Здесь мы представляем протокол измерения абсолютного числа копий митохондриальной (мт)ДНК и уровней гетероплазмы делеции мтДНК в отдельных клетках.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение количества копий одноклеточной митохондриальной ДНК и гетероплазмы с помощью цифровой капельно-полимеразной цепной реакции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Митохондриальная (мт)ДНК млекопитающих представляет собой небольшую, круглую, двухцепочечную, внутримитохондриальную молекулу ДНК, кодирующую 13 субъединиц электронной транспортной цепи. В отличие от диплоидного ядерного генома, большинство клеток содержат гораздо больше копий мтДНК, от менее 100 до более чем 200 000 копий в зависимости от типа клетки. Число копий мтДНК все чаще используется в качестве биомаркера для ряда возрастных дегенеративных состояний и заболеваний, и, таким образом, точное измерение числа копий мтДНК становится ключевым инструментом как в исследовательских, так и в диагностических условиях. Мутации в мтДНК, часто встречающиеся в виде однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) или делеций, могут либо существовать во всех копиях мтДНК в клетке (называемые гомоплазмой), либо в виде смеси мутированных и WT-копий мтДНК (называемых гетероплазмой). Гетероплазматические мутации мтДНК являются основной причиной клинической митохондриальной патологии, либо при редких заболеваниях, либо при растущем числе распространенных заболеваний с поздним началом, таких как болезнь Паркинсона. Определение уровня гетероплазмы, присутствующей в клетках, является критическим шагом в диагностике редких митохондриальных заболеваний и в исследованиях, направленных на понимание распространенных поздних расстройств, где митохондрии могут играть определенную роль. Число копий мтДНК и гетероплазма традиционно измерялись с помощью количественных (q)ПЦР-анализов или глубокого секвенирования. Однако недавнее внедрение технологии ddPCR обеспечило альтернативный метод измерения обоих параметров. Он предлагает несколько преимуществ по сравнению с существующими методами, включая возможность измерения абсолютного числа копий мтДНК и достаточную чувствительность для проведения точных измерений из отдельных ячеек даже при низких числах копий. Здесь представлен подробный протокол, описывающий измерение числа копий мтДНК в отдельных клетках с использованием ddPCR, впредь называемой ПЦР капельной генерации, с возможностью одновременного измерения гетероплазмы в клетках с делециями мтДНК. Также обсуждается возможность расширения этого метода для измерения гетероплазмы в клетках с мтДНК SNP.
Введение
Митохондриальная (мт)ДНК млекопитающих представляет собой небольшой (около 16,5 Кб) круговой геном ДНК, находящийся в митохондриальной матрице, которая кодирует 37 генов, включающих две рРНК, 22 тРНК и 13 генов, кодирующих белки1. В отличие от ядерного генома, который содержит одну (гаплоидную) или две (диплоидные) копии каждого гена на клетку, мтДНК присутствует в нескольких копиях в митохондриях каждой клетки, начиная от десятков копий (например, зрелых сперматоцитов) до сотен тысяч копий (например, ооцитов)2,3. Следствием этой многокопийной природы является то, что мутации в геноме м....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты соответствовали рекомендациям ARRIVE и были одобрены Этическим обзорным органом благосостояния животных Кембриджского университета (AWERB).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы пробоподготовки до образования капель должны выполняться в чистой рабочей зоне перед ПЦР, в идеале в УФ-стерилизованном шкафу, где это возможно. Протокол, описанный здесь, использует специальное оборудование для ПЦР для генерации капель (см. Таблицу материалов), и, хотя общий метод должен быть применим к другим системам, рекомендуется ознакомиться с руководящими принципами производителя относительно концентраций праймеров/зондов, условий циклирован....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
После генерации капель виден прозрачный слой непрозрачных капель, плавающих поверх нефтяной фазы в каждой скважине (рисунок 1B). На образование капель может негативно повлиять наличие моющих средств во входном лизате при проведении экспериментов на одиночных клетках. Используя протокол лизиса, описанный в 2.1.2., выход капель выше рекомендуемого уровня 10 000 обычно достигается, несмотря на наличие небольшого остаточного количества TWEEN-20 в конечном образце (рисунок 1C.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, описанный здесь, применим к широкому кругу типов клеток и видов в дополнение к тем, которые обсуждались выше, хотя тщательная оптимизация новых конструкций анализов будет иметь ключевое значение для обеспечения точности и повторяемости метода при отходе от ранее проверенных комбинаций праймера / зонда. При работе с одиночными клетками жизненно важно обеспечить, чтобы сбор образцов выполнялся как можно точнее (например, с использованием строгих одноклеточных параметров при сортировке клеток с помощью FACS), чтоб.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Отсутствие конфликта интересов для раскрытия.
Благодарности
Благодарим доктора Л. Божилову за советы по статистическому анализу данных ПЦР капельной генерации. Спасибо доктору Х. Чжану за предоставление ооцитов, используемых для генерации данных на рисунках 3C и 4B. Эта работа была выполнена SPB в Отделе митохондриальной биологии Совета по медицинским исследованиям (MC_UU_00015/9 Кембриджского университета и финансировалась Главной исследовательской стипендией Wellcome Trust, проводимой PFC (212219/ Z / 18 / Z).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 50% раствор Tween-20 | Novex | 3005 | |
| Автоматизированная каплегенераторная нефть | Bio Rad | 1864110 | Коммерческая масляная форма, используемая для получения эмульсии масла/капли (используется в протоколе Step 4.1) |
| C1000 ПЦР-машина с глубоколуночным блоком | Rad | 1851197 | ПЦР-амплификатор, оснащенная блоком нагрева глубоких скважин, используется для лизиса клеток (протокол Step 2.1.2.) и циклирования ПЦР (протокол Step 5) |
| Блок охлаждения сборной пластины | Bio Rad | 12002819 | Охлаждающий блок, который охлаждает образцы во время генерации капель (используется на этапе протокола 4.3) |
| ddPCR 96-луночные планшеты | Bio Rad | 12001925 | 96-луночные планшеты наконечники для дозаторов, предназначенные для использования в генераторе капель QX200 AutoDG, используемые для подготовки образцов (протокол шаг 3.4) и сбора капель (протокол шаг 4.3) |
| ddPCR считыватель капель масло | Bio Rad | 1863004 | Коммерческая масляная формула, используемая считывателем капель (используется на этапе протокола 6.1) |
| ddPCR Supermix для зондов (без dUTP) | Bio Rad | 1863023 | Коммерческая суперсмесь для использования в экспериментах ddPCR с использованием зондов (используется в протокольном шаге 3.3) |
| DG32 автоматический генератор капель картриджи | Bio Rad | 1864108 | Микрофлюидные картриджи, используемые в каплевидном генераторе QX200 AutoDG для генерации эмульсии масла/капли (используются в протоколе Step 4.3) |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 10270-106 | Квалифицированная фетальная бычья |
| сыворотка Фольгированные крышки для пластин | Bio Rad | 1814040 | Фольгированные крышки для пластин, используемые для герметизации пластин для сбора капель после генерации капель (используется на этапе протокола 4.6) |
| HEK 293T-клетки | Takara | 632180 | Коммерческий субклон трансформированной линии эмбриональных клеток почек человека, HEK 293, экспрессирующий SV40 Large-T |
| антиген HeLa клетки | ECACC | 93021013 | клетки эпителоидной карциномы шейки матки человека |
| с высоким содержанием глюкозы DMEM | Gibco | 13345364 | 4,5 г/л D-глюкозы, с L-глутамином и пируватом натрия |
| Цибриды Университет | Майами | ||
| Эмбриональные фибробласты мышей | Университет Ньюкасла | Увековечен из мышей C57Bl/6 | |
| Одноразовый контейнер для сбора, используемый для сбора выброшенных наконечников в генераторе капель QX200 AutoDG (используется на этапе протокола 4.3) | |||
| Наконечники для дозаторов для системы AutoDG | Bio Rad | 1864120 | Отфильтрованные наконечники для пипеток, предназначенные для использования в генераторе капель QX200 AutoDG (используется на этапе протокола 4.3) |
| Первичные клетки дермальных фибробластов человека | Newcastle Biobank | ||
| IDT | N/A | Точные последовательности праймеров/зондов будут зависеть от анализа. Праймеры и зонды, использованные в этом исследовании, приведены в Таблице 1 | |
| Раствор протеиназы K 20 мг/мл | Ambion | AM2546 | |
| PX1 PCR plate sealer | Bio Rad | 1814000 | Наносит пломбы из фольги на планшеты ddPCR для образцов после генерации капель (используется в Протоколе Шаг 4.6) |
| Программное обеспечение QX Manager Программное обеспечение | для | настройки и анализа 12012172 Droplet Reader (используется в Протоколе Шаги 6 и 7) | |
| Генератор капель QX200 AutoDG | Bio Rad | 1864101 | Автоматизированный микрофлюидный генератор капель (используется в протоколе Step 4) |
| Считыватель капель QX200 | Bio Rad | 1864003 | Считыватель капель (используется в протоколе Step 6) |
| Предустановленные кристаллы Trizma pH 8,3 | Sigma | T8943-100G |
Ссылки
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Wai, T., et al. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
