Summary
Her præsenterer vi en protokol til måling af absolut mitokondrie (mt) DNA-kopinummer og mtDNA-sletning heteroplasmaniveauer i enkeltceller.
Abstract
Pattedyrs mitokondrie-DNA (mt) er et lille, cirkulært, dobbeltstrenget, intra-mitokondrie-DNA-molekyle, der koder for 13 underenheder af elektrontransportkæden. I modsætning til det diploide nukleare genom indeholder de fleste celler mange flere kopier af mtDNA, der spænder fra mindre end 100 til over 200.000 kopier afhængigt af celletype. MtDNA-kopinummer bruges i stigende grad som biomarkør for en række aldersrelaterede degenerative tilstande og sygdomme, og dermed bliver nøjagtig måling af mtDNA-kopinummeret et nøgleværktøj i både forskning og diagnostiske indstillinger. Mutationer i mtDNA, der ofte forekommer som enkeltnukleotidpolymorfier (SNP'er) eller deletioner, kan enten eksistere i alle kopier af mtDNA i cellen (kaldet homoplasmati) eller som en blanding af muterede og WT mtDNA-kopier (kaldet heteroplasmatik). Heteroplasmatiske mtDNA-mutationer er en væsentlig årsag til klinisk mitokondriepatologi, enten i sjældne sygdomme eller i et stigende antal almindelige senfølgesygdomme som Parkinsons sygdom. Bestemmelse af niveauet af heteroplasma, der er til stede i celler, er et kritisk skridt i diagnosen af sjældne mitokondriesygdomme og i forskning, der sigter mod at forstå almindelige senindsættende lidelser, hvor mitokondrier kan spille en rolle. MtDNA-kopinummer og heteroplasmi er traditionelt blevet målt ved kvantitative (q) PCR-baserede assays eller dyb sekventering. Den nylige introduktion af ddPCR-teknologi har imidlertid givet en alternativ metode til måling af begge parametre. Det giver flere fordele i forhold til eksisterende metoder, herunder evnen til at måle absolut mtDNA-kopinummer og tilstrækkelig følsomhed til at foretage nøjagtige målinger fra enkeltceller selv ved lave kopinumre. Her præsenteres en detaljeret protokol, der beskriver målingen af mtDNA-kopinummer i enkeltceller ved hjælp af ddPCR, kaldet dråbegenerering PCR fremover, med mulighed for samtidig måling af heteroplasma i celler med mtDNA-deletioner. Muligheden for at udvide denne metode til at måle heteroplasma i celler med mtDNA SNP'er diskuteres også.
Introduction
Mammalian mitokondrie (mt) DNA er et lille (ca. 16,5 Kb), cirkulært DNA-genom, der befinder sig i mitokondriematrixen, der koder for 37 gener, der omfatter to rRNA'er, 22 tRNA'er og 13 proteinkodende gener1. I modsætning til det nukleare genom, som indeholder en (haploid) eller to (diploide) kopier af hvert gen pr. celle, er mtDNA til stede i flere kopier i mitokondrierne i hver celle, lige fra snesevis af kopier (f.eks. Modne spermatocytter) til hundredtusinder af kopier (f.eks. Oocytter)2,3. En konsekvens af denne multi-copy natur er, at mutationer i mtDNA-genomet, som kan eksistere som enkeltnukleotidpolymorfier (SNP'er), deletioner eller duplikationer, kan være til stede på forskellige niveauer i en given celle, der udgør alt fra 0% til 100% af cellens samlede mtDNA-population. Eksistensen af vildtype- og mutante mtDNA-genomer i samme celle kaldes heteroplasmatisk, og patogene heteroplasmatiske mtDNA-mutationer er en væsentlig årsag til mitokondriesygdom med flere almindelige neurologiske syndromer forbundet med underliggende heteroplasmatiske mtDNA-mutationer4.
To nøgleparametre, der bidrager til sandsynligheden for, at en heteroplasmisk mtDNA-mutation, der forårsager klinisk sygdom, er heteroplasminiveauet og mtDNA-kopinummeret. Mange heteroplasmatiske mutationer viser en tærskeleffekt, hvor biokemiske og kliniske fænotyper kun bliver synlige over et bestemt heteroplasminiveau, typisk omkring 80%5, og efterfølgende forværres, da heteroplasmi stiger yderligere4. Det er dog også vigtigt at overveje antallet af kopier af mtDNA, der er til stede i cellen, da dette vil påvirke antallet af vildtype (dvs. 'sunde') mtDNA-genomer, der er til stede på et givet heteroplasminiveau. Undersøgelser af patienter med mitokondrie har fremhævet vigtigheden af dette samspil mellem heteroplasma og kopi nummer5,6, og Filograna et al. rapporterede for nylig en stigning i mtDNA-kopinummer, der lindrer symptomer på trods af uændret heteroplasmi i en musemodel af mitokondriesygdom7.
Mens der i de senere år er gjort meget for at forbedre forståelsen af patogenese og overførsel af sygdomme forårsaget af mtDNA-heteroplasmi, er det meste af dette arbejde blevet udført på vævsniveau snarere end celler, sammenligning af gennemsnitlige vævs heteroplasmaniveauer og kopinummermålinger erhvervet fra bulkvævsbiopsier og blodprøver. Nogle veletablerede teknikker, såsom laserfangstmikrodissektion, giver mulighed for sådanne målinger på celleniveau 8,9; Den nylige eksplosion af enkeltcelleanalysemetoder med høj kapacitet eller såkaldt "Single-cell Omics"10 har imidlertid skabt et krav om metoder, der nøjagtigt kan måle disse afgørende mtDNA-parametre på enkeltcelleniveau.
Dråbegenerering PCR-metoden udnytter de seneste fremskridt inden for mikrofluidisk teknologi til at forbedre eksisterende metoder til kvantificering af ukendte DNA-koncentrationer via PCR-amplifikation af specifikke målampliconer i prøve-DNA'et11. I modsætning til qPCR, hvor prøve-DNA'et amplificeres i en enkelt reaktion, hvor den relative akkumuleringshastighed af PCR-produkt fungerer som udlæsning, opdeler denne metode den oprindelige prøve i tusindvis af individuelle dråber og opdeler således prøve-DNA-molekylerne i rumligt adskilte reaktioner12. Den efterfølgende PCR-reaktion fortsætter i hver enkelt dråbe, hvor PCR-produktet kun akkumuleres i dråber, der indeholder mål-DNA'et. Resultatet af denne reaktion er et digitalt output i form af en pulje af dråber, der enten indeholder en kopi af mål-DNA'et og forstærket PCR-produkt eller ikke indeholder mål-DNA. Ved hjælp af fluorescerende DNA-sonder eller et dobbeltstrenget (ds) DNA-bindende farvestof kan dråberne indeholdende amplificeret produkt tælles, og forholdet mellem 'positive' og 'negative' dråber kan bruges til at beregne det absolutte antal DNA-kopier, der var til stede i den oprindelige prøve. Denne absolutte måling, i modsætning til den relative måling erhvervet fra en qPCR-reaktion, er nøglefaktoren, der gør det muligt at bruge denne metode til nøjagtig måling af mtDNA-kopinummer og heteroplasmi i enkeltceller11, og flere nylige undersøgelser har allerede brugt dråbegenerering PCR-teknologi til dette formål13,14 . Denne artikel præsenterer en metode til måling af mtDNA-kopinummer og sletning heteroplasma i enkeltceller fra både humant og musevæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter fulgte ARRIVE-retningslinjerne og blev godkendt af University of Cambridge Animal Welfare Ethical Review Body (AWERB).
BEMÆRK: Alle prøveforberedelsestrin inden dråbegenerering skal udføres i et rent præ-PCR-arbejdsområde, ideelt i et UV-steriliseret skab, hvor det er muligt. Den her beskrevne protokol anvender specifikt PCR-udstyr til dråbegenerering (se Materialetabel), og selvom den generelle metode bør kunne anvendes på andre systemer, anbefales det at konsultere producentens retningslinjer vedrørende primer/sondekoncentrationer, PCR-cyklusforhold osv., da de kan afvige fra dem, der er beskrevet her. Cellelinjer/primære celler, der blev anvendt i denne undersøgelse, var som følger: Human HeLa-celler (kommercielt fremstillet), humane HEK 293T-celler (kommercielt fremstillet), primære humane dermale fibroblastceller (opnået fra Newcastle Biobank), humane cybrider (WT & ΔH2.1 deletion15, opnået fra C. Moraes, University of Miami), museembryonale fibroblaster (udødeliggjort, fra C57Bl/6 mus, opnået fra J. Stewart, Newcastle University), musens primære kimceller (opnået fra C57Bl/6 museembryoner) og muse-MII-oocytter (opnået fra voksne C57Bl/6-mus). Alle dyrkede celler blev opretholdt i høj glucose (4,5 g / L) DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C med 5% CO2. Primære museceller, der blev brugt i denne undersøgelse, blev isoleret fra dyr, der blev holdt i henhold til Animal (Scientific Procedures) Act 1986 under Home Office Project License P6C97520A.
1. Design og syntetiser primer- og sondesæt rettet mod DNA-sekvenser af interesse
BEMÆRK: Dråbegenerering PCR kan også udføres ved hjælp af et dsDNA-bindende farvestof i stedet for de amplicon-specifikke sonder.
- Design primer- og sondesekvenserne i henhold til retningslinjerne fra systemproducenten. Validerede primer- og sondesekvenser, der er egnede til måling af enkeltcellet mtDNA-kopinummer/deletionsheteroplasmi i både humane16,17- og museceller18, er angivet i tabel 1. Når du vælger alternative målsekvenser, skal du overveje følgende punkter.
- Multiplex to primer / sonde sæt i et enkelt PCR-assay, men sørg for, at de to assays bruger en FAM-mærket sonde og en HEX-mærket sonde, så målampliconerne kan differentieres af dråbelæseren. Denne protokol præsenterer et duplex sonde assay. Med omhyggeligt eksperimentelt design kan multiplexing øges op til fire mål, og alternative platforme kan opnå højere dimensionel multiplexing.
- Når multiplexing primer / sonde sæt målrettet mod separate mtDNA sekvenser, sikre, at ampliconer genereret af de to primer sæt ikke overlapper hinanden.
- Når du måler heteroplasma i prøver, der bærer mtDNA-deletioner, skal du sikre dig, at den ene målamplikon falder inden for den forventede slettede region, og den anden falder uden for den forventede slettede region.
BEMÆRK: Optimale PCR-cyklusbetingelser for alternative assays kan afvige fra dem, der er citeret i trin 5.1; se diskussionen for yderligere detaljer om analyseoptimering.
2. Isolering af DNA fra enkeltceller
BEMÆRK: Denne metode kan også bruges til små bulkprøver på op til 100 celler.
- Indsaml enkeltceller ved hjælp af en passende metode, såsom fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)19 eller laserindfangningsmikrodissektion20, i så lille et volumen som muligt i en passende beholder (f.eks. 96-brøndsplade). Brug af et cellelevedygtighedsfarvestof før eller under enkeltcelleisolering minimerer sandsynligheden for at isolere døde celler. Sorter de enkelte celler direkte i lysisbuffer, hvis det ønskes, og opbevar dem ved -80 °C (op til 6 måneder) før analysen.
- Cellerne lyses i et lille volumen (<10 μL) af en passende lysisbuffer (bufferen, der anvendes i denne undersøgelse, er beskrevet i trin 2.2.1.).
BEMÆRK: Alle data opnået fra celler i denne undersøgelse er fra enkeltcellelysater eller puljer på 20 celler (prøvestørrelser er angivet i figurforklaringerne). Effektiv dannelse af en olie/dråbeemulsion under dråbegenereringstrinnet i dråbegenererings-PCR-protokollen kan påvirkes væsentligt af tilstedeværelsen af vaskemidler i prøven; Det anbefales derfor at validere kompatibiliteten af alle cellelyskebuffere med dråbegenerering ved den tilsigtede inputkoncentration, før man fortsætter med eksperimentelle prøver og anvender det mindste praktiske volumen lysisbuffer. Følgende lysisprotokol resulterer i minimal indvirkning på dråbegenereringseffektiviteten.- Forbered lysisbufferen indeholdende 50 mM Tris-HCI pH 8,3, 1% TWEEN-20 og 200 μg/ml proteinase K.
- Der tilsættes 2,5 μL lysisbuffer til hver prøve, pladen forsegles med en klæbepladeforsegling, og prøverne centrifugeres derefter ved 1.000 x g i 1 minut ved 4 °C.
- Prøverne inkuberes ved 37 °C i 30 minutter på termocyklisten med det opvarmede låg indstillet til 105 °C for at forhindre kondensering af væske på pladedækslet.
- Der tilsættes 7,5 μL nukleasefrit vand til hver prøve for at få et endeligt prøvevolumen på 10 μL, pladen forsegles igen, og prøverne centrifugeres derefter ved 1.000 x g i 1 minut ved 4 °C.
- Inkuberes på termocyklisten ved 80 °C i 15 minutter (opvarmet låg indstillet til 105 °C) for at inaktivere proteinase K.
- Prøverne centrifugeres ved 1 000 x g i 1 minut ved 4 °C, og opbevares derefter på is.
- Fortsæt til trin 3 nedenfor.
BEMÆRK: Cellelysater kan opbevares ved -20 ° C, inden de fortsætter med trin 3; Brug dog friskladet DNA, hvor det er muligt, for at eliminere risikoen for fryse-optøningscyklusser, der resulterer i DNA-nedbrydning.
3. Forberedelse af prøver
BEMÆRK: Sørg for, at tekniske replikater af prøver og ikke-skabelonkontroller (NTC'er) er inkluderet på hver analyseplade for at sikre nøjagtigheden af resultaterne. Det dynamiske område for dråbegenereringens PCR-assay er op til 120.000 kopier af målampliconen pr. Reaktion. For enkeltcellede eller små bulkcelleprøvelysater er fortynding sandsynligvis ikke nødvendig, og lysatblandingen kan indledes direkte til reaktionen til måling af mtDNA-kopinummer (f.eks. kan en lysatprøve på 10 μL opdeles og køres i tre eksemplarer med 3 μL input direkte i hvert assay). Brug af ufortyndet lysat fra celler med meget høje kopi mtDNA-tal (f.eks. Oocytter) eller indeholdende et større antal celler (f.eks. 50-100) kan dog overstige dette dynamiske område. I sådanne tilfælde kræves en indledende seriefortynding for at identificere en passende fortyndingsfaktor, der undgår mætning af analysen for den specifikke celletype/cellenummer (se Repræsentative resultater for yderligere oplysninger).
- Afrim alle reagenser på is, hvirvel og drej ned kort før brug.
- Forbered masterblandingen (minus prøve-DNA) på is som beskrevet i (tabel 2).
BEMÆRK: Hvis der kun måles en målamplicon, tilsættes yderligere 2,55 μL nukleasefrit vand pr. prøve for at opnå det endelige volumen på 22 μL. Forbered tilstrækkelig masterblanding til antallet af prøver og NTC'er, der skal analyseres, plus nok til at tage højde for eventuelle 'blanke' brønde, der kræves på PCR-pladen til dråbegenerering (se næste trin). - Vortex den forberedte masterblanding kort for at blande og aliquot det krævede volumen (22 μL minus input DNA-volumen) i hver brønd af en dråbegenerering PCR 96-brøndplade. Arranger prøverne i fulde kolonner på 96-brøndpladen; fyld eventuelle tomme brønde i ufuldstændige kolonner med mastermix og brug dem som NTC'er.
- Tilsæt input-DNA'et til hver prøvebrønd og nukleasefri vand/elueringsbuffer til NTC-brønde for at bringe det samlede volumen af hver op til 22 μL.
- Pladen forsegles med en klæbepladeforsegling, og den anbringes på en ryster ved 2.000 o/min i 1 min., og centrifuge derefter ved 1.000 x g i et minut ved 4 °C.
- Placer pladen på is og fortsæt til trin 4.
BEMÆRK: Tilberedte plader kan opbevares på is og beskyttes mod lys i korte perioder (f.eks. 1-2 timer), før de fortsætter med dråbegenerering.
4. Generering af dråber
BEMÆRK: Se figur 1A for skematisk for dråbegeneratorinstrumentdækket, der henvises til i dette afsnit.
- Tænd for dråbegeneratoren.
- Kontroller, at en flaske dråbegenererende olie er fyldt til instrumentdækkets position E. Hvis du bliver bedt om det, skal du følge instruktionerne på skærmen for at udskifte flasken.
- Klik på Konfigurer prøveplade på berøringsskærmen. Vælg alle kolonner på prøvepladen, der indeholder prøver/emner.
BEMÆRK: Indtastning af pladenavn og detaljer om eksperimentet på dette trin er valgfrit og ikke påkrævet for at fortsætte opsætningen af eksperimentet. - Klik på OK for at bekræfte pladekonfigurationen; Orange lys lyser på instrumentdækket for at indikere positioner, hvor forbrugsstoffer skal læsses.
- Ilæg dråbegeneratorpatronerne til position B på instrumentdækket, så alle lys bliver grønne.
- Placer et tomt lossetrug i position C på instrumentdækket.
- Fjern låg fra filterspidskasser, og læg det i position D på instrumenttrinnet, så alle lys bliver grønne.
- Fjern klæbepladeforseglingen fra prøvepladen, og læg den på instrumentdækkets position F, så lyset bliver grønt.
- Anbring en tom dråbeopsamling 96-brøndplade i en kølig blok (forkølet ved -20 °C), og læg den i instrumentdækkets position G, så lyset bliver grønt.
- Klik på Start dråbegenerering på instrumentets berøringsskærm.
- Klik på Start Kør på instrumentets berøringsskærm. Instrumentlåget lukkes automatisk. Efter initialisering vises den resterende tid, indtil dråbegenereringen er færdig, på instrumentets berøringsskærm.
- Når dråbegenereringen er afsluttet, skal du kontrollere prøveopsamlingspladen visuelt for at bekræfte, at der er et dråbeemulsionslag til stede over oliefasen i hver brønd (figur 1B).
BEMÆRK: Hvis et dråbeemulsionslag ikke er synligt, skal du ikke gå videre med eksperimentet og kontrollere, om der er fejl under tidligere trin i protokollen. - Ryd de brugte forbrugsstoffer fra instrumentdækket, og tøm tip-affaldstruget.
- Tænd pladeforsegleren, indstil temperaturen til 180 °C og tætningstiden til 5 s, og lad maskinen nå driftstemperaturen.
- Sæt prøveopsamlingspladen i pladeforseglerens pladeholder, og læg en frisk folieforsegling oven på pladen med den røde linje opad. Pas på ikke at røre ved undersiden af folieforseglingen.
BEMÆRK: Pladeholderen skal opbevares ved stuetemperatur (RT) og kun placeres i pladeforseglerskuffen, når der påføres en folieforsegling for at forhindre varmeoverførsel til prøveopsamlingspladen. - Når pladeforsegleren har nået driftstemperatur, skal du trykke på Skub ud på instrumentets berøringsskærm; skuffen åbnes automatisk.
- Anbring pladeholderen i pladeforseglerskuffen, og tryk på Seal. Skuffen lukker automatisk og åbnes derefter igen, når forseglingen er afsluttet.
- Udskift den forseglede plade på køleblokken, sluk for pladeforsegleren, og fortsæt straks til trin 5.
BEMÆRK: På dette stadium er dråberne ustabile, så sørg for, at PCR-trinnet påbegyndes inden for 1 time efter dråbegenereringsafslutning.
5. PCR
- Anbring den forseglede dråbeopsamlingsplade på en PCR-cyklist udstyret med en 96-dyb brøndblok, og kør den termiske cykelprotokol, der er beskrevet i tabel 3.
BEMÆRK: Indstil den opvarmede lågtemperatur til 105 °C og prøvevolumen til 40 μL. Denaturerings- og udglødnings-/forlængelsestrin skal omfatte en temperaturrampehastighed på 2 °C/s for at sikre, at olien har tid til at balancere til den korrekte temperatur. - Fortsæt til trin 6.
BEMÆRK: Når den termiske cykelprotokol er færdig, er dråberne mere stabile, og pladen kan opbevares i op til 4 dage ved 4 ° C, før du fortsætter med næste trin.
6. Dråbelæsning
- Tænd for dråbelæseren og den tilsluttede computer.
- Kontroller væskeniveauerne i dråbelæserens olie- og dråbelæseraffaldsflasker, og fyld/tøm disse, hvis det er nødvendigt.
- Læg pladen med post-PCR-prøverne i dråbelæserpladen, læg dækslet oven på holderen, og fastgør det på plads med de sorte låseclips. Fjern ikke folielåget fra prøvepladen.
- Tryk på Åbn/luk-knappen på låget på dråbelæseren for at åbne den.
- Læg dråbelæserpladeholderen, der indeholder prøvepladen, i læserkammeret, og find den sikkert på magnetbasen.
- Tryk på Åbn/luk-knappen på låget på dråbelæseren for at lukke den.
- Åbn analysesoftwaregrænsefladen, vælg fanen Tilføj plade , og forbered en ny prøveplade som følger:
- Klik på Tilføj plade og derefter på Konfigurer plade.
- På fanen Pladeoplysninger skal du indtaste et pladenavn, vælge Supermix til sonder (ingen dUTP) i rullemenuen Supermix og indtaste et filnavn under Gem datafil som.
- På fanen Valg af brønd skal du fremhæve de brønde, der skal analyseres, og klikke på Medtag valgte brønde.
BEMÆRK: Trin 6.7.4 – 6.7.7 er valgfri. - På fanen Oplysninger om brønd skal du vælge de brønde, der skal kommenteres.
BEMÆRK: Se figur 1D for et eksempel på grænsefladen til fanen Brøndinformation . - Vælg Direkte kvantificering (DQ) i rullemenuen Eksperimenttype , udfyld felterne Eksempelbeskrivelse, Eksempeltype og Målnavn , og tilføj brøndnoter og/eller Pladenoter efter behov.
- Klik på Anvend. Oplysningerne i felterne vil blive anvendt på de valgte brønde.
- Gentag trin 6.7.4–6.7.6, indtil alle prøveboringer er blevet kommenteret.
- Når pladekonfigurationen er fuldført, skal du klikke på Start kørsel.
- Når kørslen er færdig, skal du kassere den tomme prøveplade og tømme affaldsflasken med dråbelæser, hvis det er nødvendigt.
- Fortsæt til trin 7.
7. Analyse af resultater
BEMÆRK: Dråbelæseren måler fluorescensintensiteten i FAM- og HEX-kanalen for hver dråbe i en prøve. I et vellykket assay falder dråber i en af to kategorier for hver sonde: Negativ (hvilket betyder, at målet ikke var til stede i dråben) eller Positiv (hvilket betyder, at målet var til stede i dråben). Før du analyserer prøver, skal du sikre dig, at hver brønd indeholder >10.000 dråber og har to klart adskilte populationer af lav fluorescens (negativ) og høj fluorescens (positiv) dråber i hver kanal (figur 2A).
- Vælg fanen Dataanalyse , og åbn den fil, der skal analyseres, i menuen Mine datafiler .
- Klik på fanen 1D-amplitude for enkeltfarveeksperimenter eller fanen 2D-amplitude for tofarvede eksperimenter.
- Påfør en fluorescenstærskel på hver kanal for at skelne mellem de positive og negative dråber. Analysesoftwaren vil forsøge at anvende en automatisk tærskel på stikprøve-for-prøve og kanal for kanal-basis, men hvis dette ser ud til at være mislykkedes eller ser unøjagtigt ud, skal du manuelt anvende tærsklen som følger:
- Vælg de brønde, der kræver tærskelværdi.
- Anvend tærsklen manuelt i det klare mellemrum mellem de positive og negative populationer i amplitudeplottet ved hjælp af værktøjet Tærskellinjetilstand . Når du indstiller manuelle tærskler i 2D-visning, skal du sikre dig, at trådkorset er placeret, så de fire dråbepopulationer (dobbelt negativ, enkelt positiv FAM, enkelt positiv HEX og dobbelt positiv) er tydeligt adskilt.
BEMÆRK: Tærskel kan enten gøres godt for godt eller anvendes på flere brønde på én gang.
- Når alle prøver har fået anvendt en tærskel, skal du eksportere resultaterne som en .csv fil til yderligere analyse ved at klikke på fanen Datatabel , klikke på Import/eksport og vælge Eksportér synlige data til CSV. Indtast et passende filnavn, og klik på Gem.
- MtDNA-kopinummeret i den indledende prøve beregnes på følgende måde:
Kopinummer = mtDNA-målkoncentration × 22 × 1/brøkdel af det samlede lysatinput
BEMÆRK: Hvis der anvendes to mitokondrieprober, beregnes koncentrationen af de to mål i gennemsnit, inden beregningen foretages. For prøver, der indeholder mere end én celle, beregnes kopinummeret pr. celle ved at dividere med antallet af celler i prøven. Det er vigtigt at anvende »koncentrationsværdien« (dvs. antallet af kopier pr. mikroliter) ganget med den oprindelige prøvevolumen på 22 μL i stedet for værdien »Kopier pr. 20 μL«, der er beregnet i .csv filen, da de mtDNA-kopier, der er tilbage i det 2 μL-overforbrug, som dråbegeneratoren kræver, skal tages i betragtning ved beregningen af det absolutte kopinummer for den oprindelige prøve. - For celler, der bærer heteroplasmatiske mtDNA-deletioner, beregnes kopinummeret ved hjælp af resultaterne fra mtDNA-målet uden for det slettede område (dvs. det mål, der er til stede i både slettede og WT mtDNA-molekyler). Deletionsheteroplasmien beregnes ved hjælp af koncentrationerne af målet inden for det slettede område og målet uden for det slettede område som følger:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter dråbegenerering er et klart lag af uigennemsigtige dråber synligt, der flyder oven på oliefasen i hver brønd (figur 1B). Dråbedannelse kan påvirkes negativt af tilstedeværelsen af vaskemidler i inputlysatet, når der udføres forsøg på enkeltceller. Ved hjælp af lysisprotokollen beskrevet i punkt 2.1.2 opnås der rutinemæssigt dråbeudbytter over det anbefalede niveau på 10.000 på trods af tilstedeværelsen af en lille restmængde TWEEN-20 i den endelige prøve (figur 1C). Men med andre lysisbuffere, såsom buffer RLT Plus, ses en dramatisk reduktion i antallet af dannede dråber (figur 1C), hvilket sandsynligvis vil påvirke nøjagtigheden af kopinummermålingen negativt.
Efter PCR- og dråbeaflæsning ses klart adskilte populationer af positive og negative dråber i hver af de kanaler, der anvendes til hver prøvebrønd (figur 2A), hvor NTC-brønde kun indeholder negative dråber. Potentielle problemer, der kan opstå ved analyse af resultater, omfatter:
Manglen på klar adskillelse mellem positive og negative populationer og tilstedeværelsen af dråber i kløften mellem de to populationer, kaldet 'regn' (figur 2B). Dette kan forekomme, hvis der anvendes en ikke-optimal udglødnings-/forlængelsestemperatur, især i assays, hvor forskellen i fluorescens mellem positive og negative dråber er relativt lille. At køre en gradient af udglødnings- / forlængelsestemperaturer kan hjælpe med at identificere en optimal temperatur, der skal bruges. Alternativt kan det være nødvendigt at redesigne primere / sonder for at forbedre analyseydelsen.
Et 'dobbelt bånd' af dråber i den negative befolkning, når du bruger visningen '1D Amplitude'. I nogle tilfælde kan der ses et dobbelt bånd af negative dråber i HEX-kanalen (figur 2Bii); dette er resultatet af forskellige niveauer af baggrundsfluorescens mellem de dobbeltnegative og enkeltnegative (dvs. FAM-positive, HEX-negative) dråbepopulationer, som det ses i (figur 2Biii), som viser FAM-enkeltpositiv population (øverste venstre kvadrant) med lavere gennemsnitlig fluorescens i HEX-kanalen end den dobbeltnegative population (nederste venstre kvadrant). Denne fluorescensartefakt påvirker ikke resultaterne af analysen, og brugen af '2D-amplitude' gør det muligt at identificere de fire dråbepopulationer tydeligt.
Fravær af positive dråber (figur 2C). For validerede assays skyldes dette sandsynligvis en fejl under prøveforberedelsen (f.eks. ufuldstændig cellelyse, forkerte primere / sonde tilsat til masterblandingen, svigt i enkeltcellesortering osv.).
Fravær af negative dråber (figur 2D). Dette sker, når analysen er mættet med et højt mål-DNA-input, hvilket resulterer i, at hver dråbe indeholder en eller flere målsekvenser. Dette ses sandsynligvis ved måling af prøver med højt kopiantal (f.eks. Oocytter) og kan løses ved fortynding af lysatet før trin 3.5. En seriel fortynding af input-DNA'et (figur 2D) kan bruges til at identificere en passende fortyndingsfaktor, når dette problem opstår.
Når du bruger to uafhængige mtDNA-sonder, kan integriteten af prøve-DNA'et vurderes ved at vælge visningen '2D Amplitude': Intakte mtDNA-molekyler bærer begge målsekvenser; derfor vil dråber, der indeholder komplette mtDNA-genomer, være positive i begge kanaler (figur 3A). Ved analyse af prøver, der bærer mtDNA-deletioner, vil en blanding af dobbeltpositive dråber og dråber, der kun er positive for den ikke-slettede målsekvens, være til stede, selv i ikke-nedbrudte prøver (figur 3B). Når mtDNA nedbrydes, vil der sandsynligvis eksistere nogle målsekvenser på separate DNA-fragmenter, og derfor er dråber mere tilbøjelige til at være positive for kun en sonde, og færre dråber vil være positive for begge (figur 3C). Disse forskelle tages i betragtning under dataanalysen, da koncentrationer altid estimeres uafhængigt for hvert mål ved hjælp af den samlede population af alle positive dråber i den fluorescenskanal og derefter enten beregnes som gennemsnit for at estimere kopiantal eller bruges til at beregne heteroplasma (se trin 7.3.-7.4.).
Denne metode kan bruges til at måle kopinummeret i en lang række celletyper fra både mus og humant væv, herunder laboratoriecellelinjer som HeLa, HEK 293T og udødeliggjorte museembryonale fibroblaster (MEF'er) og primære celler såsom humane dermale fibroblaster og mus primordiale kimceller (PGC'er) (figur 4A). I de testede somatiske celletyper ses en række kopinumre fra et par hundrede (f.eks. Dermale fibroblaster) til flere tusinde (f.eks. HeLa-celler). For at kvantificere analysepræcision blev modne museoocytter, som har et meget højt kopinummer (>150.000 kopier pr. celle)2, lyseret, og det resulterende lysat blev delt ligeligt over 22 separate reaktioner pr. Celle. Efter at have kørt PCR-protokollen til dråbegenerering blev der set meget lille forskel i antallet af kopier påvist i hver reaktion, med to repræsentative celler (figur 4B), der gav i alt 229.647 kopier (gennemsnit 10.439 pr. brønd, standardafvigelse 380) og 330.121 kopier (gennemsnit 15.006 pr. brønd, standardafvigelse 340) pr. oocyt. Variationskoefficienterne (CV) for disse to celler var henholdsvis 3,64% og 2,26%. For at teste reproducerbarheden på tværs af biologiske prøver blev PGC'er høstet fra gonaderne fra fire embryonale mus på dag 13,5 efter undfangelsen, og det resulterende enkeltcellede kopiantal af disse cellepopulationer blev sammenlignet på tværs af de forskellige embryoner (figur 4C). Selv om der kan forventes en vis biologisk variation, forblev det gennemsnitlige kopiantal og standardafvigelsen sammenlignelige på tværs af de fire testede embryoner, og disse resultater var i overensstemmelse med kopinummerdata, der tidligere var rapporteret i denne celletype på et lignende stadium af embryonal udvikling21.
Ud over at måle kopiantal kan denne metode også bruges til at måle heteroplasminiveau i cybridceller, der bærer en heteroplasmisk mtDNA-deletion. Dette kræver brug af to mtDNA-sonder, en falder inden for det slettede område af mtDNA og en falder udenfor (figur 5A). Efter analyse kan niveauet af heteroplasma findes ved at sammenligne koncentrationen af hver sonde for at beregne andelen af kopier, der indeholder begge mål (dvs. WT mtDNA-genomer) og den andel, der kun indeholder sonden, der falder uden for det slettede område (dvs. slettede mtDNA-genomer) som beskrevet i trin 7.4. Da målet uden for det slettede område er til stede i alle mtDNA-kopier, kan dette også bruges til at beregne cellens samlede kopinummer. I celler med høj deletion heteroplasma detekteres relativt få kopier af sonden inde i det slettede område (figur 5Bi), mens koncentrationerne af de to sonder er meget mere ens i celler med lav deletion heteroplasma (figur 5Bii). Brug af 'in-out' sondeassays til at måle deletion heteroplasmi ved dråbegenerering PCR i bulk-ekstraherede DNA-prøver har vist forbedret præcision i forhold til qPCR-baserede metoder, men mangler følsomhed, når man beskæftiger sig med meget lave heteroplasmaniveauer (<5%)22, og anbefales derfor ikke i celler med meget små deletionsbyrder. Primer-/sondesættene for både mus og humant mtDNA beskrevet i tabel 1 omfatter et mål inden for mtDNA-hovedbuen og et mål udenfor og er derfor egnede til de mest almindelige mtDNA-deletioner23,24.
| Art | Mål | Navn på primer/sonde | Sekvens | 5' Sonde | 3' Quencher | ||
| Menneskelig | ND4 | huND4_F Primer | AGTGCGATGAGTAGGGGAAGG | ||||
| huND4_R Primer | ACCTTGGCTATCATCACCCGAT | ||||||
| huND4_FAM Sonde | CAACCAGCCAGAACGCCTGAACGCA | FAM | BHQ 2 | ||||
| ND1 | huND1_F Primer | GGGTTCATAGTAGAAGAGCGATGG | |||||
| huND1_R Primer | ACGCCATAAAACTCTTCACCAAAG | ||||||
| huND1_HEX Sonde | ACCCGCCACATCTACCATCACCCTC | HEX | BHQ 1 | ||||
| Mus | ND1 | musND1_F Primer | GAGCCTCAAACTCCAAATACTCACT | ||||
| musND1_R Primer | GAACTGATAAAAGGATAATA GCTATGGTTACTTCA |
||||||
| musND1_FAM Sonde | CCGTAGCCCAAACAAT | FAM | BHQ 1 | ||||
| Cox3 | musCOX3_F Primer | CCTCGTACCAACACATGATCTAGG | |||||
| musCOX3_R Primer | AGTGGGACTTCTAGAGGGTTAAGTG | ||||||
| musCOX3_HEX Sonde | ACCTCCAACAGGAATTTCA | HEX | BHQ 1 | ||||
Tabel 1: Validerede PCR-primer- og sondesæt til dråbegenerering til brug i humane celler og museceller. Primer- og sondesæt til tidligere validerede assays, der forstærker to uafhængige mtDNA-mål for humane 16,17 og museceller18.
| Komponent | Volumen pr. prøve | Endelig koncentration |
| 2X ddPCR Supermix til sonder (ingen dUTP) | 11 μl | 1X |
| Mål 1 Primer F (20 μM) | 1 μl | 900 nM |
| Mål 1 Primer R (20 μM) | 1 μl | 900 nM |
| Mål 2 Primer F (20 μM) | 1 μl | 900 nM |
| Mål 2 Primer R (20 μM) | 1 μl | 900 nM |
| Mål 1 sonde (FAM, 10 μM) | 0,55 μl | 250 nM |
| Mål 2 sonde (HEX, 10 μM) | 0,55 μl | 250 nM |
| Prøve-DNA (tilføjet i trin 3.4) | Variabel | Variabel |
| Nukleasefrit vand | Variabel | |
| Samlet volumen | 22 μl |
Tabel 2: Opskrift på dråbegenerering PCR-reaktionsblanding. Reaktionsblanding kræves til et PCR-assay til generering af en enkelt dråbe. Anbefalede primer-/sondesekvenser findes i tabel 1; Opskriften kan skaleres op, når du kører flere prøver.
| Skridt | Temp (°C) | Tidspunkt | Nej. Cykler |
| Aktivering af enzymer | 95 | 10 minutter | 1 |
| Denaturering | 94 | 30 sek. | 40 |
| Udglødning/udvidelse | 58 | 1 minut | |
| Deaktivering af enzym | 98 | 10 minutter | 1 |
| Holde | 4 | Uendelig | 1 |
Tabel 3: Dråbegenerering PCR termisk cykelprotokol. Cykelprotokol til forstærkning af mål-DNA efter dråbegenerering.
Figur 1: Generering af dråbe. (A) Skematisk layout af dråbegenerering PCR-dråbegeneratorinstrumentdæk, positioner som følger: A = automatiseret væskehåndteringsmodul, B = dråbegeneratorpatron (x3), C = tipaffaldsspand, D = filterspidsboks (x2), E = dråbegeneratorolieholder, F = prøveplade, G = opsamlingsplade (anbragt i kølig blok). (B) Repræsentativt billede af dråbeemulsion, der flyder oven på oliefasen umiddelbart efter dråbegenerering. (C) virkningen af forskellige lysisbuffere på dråbeantal; med 1% TWEEN-20 er der et lille fald i dråbeantal, mens RLT Plus-buffer resulterer i en næsten tredobling i dråbeantal, langt under det anbefalede antal på 10.000 (resultater vist som gennemsnit af tre tekniske gentagelser pr. betingelse med standardafvigelser). (D) Skærmbillede af fanen softwarebrøndinformation, der viser udfyldte prøveoplysninger anvendt på brønd A1 i en 96-brøndsskabelon. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative PCR-analyseanalyser af dråbegenerering, der viser forventede resultater og almindelige problemer. (A) Dobbelt mtDNA-sondeassay fra tre HeLa-enkeltcellelysater, der viser klart adskilte positive og negative dråbepopulationer i (i) FAM-kanalen, (ii) HEX-kanalen og (iii) kombineret 2D-amplitudevisning. (B) Assayresultater fra fire bulk HeLa 20-celleprøver, der viser "regn" mellem de positive og negative populationer i (i) FAM-kanalen, (ii) dårlig adskillelse mellem positive og negative dråber i HEX-kanalen og (iii) et dobbelt dråbebånd i de negative dråber i HEX-kanalen (ii) på grund af forskellige baggrundsfluorescensniveauer i de HEX-negative populationer, som set i 2D amplitude visning. (C) Et eksempel på et WT cybrid enkeltcellet lysat uden positive dråber (i) i begge fluorescenskanaler med et vellykket WT-cybridassay fra det samme eksperiment (ii) til sammenligning. (D) Repræsentative resultater fra en 10 gange seriel fortynding af PCR-forstærket human ND1-målamplikon med kendt koncentration, der viser mætning af dråbegenererings-PCR over den øvre analysegrænse på 120.000 eksemplarer. RFU = Relative fluorescensenheder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Vurdering af mtDNA-integritet ved hjælp af visningen '2D Amplitude'. (A) Repræsentativ dråbegenerering PCR er resultatet af et WT cybrid enkeltcellet lysat, der for det meste indeholder intakte mtDNA-genomer, indikeret ved tilstedeværelsen af hovedsageligt FAM- og HEX-dobbeltpositive dråber. (B) Dråbegenerering PCR er resultatet af en heteroplasmatisk deletion cybrid enkeltcellelysat, der viser en blanding af HEX enkeltpositive dråber (indeholdende slettede mtDNA-molekyler, der kun bærer HEX-målet) og FAM og HEX dobbeltpositive dråber (indeholdende komplette mtDNA-molekyler, der bærer begge mål), med meget få FAM enkeltpositive dråber, hvilket indikerer ingen større mtDNA-nedbrydning. (C) PCR-dråbegenerering stammer fra et museoocyt-enkeltcellelysat, der indeholder en blanding af FAM-enkeltpositive, HEX-enkeltpositive og FAM- og HEX-dobbeltpositive dråber, hvilket indikerer, at der sandsynligvis er sket en vis mtDNA-nedbrydning i denne prøve. RFU = Relative fluorescensenheder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Enkeltcellede kopinummermålinger afslører variation mellem celletyper, men viser robust intra- og intereksperimentel repeterbarhed. (A) Repræsentative enkeltcellede kopinummermålinger fra en række cellelinjer fra både humane (kvadrater) og mus (trekanter) væv (n = 12 celler pr. væv). (B) seriemåling af kopinummer i lysat fra to individuelle museoocytter; det samlede lysatvolumen blev opdelt på tværs af 22 separate PCR-reaktioner fra dråbegenerering; Hvert punkt på kassen og whisker plots repræsenterer kopinummeret målt i en enkelt brønd. Middelværdi, standardafvigelse (SD) og variationskoefficient (CV) rapporteres for hver oocyt. C) Enkeltcellet antal primære primære primære kimceller til mus indsamlet fra fire separate embryoner 13,5 dage efter befrugtningen (n = 94 enkeltceller pr. embryo). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Måling af encellet heteroplasmi i en deletion cybrid linje . (A) Skematisk visning af det område af mtDNA, der er slettet i den cybridlinje, der blev brugt til denne undersøgelse, og placeringen af ND1- og ND4 mtDNA-sonderne. (B) Repræsentative resultater fra (i) et højt heteroplasmatisk enkeltcellelysat og (ii) et lavt heteroplasmatisk enkeltcellelysat, der viser de forskellige forhold mellem ND4: ND1-sonden og det resulterende kopiantal og heteroplasmatiske målinger. RFU = Relative fluorescensenheder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokol, der er beskrevet her, gælder på tværs af en lang række celletyper og arter ud over dem, der er diskuteret ovenfor, selvom omhyggelig optimering af nye analysedesign vil være nøglen til at sikre, at metodens nøjagtighed og repeterbarhed opretholdes, når man bevæger sig væk fra tidligere validerede primer / sondekombinationer. Når man arbejder med enkeltceller, er det vigtigt at sikre, at prøveindsamlingen udføres så nøjagtigt som muligt (f.eks. ved hjælp af strenge enkeltcelleparametre ved sortering af celler efter FACS) for at sikre, at de opnåede resultater virkelig afspejler de enkelte cellers, og også at alt forberedende arbejde udføres i et rent præ-PCR-område for at reducere risikoen for forurening. Effektiv cellelyse er også afgørende for at sikre, at mtDNA-kopier med succes kan opdeles i separate dråber; Dette skal dog afvejes mod risikoen for at forstyrre dråbedannelsen, når der anvendes højere koncentrationer af vaskemiddel.
På grund af at analysedesignet og lysistrinnene er de mest kritiske i protokollen, er dette også de trin, der mest sandsynligt kræver fejlfinding. Primer/ sondesæt, der ikke oprindeligt producerer godt adskilte populationer af positive og negative dråber, kan vise forbedret ydeevne, hvis PCR-protokollens udglødnings- / forlængelsestemperatur optimeres. Den foreslåede temperatur på 58 °C angivet i trin 5.1. er valideret for primer-/sondesættene i (tabel 1) Den optimale temperatur kan dog variere fra 55-65 °C, og en gradient PCR på tværs af dette interval kan køres for at finde den bedst egnede temperatur til nye primer/sondesæt. Hvis dette ikke lykkes, kan det være nødvendigt at redesigne primere og / eller sonder for at forbedre ydeevnen med henvisning til producentens retningslinjer for analysedesign (se Materialetabel).
Hvis der er andre lysforhold end dem, der er beskrevet i trin 2.1.2. er påkrævet, skal virkningen af den alternative lysisbuffer på dråbegenerering vurderes. Det kan være muligt at forbedre dråbegenereringen ved at reducere koncentrationen af vaskemiddel i lysisbufferen eller fortynde lysatet i et større volumen nukleasefrit vand, selvom vi har fundet ud af, at nogle buffere (f.eks. RLT Plus-buffer) stadig har en signifikant effekt på dråbedannelse selv ved meget lave koncentrationer. En mulig løsning på dette problem er at udføre en oprydning efter lysis af DNA'et, for eksempel ved hjælp af SPRI-perler til at binde DNA'et og lade vaskemidlerne vaskes væk. Mens SPRI-perler bruges til at rense både genomisk DNA25 og mtDNA26 fra enkeltcellelysater, vil ethvert tab af mtDNA-genomer under denne proces påvirke den efterfølgende kopinummermåling, og der er i øjeblikket ingen data, der kvantificerer denne potentielle fejlkilde, når der anvendes kommercielt tilgængelige SPRI-perleprodukter på enkeltcellelysater.
Traditionelt er mtDNA-kopinummer og sletning heteroplasma blevet målt ved hjælp af qPCR-assays27. Mens det underliggende koncept for qPCR-tilgangen ligner meget dråbegenererings-PCR-teknikken, der er beskrevet her, er en stor ulempe ved at bruge qPCR dens manglende evne til direkte at måle absolut kopi nummer11. For hver prøve måler qPCR en cyklustærskelværdi (ct) - antallet af PCR-cyklusser, der kræves for at nå en vis mængde produkt fra det oprindelige input-DNA. Da denne tærskel er vilkårlig, er det nødvendigt at generere en standardkurve ud fra input, der indeholder en række kendte målkoncentrationer, før der kan tildeles absolutte kopinumre til prøver. På bulk-DNA-niveau er denne proces meget nøjagtig og sammenlignelig med dråbegenerering PCR i sin evne til at måle mtDNA-kopinummer. Ved meget lave kopinumre, som dem, der typisk findes i enkeltceller, bliver det imidlertid stadig vanskeligere at nøjagtigt generere standardkurver for qPCR og derfor sværere at opnå nøjagtige målinger af absolut kopi nummer11. Det skal bemærkes, at dråbegenerering PCR i øjeblikket er dyrere at udføre end qPCR, hvor forbrugsstoffer og reagenser koster ca. 2,5 gange så meget pr. Prøve ud over højere indledende udstyrsomkostninger. Dette betyder, at omkostningerne ved dråbegenerering PCR kan være uoverkommelige for visse applikationer med høj kapacitet, i hvilket tilfælde qPCR stadig repræsenterer et levedygtigt alternativ.
Da PCR til dråbegenerering direkte måler antallet af kopier af et givet mål, der er til stede i en prøve, er der ikke krav om en standardkurve ved måling af absolut kopinummer, og dråbegenererings-PCR-metoden er derfor ekstremt følsom selv med meget små mængder input-DNA11,12. I betragtning af den nye betydning af enkeltcelleteknologier inden for mitokondriebiologi repræsenterer denne PCR-baserede tilgang til dråbegenerering et vigtigt fremskridt i forhold til tidligere metoder og giver mulighed for fortsat måling af vigtige mitokondrieparametre i enkeltcelleindstillingen. Det er også muligt at bruge dråbegenerering PCR til at måle mtDNA-kopinummer i DNA ekstraheret fra bulkvævsprøver; dette kræver måling af nukleart DNA-kopinummer ud over mtDNA-kopinummer for at muliggøre normalisering til cellenummer. Derfor kræves inkludering af et primer / sondesæt rettet mod et nukleært gen sammen med et primer / sondesæt rettet mod mtDNA. Som angivet ovenfor er dråbegenererings-PCR- og standard qPCR-metoder på bulkvævsniveau af sammenlignelig nøjagtighed, og derfor giver dråbegenererings-PCR ikke væsentlige fordele i forhold til eksisterende teknologier i denne indstilling.
En væsentlig begrænsning ved den metode, der præsenteres her, er manglende evne til at måle heteroplasmatiske niveauer i celler, der bærer heteroplasmatiske SNP'er snarere end mtDNA-deletioner, hvilket kræver et yderligere assay (f.eks. Pyrosequencing eller qPCR) for at måle både kopinummer og heteroplasma fra en enkelt celle. Vellykket påvisning af SNP'er, der demonstrerer allelspecifik ekspression (ASE) ved hjælp af denne platform, er blevet rapporteret28, og en nylig rapport beskrev brugen af denne metode til at måle heteroplasma af den almindelige m.3243A>G MELAS-mutation29. Selvom det ser ud til, at denne begrænsning kan overvindes ved hjælp af omhyggeligt designede sondepar, kræver det derfor, at der designes / valideres et separat primer/ sondesæt for hver enkelt SNP, og designparametrene er meget mere begrænset af behovet for sonder til at målrette mod en bestemt base i mtDNA-sekvensen. Som sådan er inkorporering af SNP-detektion i dråbegenererings-PCR-protokollen, der er beskrevet her, endnu ikke forsøgt.
Det er vigtigt at bemærke, at dråbebaserede digitale PCR-platforme, såsom den type, der anvendes i denne undersøgelse, ikke er de eneste teknologier, der er i stand til absolut kvantificering af DNA-mål, og kommercielle produkter, der bruger alternative metoder såsom også pladebaseret partitionering, er også tilgængelige30. Desuden kan teknologier, der anvender alternativer til PCR, såsom loopmedieret isotermisk amplifikation (LAMP)31 og rekombinasepolymeraseamplifikation (RPA)32, vise sig at være mere egnede end PCR til dråbegenerering til brug i kliniske omgivelser.
Samlet set præsenterer denne protokol en meget følsom metode til måling af mtDNA-kopinummer og deletionsheteroplasmi i enkeltceller, som kan anvendes på en lang række forskellige celletyper og arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Tak til Dr. L Bozhilova for råd om den statistiske analyse af PCR-data fra dråbegenerering. Tak til Dr. H Zhang for at levere de oocytter, der bruges til at generere data i figur 3C og figur 4B. Dette arbejde blev udført af SPB ved Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9), University of Cambridge, og finansieret af et Wellcome Trust Principal Research Fellowship afholdt af PFC (212219/Z/18/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Tween-20 solution | Novex | 3005 | |
| Automated droplet-generating oil | Bio Rad | 1864110 | Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1) |
| C1000 PCR machine with deep-well block | Bio Rad | 1851197 | PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5) |
| Collection plate cooling block | Bio Rad | 12002819 | Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3) |
| ddPCR 96-well plates | Bio Rad | 12001925 | 96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3) |
| ddPCR droplet reader oil | Bio Rad | 1863004 | Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1) |
| ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio Rad | 1863023 | Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3) |
| DG32 automated droplet generator cartridges | Bio Rad | 1864108 | Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3) |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Qualified fetal bovine serum |
| Foil plate covers | Bio Rad | 1814040 | Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6) |
| HEK 293T cells | Takara | 632180 | Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen |
| HeLa cells | ECACC | 93021013 | Human cervix epitheloid carcinoma cells |
| High glucose DMEM | Gibco | 13345364 | 4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Human cybrids | University of Miami | ||
| Mouse embryonic fibroblasts | Newcastle University | Immortalized from C57Bl/6 mice | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PCR plate seals | Pierce | SP-0027 | Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6) |
| Pipet Tip Waste Bins | Bio Rad | 1864125 | Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Pipet tips for AutoDG system | Bio Rad | 1864120 | Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Primary human dermal fibroblast cells | Newcastle Biobank | ||
| Primers/Probes | IDT | N/A | Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1 |
| Proteinase K 20 mg/mL solution | Ambion | AM2546 | |
| PX1 PCR plate sealer | Bio Rad | 1814000 | Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6) |
| QX Manager software | Bio Rad | 12012172 | Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7) |
| QX200 AutoDG droplet generator | Bio Rad | 1864101 | Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4) |
| QX200 droplet reader | Bio Rad | 1864003 | Droplet reader (used in Protocol Step 6) |
| Trizma pre-set crystals pH 8.3 | Sigma | T8943-100G |
References
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Wai, T., et al. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility. Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).
- D'Erchia, A. M., et al. Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity. Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A-->G. American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).
- Liu, H., et al. Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases. PloS One. 8 (6), 67146 (2013).
- Filograna, R., et al. Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Wang, Y., et al. The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues. Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).
- Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF). American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).
- Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Herbst, A., et al. Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).
- O'Hara, R., et al. Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution. Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).
- Diaz, F., et al. Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).
- Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells. Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).
- Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis. Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).
- Perier, C., et al. Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms. Brain. 136, Pt 8 2369-2378 (2013).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Espina, V., et al.
- Cree, L. M., et al. A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes. Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).
- Belmonte, F. R., et al. Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions. Scientific Reports. 6, 25186 (2016).
- Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. Two direct repeats cause most human mtDNA deletions. Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).
- Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation. Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).
- Macaulay, I. C., et al. Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&T-seq. Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).
- Ludwig, L. S., et al. Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics. Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).
- Rooney, J. P., et al. PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species. Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).
- Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression. Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).
- Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 10821 (2020).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E.
- Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane. ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).
- Li, Z., et al. Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care. Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952 (2021).
