Summary
यहां हम एकल कोशिकाओं में पूर्ण माइटोकॉन्ड्रियल (एमटी) डीएनए कॉपी नंबर और एमटीडीएनए विलोपन हेटरोप्लाज्मी स्तर को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
स्तनधारी माइटोकॉन्ड्रियल (एमटी) डीएनए एक छोटा, गोलाकार, डबल-फंसे हुए, इंट्रा-माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए अणु है, जो इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के 13 सबयूनिट्स को एन्कोडिंग करता है। द्विगुणित परमाणु जीनोम के विपरीत, अधिकांश कोशिकाओं में एमटीडीएनए की कई और प्रतियां होती हैं, जो सेल प्रकार के आधार पर 100 से कम से लेकर 200,000 से अधिक प्रतियां होती हैं। एमटीडीएनए कॉपी नंबर का उपयोग उम्र से संबंधित कई अपक्षयी स्थितियों और बीमारियों के लिए बायोमार्कर के रूप में तेजी से किया जाता है, और इस प्रकार, एमटीडीएनए कॉपी नंबर का सटीक माप अनुसंधान और नैदानिक सेटिंग्स दोनों में एक महत्वपूर्ण उपकरण बन रहा है। एमटीडीएनए में उत्परिवर्तन, जो अक्सर एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) या विलोपन के रूप में होता है, या तो सेल के भीतर एमटीडीएनए की सभी प्रतियों में मौजूद हो सकता है (जिसे होमोप्लाज्मी कहा जाता है) या उत्परिवर्तित और डब्ल्यूटी एमटीडीएनए प्रतियों (जिसे हेटेरोप्लाज्मी कहा जाता है) के मिश्रण के रूप में। हेटेरोप्लाज्मिक एमटीडीएनए उत्परिवर्तन नैदानिक माइटोकॉन्ड्रियल विकृति का एक प्रमुख कारण है, या तो दुर्लभ बीमारियों में या पार्किंसंस रोग जैसे आम देर से शुरू होने वाली बीमारियों की बढ़ती संख्या में। कोशिकाओं में मौजूद हेटरप्लाज्मी के स्तर का निर्धारण दुर्लभ माइटोकॉन्ड्रियल रोगों के निदान में और अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण कदम है जिसका उद्देश्य आम देर से शुरू होने वाले विकारों को समझना है जहां माइटोकॉन्ड्रिया एक भूमिका निभा सकते हैं। एमटीडीएनए कॉपी नंबर और हेटेरोप्लाज्मी को पारंपरिक रूप से मात्रात्मक (क्यू) पीसीआर-आधारित परख या गहरी अनुक्रमण द्वारा मापा गया है। हालांकि, डीडीपीसीआर तकनीक की हालिया शुरूआत ने दोनों मापदंडों को मापने के लिए एक वैकल्पिक विधि प्रदान की है। यह मौजूदा तरीकों पर कई फायदे प्रदान करता है, जिसमें पूर्ण एमटीडीएनए कॉपी संख्या को मापने की क्षमता और कम कॉपी संख्या पर भी एकल कोशिकाओं से सटीक माप करने के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता शामिल है। यहां प्रस्तुत एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जो डीडीपीसीआर का उपयोग करके एकल कोशिकाओं में एमटीडीएनए कॉपी नंबर के माप का वर्णन करता है, जिसे ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर के रूप में जाना जाता है, जिसमें एमटीडीएनए विलोपन के साथ कोशिकाओं में हेटेरोप्लाज्मी के एक साथ माप के लिए विकल्प है। एमटीडीएनए एसएनपी के साथ कोशिकाओं में हेटरोप्लाज्मी को मापने के लिए इस विधि का विस्तार करने की संभावना पर भी चर्चा की गई है।
Introduction
स्तनधारी माइटोकॉन्ड्रियल (एमटी) डीएनए माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में रहने वाला एक छोटा (लगभग 16.5 केबी), गोलाकार डीएनए जीनोम है जो 37 जीनों को एन्कोड करता है, जिसमें दो आरआरएनए, 22 टीआरएनए और 13 प्रोटीन-कोडिंग जीनशामिल हैं। परमाणु जीनोम के विपरीत, जिसमें प्रति कोशिका प्रत्येक जीन की एक (अगुणित) या दो (द्विगुणित) प्रतियां होती हैं, एमटीडीएनए प्रत्येक कोशिका के माइटोकॉन्ड्रिया में कई प्रतियों में मौजूद होता है, जो दसियों प्रतियों (जैसे, परिपक्व शुक्राणुकोशिकाओं) से लेकर सैकड़ों हजारों प्रतियों (जैसे, अंडाणुओं) तक होता है। इस बहु-प्रतिलिपि प्रकृति का एक परिणाम यह है कि एमटीडीएनए जीनोम में उत्परिवर्तन, जो एकल-न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी), विलोपन, या दोहराव के रूप में मौजूद हो सकते हैं, किसी भी सेल में अलग-अलग स्तरों पर मौजूद हो सकते हैं, जो सेल की कुल एमटीडीएनए आबादी का 0% से 100% तक कहीं भी बनाते हैं। एक ही सेल में जंगली-प्रकार और उत्परिवर्ती एमटीडीएनए जीनोम के अस्तित्व को हेटेरोप्लाज्मी कहा जाता है, और रोगजनक हेटरोप्लाज्मिक एमटीडीएनए उत्परिवर्तन माइटोकॉन्ड्रियल बीमारी का एक प्रमुख कारण है, जिसमें कई सामान्य न्यूरोलॉजिकल सिंड्रोम अंतर्निहित हेट्रोप्लाज्मिक एमटीडीएनए उत्परिवर्तनसे जुड़े हैं।
दो प्रमुख पैरामीटर जो नैदानिक बीमारी के कारण एक हेट्रोप्लाज्मिक एमटीडीएनए उत्परिवर्तन की संभावना में योगदान करते हैं, वे हेटेरोप्लाज्मी स्तर और एमटीडीएनए कॉपी नंबर हैं। कई हेटरप्लाज्मिक उत्परिवर्तन एक दहलीज प्रभाव प्रदर्शित करते हैं, जैव रासायनिक और नैदानिक फेनोटाइप केवल एक निश्चित हेटरोप्लाज्मी स्तर से ऊपर स्पष्ट हो जाते हैं, आमतौर पर लगभग 80% 5, और बाद में बिगड़ते हैं क्योंकि हेटरोप्लाज्मी और बढ़जाती है। हालांकि, सेल में मौजूद एमटीडीएनए की प्रतियों की संख्या पर विचार करना भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह जंगली-प्रकार (यानी, 'स्वस्थ') एमटीडीएनए जीनोम की संख्या को प्रभावित करेगा जो किसी दिए गए हेटेरोप्लाज्मी स्तर पर मौजूद हैं। माइटोकॉन्ड्रियल रोग के रोगियों में अध्ययन ने हेटेरोप्लाज्मी और कॉपी नंबर 5,6 के बीच इस परस्पर क्रिया के महत्व पर प्रकाश डाला है, और फिलोगराना एट अल ने हाल ही में माइटोकॉन्ड्रियल रोग7 के माउस मॉडल में अपरिवर्तित हेटरोप्लाज्मी के बावजूद एमटीडीएनए कॉपी संख्या में वृद्धि की सूचना दी है।
जबकि एमटीडीएनए हेटेरोप्लाज्मी के कारण होने वाली बीमारियों के रोगजनन और संचरण की समझ में सुधार के लिए हाल के वर्षों में बहुत कुछ किया गया है, इस काम का अधिकांश हिस्सा कोशिकाओं के बजाय ऊतकों के स्तर पर आयोजित किया गया है, औसत ऊतक हेटरप्लाज्मी स्तरों और थोक ऊतक बायोप्सी और रक्त के नमूनों से प्राप्त संख्या माप की प्रतिलिपि बनाते हैं। कुछ अच्छी तरह से स्थापित तकनीकें, जैसे लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन, सेलुलर स्तर 8,9 पर ऐसे मापकी अनुमति देती हैं; हालांकि, उच्च-थ्रूपुट सिंगल-सेल विश्लेषण विधियों, या तथाकथित "सिंगल-सेल ओमिक्स" 10 के हालिया विस्फोट ने उन तरीकों की आवश्यकता पैदा की है जो एकल-सेल स्तर पर इन महत्वपूर्ण एमटीडीएनए मापदंडों को सटीक रूप से माप सकते हैं।
ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर विधि नमूना डीएनए11 में विशिष्ट लक्ष्य एम्प्लिकॉन के पीसीआर प्रवर्धन के माध्यम से अज्ञात डीएनए सांद्रता की मात्रा निर्धारित करने के मौजूदा तरीकों में सुधार करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक में हालिया प्रगति का लाभ उठाती है। क्यूपीसीआर के विपरीत, जहां नमूना डीएनए को एक ही प्रतिक्रिया में प्रवर्धित किया जाता है, जिसमें पीसीआर उत्पाद के संचय की सापेक्ष दर रीडआउट के रूप में कार्य करती है, यह विधि प्रारंभिक नमूने को हजारों अलग-अलग बूंदों में विभाजित करती है, इस प्रकार नमूना डीएनए अणुओं को स्थानिक रूप सेअलग-अलग प्रतिक्रियाओं में विभाजित करती है। बाद में पीसीआर प्रतिक्रिया प्रत्येक व्यक्तिगत बूंद में आगे बढ़ती है, जिसमें पीसीआर उत्पाद केवल उन बूंदों में जमा होता है जिनमें लक्ष्य डीएनए होता है। इस प्रतिक्रिया का परिणाम बूंदों के पूल के रूप में एक डिजिटल आउटपुट है जिसमें या तो लक्ष्य डीएनए और प्रवर्धित पीसीआर उत्पाद की एक प्रति होती है, या इसमें लक्ष्य डीएनए नहीं होता है। फ्लोरोसेंट डीएनए जांच या डबल-स्ट्रैंडेड (डीएस) डीएनए बाइंडिंग डाई का उपयोग करके, प्रवर्धित उत्पाद वाली बूंदों की गणना की जा सकती है, और प्रारंभिक नमूने में मौजूद डीएनए प्रतियों की पूर्ण संख्या की गणना करने के लिए 'सकारात्मक' से 'नकारात्मक' बूंदों के अनुपात का उपयोग किया जा सकता है। यह पूर्ण माप, क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया से प्राप्त सापेक्ष माप के विपरीत, महत्वपूर्ण कारक है जो इस पद्धति को एकल कोशिकाओंमें एमटीडीएनए कॉपी संख्या और हेटरोप्लाज्मी के सटीक माप के लिए उपयोग करने की अनुमति देता है, और हाल के कई अध्ययनों ने पहले से ही इस उद्देश्य के लिए ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर तकनीक का उपयोग किया है। . यह लेख मानव और माउस ऊतक दोनों से एकल कोशिकाओं में एमटीडीएनए कॉपी संख्या और विलोपन हेटेरोप्लाज्मी को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है।
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Protocol
सभी प्रयोगों ने एराइव दिशानिर्देशों का पालन किया और कैम्ब्रिज पशु कल्याण नैतिक समीक्षा निकाय (AWERB) विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया।
नोट: ड्रॉपलेट जनरेशन से पहले सभी नमूना तैयारी चरणों को एक स्वच्छ प्री-पीसीआर कार्य क्षेत्र में किया जाना चाहिए, आदर्श रूप से जहां संभव हो यूवी-स्टरलाइज़्ड कैबिनेट में। यहां वर्णित प्रोटोकॉल विशिष्ट ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर उपकरण ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करता है, और जबकि सामान्य विधि अन्य प्रणालियों पर लागू होनी चाहिए, प्राइमर / जांच सांद्रता, पीसीआर साइक्लिंग स्थितियों आदि के बारे में निर्माता के दिशानिर्देशों से परामर्श करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि वे यहां वर्णित लोगों से भिन्न हो सकते हैं। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली सेल लाइनें / प्राथमिक कोशिकाएं निम्नानुसार थीं: मानव हेला कोशिकाएं (व्यावसायिक रूप से प्राप्त), मानव एचईके 293 टी कोशिकाएं (व्यावसायिक रूप से प्राप्त), प्राथमिक मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाएं (न्यूकैसल बायोबैंक से प्राप्त), मानव साइब्रिड्स (डब्ल्यूटी और एएच 2.1 विलोपन15, सी मोरेस, मियामी विश्वविद्यालय से प्राप्त), माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (सी 57 बीएल / 6 चूहों से अमर, जे स्टीवर्ट से प्राप्त)। न्यूकैसल विश्वविद्यालय, माउस प्राइमर्डियल जर्म कोशिकाएं (सी 57 बीएल / 6 माउस भ्रूण से प्राप्त), और माउस एमआईआई अंडाणु (वयस्क महिला सी 57 बीएल / 6 चूहों से प्राप्त)। सभी सुसंस्कृत कोशिकाओं को उच्च ग्लूकोज (4.5 ग्राम / एल) डीएमईएम में बनाए रखा गया था, जो 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक था। इस अध्ययन में उपयोग किए गए प्राथमिक माउस कोशिकाओं को गृह कार्यालय परियोजना लाइसेंस पी 6 सी 97520 ए के तहत पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम 1986 के अनुसार रखे गए जानवरों से अलग किया गया था।
1. रुचि के डीएनए अनुक्रमों को लक्षित करने वाले प्राइमर और जांच सेट को डिजाइन और संश्लेषित करें
नोट: ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर को एम्प्लिकॉन-विशिष्ट जांच के स्थान पर डीएसडीएनए बाइंडिंग डाई का उपयोग करके भी किया जा सकता है।
- सिस्टम निर्माता द्वारा दिए गए दिशानिर्देशों के अनुसार प्राइमर और जांच अनुक्रमों को डिजाइन करें। मानव16,17 और माउस18 कोशिकाओं दोनों में एकल-सेल एमटीडीएनए कॉपी संख्या/विलोपन हेटेरोप्लाज्मी को मापने के लिए उपयुक्त मान्य प्राइमर और जांच अनुक्रम तालिका 1 में प्रदान किए गए हैं। वैकल्पिक लक्ष्य अनुक्रमों का चयन करते समय, निम्नलिखित बिंदुओं पर विचार करें।
- मल्टीप्लेक्स एक एकल पीसीआर परख में दो प्राइमर / प्रोब सेट करता है, लेकिन यह सुनिश्चित करता है कि दो परख एक एफएएम-लेबल जांच और एक एचईएक्स-लेबल जांच का उपयोग करें ताकि ड्रॉपलेट रीडर द्वारा लक्ष्य एम्प्लिकॉन को विभेदित किया जा सके। यह प्रोटोकॉल एक डुप्लेक्स जांच परख प्रस्तुत करता है। सावधानीपूर्वक प्रयोगात्मक डिजाइन के साथ, मल्टीप्लेक्सिंग को चार लक्ष्यों तक बढ़ाया जा सकता है, और वैकल्पिक प्लेटफॉर्म उच्च-आयामी मल्टीप्लेक्सिंग प्राप्त कर सकते हैं।
- अलग-अलग एमटीडीएनए अनुक्रमों को लक्षित करने वाले प्राइमर /प्रोब सेट को मल्टीप्लेक्स करते समय, सुनिश्चित करें कि दो प्राइमर सेटों द्वारा उत्पन्न एम्प्लिकॉन ओवरलैप नहीं होते हैं।
- एमटीडीएनए विलोपन वाले नमूनों में हेटरोप्लाज्मी को मापते समय, सुनिश्चित करें कि एक लक्ष्य एम्प्लिकॉन अपेक्षित हटाए गए क्षेत्र के भीतर आता है और दूसरा अपेक्षित हटाए गए क्षेत्र के बाहर आता है।
नोट: वैकल्पिक परख के लिए इष्टतम पीसीआर साइकिलिंग की स्थिति चरण 5.1 में उद्धृत लोगों से भिन्न हो सकती है; परख अनुकूलन पर अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें।
2. एकल कोशिकाओं से डीएनए का अलगाव
नोट: इस विधि का उपयोग 100 कोशिकाओं तक के छोटे थोक नमूनों के लिए भी किया जा सकता है।
- एक उपयुक्त विधि का उपयोग करके एकल कोशिकाओं को इकट्ठा करें, जैसे कि फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस)19 या लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन20, एक उपयुक्त रिसेप्टेक (जैसे, 96-वेल प्लेट) में जितना संभव हो उतना कम मात्रा में। एकल-कोशिका अलगाव से पहले या उसके दौरान सेल व्यवहार्यता डाई का उपयोग मृत कोशिकाओं को अलग करने की संभावना को कम करेगा। वांछित होने पर एकल कोशिकाओं को सीधे लाइसिस बफर में क्रमबद्ध करें और विश्लेषण से पहले -80 डिग्री सेल्सियस (6 महीने तक) पर स्टोर करें।
- एक उपयुक्त लाइसिस बफर की एक छोटी मात्रा (<10 μL) में कोशिकाओं को लाइस करें (इस अध्ययन में उपयोग किए गए बफर को चरण 2.2.1 में वर्णित किया गया है)।
नोट: इस अध्ययन में कोशिकाओं से प्राप्त सभी डेटा एकल-सेल लाइसेट या 20 कोशिकाओं के पूल से हैं (नमूना आकार आकृति किंवदंतियों में निर्धारित हैं)। ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर प्रोटोकॉल के ड्रॉपलेट जनरेशन स्टेप के दौरान तेल/ड्रॉपलेट इमल्शन का कुशल गठन नमूने में डिटर्जेंट की उपस्थिति से काफी प्रभावित हो सकता है; इसलिए, प्रयोगात्मक नमूनों के साथ आगे बढ़ने और लाइसिस बफर की सबसे छोटी व्यावहारिक मात्रा का उपयोग करने से पहले इच्छित इनपुट एकाग्रता पर ड्रॉपलेट जनरेशन के साथ सभी सेल-लाइसिस बफर की संगतता को मान्य करने की सिफारिश की जाती है। निम्नलिखित लाइसिस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप बूंद उत्पादन दक्षता पर न्यूनतम प्रभाव पड़ता है।- लाइसिस बफर तैयार करें जिसमें 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 1% TWEEN-20, और 200 μg / mL Proteinase K हो।
- प्रत्येक नमूने में लाइसिस बफर के 2.5 μL जोड़ें, प्लेट को चिपकने वाली प्लेट सील के साथ सील करें, और फिर नमूनों को 1,000 x g पर 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- प्लेट कवर पर तरल के संघनन को रोकने के लिए 105 डिग्री सेल्सियस पर गर्म ढक्कन सेट के साथ थर्मोसाइक्लर पर 30 मिनट के लिए नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- 10 μL की अंतिम नमूना मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रत्येक नमूने में 7.5 μL न्यूक्लियस मुक्त पानी जोड़ें, प्लेट को फिर से सील करें, और फिर नमूनों को 1,000 x g पर 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- प्रोटीन के को निष्क्रिय करने के लिए 15 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोसाइक्लर पर इनक्यूबेट करें (गर्म ढक्कन 105 डिग्री सेल्सियस पर सेट)।
- नमूनों को 1,000 x g पर 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें और फिर बर्फ पर रखें।
- नीचे चरण 3 पर आगे बढ़ें।
नोट: चरण 3 के साथ जारी रखने से पहले सेल लाइसेट को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है; हालांकि, डीएनए क्षरण के परिणामस्वरूप फ्रीज-पिघलने चक्र के जोखिम को खत्म करने के लिए जहां संभव हो, ताजा इल्यूटेड डीएनए का उपयोग करें।
3. नमूने तैयार करना
नोट: सुनिश्चित करें कि परिणामों की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक परख प्लेट पर नमूने और गैर-टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) की तकनीकी प्रतिकृतियां शामिल हैं। ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर परख की गतिशील सीमा प्रति प्रतिक्रिया लक्ष्य एम्प्लिकॉन की 120,000 प्रतियों तक है। एकल-सेल या छोटे थोक-सेल नमूना लाइसेट के लिए, कमजोर पड़ने की आवश्यकता नहीं है, और लाइसेट मिश्रण को एमटीडीएनए कॉपी नंबर के माप के लिए प्रतिक्रिया में सीधे इनपुट किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, 10 μL का लाइसेट नमूना विभाजित किया जा सकता है और प्रत्येक परख में सीधे 3 μL इनपुट के साथ तीन प्रतियों में चलाया जा सकता है)। हालांकि, बहुत अधिक कॉपी एमटीडीएनए संख्या (जैसे, अंडाणु) वाली कोशिकाओं से अनडिल्यूटेड लाइसेट का उपयोग करना या बड़ी संख्या में कोशिकाओं (जैसे, 50-100) वाले कोशिकाओं से इस गतिशील सीमा से अधिक हो सकता है। ऐसे मामलों में, एक उपयुक्त कमजोर पड़ने वाले कारक की पहचान करने के लिए एक प्रारंभिक सीरियल कमजोर पड़ने की आवश्यकता होती है जो उस विशिष्ट सेल प्रकार / सेल नंबर के लिए परख की संतृप्ति से बचता है (अधिक विवरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
- उपयोग करने से पहले बर्फ, भंवर और स्पिन पर सभी अभिकर्मकों को संक्षेप में डीफ्रॉस्ट करें।
- बर्फ पर मास्टर मिश्रण (माइनस नमूना डीएनए) तैयार करें जैसा कि (तालिका 2) में वर्णित है।
नोट: यदि केवल एक लक्ष्य एम्प्लिकॉन मापा जा रहा है, तो 22 μL की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रति नमूना न्यूक्लियस-मुक्त पानी का एक अतिरिक्त 2.55 μL जोड़ें। विश्लेषण किए जाने वाले नमूनों और NTC की संख्या के लिए पर्याप्त मास्टर मिश्रण तैयार करें, साथ ही ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर प्लेट पर आवश्यक किसी भी 'खाली' कुओं के लिए पर्याप्त है (अगला चरण देखें)। - वोर्टेक्स तैयार मास्टर मिश्रण एक बूंद पीढ़ी पीसीआर 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में आवश्यक मात्रा (22 μL माइनस इनपुट डीएनए वॉल्यूम) को मिश्रण और एलिकोट करने के लिए संक्षिप्त रूप से करता है। नमूने को 96-वेल प्लेट पर पूर्ण कॉलम में व्यवस्थित करें; मास्टर मिक्स के साथ अधूरे कॉलम में किसी भी खाली कुओं को भरें और उन्हें एनटीसी के रूप में उपयोग करें।
- प्रत्येक नमूने की कुल मात्रा को 22 μL तक लाने के लिए प्रत्येक नमूने में इनपुट डीएनए को अच्छी तरह से जोड़ें और NTC कुओं में न्यूक्लियस-मुक्त पानी / क्षालन बफर जोड़ें।
- प्लेट को चिपकने वाली प्लेट सील के साथ सील करें और 1 मिनट के लिए 2,000 आरपीएम पर एक शेकर पर रखें, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- प्लेट को बर्फ पर रखें और चरण 4 पर आगे बढ़ें।
नोट: तैयार प्लेटों को बर्फ पर संग्रहीत किया जा सकता है और बूंद उत्पादन के साथ आगे बढ़ने से पहले थोड़े समय (जैसे, 1-2 घंटे) के लिए प्रकाश से संरक्षित किया जा सकता है।
4. बूंदों का उत्पादन
नोट: इस खंड में संदर्भित ड्रॉपलेट जनरेटर इंस्ट्रूमेंट डेक के योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1 ए देखें।
- ड्रॉपलेट जनरेटर पर शक्ति।
- जांचें कि उपकरण डेक के ई को रखने के लिए बूंद उत्पन्न करने वाले तेल की एक बोतल लोड की गई है। यदि संकेत दिया जाता है, तो बोतल को बदलने के लिए ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करें।
- टच स्क्रीन पर नमूना प्लेट कॉन्फ़िगर करें क्लिक करें. नमूना प्लेट पर उन सभी स्तंभों का चयन करें जिनमें नमूने/रिक्त स्थान हैं.
नोट: इस चरण में प्लेट नाम और प्रयोग के विवरण की प्रविष्टि वैकल्पिक है और प्रयोग को स्थापित करना जारी रखने की आवश्यकता नहीं है। - प्लेट कॉन्फ़िगरेशन की पुष्टि करने के लिए ठीक क्लिक करें; नारंगी रोशनी उपकरण डेक पर उन स्थितियों को इंगित करने के लिए रोशन करेगी जहां उपभोग्य सामग्रियों को लोड करने की आवश्यकता होती है।
- उपकरण डेक पर बी को रखने के लिए ड्रॉपलेट जनरेटर कारतूस लोड करें ताकि सभी रोशनी हरी हो जाए।
- उपकरण डेक पर स्थिति सी में एक खाली टिप अपशिष्ट गर्त रखें।
- फ़िल्टर टिप बॉक्स से ढक्कन निकालें और उपकरण मंच पर डी को रखने के लिए लोड करें ताकि सभी रोशनी हरी हो जाए।
- नमूना प्लेट से चिपकने वाली प्लेट सील को हटा दें और उपकरण डेक की स्थिति एफ पर लोड करें ताकि प्रकाश हरा हो जाए।
- एक खाली बूंद संग्रह 96-वेल प्लेट को एक शांत ब्लॉक (-20 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-ठंडा) में रखें और उपकरण डेक की स्थिति जी पर लोड करें ताकि प्रकाश हरा हो जाए।
- इंस्ट्रूमेंट टच स्क्रीन पर ड्रॉपलेट जनरेशन प्रारंभ करें क्लिक करें.
- उपकरण टच स्क्रीन पर स्टार्ट रन क्लिक करें. उपकरण ढक्कन स्वचालित रूप से बंद हो जाएगा। प्रारंभ करने के बाद, ड्रॉपलेट जनरेशन पूरा होने तक शेष समय उपकरण टच स्क्रीन पर प्रदर्शित होगा।
- एक बार बूंद पीढ़ी पूरी हो जाने के बाद, नमूना संग्रह प्लेट को नेत्रहीन रूप से जांचें ताकि यह पुष्टि की जा सके कि प्रत्येक कुएं में तेल चरण के ऊपर एक बूंद इमल्शन परत मौजूद है (चित्रा 1 बी)।
नोट: यदि एक ड्रॉपलेट इमल्शन परत दिखाई नहीं दे रही है, तो प्रयोग के साथ आगे न बढ़ें और प्रोटोकॉल के पिछले चरणों के दौरान हुई किसी भी त्रुटि की जांच करें। - उपकरण डेक से उपयोग किए गए उपभोग्य सामग्रियों को साफ करें और टिप-वेस्ट गर्त को खाली करें।
- प्लेट सीलर पर पावर, तापमान को 180 डिग्री सेल्सियस और सील समय को 5 सेकंड तक सेट करें, और मशीन को ऑपरेटिंग तापमान तक पहुंचने की अनुमति दें।
- नमूना संग्रह प्लेट को प्लेट सीलर प्लेट-धारक में डालें और लाल रेखा के साथ प्लेट के शीर्ष पर एक ताजा पन्नी सील रखें। ध्यान रखें कि पन्नी सील के नीचे के हिस्से को न छुएं।
नोट: प्लेट धारक को कमरे के तापमान (आरटी) पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और केवल प्लेट सीलर दराज में रखा जाना चाहिए जब नमूना संग्रह प्लेट में गर्मी हस्तांतरण को रोकने के लिए एक पन्नी सील लागू की जा रही हो। - जब प्लेट सीलर ऑपरेटिंग तापमान तक पहुंच गया है, तो इंस्ट्रूमेंट टचस्क्रीन पर इजेक्ट दबाएं; दराज स्वचालित रूप से खुल जाएगा।
- प्लेट धारक को प्लेट सीलर दराज में रखें और सील दबाएं। दराज स्वचालित रूप से बंद हो जाएगा और फिर सीलिंग पूरा होने के बाद फिर से खुल जाएगा।
- कोल्ड ब्लॉक पर सील की गई प्लेट को बदलें, प्लेट सीलर को बंद करें, और तुरंत चरण 5 पर आगे बढ़ें।
नोट: इस स्तर पर, बूंदें अस्थिर होती हैं, इसलिए सुनिश्चित करें कि बूंद पीढ़ी समाप्त होने के 1 घंटे के भीतर पीसीआर चरण शुरू हो गया है।
5. पीसीआर
- सील ड्रॉपलेट कलेक्शन प्लेट को 96-डीप-वेल ब्लॉक से लैस पीसीआर साइकिलर पर रखें और तालिका 3 में वर्णित थर्मल साइक्लिंग प्रोटोकॉल चलाएं।
नोट: गर्म ढक्कन तापमान को 105 डिग्री सेल्सियस और नमूना मात्रा को 40 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। विकृतीकरण और एनीलिंग / विस्तार चरणों में 2 डिग्री सेल्सियस / सेकंड की तापमान रैंप-दर शामिल होनी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि तेल के पास सही तापमान के बराबर होने का समय है। - चरण 6 पर आगे बढ़ें।
नोट: थर्मल साइक्लिंग प्रोटोकॉल पूरा होने के बाद, बूंदें अधिक स्थिर होती हैं, और प्लेट को अगले चरण के साथ आगे बढ़ने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
6. ड्रॉपलेट रीडिंग
- ड्रॉपलेट रीडर और कनेक्टेड कंप्यूटर पर पावर।
- ड्रॉपलेट रीडर तेल और ड्रॉपलेट रीडर अपशिष्ट बोतलों में द्रव के स्तर की जांच करें और यदि आवश्यक हो, तो क्रमशः इन्हें भरें / खाली करें।
- पोस्ट-पीसीआर नमूने वाली प्लेट को ड्रॉपलेट रीडर प्लेट धारक में लोड करें, कवर को धारक के शीर्ष पर रखें और इसे काले लॉकिंग क्लिप के साथ सुरक्षित करें। नमूना प्लेट से पन्नी ढक्कन न निकालें।
- इसे खोलने के लिए ड्रॉपलेट रीडर के ढक्कन पर ओपन /क्लोज बटन दबाएं ।
- नमूना प्लेट वाले ड्रॉपलेट रीडर प्लेट धारक को रीडर कक्ष में लोड करें और इसे चुंबकीय आधार पर सुरक्षित रूप से ढूंढें।
- इसे बंद करने के लिए ड्रॉपलेट रीडर के ढक्कन पर ओपन/क्लोज बटन दबाएं।
- विश्लेषण सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस खोलें, प्लेट जोड़ें टैब का चयन करें और निम्नानुसार एक नई नमूना प्लेट तैयार करें:
- प्लेट जोड़ें क्लिक करें और तब प्लेट कॉन्फ़िगर करें.
- प्लेट सूचना टैब में प्लेट नाम दर्ज करें, सुपरमिक्स ड्रॉप-डाउन मेनू से प्रोब्स के लिए सुपरमिक्स (कोई डीयूटीपी नहीं) का चयन करें और डेटा फ़ाइल को सहेजें के तहत फ़ाइल नाम दर्ज करें।
- वेल सिलेक्शन टैब में विश्लेषण किए जाने वाले कुओं को हाइलाइट करें और चयनित वेल्स शामिल करें पर क्लिक करें।
नोट: चरण 6.7.4 – 6.7.7 वैकल्पिक हैं। - अच्छी तरह से जानकारी टैब में, एनोटेट किए जाने वाले कुओं का चयन करें।
नोट: अच्छी तरह से जानकारी टैब इंटरफ़ेस के एक उदाहरण के लिए चित्रा 1 डी देखें। - प्रयोग प्रकार ड्रॉप-डाउन मेनू से प्रत्यक्ष परिमाणीकरण (डीक्यू) का चयन करें, नमूना विवरण, नमूना प्रकार और लक्ष्य नाम बॉक्स को पॉप्युलेट करें, और आवश्यकतानुसार अच्छी तरह से नोट्स और / या प्लेट नोट्स जोड़ें।
- लागू करें क्लिक करें. खेतों की जानकारी चयनित कुओं पर लागू की जाएगी।
- चरण 6.7.4–6.7.6 को दोहराएँ जब तक कि सभी नमूना कुओं को एनोटेट नहीं किया जाता है।
- प्लेट कॉन्फ़िगरेशन पूर्ण हो जाने के बाद, रन प्रारंभ करें क्लिक करें.
- जब रन पूरा हो जाता है, तो खाली नमूना प्लेट को छोड़ दें और यदि आवश्यक हो तो ड्रॉपलेट रीडर अपशिष्ट बोतल खाली करें।
- चरण 7 पर आगे बढ़ें।
7. परिणामों का विश्लेषण
नोट: ड्रॉपलेट रीडर एक नमूने में प्रत्येक बूंद के लिए एफएएम और एचईएक्स चैनल में प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापता है। एक सफल परख में, बूंदें प्रत्येक जांच के लिए दो श्रेणियों में से एक में आती हैं: नकारात्मक (जिसका अर्थ है कि लक्ष्य बूंद में मौजूद नहीं था) या सकारात्मक (जिसका अर्थ है कि लक्ष्य बूंद में मौजूद था)। नमूनों का विश्लेषण करने से पहले, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कुएं में >10,000 बूंदें हैं और प्रत्येक चैनल में कम प्रतिदीप्ति (नकारात्मक) और उच्च प्रतिदीप्ति (सकारात्मक) बूंदों की दो स्पष्ट रूप से अलग आबादी है (चित्रा 2 ए)।
- डेटा विश्लेषण टैब का चयन करें और मेरे डेटाफ़ाइल्स मेनू से विश्लेषण की जाने वाली फ़ाइल खोलें.
- एकल-रंग प्रयोगों के लिए 1D आयाम टैब या दो-रंग प्रयोगों के लिए 2D आयाम टैब क्लिक करें.
- सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों को अलग करने के लिए प्रत्येक चैनल पर एक प्रतिदीप्ति सीमा लागू करें। विश्लेषण सॉफ़्टवेयर नमूना-दर-नमूना और चैनल-दर-चैनल आधार पर एक स्वचालित सीमा लागू करने का प्रयास करेगा, लेकिन यदि यह विफल प्रतीत होता है, या गलत दिखता है, तो मैन्युअल रूप से सीमा को निम्नानुसार लागू करें:
- उन कुओं का चयन करें जिन्हें दहलीज की आवश्यकता होती है।
- थ्रेशोल्ड लाइन मोड टूल का उपयोग करके आयाम प्लॉट पर सकारात्मक और नकारात्मक आबादी के बीच स्पष्ट स्थान में सीमा को मैन्युअल रूप से लागू करें। 2 डी दृश्य में मैन्युअल थ्रेसहोल्ड सेट करते समय, सुनिश्चित करें कि क्रॉसहेयर रखा गया है ताकि चार बूंद आबादी (डबल नकारात्मक, एकल सकारात्मक एफएएम, एकल सकारात्मक एचईएक्स, और डबल पॉजिटिव) स्पष्ट रूप से अलग हो जाएं।
नोट: थ्रेसहोल्डिंग या तो अच्छी तरह से अच्छी तरह से किया जा सकता है या एक बार में कई कुओं पर लागू किया जा सकता है।
- एक बार जब सभी नमूने एक सीमा लागू कर लेते हैं, तो डेटा तालिका टैब पर क्लिक करके, आयात / निर्यात पर क्लिक करके और सीएसवी में निर्यात दृश्यमान डेटा का चयन करके परिणामों को आगे के विश्लेषण के लिए .csv फ़ाइल के रूप में निर्यात करें। उपयुक्त फ़ाइल नाम दर्ज करें और सहेजें क्लिक करें.
- प्रारंभिक नमूने में एमटीडीएनए कॉपी संख्या की गणना निम्नानुसार करें:
प्रतिलिपि संख्या = mtDNA लक्ष्य सांद्रता × 22 × कुल लाइसेट इनपुट का 1/अंश
नोट: यदि दो माइटोकॉन्ड्रियल जांच का उपयोग किया जाता है, तो गणना करने से पहले दो लक्ष्यों की एकाग्रता का औसत निकाला जाता है। एक से अधिक सेल वाले नमूनों के लिए, प्रति सेल कॉपी संख्या की गणना नमूने में कोशिकाओं की संख्या से विभाजित करके की जाती है। .csv फ़ाइल में गणना की गई 'प्रति 20 μL' मान के बजाय 22 μL के प्रारंभिक नमूना आयतन से गुणा किए गए 'एकाग्रता' मान (यानी, प्रति माइक्रोलीटर प्रतियों की संख्या) का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि ड्रॉपलेट जनरेटर द्वारा आवश्यक 2 μL ओवरेज में छोड़ी गई mtDNA प्रतियों को प्रारंभिक नमूने की पूर्ण प्रतिलिपि संख्या की गणना करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए। - हेटेरोप्लाज्मिक एमटीडीएनए विलोपन ले जाने वाली कोशिकाओं के लिए, हटाए गए क्षेत्र के बाहर एमटीडीएनए लक्ष्य से परिणामों का उपयोग करके प्रतिलिपि संख्या की गणना करें (यानी, हटाए गए और डब्ल्यूटी एमटीडीएनए अणुओं दोनों में मौजूद लक्ष्य)। विलोपन हेटेरोप्लाज्मी की गणना हटाए गए क्षेत्र के अंदर लक्ष्य की सांद्रता और हटाए गए क्षेत्र के बाहर लक्ष्य का उपयोग करके निम्नानुसार की जाती है:
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Representative Results
बूंद उत्पादन के बाद, अपारदर्शी बूंदों की एक स्पष्ट परत प्रत्येक कुएं में तेल चरण के शीर्ष पर तैरती हुई दिखाई देती है (चित्रा 1 बी)। एकल कोशिकाओं पर प्रयोग करते समय इनपुट लाइसेट में डिटर्जेंट की उपस्थिति से बूंद गठन पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ सकता है। 2.1.2 में वर्णित लाइसिस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, अंतिम नमूने में ट्वीन -20 की एक छोटी अवशिष्ट मात्रा की उपस्थिति के बावजूद, 10,000 के अनुशंसित स्तर से ऊपर बूंद पैदावार नियमित रूप से प्राप्त की जाती है (चित्रा 1 सी)। हालांकि, बफर आरएलटी प्लस जैसे अन्य लाइसिस बफर के साथ, गठित बूंदों की संख्या में नाटकीय कमी देखी जाती है (चित्रा 1 सी), जो कॉपी संख्या माप की सटीकता पर प्रतिकूल प्रभाव डालने की संभावना है।
पीसीआर और ड्रॉपलेट रीडिंग के बाद, सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों की स्पष्ट रूप से अलग आबादी प्रत्येक नमूने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक चैनल में देखी जाएगी (चित्रा 2 ए), जिसमें एनटीसी कुओं में केवल नकारात्मक बूंदें होंगी। परिणामों का विश्लेषण करते समय आने वाली संभावित समस्याओं में शामिल हैं:
सकारात्मक और नकारात्मक आबादी के बीच स्पष्ट अलगाव की कमी, और दो आबादी के बीच अंतर में बूंदों की उपस्थिति, जिसे 'बारिश' कहा जाता है (चित्रा 2 बी)। यह तब हो सकता है जब एक गैर-इष्टतम एनीलिंग / विस्तार तापमान का उपयोग किया जाता है, खासकर परख में जहां सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों के बीच प्रतिदीप्ति में अंतर अपेक्षाकृत छोटा होता है। विस्तार तापमान की ढाल चलाने से उपयोग करने के लिए इष्टतम तापमान की पहचान करने में मदद मिल सकती है। वैकल्पिक रूप से, परख प्रदर्शन में सुधार के लिए प्राइमरों / जांच को फिर से डिजाइन करने की आवश्यकता हो सकती है।
'1 डी आयाम' दृश्य का उपयोग करते समय नकारात्मक आबादी में बूंदों का एक 'डबल बैंड'। कुछ मामलों में, एचईएक्स चैनल (चित्रा 2बीआई) में नकारात्मक बूंदों का एक डबल बैंड देखा जा सकता है; यह डबल-नकारात्मक और एकल-नकारात्मक (यानी, एफएएम-पॉजिटिव, एचईएक्स-नकारात्मक) बूंद आबादी के बीच पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के अलग-अलग स्तरों का परिणाम है, जैसा कि (चित्रा 2बीiii) में देखा गया है, जो डबल-नकारात्मक आबादी (नीचे बाएं चतुर्थांश) की तुलना में एचईएक्स चैनल में कम औसत प्रतिदीप्ति के साथ एफएएम एकल-सकारात्मक आबादी (शीर्ष बाएं चतुर्थांश) को दर्शाता है। यह प्रतिदीप्ति विरूपण साक्ष्य परख के परिणामों को प्रभावित नहीं करता है, और '2 डी आयाम' का उपयोग चार बूंद आबादी को स्पष्ट रूप से पहचानने की अनुमति देता है।
सकारात्मक बूंदों की अनुपस्थिति (चित्रा 2 सी)। मान्य परखों के लिए, यह नमूना तैयार करने के दौरान त्रुटि के कारण सबसे अधिक संभावना है (उदाहरण के लिए, अपूर्ण सेल लाइसिस, मास्टर मिश्रण में जोड़ा गया गलत प्राइमर / जांच, एकल-सेल सॉर्टिंग की विफलता, आदि)।
नकारात्मक बूंदों की अनुपस्थिति (चित्रा 2 डी)। यह तब होता है जब परख एक उच्च लक्ष्य डीएनए इनपुट से संतृप्त होती है, जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक बूंद में एक या अधिक लक्ष्य अनुक्रम होते हैं। यह उच्च प्रतिलिपि संख्या नमूने (जैसे, अंडाणुओं) को मापते समय देखे जाने की सबसे अधिक संभावना है और चरण 3.5 से पहले लाइसेट को पतला करके हल किया जा सकता है। इनपुट डीएनए (चित्रा 2 डी) के एक सीरियल कमजोर पड़ने का उपयोग इस समस्या का सामना करने पर एक उपयुक्त कमजोर पड़ने वाले कारक की पहचान करने के लिए किया जा सकता है।
दो स्वतंत्र एमटीडीएनए जांच का उपयोग करते समय, नमूना डीएनए की अखंडता का आकलन '2 डी आयाम' दृश्य का चयन करके किया जा सकता है: बरकरार एमटीडीएनए अणु दोनों लक्ष्य अनुक्रमों को ले जाते हैं; इसलिए, पूर्ण एमटीडीएनए जीनोम वाली बूंदें दोनों चैनलों (चित्रा 3 ए) में सकारात्मक होंगी। एमटीडीएनए विलोपन वाले नमूनों का विश्लेषण करते समय, गैर-हटाए गए लक्ष्य अनुक्रम के लिए केवल डबल-पॉजिटिव बूंदों और बूंदों का मिश्रण मौजूद होगा, यहां तक कि गैर-अवक्रमित नमूनों में भी (चित्रा 3 बी)। जब एमटीडीएनए को नीचा दिखाया जाता है, तो कुछ लक्ष्य अनुक्रम अलग-अलग डीएनए टुकड़ों पर मौजूद होने की संभावना होती है, और इसलिए बूंदों को केवल एक जांच के लिए सकारात्मक होने की अधिक संभावना होती है, और कम बूंदें दोनों के लिए सकारात्मक होंगी (चित्रा 3 सी)। डेटा विश्लेषण के दौरान इन अंतरों का हिसाब लगाया जाता है, क्योंकि उस फ्लोरेसेंस चैनल में सभी सकारात्मक बूंदों की कुल आबादी का उपयोग करके प्रत्येक लक्ष्य के लिए सांद्रता का हमेशा स्वतंत्र रूप से अनुमान लगाया जाता है, और फिर या तो कॉपी संख्या का अनुमान लगाने के लिए औसत किया जाता है या हेटरोप्लाज्मी की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है (चरण 7.3.-7.4 देखें)।
इस विधि का उपयोग माउस और मानव ऊतकों दोनों से विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों में कॉपी संख्या को मापने के लिए किया जा सकता है, जिसमें प्रयोगशाला सेल लाइनें जैसे हेला, एचईके 293 टी, और अमर माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) और प्राथमिक कोशिकाएं जैसे मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट और माउस प्राइमर्डियल जर्म सेल (पीजीसी) (चित्रा 4 ए) शामिल हैं। परीक्षण किए गए दैहिक कोशिका प्रकारों में, प्रतिलिपि संख्याओं की एक श्रृंखला कुछ सौ (जैसे, त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट) से लेकर कई हजार (जैसे, हेला कोशिकाओं) तक देखी जाती है। परख परिशुद्धता को मापने के लिए, परिपक्व माउस अंडाणु, जिनकी प्रतिलिपि संख्या बहुत अधिक है (>150,000 प्रतियां प्रति सेल)2, को लाइस किया गया था, और परिणामस्वरूप लाइसेट को प्रति सेल 22 अलग-अलग प्रतिक्रियाओं में समान रूप से विभाजित किया गया था। ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर प्रोटोकॉल चलाने के बाद, प्रत्येक प्रतिक्रिया में पाई गई प्रतियों की संख्या में बहुत कम अंतर देखा गया, जिसमें दो प्रतिनिधि कोशिकाओं (चित्रा 4 बी) ने कुल 229,647 प्रतियां (औसत 10,439 प्रति कुआं, मानक विचलन 380) और 330,121 प्रतियां (मतलब 15,006 प्रति कुआं, मानक विचलन 340) प्रति अंडाणु उत्पन्न कीं। इन दो कोशिकाओं के लिए भिन्नता (सीवी) के गुणांक क्रमशः 3.64% और 2.26% थे। जैविक नमूनों में प्रजनन क्षमता का परीक्षण करने के लिए, गर्भाधान के बाद 13.5 दिन में चार भ्रूण चूहों के गोनैड्स से पीजीसी की कटाई की गई थी, और इन सेल आबादी की परिणामस्वरूप एकल-कोशिका प्रतिलिपि संख्या की तुलना विभिन्न भ्रूणों में की गई थी (चित्रा 4 सी)। जबकि कुछ जैविक भिन्नता की उम्मीद की जानी है, औसत प्रतिलिपि संख्या और मानक विचलन परीक्षण किए गए चार भ्रूणों में तुलनीय रहे, और ये परिणाम भ्रूण के विकासके समान चरण में इस सेल प्रकार में पहले रिपोर्ट किए गए कॉपी नंबर डेटा के अनुरूप थे।
कॉपी नंबर को मापने के अलावा, इस विधि का उपयोग हेटेरोप्लाज्मिक एमटीडीएनए विलोपन ले जाने वाली साइब्रिड कोशिकाओं में हेटेरोप्लाज्मी स्तर को मापने के लिए भी किया जा सकता है। इसके लिए दो एमटीडीएनए जांच के उपयोग की आवश्यकता होती है, एक एमटीडीएनए के हटाए गए क्षेत्र के अंदर गिरता है और एक बाहर गिरता है (चित्रा 5 ए)। विश्लेषण के बाद, हेटेरोप्लाज्मी के स्तर को प्रत्येक जांच की एकाग्रता की तुलना करके पाया जा सकता है ताकि दोनों लक्ष्यों (यानी, डब्ल्यूटी एमटीडीएनए जीनोम) वाली प्रतियों के अनुपात की गणना की जा सके और उस अनुपात में केवल जांच होती है जो हटाए गए क्षेत्र (यानी, हटाए गए एमटीडीएनए जीनोम) के बाहर आती है, जैसा कि चरण 7.4 में वर्णित है। चूंकि हटाए गए क्षेत्र के बाहर स्थित लक्ष्य सभी एमटीडीएनए प्रतियों में मौजूद है, इसलिए इसका उपयोग सेल की समग्र प्रतिलिपि संख्या की गणना करने के लिए भी किया जा सकता है। उच्च विलोपन हेटरोप्लाज्मी वाली कोशिकाओं में, हटाए गए क्षेत्र के अंदर जांच की अपेक्षाकृत कम प्रतियां पाई जाती हैं (चित्रा 5बी), जबकि कम विलोपन हेटरोप्लाज्मी वाली कोशिकाओं में, दो जांच की सांद्रता बहुत अधिक समान होती है (चित्रा 5बीआई)। थोक-निकाले गए डीएनए नमूनों में ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर द्वारा विलोपन हेटेरोप्लाज्मी को मापने के लिए 'इन-आउट' जांच परख के उपयोग ने क्यूपीसीआर-आधारित विधियों पर बेहतर परिशुद्धता दिखाई है, लेकिन बहुत कम हेटेरोप्लाज्मी स्तर (<5%) 22 से निपटने के दौरान संवेदनशीलता की कमी है, और इसलिए बहुत कम विलोपन बोझ वाली कोशिकाओं में इसकी सिफारिश नहीं की जाती है। तालिका 1 में वर्णित माउस और मानव एमटीडीएनए दोनों के लिए प्राइमर / प्रोब सेट में एमटीडीएनए प्रमुख चाप के भीतर एक लक्ष्य और बाहर एक लक्ष्य शामिल है, और इसलिए सबसे आम एमटीडीएनए विलोपन23,24 के लिए उपयुक्त हैं।
| प्रजातियां | लक्ष्य | प्राइमर/प्रोब का नाम | अनुक्रम | 5' जांच | 3' बुझाने वाला | ||
| मानवीय | ND4 | huND4_F प्राइमर | AGTGCGATGAGTAGGAGAGAGAGG | ||||
| huND4_R प्राइमर | ACCTTGGCTATCATCACCGAT | ||||||
| huND4_FAM जांच | CAACCAGAGAACGCCTGAACGCA | FAM | BHQ 2 | ||||
| ND1 | huND1_F प्राइमर | GGGTTCATagTAGAGAGCGATGG | |||||
| huND1_R प्राइमर | ACGCCATAAAACTCTCACAAAAG | ||||||
| huND1_HEX जांच | ACCCGCCACCATACCATCACCCCCC | हेक्स | BHQ 1 | ||||
| चूहा | ND1 | musND1_F प्राइमर | GAGCCTCAAACTCAATACTCACT | ||||
| musND1_R प्राइमर | GAACTAGAAAAGAATA GCTATGGTTACTCA |
||||||
| musND1_FAM जांच | CCGTAGCCCAAACAAT | FAM | BHQ 1 | ||||
| COX3 | musCOX3_F प्राइमर | CCTCGTACCACACATGATCTAGG | |||||
| musCOX3_R प्राइमर | AGTGGGACTTAGGGGTAGTG | ||||||
| musCOX3_HEX जांच | ACCTCCAACAGGAATTTCA | हेक्स | BHQ 1 | ||||
तालिका 1: मानव और माउस कोशिकाओं में उपयोग के लिए मान्य ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर प्राइमर और जांच सेट। पहले से मान्य परीक्षणों के लिए प्राइमर और प्रोब सेट मानव16,17 और माउस कोशिकाओं 18 के लिए दो स्वतंत्र एमटीडीएनए लक्ष्यों को बढ़ातेहैं।
| घटक | मात्रा प्रति नमूना | अंतिम एकाग्रता |
| प्रोब्स के लिए 2X ddPCR सुपरमिक्स (कोई dUTP) | 11 μl | 1X |
| लक्ष्य 1 प्राइमर F (20 μM) | 1 μl | 900 nM |
| लक्ष्य 1 प्राइमर R (20 μM) | 1 μl | 900 nM |
| लक्ष्य 2 प्राइमर F (20 μM) | 1 μl | 900 nM |
| लक्ष्य 2 प्राइमर R (20 μM) | 1 μl | 900 nM |
| लक्ष्य 1 प्रोब (FAM, 10 μM) | 0.55 μl | 250 nM |
| लक्ष्य 2 प्रोब (HEX, 10 μM) | 0.55 μl | 250 nM |
| नमूना डीएनए (चरण 3.4 में जोड़ा गया) | परिवर्तनशील | परिवर्तनशील |
| न्यूक्लियस मुक्त पानी | परिवर्तनशील | |
| कुल मात्रा | 22 μl |
तालिका 2: ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर रिएक्शन मिक्स रेसिपी। एकल-अच्छी बूंद पीढ़ी पीसीआर परख के लिए आवश्यक प्रतिक्रिया मिश्रण। अनुशंसित प्राइमर /जांच अनुक्रम तालिका 1 में पाया जा सकता है; कई नमूने चलाते समय नुस्खा को बढ़ाया जा सकता है।
| क़दम | Temp (°C) | समय | नहीं। चक्र |
| एंजाइम सक्रियण | 95 | 10 मिनट | 1 |
| विकृतीकरण | 94 | 30 सेकंड | 40 |
| एनीलिंग/एक्सटेंशन | 58 | 1 मिनट | |
| एंजाइम निष्क्रियीकरण | 98 | 10 मिनट | 1 |
| पकड | 4 | अनंत | 1 |
तालिका 3: ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर थर्मल साइक्लिंग प्रोटोकॉल। ड्रॉपलेट जनरेशन के बाद लक्ष्य डीएनए के प्रवर्धन के लिए साइकिल िंग प्रोटोकॉल।
(ए) ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर ड्रॉपलेट जनरेटर इंस्ट्रूमेंट डेक का योजनाबद्ध लेआउट, निम्नानुसार स्थिति: ए = स्वचालित तरल हैंडलिंग मॉड्यूल, बी = ड्रॉपलेट जनरेटर कारतूस (एक्स 3), सी = टिप वेस्ट बाल्टी, डी = फिल्टर टिप बॉक्स (एक्स 2), ई = ड्रॉपलेट जनरेटर ऑयल होल्डर, एफ = नमूना प्लेट, जी = संग्रह प्लेट (शांत ब्लॉक में रखा गया)। (बी) बूंद उत्पादन के तुरंत बाद तेल चरण के शीर्ष पर तैरते बूंद इमल्शन की प्रतिनिधि छवि। (सी) ड्रॉपलेट संख्या पर विभिन्न लाइसिस बफर का प्रभाव; 1% ट्वीन -20 के साथ बूंद संख्या में थोड़ी कमी होती है, जबकि आरएलटी प्लस बफर के परिणामस्वरूप बूंद संख्या में लगभग तीन गुना कमी होती है, जो 10,000 की अनुशंसित संख्या से काफी कम है (परिणाम मानक विचलन के साथ प्रति स्थिति तीन तकनीकी दोहराव के औसत के रूप में दिखाए गए हैं)। (डी) सॉफ्टवेयर वेल इंफॉर्मेशन टैब का स्क्रीनशॉट जो 96-वेल टेम्पलेट के अच्छी तरह से ए 1 पर लागू पूर्ण नमूना जानकारी दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: प्रतिनिधि ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर परख विश्लेषण अपेक्षित परिणाम और सामान्य मुद्दों को दर्शाता है। (ए) तीन हेला सिंगल-सेल लाइसेट से दोहरी एमटीडीएनए जांच परख परिणाम (i) एफएएम चैनल, (ii) एचईएक्स चैनल, और (iii) संयुक्त 2 डी आयाम दृश्य में स्पष्ट रूप से अलग सकारात्मक और नकारात्मक बूंद आबादी दिखाते हैं। (बी) परख के परिणाम चार थोक हेला 20-सेल नमूनों से पता चलता है जो (i) एफएएम चैनल में सकारात्मक और नकारात्मक आबादी के बीच 'बारिश' दिखाते हैं, (ii) एचईएक्स चैनल में सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों के बीच खराब अलगाव, और (iii) एचईएक्स चैनल की नकारात्मक बूंदों में एक डबल ड्रॉपलेट बैंड (ii) एचईएक्स-नकारात्मक आबादी में अलग-अलग पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति स्तरों के कारण। जैसा कि 2 डी आयाम दृश्य में देखा गया है। (सी) डब्ल्यूटी साइब्रिड सिंगल-सेल लाइसेट का एक उदाहरण जिसमें प्रतिदीप्ति चैनल में कोई सकारात्मक बूंदें नहीं होती हैं (i) तुलना के लिए एक ही प्रयोग (ii) से एक सफल डब्ल्यूटी साइब्रिड परख के साथ। (घ) पीसीआर-प्रवर्धित मानव एनडी1 लक्ष्य एम्प्लिकॉन के ज्ञात सांद्रता के साथ 10 गुना क्रमिक कमजोर पड़ने के प्रतिनिधि परिणाम, 120,000 प्रतियों की परख ऊपरी सीमा से ऊपर बूंद पीढ़ी पीसीआर की संतृप्ति को दर्शाते हैं। आरएफयू = सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयाँ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: '2D आयाम' दृश्य का उपयोग करके mtDNA अखंडता का आकलन करना। (A) प्रतिनिधि ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर परिणाम WT साइब्रिड सिंगल-सेल लाइसेट से होते हैं जिसमें ज्यादातर बरकरार एमटीडीएनए जीनोम होते हैं, जो मुख्य रूप से FAM और HEX डबल-पॉजिटिव बूंदों की उपस्थिति से संकेत मिलते हैं। (बी) ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर एक हेट्रोप्लाज्मिक विलोपन साइब्रिड सिंगल-सेल लाइसेट से उत्पन्न होता है, जिसमें एचईएक्स सिंगल-पॉजिटिव बूंदों (केवल एचईएक्स लक्ष्य को ले जाने वाले हटाए गए एमटीडीएनए अणु होते हैं) और एफएएम और एचईएक्स डबल-पॉजिटिव बूंदों (दोनों लक्ष्यों को ले जाने वाले पूर्ण एमटीडीएनए अणु होते हैं) का मिश्रण दिखाया जाता है, जिसमें बहुत कम एफएएम एकल-सकारात्मक बूंदें होती हैं, जो कोई बड़ी एमटीडीएनए गिरावट का संकेत नहीं देती हैं। (ग) ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर एक माउस ओसाइट सिंगल-सेल लाइसेट से उत्पन्न होता है जिसमें एफएएम सिंगल-पॉजिटिव, एचईएक्स सिंगल-पॉजिटिव, और एफएएम और एचईएक्स डबल-पॉजिटिव बूंदों का मिश्रण होता है, यह दर्शाता है कि इस नमूने में कुछ एमटीडीएनए क्षरण होने की संभावना है। आरएफयू = सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयाँ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: एकल-सेल कॉपी संख्या माप सेल प्रकारों के बीच भिन्नता को प्रकट करते हैं लेकिन मजबूत इंट्रा- और अंतर-प्रयोगात्मक पुनरावृत्ति दिखाते हैं। (ए) मानव (वर्ग) और माउस (त्रिकोण) ऊतकों (एन = 12 कोशिकाएं प्रति ऊतक) दोनों से सेल लाइनों की एक श्रृंखला से प्रतिनिधि एकल-सेल प्रतिलिपि संख्या माप। (बी) दो अलग-अलग माउस अंडाणुओं से लाइसेट में कॉपी संख्या का सीरियल माप; कुल लाइसेट वॉल्यूम को 22 अलग-अलग ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर प्रतिक्रियाओं में विभाजित किया गया था; बॉक्स और मूंछ भूखंडों पर प्रत्येक बिंदु एक ही कुएं में मापी गई प्रतिलिपि संख्या का प्रतिनिधित्व करता है। औसत, मानक विचलन (एसडी), और भिन्नता गुणांक (सीवी) प्रत्येक अंडाणु के लिए रिपोर्ट किए जाते हैं। (सी) निषेचन के बाद 13.5 दिनों में चार अलग-अलग भ्रूणों से एकत्र किए गए प्राथमिक माउस आदिम रोगाणु कोशिकाओं की एकल-कोशिका प्रतिलिपि संख्या (एन = 94 एकल कोशिकाएं प्रति भ्रूण)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 5: एक विलोपन साइब्रिड लाइन में एकल-कोशिका हेटरोप्लाज्मी को मापना। (ए) इस अध्ययन के लिए उपयोग की जाने वाली साइब्रिड लाइन में हटाए गए एमटीडीएनए के क्षेत्र और एनडी 1 और एनडी 4 एमटीडीएनए जांच के स्थान को दर्शाने वाला योजनाबद्ध। (बी) (i) एक उच्च हेटेरोप्लाज्मी सिंगल-सेल लाइसेट और (ii) एक कम हेटेरोप्लाज्मी सिंगल-सेल लाइसेट से प्रतिनिधि परिणाम जो एनडी 4: एनडी 1 जांच के अलग-अलग अनुपात और परिणामस्वरूप प्रतिलिपि संख्या और हेटरोप्लाज्मी माप दिखाते हैं। आरएफयू = सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयाँ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल ऊपर चर्चा किए गए लोगों के अलावा सेल प्रकारों और प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला में लागू होता है, हालांकि नए परख डिजाइनों का सावधानीपूर्वक अनुकूलन यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण होगा कि पहले से मान्य प्राइमर / जांच संयोजनों से दूर जाने पर विधि की सटीकता और पुनरावृत्ति बनाए रखी जाती है। एकल कोशिकाओं के साथ काम करते समय यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि नमूना संग्रह यथासंभव सटीक रूप से किया जाता है (उदाहरण के लिए, एफएसीएस द्वारा कोशिकाओं को छांटते समय कड़े एकल-सेल मापदंडों का उपयोग करना) यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्राप्त परिणाम वास्तव में व्यक्तिगत कोशिकाओं को प्रतिबिंबित करते हैं, और यह भी कि संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए सभी प्रारंभिक कार्य एक स्वच्छ पूर्व-पीसीआर क्षेत्र में किए जाते हैं। कुशल सेल लाइसिस यह सुनिश्चित करने के लिए भी महत्वपूर्ण है कि एमटीडीएनए प्रतियों को सफलतापूर्वक अलग बूंदों में विभाजित किया जा सकता है; हालांकि, डिटर्जेंट की उच्च सांद्रता का उपयोग करते समय बूंद गठन को बाधित करने के जोखिम के खिलाफ इसे संतुलित करने की आवश्यकता है।
परख डिजाइन और लाइसिस चरण प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण होने के कारण, ये भी समस्या निवारण की आवश्यकता वाले कदम हैं। प्राइमर /प्रोब सेट जो शुरू में सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों की अच्छी तरह से अलग आबादी का उत्पादन नहीं करते हैं, पीसीआर प्रोटोकॉल के एनीलिंग / विस्तार तापमान को अनुकूलित करने पर बेहतर प्रदर्शन दिखा सकते हैं। चरण 5.1 में 58 डिग्री सेल्सियस का सुझाया गया तापमान दिया गया है। प्राइमर/प्रोब सेट के लिए मान्य किया गया है (तालिका 1); हालांकि, इष्टतम तापमान 55-65 डिग्री सेल्सियस से भिन्न हो सकता है, और नए प्राइमर / प्रोब सेट के लिए सबसे उपयुक्त तापमान खोजने के लिए इस सीमा में एक ढाल पीसीआर चलाया जा सकता है। यदि यह असफल है, तो परख डिजाइन पर निर्माता दिशानिर्देशों का उल्लेख करते हुए प्रदर्शन में सुधार के लिए प्राइमरों और / या जांच को फिर से डिज़ाइन करना आवश्यक हो सकता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
यदि चरण 2.1.2 में वर्णित लोगों के लिए अलग-अलग लाइसिस स्थितियां हैं। यदि आवश्यक है, तो बूंद उत्पादन पर वैकल्पिक लाइसिस बफर के प्रभाव का आकलन किया जाना चाहिए। लाइसिस बफर में डिटर्जेंट की एकाग्रता को कम करके या न्यूक्लियस मुक्त पानी की एक बड़ी मात्रा में लाइसेट को पतला करके बूंद उत्पादन में सुधार करना संभव हो सकता है, हालांकि हमने पाया है कि कुछ बफर (जैसे, आरएलटी प्लस बफर) अभी भी बहुत कम सांद्रता पर भी बूंद गठन पर महत्वपूर्ण प्रभाव डालते हैं। इस समस्या का एक संभावित समाधान डीएनए की पोस्ट-लाइसिस सफाई करना है, उदाहरण के लिए डीएनए को बांधने के लिए एसपीआरआई मोतियों का उपयोग करना और डिटर्जेंट को धोने की अनुमति देना। जबकि एसपीआरआई मोतियों का उपयोग एकल सेल लाइसेट से जीनोमिक डीएनए25 और एमटीडीएनए26 दोनों को शुद्ध करने के लिए किया जाता है, इस प्रक्रिया के दौरान एमटीडीएनए जीनोम का कोई भी नुकसान बाद की कॉपी संख्या माप को प्रभावित करेगा, और वर्तमान में कोई डेटा नहीं है जो एकल-सेल लाइसेट पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एसपीआरआई बीड उत्पादों का उपयोग करते समय त्रुटि के इस संभावित स्रोत को निर्धारित करता है।
परंपरागत रूप से, एमटीडीएनए कॉपी नंबर और विलोपन हेटेरोप्लाज्मी को क्यूपीसीआर परख27 का उपयोग करके मापा गया है। जबकि क्यूपीसीआर दृष्टिकोण की अंतर्निहित अवधारणा यहां वर्णित ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर तकनीक के समान है, क्यूपीसीआर का उपयोग करने का एक बड़ा दोष सीधे पूर्ण कॉपी नंबर11 को मापने में असमर्थता है। प्रत्येक नमूने के लिए, क्यूपीसीआर एक चक्र सीमा (सीटी) मान को मापता है - प्रारंभिक इनपुट डीएनए से उत्पाद की एक निश्चित मात्रा तक पहुंचने के लिए आवश्यक पीसीआर के चक्रों की संख्या। चूंकि यह सीमा मनमानी है, इसलिए नमूनों को पूर्ण प्रतिलिपि संख्या सौंपने से पहले ज्ञात लक्ष्य सांद्रता की एक श्रृंखला वाले इनपुट से एक मानक वक्र उत्पन्न करना आवश्यक है। थोक डीएनए स्तर पर, यह प्रक्रिया एमटीडीएनए कॉपी संख्या को मापने की क्षमता में बहुत सटीक और ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर के बराबर है। हालांकि, बहुत कम कॉपी संख्याओं पर, जैसे कि आम तौर पर एकल कोशिकाओं में पाए जाते हैं, क्यूपीसीआर के लिए मानक वक्रों को सटीक रूप से उत्पन्न करना मुश्किल हो जाता है, और इसलिए, पूर्ण कॉपी संख्या11 के सटीक उपायों को प्राप्त करना कठिन हो जाता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर वर्तमान में क्यूपीसीआर की तुलना में प्रदर्शन करने के लिए अधिक महंगा है, जिसमें उपभोग्य सामग्रियों और अभिकर्मकों की लागत उच्च प्रारंभिक उपकरण लागत के अलावा प्रति-नमूना आधार पर लगभग 2.5 गुना अधिक है। इसका मतलब यह है कि ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर की लागत कुछ उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए निषेधात्मक हो सकती है, इस मामले में क्यूपीसीआर अभी भी एक व्यवहार्य विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है।
चूंकि ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर सीधे एक नमूने में मौजूद किसी दिए गए लक्ष्य की प्रतियों की संख्या को मापता है, इसलिए पूर्ण प्रतिलिपि संख्या को मापते समय एक मानक वक्र की कोई आवश्यकता नहीं होती है, और इसलिए ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर विधि इनपुट डीएनए11,12 की बहुत कम मात्रा के साथ भी बेहद संवेदनशील होती है। माइटोकॉन्ड्रियल जीव विज्ञान के क्षेत्र में एकल-कोशिका प्रौद्योगिकियों के उभरते महत्व को देखते हुए, यह बूंद पीढ़ी पीसीआर-आधारित दृष्टिकोण पिछले तरीकों पर एक महत्वपूर्ण प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है और एकल-सेल सेटिंग में प्रमुख माइटोकॉन्ड्रियल मापदंडों के निरंतर माप की अनुमति देता है। थोक ऊतक नमूनों से निकाले गए डीएनए में एमटीडीएनए कॉपी संख्या को मापने के लिए ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर का उपयोग करना भी संभव है; इसके लिए सेल नंबर को सामान्य बनाने की अनुमति देने के लिए एमटीडीएनए कॉपी नंबर के अलावा परमाणु डीएनए कॉपी नंबर के माप की आवश्यकता होती है। इसलिए, एमटीडीएनए को लक्षित करने वाले प्राइमर / प्रोब सेट के साथ-साथ परमाणु जीन को लक्षित करने वाले प्राइमर / प्रोब सेट को शामिल करना आवश्यक है। जैसा कि ऊपर बताया गया है, थोक ऊतक स्तर पर, ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर और मानक क्यूपीसीआर विधियां तुलनीय सटीकता की हैं, और इसलिए, ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर इस सेटिंग में मौजूदा तकनीकों पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान नहीं करता है।
यहां प्रस्तुत विधि की एक प्रमुख सीमा एमटीडीएनए विलोपन के बजाय हेटरोप्लाज्मिक एसएनपी ले जाने वाली कोशिकाओं में हेटरोप्लाज्मी स्तर को मापने में असमर्थता है, इस प्रकार एक एकल कोशिका से कॉपी नंबर और हेटरोप्लाज्मी दोनों को मापने के लिए एक अतिरिक्त परख (जैसे, पाइरोसीक्वेंसिंग या क्यूपीसीआर) की आवश्यकता होती है। इस मंच का उपयोग करके एलील-विशिष्ट अभिव्यक्ति (एएसई) का प्रदर्शन करने वाले एसएनपी का सफल पता लगानेकी सूचना दी गई है, और हाल ही की एक रिपोर्ट में आम एम .3243 ए>जी मेलास म्यूटेशन29 के हेटेरोप्लाज्मी को मापने के लिए इस विधि के उपयोग का वर्णन किया गया है। इसलिए, जबकि ऐसा लगता है कि सावधानीपूर्वक डिज़ाइन किए गए जांच जोड़े का उपयोग करके इस सीमा को दूर किया जा सकता है, इसके लिए प्रत्येक व्यक्तिगत एसएनपी के लिए डिज़ाइन / मान्य करने के लिए एक अलग प्राइमर / प्रोब सेट की आवश्यकता होती है, और एमटीडीएनए अनुक्रम में एक विशिष्ट आधार को लक्षित करने के लिए जांच की आवश्यकता से डिजाइन पैरामीटर बहुत अधिक प्रतिबंधित होते हैं। इस प्रकार, यहां वर्णित ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर प्रोटोकॉल में एसएनपी का पता लगाने का प्रयास अभी तक नहीं किया गया है।
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ड्रॉपलेट-आधारित डिजिटल पीसीआर प्लेटफॉर्म, जैसे कि इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्रकार, डीएनए लक्ष्यों के पूर्ण परिमाणीकरण में सक्षम एकमात्र तकनीक नहीं हैं, और वैकल्पिक तरीकों जैसे प्लेट-आधारित विभाजन का उपयोग करने वाले वाणिज्यिक उत्पादभी उपलब्ध हैं। इसके अलावा, पीसीआर के विकल्पों का उपयोग करने वाली प्रौद्योगिकियां, जैसे लूप-मध्यस्थता इज़ोटेर्मल प्रवर्धन (एलएएमपी) 31 और रिकोम्बिनेस पोलीमरेज़ प्रवर्धन (आरपीए)32, नैदानिक सेटिंग्स में उपयोग के लिए ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर की तुलना में अधिक उपयुक्त साबित हो सकती हैं।
कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल एकल कोशिकाओं में एमटीडीएनए कॉपी संख्या और विलोपन हेटरप्लाज्मी को मापने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील विधि प्रस्तुत करता है, जिसे विभिन्न सेल प्रकारों और प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है।
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Disclosures
खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
ड्रॉपलेट जनरेशन पीसीआर डेटा के सांख्यिकीय विश्लेषण पर सलाह के लिए डॉ एल बोज़िलोवा को धन्यवाद। चित्रा 3 सी और चित्रा 4 बी में डेटा उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अंडाणुओं को प्रदान करने के लिए डॉ एच झांग को धन्यवाद। यह काम कैम्ब्रिज विश्वविद्यालय के मेडिकल रिसर्च काउंसिल माइटोकॉन्ड्रियल बायोलॉजी यूनिट (MC_UU_00015/9) में एसपीबी द्वारा किया गया था, और पीएफसी (212219 / जेड / 18 / जेड) द्वारा आयोजित वेलकम ट्रस्ट प्रिंसिपल रिसर्च फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Tween-20 solution | Novex | 3005 | |
| Automated droplet-generating oil | Bio Rad | 1864110 | Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1) |
| C1000 PCR machine with deep-well block | Bio Rad | 1851197 | PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5) |
| Collection plate cooling block | Bio Rad | 12002819 | Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3) |
| ddPCR 96-well plates | Bio Rad | 12001925 | 96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3) |
| ddPCR droplet reader oil | Bio Rad | 1863004 | Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1) |
| ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio Rad | 1863023 | Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3) |
| DG32 automated droplet generator cartridges | Bio Rad | 1864108 | Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3) |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Qualified fetal bovine serum |
| Foil plate covers | Bio Rad | 1814040 | Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6) |
| HEK 293T cells | Takara | 632180 | Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen |
| HeLa cells | ECACC | 93021013 | Human cervix epitheloid carcinoma cells |
| High glucose DMEM | Gibco | 13345364 | 4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Human cybrids | University of Miami | ||
| Mouse embryonic fibroblasts | Newcastle University | Immortalized from C57Bl/6 mice | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PCR plate seals | Pierce | SP-0027 | Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6) |
| Pipet Tip Waste Bins | Bio Rad | 1864125 | Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Pipet tips for AutoDG system | Bio Rad | 1864120 | Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Primary human dermal fibroblast cells | Newcastle Biobank | ||
| Primers/Probes | IDT | N/A | Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1 |
| Proteinase K 20 mg/mL solution | Ambion | AM2546 | |
| PX1 PCR plate sealer | Bio Rad | 1814000 | Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6) |
| QX Manager software | Bio Rad | 12012172 | Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7) |
| QX200 AutoDG droplet generator | Bio Rad | 1864101 | Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4) |
| QX200 droplet reader | Bio Rad | 1864003 | Droplet reader (used in Protocol Step 6) |
| Trizma pre-set crystals pH 8.3 | Sigma | T8943-100G |
References
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