu gibi bazı köklü teknikler, hücresel düzeyde bu tür ölçümlere izin verir 8,9; Bununla birlikte, yüksek verimli tek hücreli analiz yöntemlerinin veya "Tek Hücreli Omics"10 olarak adlandırılan son patlaması, bu önemli mtDNA parametrelerini tek hücre düzeyinde doğru bir şekilde ölçebilen yöntemler için bir gereklilik yaratmıştır.
Damlacık üretimi PCR yöntemi, örnek DNA11'deki spesifik hedef amplikonların PCR amplifikasyonu yoluyla bilinmeyen DNA konsantrasyonlarını ölçmek için mevcut yöntemleri geliştirmek için mikroakışkan teknolojisindeki son gelişmelerden yararlanır. Numune DNA'sının tek bir reaksiyonda güçlendirildiği qPCR'den farklı olarak, PCR ürününün göreceli birikim hızı okuma görevi görür, bu yöntem ilk numuneyi binlerce bireysel damlacığa böler, böylece numune DNA moleküllerini mekansal olarak ayrı reaksiyonlara bölümlere ayırır12. Sonraki PCR reaksiyonu her bir damlacıkta ilerler, PCR ürünü sadece hedef DNA'yı içeren damlacıklarda birikir. Bu reaksiyonun sonucu, hedef DNA'nın ve güçlendirilmiş PCR ürününün bir kopyasını içeren veya hedef DNA içermeyen bir damlacık havuzu şeklinde dijital bir çıktıdır. Floresan DNA probları veya çift sarmallı (ds) DNA bağlayıcı boya kullanılarak, güçlendirilmiş ürün içeren damlacıklar sayılabilir ve ilk numunede bulunan DNA kopyalarının mutlak sayısını hesaplamak için 'pozitif' ila 'negatif' damlacıkların oranı kullanılabilir. Bu mutlak ölçüm, bir qPCR reaksiyonundan elde edilen bağıl ölçümün aksine, bu metodolojinin tek hücrelerde mtDNA kopya sayısının ve heteroplazminin doğru ölçümü için kullanılmasına izin veren anahtar faktördür11 ve son zamanlarda yapılan birkaç çalışmada damlacık üretimi PCR teknolojisi bu amaçla kullanılmıştır13,14 . Bu makalede, hem insan hem de fare dokusundan tek hücrelerde mtDNA kopya sayısını ve delesyon heteroplazmisini ölçmek için bir yöntem sunulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler ARRIVE yönergelerini takip etti ve Cambridge Üniversitesi Hayvan Refahı Etik İnceleme Organı (AWERB) tarafından onaylandı.
NOT: Damlacık oluşturmadan önceki tüm numune hazırlama adımları, temiz bir PCR öncesi çalışma alanında, ideal olarak mümkün olduğunda UV sterilize edilmiş bir kabinde gerçekleştirilmelidir. Burada açıklanan protokol, belirli damlacık üretimi PCR ekipmanı kullanır ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve genel yöntemin diğer sistemlere uygulanabilir olması gerekirken, burada açıklananlardan farklı olabileceğinden, üreticinin astar / prob konsantrasyonları, PCR döngü koşulları vb. İle ilgili yönergelerine başvurulması önerilir. Bu çalışmada kullanılan hücre hatları / birincil hücreler aşağıdaki gibidir: İnsan HeLa hücreleri (ticari olarak elde edilen), insan HEK 293T hücreleri (ticari olarak elde edilen), birincil insan dermal fibroblast hücreleri (Newcastle Biobank'tan elde edilen), insan cybridleri (C. Moraes, Miami Üniversitesi'nden elde edilen WT & ΔH2.1 delesyon15), fare embriyonik fibroblastları (ölümsüzleştirilmiş, J. Stewart'tan elde edilen C57Bl / 6 farelerden, Newcastle Üniversitesi), fare ilkel germ hücreleri (C57Bl / 6 fare embriyolarından elde edilen) ve fare MII oositleri (yetişkin dişi C57Bl / 6 farelerden elde edilen). Tüm kültürlenmiş hücreler Yüksek Glukoz (4.5g / L) DMEM'de tutuldu ve %5 CO2 ile 37 °C'de %10 fetal sığır serumu desteklendi. Bu çalışmada kullanılan birincil fare hücreleri, İçişleri Bakanlığı Proje Lisansı P6C97520A kapsamında 1986 tarihli Hayvan (Bilimsel Prosedürler) Yasası'na göre tutulan hayvanlardan izole edilmiştir.
1. İlgilenilen DNA dizilerini hedefleyen astar ve prob setleri tasarlayın ve sentezleyin
NOT: Damlacık üretimi PCR, amplikona özgü probların yerine dsDNA bağlayıcı bir boya kullanılarak da gerçekleştirilebilir.
- Astar ve prob dizilerini sistem üreticisi tarafından verilen yönergelere göre tasarlayın. Hem insan 16,17 hem de fare18 hücrelerinde tek hücreli mtDNA kopya sayısı/delesyon heteroplazmisini ölçmek için uygun doğrulanmış primer ve prob dizileri Tablo 1'de verilmiştir. Alternatif hedef dizileri seçerken, aşağıdaki noktaları göz önünde bulundurun.
- Tek bir PCR testinde iki astar/prob setini çoğaltın, ancak iki tahlilin bir FAM etiketli prob ve bir HEX etiketli prob kullandığından emin olun, böylece hedef amplikonlar damlacık okuyucu tarafından ayırt edilebilir. Bu protokol çift yönlü bir prob testi sunar. Dikkatli deneysel tasarımla, çoklama dört hedefe kadar artırılabilir ve alternatif platformlar daha yüksek boyutlu çoklama elde edebilir.
- Ayrı mtDNA dizilerini hedefleyen astar/prob setlerini çoğaltırken, iki astar seti tarafından üretilen amplikonların üst üste binmediğinden emin olun.
- MtDNA delesyonları taşıyan örneklerde heteroplazmi ölçerken, bir hedef amplikonun beklenen silinmiş bölge içinde ve diğerinin beklenen silinen bölgenin dışında kaldığından emin olun.
NOT: Alternatif testler için optimal PCR döngü koşulları, Adım 5.1'de belirtilenlerden farklı olabilir; Tahlil optimizasyonu hakkında daha fazla ayrıntı için Tartışma'ya bakın.
2. DNA'nın tek hücrelerden izolasyonu
NOT: Bu yöntem, 100 hücreye kadar küçük toplu numuneler için de kullanılabilir.
- Floresanla Aktive Edilmiş Hücre Sıralama (FACS)19 veya lazer yakalama mikrodiseksiyonu20 gibi uygun bir yöntem kullanarak tek hücreleri, uygun bir kapta (örneğin, 96 delikli plaka) mümkün olduğunca küçük bir hacimde toplayın. Tek hücreli izolasyondan önce veya sırasında bir hücre canlılığı boyasının kullanılması, ölü hücrelerin izole edilme olasılığını en aza indirecektir. İsterseniz tek hücreleri doğrudan lizis tamponuna ayırın ve analizden önce -80 ° C'de (6 aya kadar) saklayın.
- Hücreleri uygun bir lizis tamponunun küçük bir hacminde (<10 μL) lize edin (bu çalışmada kullanılan tampon adım 2.2.1'de açıklanmıştır).
NOT: Bu çalışmada hücrelerden elde edilen tüm veriler, tek hücreli lizatlardan veya 20 hücreli havuzlardan elde edilmiştir (örnek büyüklükleri şekil açıklamalarında belirtilmiştir). Damlacık üretimi PCR protokolünün damlacık oluşturma adımı sırasında bir yağ/damlacık emülsiyonunun verimli oluşumu, numunedeki deterjanların varlığından önemli ölçüde etkilenebilir; bu nedenle, deneysel numunelere devam etmeden ve en küçük pratik lizis tamponu hacmini kullanmadan önce, tüm hücre lizis tamponlarının amaçlanan giriş konsantrasyonunda damlacık üretimi ile uyumluluğunun doğrulanması önerilir. Aşağıdaki lizis protokolü, damlacık üretim verimliliği üzerinde minimum etki ile sonuçlanır.- 50 mM Tris-HCl pH 8.3,% 1 ARA-20 ve 200 μg / mL Proteinaz K içeren lizis tamponunu hazırlayın.
- Her numuneye 2,5 μL lizis tamponu ekleyin, plakayı yapışkan bir plaka contasıyla kapatın ve ardından numuneleri 4 ° C'de 1 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj edin.
- Plaka kapağında sıvının yoğuşmasını önlemek için numuneleri termosikler üzerinde 30 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin, ısıtmalı kapak 105 °C'ye ayarlanmıştır.
- 10 μL'lik son numune hacmi elde etmek için her numuneye 7,5 μL nükleaz içermeyen su ekleyin, plakayı yeniden kapatın ve ardından numuneleri 4 ° C'de 1 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj edin.
- Proteinaz K'yı inaktive etmek için termosikler üzerinde 15 dakika boyunca 80 ° C'de (ısıtılmış kapak 105 ° C'ye ayarlanmış) inkübe edin.
- Numuneleri 4 ° C'de 1 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın ve ardından buz üzerinde tutun.
- Aşağıdaki 3. adıma geçin.
NOT: Hücre lizatları, adım 3'e devam etmeden önce -20 ° C'de saklanabilir; Bununla birlikte, DNA bozulmasına neden olan donma-çözülme döngüleri riskini ortadan kaldırmak için mümkün olduğunca taze salınımlı DNA kullanın.
3. Numunelerin hazırlanması
NOT: Sonuçların doğruluğunu sağlamak için numunelerin ve şablon dışı kontrollerin (NTC'ler) teknik kopyalarının her bir tahlil plakasına dahil edildiğinden emin olun. Damlacık üretimi PCR testinin dinamik aralığı, reaksiyon başına hedef amplikon'un 120.000 kopyasına kadardır. Tek hücreli veya küçük hacimli numune lizatları için, seyreltmenin gerekli olması muhtemel değildir ve lizat karışımı, mtDNA kopya sayısının ölçümü için doğrudan reaksiyona girilebilir (örneğin; 10 μL'lik bir lizat numunesi, her tahlilde doğrudan 3 μL girişi ile bölünebilir ve üçlü olarak çalıştırılabilir). Bununla birlikte, çok yüksek kopya mtDNA numaralarına (örneğin, oositler) sahip hücrelerden seyreltilmemiş lizat kullanmak veya daha fazla sayıda hücre içeren (örneğin, 50-100) bu dinamik aralığı aşabilir. Bu gibi durumlarda, söz konusu spesifik hücre tipi/hücre numarası için tahlilin doygunluğunu önleyen uygun bir seyreltme faktörünü tanımlamak için ilk seri seyreltme gereklidir (daha fazla ayrıntı için Temsili Sonuçlar'a bakın).
- Buz, girdap üzerindeki tüm reaktiflerin buzunu çözün ve kullanmadan önce kısa bir süre aşağı doğru döndürün.
- Ana karışımı (eksi örnek DNA) buz üzerinde açıklandığı gibi hazırlayın (Tablo 2).
NOT: Yalnızca bir hedef amplikon ölçülüyorsa, 22 μL'lik nihai hacme ulaşmak için numune başına ilave 2,55 μL nükleaz içermeyen su ekleyin. analiz edilecek numune ve NTC sayısı için yeterli ana karışım hazırlayın, ayrıca damlacık üretimi PCR plakasında gerekli olan 'boş' kuyucukları hesaba katacak kadar (bir sonraki adıma bakın). - Vorteks, gerekli hacmi (22 μL eksi giriş DNA hacmi) bir damlacık üretimi PCR 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna karıştırmak ve aliquot etmek için hazırlanan ana karışımı kısaca karıştırın. Numuneleri 96 delikli plaka üzerinde tam sütunlar halinde düzenleyin; eksik sütunlardaki boş kuyucukları ana karışımla doldurun ve NTC olarak kullanın.
- Her numune kuyucuğuna giriş DNA'sını ve NTC kuyularına nükleaz içermeyen su/elüsyon tamponunu ekleyerek her birinin toplam hacmini 22 μL'ye çıkarın.
- Plakayı yapışkan bir plaka contasıyla kapatın ve 1 dakika boyunca 2.000 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirin ve ardından 4 ° C'de bir dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın.
- Plakayı buzun üzerine yerleştirin ve Adım 4'e geçin.
NOT: Hazırlanan plakalar buz üzerinde saklanabilir ve damlacık üretimine geçmeden önce kısa süreler (örneğin, 1-2 saat) ışıktan korunabilir.
4. Damlacık oluşumu
NOT: Bu bölümde atıfta bulunulan damlacık jeneratörü cihaz güvertesinin şeması için Şekil 1A'ya bakın.
- Damlacık jeneratörünü açın.
- Gösterge güvertesinin E konumuna bir şişe damlacık üreten yağ yüklendiğini kontrol edin. İstenirse, şişeyi değiştirmek için ekrandaki talimatları izleyin.
- Dokunmatik ekranda Örnek Plakayı Yapılandır'ı tıklatın. Numune plakasında numune/boşluk içeren tüm sütunları seçin.
NOT: Bu adımda plaka adının ve denemenin ayrıntılarının girilmesi isteğe bağlıdır ve denemeyi kurmaya devam etmek için gerekli değildir. - Plaka yapılandırmasını onaylamak için Tamam'ı tıklatın; Sarf malzemelerinin yüklenmesi gereken konumları belirtmek için gösterge güvertesinde turuncu ışıklar yanar.
- Tüm ışıkların yeşile dönmesi için damlacık jeneratörü kartuşlarını gösterge güvertesinde B konumuna getirin.
- Boş bir uç atık oluğunu, enstrüman güvertesindeki C konumuna yerleştirin.
- Filtre ucu kutularındaki kapakları çıkarın ve tüm ışıkların yeşile dönmesi için cihaz sahnesindeki D konumuna yükleyin.
- Yapışkan plaka contasını numune plakasından çıkarın ve ışığın yeşile dönmesi için alet güvertesinin F konumuna getirin.
- Boş bir damlacık toplama 96 delikli plakayı serin bir bloğa yerleştirin (-20 ° C'de önceden soğutulmuş) ve ışığın yeşile dönmesi için enstrüman güvertesinin G konumuna yükleyin.
- Cihazın dokunmatik ekranında Damlacık Oluşturmayı Başlat'a tıklayın.
- Cihazın dokunmatik ekranında Start Run (Çalıştırmayı Başlat ) düğmesini tıklatın. Cihaz kapağı otomatik olarak kapanacaktır. Başlattıktan sonra, damlacık oluşumu tamamlanana kadar kalan süre cihazın dokunmatik ekranında görüntülenecektir.
- Damlacık üretimi tamamlandıktan sonra, her bir kuyucukta yağ fazının üzerinde bir damlacık emülsiyon tabakasının bulunduğunu doğrulamak için numune toplama plakasını görsel olarak kontrol edin (Şekil 1B).
NOT: Bir damlacık emülsiyon tabakası görünmüyorsa, deneye devam etmeyin ve protokolün önceki adımlarında oluşmuş olabilecek hataları kontrol edin. - Kullanılan sarf malzemelerini cihaz güvertesinden temizleyin ve uç atık oluğunu boşaltın.
- Plaka kapatıcıyı çalıştırın, sıcaklığı 180 ° C'ye ayarlayın ve sızdırmazlık süresini 5 s'ye ayarlayın ve makinenin çalışma sıcaklığına ulaşmasına izin verin.
- Numune toplama plakasını plaka kapatıcı plaka tutucusuna yerleştirin ve plakanın üzerine, kırmızı çizgi yukarı bakacak şekilde taze bir folyo conta yerleştirin. Folyo contanın alt tarafına dokunmamaya dikkat edin.
NOT: Plaka tutucu oda sıcaklığında (RT) saklanmalı ve sadece numune toplama plakasına ısı transferini önlemek için bir folyo conta uygulanırken plaka sızdırmazlık çekmecesine yerleştirilmelidir. - Plaka sızdırmazlık elemanı çalışma sıcaklığına ulaştığında, cihazın dokunmatik ekranında Çıkar düğmesine basın; çekmece otomatik olarak açılacaktır.
- Plaka tutucuyu plaka sızdırmazlık çekmecesine yerleştirin ve Conta'ya basın. Çekmece otomatik olarak kapanacak ve sızdırmazlık tamamlandıktan sonra tekrar açılacaktır.
- Soğuk blok üzerindeki kapalı plakayı değiştirin, plaka kapatıcıyı kapatın ve hemen Adım 5'e geçin.
NOT: Bu aşamada, damlacıklar kararsızdır, bu nedenle PCR adımının damlacık oluşturma işleminin tamamlanmasından sonraki 1 saat içinde başlatıldığından emin olun.
5. PCR
- Kapalı damlacık toplama plakasını, 96 derinliğinde bir kuyucuk bloğu ile donatılmış bir PCR bisikletçisine yerleştirin ve Tablo 3'te açıklanan termal döngü protokolünü çalıştırın.
NOT: Isıtmalı kapak sıcaklığını 105 °C'ye ve numune hacmini 40 μL'ye ayarlayın. - Adım 6'ya geçin.
NOT: Termal döngü protokolü tamamlandıktan sonra, damlacıklar daha kararlıdır ve plaka bir sonraki adıma geçmeden önce 4 ° C'de 4 güne kadar saklanabilir.
6. Damlacık okuma
- Damlacık okuyucuyu ve bağlı bilgisayarı açın.
- Damlacık okuyucu yağı ve damlacık okuyucu atık şişelerindeki sıvı seviyelerini kontrol edin ve gerekirse bunları sırasıyla doldurun / boşaltın.
- PCR sonrası numuneleri içeren plakayı damlacık okuyucu plakası tutucusuna yerleştirin, kapağı tutucunun üstüne yerleştirin ve siyah kilitleme klipsleriyle yerine sabitleyin. Folyo kapağını numune plakasından çıkarmayın.
- Damlacık okuyucuyu açmak için kapağındaki Aç/Kapat düğmesine basın.
- Numune plakasını içeren damlacık okuyucu plakası tutucusunu okuyucu odasına yükleyin ve manyetik tabana güvenli bir şekilde yerleştirin.
- Damlacık okuyucuyu kapatmak için kapağındaki Aç/Kapat düğmesine basın.
- Analiz yazılımı arayüzünü açın, Plaka Ekle sekmesini seçin ve aşağıdaki gibi yeni bir numune plakası hazırlayın:
- Plaka Ekle'yi ve ardından Plakayı Yapılandır'ı tıklatın.
- Plaka Bilgileri sekmesinde bir Plaka Adı girin, Supermix açılır menüsünden Problar için Supermix'i seçin (dUTP yok) ve Veri Dosyasını Farklı Kaydet altına bir dosya adı girin.
- Kuyu Seçimi sekmesinde analiz edilecek kuyuları vurgulayın ve Seçili Kuyuları Dahil Et'i tıklatın.
NOT: 6.7.4 – 6.7.7 arasındaki adımlar isteğe bağlıdır. - Kuyu Bilgileri sekmesinde, açıklama eklenecek kuyuları seçin.
NOT: Kuyu Bilgileri sekmesi arabiriminin bir örneği için Şekil 1B'ye bakın. - Deneme Türü açılır menüsünden Doğrudan Niceleme (DQ) öğesini seçin, Örnek Açıklaması, Örnek Türü ve Hedef Adı kutularını doldurun ve gerektiğinde Kuyu Notları ve/veya Plaka Notları ekleyin.
- Apply'ı (Uygula) tıklayın. Alanlardaki bilgiler seçilen kuyucuklara uygulanacaktır.
- Tüm numune kuyularına açıklama eklenene kadar 6.7.4–6.7.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Plaka yapılandırması tamamlandıktan sonra, Çalıştırmayı Başlat'ı tıklatın.
- Çalıştırma tamamlandığında, boş numune plakasını atın ve gerekirse damlacık okuyucu atık şişesini boşaltın.
- Adım 7'ye geçin.
7. Sonuçların analizi
NOT: Damlacık okuyucu, bir numunedeki her damlacık için FAM ve HEX kanalındaki floresan yoğunluğunu ölçer. Başarılı bir tahlilde, damlacıklar her bir prob için iki kategoriden birine girer: Negatif (hedefin damlacıkta bulunmadığı anlamına gelir) veya Pozitif (hedefin damlacıkta mevcut olduğu anlamına gelir). Numuneleri analiz etmeden önce, her bir kuyucuğun >10.000 damlacık içerdiğinden ve her kanalda düşük floresan (negatif) ve yüksek floresan (pozitif) damlacıklardan oluşan açıkça ayrı iki popülasyona sahip olduğundan emin olun (Şekil 2A).
- Veri Analizi sekmesini seçin ve analiz edilecek dosyayı Veri Dosyalarım menüsünden açın.
- Tek renkli denemeler için 1B Genlik sekmesini veya iki renkli denemeler için 2B Genlik sekmesini tıklatın.
- Pozitif ve negatif damlacıkları ayırt etmek için her kanala bir floresan eşiği uygulayın. Analiz yazılımı, numune bazında ve kanal bazında otomatik bir eşik uygulamaya çalışır, ancak bu başarısız olmuş gibi görünüyorsa veya yanlış görünüyorsa, eşiği aşağıdaki gibi el ile uygulayın:
- Eşik gerektiren kuyucukları seçin.
- Eşik Çizgisi Modu aracını kullanarak genlik grafiğindeki pozitif ve negatif popülasyonlar arasındaki boş alana eşiği el ile uygulayın. 2B görünümde manuel eşikler ayarlarken, artı işaretinin dört damlacık popülasyonunun (çift negatif, tek pozitif FAM, tek pozitif HEX ve çift pozitif) açıkça ayrılacağı şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
NOT: Eşikleme ya iyi bir şekilde yapılabilir ya da aynı anda birden fazla kuyuya uygulanabilir.
- Tüm örneklere bir eşik uygulandıktan sonra, Veri Tablosu sekmesini tıklatıp, İçeri/Dışa Aktar'ı tıklatıp Görünür Verileri CSV'ye Aktar'ı seçerek sonuçları daha fazla analiz için .csv dosyası olarak dışa aktarın. Uygun bir dosya adı girin ve Kaydet'i tıklatın.
- İlk örneklemdeki mtDNA kopya numarasını aşağıdaki gibi hesaplayın:
Kopya Sayısı = mtDNA hedef konsantrasyonu × 22 × toplam lizat girişinin 1/fraksiyonu
NOT: İki mitokondriyal prob kullanılıyorsa, hesaplama yapılmadan önce iki hedefin konsantrasyonunun ortalaması alınır. Birden fazla hücre içeren örnekler için, hücre başına kopya sayısı, örnekteki hücre sayısına bölünerek hesaplanır. .csv dosyasında hesaplanan '20 μL başına kopyalar' değeri yerine, 22 μL'lik ilk numune hacmi ile çarpılan 'Konsantrasyon' değerinin (yani, mikrolitre başına kopya sayısı) kullanılması önemlidir, çünkü damlacık üretecinin gerektirdiği 2 μL fazlalıkta bırakılan mtDNA kopyaları, ilk numunenin mutlak kopya sayısı hesaplanırken dikkate alınmalıdır. - Heteroplazmik mtDNA delesyonları taşıyan hücreler için, silinen bölgenin dışındaki mtDNA hedefinden elde edilen sonuçları kullanarak kopya sayısını hesaplayın (yani, hem silinmiş hem de WT mtDNA moleküllerinde bulunan hedef). Delesyon heteroplazmi, hedefin silinen bölge içindeki ve silinen bölgenin dışındaki hedef konsantrasyonları kullanılarak aşağıdaki gibi hesaplanır:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Damlacık oluşumunu takiben, her bir kuyucuktaki yağ fazının üstünde yüzen şeffaf bir opak damlacık tabakası görülebilir (Şekil 1B). Damlacık oluşumu, tek hücreler üzerinde deneyler yapılırken giriş lizatındaki deterjanların varlığından olumsuz etkilenebilir. 2.1.2.'de açıklanan lizis protokolü kullanılarak, son numunede küçük bir kalıntı miktarda TWEEN-20 bulunmasına rağmen, önerilen 10.000 seviyesinin üzerindeki damlacık verimleri rutin olarak elde edilir (Şekil 1C). Bununla birlikte, tampon RLT Plus gibi diğer lizis tamponlarında, oluşan damlacıkların sayısında dramatik bir azalma görülür (Şekil 1C), bu da kopya sayısı ölçümünün doğruluğunu olumsuz yönde etkileyebilir.
PCR ve damlacık okumasını takiben, her bir numune kuyucuğu için kullanılan kanalların her birinde açıkça ayrılmış pozitif ve negatif damlacık popülasyonları görülecektir (Şekil 2A), NTC kuyuları sadece negatif damlacıklar içerir. Sonuçları analiz ederken karşılaşılabilecek olası sorunlar şunlardır:
Pozitif ve negatif popülasyonlar arasında net bir ayrım olmaması ve iki popülasyon arasındaki boşlukta damlacıkların varlığı, 'yağmur' olarak adlandırılır (Şekil 2B). Bu, özellikle pozitif ve negatif damlacıklar arasındaki floresan farkının nispeten küçük olduğu tahlillerde, optimal olmayan bir tavlama / uzatma sıcaklığı kullanıldığında ortaya çıkabilir. Tavlama/uzatma sıcaklıklarının bir gradyanını çalıştırmak, kullanılacak optimum sıcaklığın belirlenmesine yardımcı olabilir. Alternatif olarak, tahlil performansını artırmak için primerlerin/probların yeniden tasarlanması gerekebilir.
'1D Genlik' görünümünü kullanırken negatif popülasyondaki damlacıkların 'çift bant'ı. Bazı durumlarda, HEX kanalında çift bant negatif damlacık görülebilir (Şekil 2Bii); bu, çift negatif ve tek negatif (yani, FAM-pozitif, HEX-negatif) damlacık popülasyonları arasındaki farklı arka plan floresan seviyelerinin sonucudur, burada görüldüğü gibi (Şekil 2Biii), HEX kanalında çift negatif popülasyondan (sol alt kadran) daha düşük ortalama floresan ile FAM tek pozitif popülasyonu (sol üst kadran) gösterir. Bu floresan artefakt, tahlilin sonuçlarını etkilemez ve '2D Genlik'in kullanımı, dört damlacık popülasyonunun açıkça tanımlanmasını sağlar.
Pozitif damlacıkların yokluğu (Şekil 2C). Doğrulanmış analizler için, bu büyük olasılıkla numune hazırlama sırasındaki bir hatadan kaynaklanmaktadır (örneğin, eksik hücre lizisi, ana karışıma eklenen yanlış primerler/prob, tek hücreli sıralamanın başarısızlığı, vb.).
Negatif damlacıkların yokluğu (Şekil 2D). Bu, tahlil yüksek bir hedef DNA girişi ile doyurulduğunda meydana gelir ve bu da bir veya daha fazla hedef dizisi içeren her damlacıkla sonuçlanır. Bu, yüksek kopya sayısı örneklerini (örneğin, oositler) ölçerken görülmesi muhtemeldir ve adım 3.5'ten önce lizatın seyreltilmesiyle çözülebilir. Giriş DNA'sının seri seyreltilmesi (Şekil 2D), bu sorunla karşılaşıldığında uygun bir seyreltme faktörünü tanımlamak için kullanılabilir.
İki bağımsız mtDNA probu kullanıldığında, örnek DNA'nın bütünlüğü '2D Genlik' görünümü seçilerek değerlendirilebilir: Bozulmamış mtDNA molekülleri her iki hedef dizisini de taşır; bu nedenle, tam mtDNA genomlarını içeren damlacıklar her iki kanalda da pozitif olacaktır (Şekil 3A). mtDNA delesyonları taşıyan numuneleri analiz ederken, parçalanmamış numunelerde bile, sadece silinmemiş hedef dizi için pozitif olan çift pozitif damlacıklar ve damlacıkların bir karışımı mevcut olacaktır (Şekil 3B). mtDNA bozulduğunda, bazı hedef dizilerin ayrı DNA fragmanları üzerinde bulunması muhtemeldir ve bu nedenle damlacıkların sadece bir prob için pozitif olma olasılığı daha yüksektir ve her ikisi için de daha az damlacık pozitif olacaktır (Şekil 3C). Bu farklılıklar veri analizi sırasında hesaba katılır, çünkü konsantrasyonlar her zaman bu floresan kanalındaki tüm pozitif damlacıkların toplam popülasyonu kullanılarak her hedef için bağımsız olarak tahmin edilir ve daha sonra kopya sayısını tahmin etmek için ortalamaya alınır veya heteroplazmiyi hesaplamak için kullanılır (bkz. adım 7.3.-7.4).
Bu yöntem, HeLa, HEK 293T gibi laboratuvar hücre hatları ve ölümsüzleştirilmiş fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) ve insan dermal fibroblastları ve fare ilkel germ hücreleri (PGC'ler) gibi birincil hücreler de dahil olmak üzere hem fare hem de insan dokularından çok çeşitli hücre tiplerinde kopya sayısını ölçmek için kullanılabilir (Şekil 4A). Test edilen somatik hücre tiplerinde, birkaç yüzden (örneğin, dermal fibroblastlar) birkaç bine (örneğin, HeLa hücreleri) kadar bir dizi kopya sayısı görülür. Tahlil hassasiyetini ölçmek için, çok yüksek bir kopya sayısına (hücre başına >150.000 kopya)2 sahip olgun fare oositleri lize edildi ve elde edilen lizat, hücre başına 22 ayrı reaksiyona eşit olarak bölündü. Damlacık üretimi PCR protokolünü çalıştırdıktan sonra, her reaksiyonda tespit edilen kopya sayısında çok az fark görüldü, iki temsili hücre (Şekil 4B) oosit başına toplam 229.647 kopya (kuyu başına ortalama 10.439, standart sapma 380) ve 330.121 kopya (kuyu başına ortalama 15.006, standart sapma 340) verdi. Bu iki hücre için varyasyon katsayıları (CV) sırasıyla %3.64 ve %2.26 idi. Biyolojik örnekler arasında tekrarlanabilirliği test etmek için, PGC'ler gebe kaldıktan sonraki 13.5. günde dört embriyonik farenin gonadlarından toplandı ve bu hücre popülasyonlarının ortaya çıkan tek hücreli kopya sayısı farklı embriyolar arasında karşılaştırıldı (Şekil 4C). Bazı biyolojik varyasyonlar beklenirken, ortalama kopya sayısı ve standart sapma, test edilen dört embriyo arasında karşılaştırılabilir kalmıştır ve bu sonuçlar, embriyonik gelişimin benzer bir aşamasında bu hücre tipinde daha önce bildirilen kopya sayısı verileriyle uyumludur21.
Kopya sayısını ölçmeye ek olarak, bu yöntem heteroplazmik mtDNA delesyonunu taşıyan sibrid hücrelerinde heteroplazmi seviyesini ölçmek için de kullanılabilir. Bu, biri mtDNA'nın silinmiş bölgesinin içine düşen ve diğeri dışında kalan iki mtDNA probunun kullanılmasını gerektirir (Şekil 5A). Analizden sonra, heteroplazmi seviyesi, her iki hedefi (yani, WT mtDNA genomları) içeren kopyaların oranını ve sadece silinen bölgenin dışında kalan probu (yani, silinmiş mtDNA genomları) içeren oranı hesaplamak için her bir probun konsantrasyonunu karşılaştırarak bulunabilir. adım 7.4'te açıklandığı gibi. Silinen bölgenin dışında bulunan hedef tüm mtDNA kopyalarında bulunduğundan, bu hücrenin toplam kopya sayısını hesaplamak için de kullanılabilir. Yüksek delesyon heteroplazmisine sahip hücrelerde, silinen bölge içindeki probun nispeten az sayıda kopyası tespit edilir (Şekil 5Bi), düşük delesyon heteroplazmisine sahip hücrelerde, iki probun konsantrasyonları çok daha benzerdir (Şekil 5Bii). Toplu ekstrakte edilmiş DNA örneklerinde damlacık üretimi PCR ile delesyon heteroplazmsını ölçmek için 'içeri-dışarı' prob testlerinin kullanılması, qPCR tabanlı yöntemlere göre daha yüksek hassasiyet göstermiştir, ancak çok düşük heteroplazmi seviyeleri (% <5) ile uğraşırken duyarlılıktan yoksundur ve bu nedenle çok küçük delesyon yüklerine sahip hücrelerde önerilmez. Tablo 1'de tarif edilen hem fare hem de insan mtDNA'sı için primer / prob setleri, mtDNA majör arkı içinde bir hedef ve dışarıda bir hedef içerir ve bu nedenle en yaygın mtDNA delesyonları23,24 için uygundur.
| Tür | Hedef | Astar/Prob Adı | Sıra | 5' Prob | 3' Quencher | ||
| İnsan | ND4 Serisi | huND4_F Astar | AGTGCGATGAGTAGGGGAAGG | ||||
| huND4_R Astar | ACCTTGGCTATCATCACCCGAT | ||||||
| huND4_FAM Probu | CAACCAGCCAGAACGCCTGAACGCA | cesaret | BHQ 2 | ||||
| ND1 | huND1_F Astar | GGGTTCATAGTAGAAGAGCGATGG | |||||
| huND1_R Astar | ACGCCATAAAACTCTTCACCAAAG | ||||||
| huND1_HEX Probu | ACCCGCCACATCTACCATCACCCTC | BÜYÜ | BHQ 1 | ||||
| Fare | ND1 | musND1_F Astar | GAGCCTCAAACTCCAAATACTCACT | ||||
| musND1_R Astar | GAACTGATAAAAGGATAATA GCTATGGTTACTTCA |
||||||
| musND1_FAM Probu | CCGTAGCCCAAACAAT | cesaret | BHQ 1 | ||||
| COX3 Serisi | musCOX3_F Astar | CCTCGTACCAACACATGATCTAGG | |||||
| musCOX3_R Astar | AGTGGGACTTCTAGAGGGTTAAGTG | ||||||
| musCOX3_HEX Probu | ACCTCCAACAGGAATTTCA | BÜYÜ | BHQ 1 | ||||
Tablo 1: İnsan ve fare hücrelerinde kullanılmak üzere doğrulanmış damlacık üretimi PCR primer ve prob setleri. İnsan 16,17 ve fare hücreleri18 için iki bağımsız mtDNA hedefini yükselten daha önce doğrulanmış tahliller için primer ve prob setleri.
| Parça | Örnek başına hacim | Son Konsantrasyon |
| Problar için 2X ddPCR Supermix (dUTP yok) | 11 μl | 1X |
| Hedef 1 Astar F (20 μM) | 1 μl | 900 nM |
| Hedef 1 Astar R (20 μM) | 1 μl | 900 nM |
| Hedef 2 Astar F (20 μM) | 1 μl | 900 nM |
| Hedef 2 Astar R (20 μM) | 1 μl | 900 nM |
| Hedef 1 Probu (FAM, 10 μM) | 0,55 μl | 250 nM |
| Hedef 2 Probu (HEX, 10 μM) | 0,55 μl | 250 nM |
| Örnek DNA (adım 3.4'te eklenmiştir) | Değişken | Değişken |
| Nükleaz içermeyen su | Değişken | |
| Toplam Hacim | 22 μl |
Tablo 2: Damlacık oluşumu PCR reaksiyonu karışımı tarifi. Tek kuyucuklu damlacık üretimi PCR testi için reaksiyon karışımı gereklidir. Önerilen astar/prob dizileri Tablo 1'de bulunabilir; tarif, birden fazla numune çalıştırılırken büyütülebilir.
| Adım | Sıcaklık (°C) | Saat | Hayır. Döngü |
| Enzim Aktivasyonu | 95 | 10 dk | 1 |
| Denatürasyon | 94 | 30 saniye | 40 |
| Tavlama/Uzatma | 58 | 1 dk | |
| Enzim Deaktivasyonu | 98 | 10 dk | 1 |
| Tutmak | 4 | Sonsuz | 1 |
Tablo 3: Damlacık üretimi PCR termal döngü protokolü. Damlacık oluşumunu takiben hedef DNA'nın amplifikasyonu için döngü protokolü.
Şekil 1: Damlacık üretimi. (A) Damlacık üretimi PCR damlacık jeneratörü cihaz güvertesinin şematik düzeni, aşağıdaki gibi konumlar: A = otomatik sıvı taşıma modülü, B = damlacık jeneratörü kartuşu (x3), C = uç atık kovası, D = filtre uç kutusu (x2), E = damlacık jeneratörü yağ tutucusu, F = numune plakası, G = toplama plakası (soğuk blokta bulunur). (B) Damlacık oluşumundan hemen sonra yağ fazının üzerinde yüzen damlacık emülsiyonunun temsili görüntüsü. (C) Farklı lizis tamponlarının damlacık sayısı üzerindeki etkisi; % 1 ARA-20 ile damlacık sayısında küçük bir azalma olurken, RLT Plus tamponu, damlacık sayılarında, önerilen 10.000 sayısının çok altında, neredeyse üç kat azalmaya neden olur (sonuçlar, standart sapmalarla koşul başına üç teknik tekrarın ortalaması olarak gösterilmiştir). (D) 96 kuyucuklu bir şablonun A1 kuyusuna uygulanan tamamlanmış örnek bilgileri gösteren yazılım Kuyu Bilgileri sekmesinin ekran görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Beklenen sonuçları ve ortak sorunları gösteren temsili damlacık üretimi PCR testi analizleri. (A) Çift mtDNA probu testi, (i) FAM kanalında, (ii) HEX kanalında ve (iii) kombine 2D genlik görünümünde açıkça ayrılmış pozitif ve negatif damlacık popülasyonlarını gösteren üç HeLa tek hücreli lizattan elde edilen sonuçlardır. (B) (i) FAM kanalındaki pozitif ve negatif popülasyonlar arasında 'yağmur' gösteren dört toplu HeLa 20 hücreli numuneden elde edilen tahlil sonuçları, (ii) HEX kanalındaki pozitif ve negatif damlacıklar arasındaki zayıf ayrım ve (iii) HEX kanalının negatif damlacıklarında bir çift damlacık bandı (ii) HEX negatif popülasyonlarındaki farklı arka plan floresan seviyeleri nedeniyle, 2B genlik görünümünde görüldüğü gibi. (C) Her iki floresan kanalında da pozitif damlacık içermeyen WT cybrid tek hücreli lizat örneği, karşılaştırma için aynı deneyden (ii) başarılı bir WT cybrid testi ile. (D) PCR ile güçlendirilmiş insan ND1 hedef amplikonunun bilinen konsantrasyona sahip 10 kat seri seyreltilmesinden elde edilen temsili sonuçlar, damlacık üretimi PCR'nin 120.000 kopyalık tahlil üst sınırının üzerinde doygunluğunu gösterir. RFU = Bağıl Floresan Birimleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: '2D Genlik' görünümünü kullanarak mtDNA bütünlüğünün değerlendirilmesi . (A) Temsili damlacık üretimi PCR, esas olarak FAM ve HEX çift pozitif damlacıkların varlığı ile gösterilen, çoğunlukla bozulmamış mtDNA genomları içeren bir WT cybrid tek hücreli lizattan elde edilir. (B) Damlacık üretimi PCR, HEX tek pozitif damlacıkların (sadece HEX hedefini taşıyan silinmiş mtDNA moleküllerini içeren) ve FAM ve HEX çift pozitif damlacıkların (her iki hedefi de taşıyan tam mtDNA moleküllerini içeren) bir karışımını gösteren heteroplazmik delesyon sibrid tek hücreli lizattan kaynaklanır, çok az FAM tek pozitif damlacık ile, büyük bir mtDNA bozulması olmadığını gösterir. (C) Damlacık üretimi PCR, FAM tek pozitif, HEX tek pozitif ve FAM ve HEX çift pozitif damlacıkların bir karışımını içeren bir fare oosit tek hücreli lizattan kaynaklanır ve bu örnekte bazı mtDNA bozulmalarının meydana gelmiş olabileceğini gösterir. RFU = Bağıl Floresan Birimleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Tek hücreli kopya sayısı ölçümleri, hücre tipleri arasındaki varyasyonu ortaya koymaktadır, ancak sağlam iç ve deneyler arası tekrarlanabilirlik göstermektedir. (A) Hem insan (kareler) hem de fare (üçgenler) dokularından (n = doku başına 12 hücre) bir dizi hücre çizgisinden temsili tek hücreli kopya sayısı ölçümleri. (B) İki ayrı fare oositinden lizattaki kopya sayısının seri ölçümü; toplam lizat hacmi 22 ayrı damlacık üretimi PCR reaksiyonuna bölündü; kutu ve bıyık grafiklerindeki her nokta, tek bir kuyucukta ölçülen kopya sayısını temsil eder. Her oosit için ortalama, standart sapma (SD) ve varyasyon katsayısı (CV) bildirilir. (C) Döllenmeden sonraki 13,5 günde dört ayrı embriyodan toplanan birincil fare ilkel germ hücrelerinin tek hücreli kopya sayısı (n = embriyo başına 94 tek hücre). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Bir delesyon cybrid hattında tek hücreli heteroplazmilerin ölçülmesi . (A) Bu çalışma için kullanılan cybrid hattında silinen mtDNA bölgesini ve ND1 ve ND4 mtDNA problarının yerini gösteren şema. (B) (i) yüksek heteroplazmlı tek hücreli lizattan ve (ii) ND4:ND1 probunun farklı oranlarını ve bunun sonucunda ortaya çıkan kopya sayısını ve heteroplazmi ölçümlerini gösteren düşük heteroplazmiye sahip tek hücreli lizattan elde edilen temsili sonuçlar. RFU = Bağıl Floresan Birimleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol, yukarıda tartışılanlara ek olarak çok çeşitli hücre tipleri ve türleri arasında uygulanabilir, ancak yeni tahlil tasarımlarının dikkatli optimizasyonu, daha önce doğrulanmış primer / prob kombinasyonlarından uzaklaşırken yöntemin doğruluğunun ve tekrarlanabilirliğinin korunmasını sağlamak için anahtar olacaktır. Tek hücrelerle çalışırken, elde edilen sonuçların tek tek hücrelerinkileri gerçekten yansıttığından emin olmak için numune toplamanın mümkün olduğunca doğru bir şekilde yapılmasını sağlamak (örneğin, hücreleri FACS'a göre sıralarken katı tek hücreli parametreler kullanmak) ve ayrıca tüm hazırlık çalışmalarının kontaminasyon riskini azaltmak için temiz bir PCR öncesi alanda yapılmasını sağlamak hayati önem taşır. Etkili hücre lizisi, mtDNA kopyalarının ayrı damlacıklara başarılı bir şekilde bölümlere ayrılabilmesini sağlamak için de kritik öneme sahiptir; Bununla birlikte, bunun daha yüksek konsantrasyonlarda deterjan kullanıldığında damlacık oluşumunu bozma riskine karşı dengelenmesi gerekir.
Tahlil tasarımı ve lizis adımlarının protokolde en kritik olması nedeniyle, bunlar aynı zamanda sorun giderme gerektirme olasılığı en yüksek adımlardır. Başlangıçta iyi ayrılmış pozitif ve negatif damlacık popülasyonları üretmeyen primer / prob setleri, PCR protokolünün tavlama / uzatma sıcaklığı optimize edilirse gelişmiş performans gösterebilir. Adım 5.1'de verilen 58 ° C'lik önerilen sıcaklık. astar/prob setleri için doğrulanmıştır (Tablo 1); Bununla birlikte, optimum sıcaklık 55-65 ° C arasında değişebilir ve yeni astar / prob setleri için en uygun sıcaklığı bulmak için bu aralıkta bir gradyan PCR çalıştırılabilir. Bu başarısız olursa, tahlil tasarımıyla ilgili üretici yönergelerine atıfta bulunarak performansı artırmak için astarların ve / veya probların yeniden tasarlanması gerekebilir (bkz.
Adım 2.1.2'de açıklananlardan farklı lizis koşulları varsa. gereklidir, daha sonra alternatif lizis tamponunun damlacık oluşumu üzerindeki etkisi değerlendirilmelidir. Lizis tamponundaki deterjan konsantrasyonunu azaltarak veya lizatı daha büyük miktarda nükleaz içermeyen suda seyrelterek damlacık oluşumunu iyileştirmek mümkün olabilir, ancak bazı tamponların (örneğin, RLT Plus tamponu) çok düşük konsantrasyonlarda bile damlacık oluşumu üzerinde hala önemli bir etkiye sahip olduğunu bulduk. Bu sorunun olası bir çözümü, DNA'nın lizis sonrası temizliğini yapmaktır, örneğin DNA'yı bağlamak ve deterjanların yıkanmasına izin vermek için SPRI boncukları kullanmaktır. SPRI boncukları, hem genomik DNA25 hem de mtDNA26'yı tek hücreli lizatlardan arındırmak için kullanılırken, bu işlem sırasında mtDNA genomlarının herhangi bir kaybı, sonraki kopya sayısı ölçümünü etkileyecektir ve şu anda tek hücreli lizatlar üzerinde ticari olarak temin edilebilen SPRI boncuk ürünlerini kullanırken bu potansiyel hata kaynağını ölçen hiçbir veri yoktur.
Geleneksel olarak, mtDNA kopya sayısı ve delesyon heteroplazmi, qPCR testleri27 kullanılarak ölçülmüştür. qPCR yaklaşımının altında yatan kavram, burada açıklanan damlacık üretimi PCR tekniğine çok benzer olsa da, qPCR kullanmanın en büyük dezavantajlarından biri, mutlak kopya sayısı11'i doğrudan ölçememesidir. Her numune için qPCR, ilk giriş DNA'sından belirli bir miktarda ürüne ulaşmak için gereken PCR döngü sayısı olan bir döngü eşiği (ct) değerini ölçer. Bu eşik keyfi olduğundan, numunelere mutlak kopya numaraları atanmadan önce bir dizi bilinen hedef konsantrasyonu içeren girdilerden standart bir eğri oluşturmak gerekir. Toplu DNA düzeyinde, bu işlem çok doğrudur ve mtDNA kopya sayısını ölçme kabiliyetinde damlacık üretimi PCR ile karşılaştırılabilir. Bununla birlikte, tipik olarak tek hücrelerde bulunanlar gibi çok düşük kopya sayılarında, qPCR için standart eğrileri doğru bir şekilde oluşturmak giderek zorlaşır ve bu nedenle mutlak kopya sayısı11'in doğru ölçümlerini elde etmek zorlaşır. Damlacık üretimi PCR'nin şu anda qPCR'den daha pahalı olduğu, sarf malzemelerinin ve reaktiflerin daha yüksek ilk ekipman maliyetlerine ek olarak, numune başına kabaca 2,5 kat daha pahalı olduğu belirtilmelidir. Bu, damlacık üretimi PCR'nin maliyetinin belirli yüksek verimli uygulamalar için engelleyici olabileceği anlamına gelir, bu durumda qPCR hala geçerli bir alternatifi temsil eder.
Damlacık üretimi PCR, bir numunede bulunan belirli bir hedefin kopya sayısını doğrudan ölçtüğünden, mutlak kopya sayısını ölçerken standart bir eğriye gerek yoktur ve damlacık üretimi PCR yöntemi bu nedenle çok az miktarda girdi DNA11,12 ile bile son derece hassastır. Mitokondriyal biyoloji alanında tek hücreli teknolojilerin ortaya çıkan önemi göz önüne alındığında, bu damlacık üretimi PCR tabanlı yaklaşım, önceki metodolojilere göre önemli bir ilerlemeyi temsil eder ve tek hücreli ortamda anahtar mitokondriyal parametrelerin sürekli ölçülmesine izin verir. Toplu doku örneklerinden ekstrakte edilen DNA'daki mtDNA kopya sayısını ölçmek için damlacık üretimi PCR'yi kullanmak da mümkündür; bu, hücre numarasına normalleşmeye izin vermek için mtDNA kopya numarasına ek olarak nükleer DNA kopya numarasının ölçülmesini gerektirir. Bu nedenle, mtDNA'yı hedefleyen bir astar/prob setinin yanı sıra nükleer geni hedefleyen bir astar/prob setinin dahil edilmesi gerekmektedir. Yukarıda belirtildiği gibi, dökme doku düzeyinde, damlacık üretimi PCR ve standart qPCR yöntemleri karşılaştırılabilir doğruluktadır ve bu nedenle, damlacık üretimi PCR, bu ortamdaki mevcut teknolojilere göre önemli avantajlar sunmaz.
Burada sunulan yöntemin önemli bir sınırlaması, mtDNA delesyonları yerine heteroplazmik SNP'ler taşıyan hücrelerde heteroplazmi seviyelerinin ölçülememesidir, bu nedenle tek bir hücreden hem kopya sayısını hem de heteroplazmiyi ölçmek için ek bir tahlil (örneğin, pirosekanslama veya qPCR) gerektirir. Bu platformu kullanarak Alele özgü ekspresyonu (ASE) gösteren SNP'lerin başarılı bir şekilde saptanması bildirilmiştir28 ve yakın tarihli bir raporda, ortak m.3243A>G MELAS mutasyonu29'un heteroplazmisini ölçmek için bu yöntemin kullanımı açıklanmıştır. Bu nedenle, bu sınırlamanın dikkatlice tasarlanmış prob çiftleri kullanılarak üstesinden gelinebileceği görülse de, her bir SNP için tasarlanacak / doğrulanacak ayrı bir astar / prob seti gerektirir ve tasarım parametreleri, mtDNA dizisindeki belirli bir tabanı hedeflemek için problara duyulan ihtiyaçla çok daha sınırlıdır. Bu nedenle, SNP tespitinin burada açıklanan damlacık oluşturma PCR protokolüne dahil edilmesi henüz denenmemiştir.
Bu çalışmada kullanılan tip gibi damlacık bazlı dijital PCR platformlarının, DNA hedeflerinin mutlak niceliğini yapabilen tek teknoloji olmadığını ve ayrıca plaka tabanlı bölümleme gibi alternatif yöntemler kullanan ticari ürünlerin de mevcut olduğunu belirtmek önemlidir30. Ayrıca, döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP)31 ve rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA)32 gibi PCR'ye alternatifler kullanan teknolojilerin, klinik ortamlarda kullanım için damlacık üretimi PCR'den daha uygun olduğu kanıtlanabilir.
Genel olarak, bu protokol, mtDNA kopya sayısını ve tek hücrelerdeki delesyon heteroplazmisini ölçmek için çok çeşitli farklı hücre tiplerine ve türlerine uygulanabilen oldukça hassas bir yöntem sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Açıklanacak çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Dr. L Bozhilova'ya damlacık üretimi PCR verilerinin istatistiksel analizi konusunda tavsiyeleriniz için teşekkür ederiz. Dr. H Zhang'a, Şekil 3C ve Şekil 4B'de veri üretmek için kullanılan oositleri sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Cambridge Üniversitesi Tıbbi Araştırma Konseyi Mitokondriyal Biyoloji Birimi'nde (MC_UU_00015 / 9) SPB tarafından yürütülmüş ve PFC (212219 / Z / 18 / Z) tarafından düzenlenen Wellcome Trust Principal Research Fellowship tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Tween-20 solution | Novex | 3005 | |
| Automated droplet-generating oil | Bio Rad | 1864110 | Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1) |
| C1000 PCR machine with deep-well block | Bio Rad | 1851197 | PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5) |
| Collection plate cooling block | Bio Rad | 12002819 | Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3) |
| ddPCR 96-well plates | Bio Rad | 12001925 | 96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3) |
| ddPCR droplet reader oil | Bio Rad | 1863004 | Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1) |
| ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio Rad | 1863023 | Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3) |
| DG32 automated droplet generator cartridges | Bio Rad | 1864108 | Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3) |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Qualified fetal bovine serum |
| Foil plate covers | Bio Rad | 1814040 | Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6) |
| HEK 293T cells | Takara | 632180 | Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen |
| HeLa cells | ECACC | 93021013 | Human cervix epitheloid carcinoma cells |
| High glucose DMEM | Gibco | 13345364 | 4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Human cybrids | University of Miami | ||
| Mouse embryonic fibroblasts | Newcastle University | Immortalized from C57Bl/6 mice | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PCR plate seals | Pierce | SP-0027 | Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6) |
| Pipet Tip Waste Bins | Bio Rad | 1864125 | Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Pipet tips for AutoDG system | Bio Rad | 1864120 | Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Primary human dermal fibroblast cells | Newcastle Biobank | ||
| Primers/Probes | IDT | N/A | Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1 |
| Proteinase K 20 mg/mL solution | Ambion | AM2546 | |
| PX1 PCR plate sealer | Bio Rad | 1814000 | Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6) |
| QX Manager software | Bio Rad | 12012172 | Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7) |
| QX200 AutoDG droplet generator | Bio Rad | 1864101 | Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4) |
| QX200 droplet reader | Bio Rad | 1864003 | Droplet reader (used in Protocol Step 6) |
| Trizma pre-set crystals pH 8.3 | Sigma | T8943-100G |
References
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Wai, T., et al. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility. Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).
- D'Erchia, A. M., et al. Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity. Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A-->G. American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).
- Liu, H., et al. Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases. PloS One. 8 (6), 67146 (2013).
- Filograna, R., et al. Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Wang, Y., et al. The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues. Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).
- Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF). American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).
- Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Herbst, A., et al. Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).
- O'Hara, R., et al. Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution. Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).
- Diaz, F., et al. Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).
- Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells. Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).
- Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis. Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).
- Perier, C., et al. Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms. Brain. 136, Pt 8 2369-2378 (2013).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Espina, V., et al.
- Cree, L. M., et al. A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes. Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).
- Belmonte, F. R., et al. Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions. Scientific Reports. 6, 25186 (2016).
- Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. Two direct repeats cause most human mtDNA deletions. Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).
- Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation. Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).
- Macaulay, I. C., et al. Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&T-seq. Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).
- Ludwig, L. S., et al. Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics. Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).
- Rooney, J. P., et al. PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species. Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).
- Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression. Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).
- Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 10821 (2020).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E.
- Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane. ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).
- Li, Z., et al. Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care. Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952 (2021).
