Summary
Здесь мы представляем протокол измерения абсолютного числа копий митохондриальной (мт)ДНК и уровней гетероплазмы делеции мтДНК в отдельных клетках.
Abstract
Митохондриальная (мт)ДНК млекопитающих представляет собой небольшую, круглую, двухцепочечную, внутримитохондриальную молекулу ДНК, кодирующую 13 субъединиц электронной транспортной цепи. В отличие от диплоидного ядерного генома, большинство клеток содержат гораздо больше копий мтДНК, от менее 100 до более чем 200 000 копий в зависимости от типа клетки. Число копий мтДНК все чаще используется в качестве биомаркера для ряда возрастных дегенеративных состояний и заболеваний, и, таким образом, точное измерение числа копий мтДНК становится ключевым инструментом как в исследовательских, так и в диагностических условиях. Мутации в мтДНК, часто встречающиеся в виде однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) или делеций, могут либо существовать во всех копиях мтДНК в клетке (называемые гомоплазмой), либо в виде смеси мутированных и WT-копий мтДНК (называемых гетероплазмой). Гетероплазматические мутации мтДНК являются основной причиной клинической митохондриальной патологии, либо при редких заболеваниях, либо при растущем числе распространенных заболеваний с поздним началом, таких как болезнь Паркинсона. Определение уровня гетероплазмы, присутствующей в клетках, является критическим шагом в диагностике редких митохондриальных заболеваний и в исследованиях, направленных на понимание распространенных поздних расстройств, где митохондрии могут играть определенную роль. Число копий мтДНК и гетероплазма традиционно измерялись с помощью количественных (q)ПЦР-анализов или глубокого секвенирования. Однако недавнее внедрение технологии ddPCR обеспечило альтернативный метод измерения обоих параметров. Он предлагает несколько преимуществ по сравнению с существующими методами, включая возможность измерения абсолютного числа копий мтДНК и достаточную чувствительность для проведения точных измерений из отдельных ячеек даже при низких числах копий. Здесь представлен подробный протокол, описывающий измерение числа копий мтДНК в отдельных клетках с использованием ddPCR, впредь называемой ПЦР капельной генерации, с возможностью одновременного измерения гетероплазмы в клетках с делециями мтДНК. Также обсуждается возможность расширения этого метода для измерения гетероплазмы в клетках с мтДНК SNP.
Introduction
Митохондриальная (мт)ДНК млекопитающих представляет собой небольшой (около 16,5 Кб) круговой геном ДНК, находящийся в митохондриальной матрице, которая кодирует 37 генов, включающих две рРНК, 22 тРНК и 13 генов, кодирующих белки1. В отличие от ядерного генома, который содержит одну (гаплоидную) или две (диплоидные) копии каждого гена на клетку, мтДНК присутствует в нескольких копиях в митохондриях каждой клетки, начиная от десятков копий (например, зрелых сперматоцитов) до сотен тысяч копий (например, ооцитов)2,3. Следствием этой многокопийной природы является то, что мутации в геноме мтДНК, которые могут существовать в виде однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), делеций или дупликации, могут присутствовать на различных уровнях в любой данной клетке, составляя от 0% до 100% от общей популяции мтДНК клетки. Существование геномов мтДНК дикого типа и мутантных в одной и той же клетке называется гетероплазмой, а патогенные гетероплазматические мутации мтДНК являются основной причиной митохондриальных заболеваний, с несколькими распространенными неврологическими синдромами, связанными с основными гетероплазматическими мутациями мтДНК4.
Двумя ключевыми параметрами, которые способствуют вероятности гетероплазматической мутации мтДНК, вызывающей клиническое заболевание, являются уровень гетероплазмы и число копий мтДНК. Многие гетероплазматические мутации проявляют пороговый эффект, при этом биохимические и клинические фенотипы становятся очевидными только выше определенного уровня гетероплазмы, обычно около 80%5, и впоследствии ухудшаются по мере увеличения гетероплазмы еще4. Однако также важно учитывать количество копий мтДНК, присутствующих в клетке, поскольку это будет влиять на количество геномов мтДНК дикого типа (то есть «здоровых»), которые присутствуют на данном уровне гетероплазмы. Исследования у пациентов с митохондриальными заболеваниями подчеркнули важность этого взаимодействия между гетероплазмой и номером копии 5,6, а Filograna et al. недавно сообщили об увеличении числа копий мтДНК, облегчающих симптомы, несмотря на неизменную гетероплазму в мышиной модели митохондриального заболевания7.
Хотя в последние годы многое было сделано для улучшения понимания патогенеза и передачи заболеваний, вызванных гетероплазмой мтДНК, большая часть этой работы была проведена на уровне тканей, а не клеток, сравнивая средние уровни гетероплазмы тканей и измерения числа копий, полученные из объемных биопсий тканей и образцов крови. Некоторые хорошо зарекомендовавшие себя методы, такие, как микродиссекция лазерного захвата, позволяют проводить такие измерения на клеточном уровне 8,9; однако недавний взрыв высокопроизводительных одноклеточных методов анализа, или так называемой «одноклеточной омики»10, создал потребность в методах, которые могут точно измерять эти важнейшие параметры мтДНК на уровне одной клетки.
Метод ПЦР капельной генерации использует преимущества последних достижений в области микрофлюидной технологии для улучшения существующих методов количественного определения неизвестных концентраций ДНК с помощью ПЦР-амплификации конкретных целевых ампликонов в образце ДНК11. В отличие от qPCR, где образец ДНК амплифицируется в одной реакции, при этом относительная скорость накопления продукта ПЦР выступает в качестве считывания, этот метод разделяет исходный образец на тысячи отдельных капель, тем самым разделяя молекулы ДНК образца на пространственно разделенные реакции12. Последующая реакция ПЦР протекает в каждой отдельной капле, при этом продукт ПЦР накапливается только в каплях, которые содержат целевую ДНК. Результатом этой реакции является цифровой выход в виде пула капель, которые либо содержат копию целевой ДНК и амплифицированный продукт ПЦР, либо не содержат целевой ДНК. Используя флуоресцентные ДНК-зонды или двухцепочечный (ds)ДНК-связывающий краситель, капли, содержащие амплифицированный продукт, могут быть подсчитаны, а соотношение «положительных» и «отрицательных» капель может быть использовано для расчета абсолютного числа копий ДНК, которые присутствовали в исходном образце. Это абсолютное измерение, в отличие от относительного измерения, полученного в результате реакции qPCR, является ключевым фактором, который позволяет использовать эту методологию для точного измерения числа копий мтДНК и гетероплазмы в отдельных клетках11, и в нескольких недавних исследованиях уже использовалась технология ПЦР капельной генерации для этой цели13,14 . В этой статье представлен метод измерения числа копий мтДНК и гетероплазмы делеции в отдельных клетках как из ткани человека, так и из мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты соответствовали рекомендациям ARRIVE и были одобрены Этическим обзорным органом благосостояния животных Кембриджского университета (AWERB).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы пробоподготовки до образования капель должны выполняться в чистой рабочей зоне перед ПЦР, в идеале в УФ-стерилизованном шкафу, где это возможно. Протокол, описанный здесь, использует специальное оборудование для ПЦР для генерации капель (см. Таблицу материалов), и, хотя общий метод должен быть применим к другим системам, рекомендуется ознакомиться с руководящими принципами производителя относительно концентраций праймеров/зондов, условий циклирования ПЦР и т. Д., Поскольку они могут отличаться от описанных здесь. Клеточные линии / первичные клетки, используемые в этом исследовании, были следующими: клетки HeLa человека (коммерчески полученные), человеческие клетки HEK 293T (коммерчески полученные), первичные клетки дермальных фибробластов человека (полученные из биобанка Ньюкасла), человеческие цибриды (WT & ΔH2.1 делеция15, полученная из C. Moraes, Университет Майами), эмбриональные фибробласты мышей (увековеченные, от мышей C57Bl/6, полученные от J. Stewart, Университет Ньюкасла), первичные половые клетки мышей (полученные из эмбрионов мышей C57Bl/6) и мышиные ооциты MII (полученные от взрослых самок мышей C57Bl/6). Все культивируемые клетки поддерживали в ВЫСОКОМ уровне глюкозы (4,5 г / л) DMEM, дополненном 10% фетальной бычьей сывороткой при 37 ° C с 5% CO2. Первичные мышиные клетки, используемые в этом исследовании, были выделены из животных, содержащихся в соответствии с Законом о животных (научные процедуры) 1986 года в соответствии с лицензией проекта Министерства внутренних дел P6C97520A.
1. Разработка и синтез праймеров и зондовых наборов, нацеленных на интересующие последовательности ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: ПЦР капельной генерации также может быть выполнена с использованием красителя, связывающего dsDNA, вместо ампликонов-специфических зондов.
- Проектируйте последовательность грунтовки и зонда в соответствии с рекомендациями, данными производителем системы. В таблице 1 приведены проверенные последовательности праймеров и зондов, пригодные для измерения гетероплазмы 18 копий/делеций мтДНК с одной клеткой мтДНК как в клетках человека 16,17, так и в клетках мыши18. При выборе альтернативных целевых последовательностей учитывайте следующие моменты.
- Мультиплексируйте два набора праймеров/зондов в одном ПЦР-анализе, но убедитесь, что в двух анализах используется один зонд с маркировкой FAM и один зонд с маркировкой HEX, чтобы целевые ампликоны могли быть дифференцированы считывателем капель. Этот протокол представляет собой дуплексный зондовый анализ. При тщательном экспериментальном проектировании мультиплексирование может быть увеличено до четырех целей, а альтернативные платформы могут достигать мультиплексирования более высоких размеров.
- При мультиплексировании наборов праймеров/зондов, нацеленных на отдельные последовательности мтДНК, убедитесь, что ампликоны, генерируемые двумя наборами праймеров, не перекрываются.
- При измерении гетероплазмы в образцах, несущих делеции мтДНК, убедитесь, что один целевой ампликон попадает в ожидаемую удаленную область, а другой - за пределы ожидаемой удаленной области.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные условия циклирования ПЦР для альтернативных анализов могут отличаться от условий, указанных на этапе 5.1; Более подробную информацию об оптимизации анализов см. в разделе Обсуждение.
2. Выделение ДНК из отдельных клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод также может быть использован для небольших объемных образцов до 100 клеток.
- Собирайте одиночные ячейки с помощью соответствующего метода, такого как флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS)19 или микродиссекция20 лазерного захвата, в как можно меньшем объеме в подходящую емкость (например, пластину с 96 лунками). Использование красителя жизнеспособности клеток до или во время изоляции одной клетки минимизирует вероятность выделения мертвых клеток. При необходимости отсортируйте отдельные ячейки непосредственно в буфер лизиса и храните при -80 °C (до 6 месяцев) до анализа.
- Лизируйте клетки в небольшом объеме (<10 мкл) подходящего буфера лизиса (буфер, используемый в данном исследовании, описан на этапе 2.2.1.).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все данные, полученные от клеток в этом исследовании, взяты из одноклеточных лизатов или пулов по 20 клеток (размеры выборки указаны на рисунке условных обозначений). На эффективное формирование масляной/капельной эмульсии на стадии генерации капель протокола ПЦР генерации капель может существенно влиять присутствие моющих средств в образце; поэтому рекомендуется проверить совместимость всех буферов клеточного лизиса с генерацией капель при предполагаемой входной концентрации, прежде чем приступать к экспериментальным образцам и использовать наименьший практический объем буфера лизиса. Следующий протокол лизиса приводит к минимальному влиянию на эффективность генерации капель.- Подготовьте буфер лизиса, содержащий 50 мМ Tris-HCl pH 8,3, 1% TWEEN-20 и 200 мкг/мл протеиназы K.
- Добавьте 2,5 мкл лизизного буфера к каждому образцу, запечатайте пластину клейкой пластиной, а затем центрифугируйте образцы при 1000 х г в течение 1 мин при 4 °C.
- Инкубируйте образцы при 37 °C в течение 30 мин на термоциклере с нагретой крышкой, установленной при 105 °C, чтобы предотвратить конденсацию жидкости на крышке пластины.
- Добавьте 7,5 мкл воды без нуклеазы к каждому образцу, чтобы получить окончательный объем образца 10 мкл, повторно запечатайте пластину, а затем центрифугируйте образцы при 1000 х г в течение 1 мин при 4 °C.
- Инкубировать на термоциклере при 80 °C в течение 15 мин (нагретая крышка установлена на 105 °C) для инактивации протеиназы K.
- Центрифугируйте образцы при 1000 х г в течение 1 мин при 4 °C, а затем держите на льду.
- Перейдите к шагу 3 ниже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные лизаты можно хранить при -20 °C до продолжения этапа 3; однако используйте свежеэлюрованную ДНК, где это возможно, чтобы устранить риск циклов замораживания-оттаивания, приводящих к деградации ДНК.
3. Подготовка образцов
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что технические реплики образцов и нешаблонные элементы управления (NTC) включены на каждую пробирную пластину для обеспечения точности результатов. Динамический диапазон ПЦР-анализа капельной генерации составляет до 120 000 копий целевого ампликона на реакцию. Для одноклеточных или небольших объемно-клеточных лизатов образца разбавление вряд ли потребуется, и смесь лизата может быть введена непосредственно в реакцию для измерения числа копий мтДНК (например, образец лизата объемом 10 мкл может быть разделен и запущен в трипликате с входом 3 мкл непосредственно в каждый анализ). Однако использование неразбавленного лизата из клеток с очень высоким количеством мтДНК (например, ооцитов) или содержащих большее количество клеток (например, 50-100) может превышать этот динамический диапазон. В таких случаях требуется первоначальное последовательное разбавление для определения соответствующего коэффициента разбавления, который позволяет избежать насыщения анализа для этого конкретного типа ячейки /номера ячейки (см. Репрезентативные результаты для получения дополнительной информации).
- Разморозьте все реагенты на льду, вихрь и ненадолго открутите перед использованием.
- Приготовьте мастер-микс (за вычетом образца ДНК) на льду, как описано в (таблица 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если измеряется только один целевой ампликон, добавьте дополнительно 2,55 мкл воды без нуклеазы на образец для достижения конечного объема 22 мкл. Подготовьте достаточную мастер-смесь для количества образцов и НТК, подлежащих анализу, плюс достаточно, чтобы учесть любые «пустые» скважины, необходимые на ПЦР-пластине поколения капель (см. следующий шаг). - Вихрь приготовленной мастер-смеси кратковременно перемешать и аликвотировать необходимый объем (22 мкл минус входной объем ДНК) в каждую лунку капли поколения ПЦР 96-луночной пластины. Расположите образцы в полных колоннах на 96-луночной плите; заполните любые пустые скважины в неполные колонны мастер-миксом и используйте их в качестве НТК.
- Добавьте входную ДНК в каждую пробную скважину и буфер воды/элюирования без нуклеаз в скважины NTC, чтобы довести общий объем каждой из них до 22 мкл.
- Запечатайте пластину клейким уплотнением пластины и поместите на шейкер при 2000 об/мин в течение 1 мин, а затем центрифугу при 1000 х г в течение одной минуты при 4 °C.
- Положите тарелку на лед и перейдите к шагу 4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовленные пластины можно хранить на льду и защищать от света в течение коротких периодов времени (например, 1-2 ч), прежде чем приступать к образованию капель.
4. Генерация капель
ПРИМЕЧАНИЕ: Схему приборной деки генератора капель, упомянутой в этом разделе, приведена на рисунке 1А .
- Питание от капельного генератора.
- Убедитесь, что бутылка каплеобразующего масла загружена в положение E на палубе прибора. При появлении запроса следуйте инструкциям на экране, чтобы заменить бутылку.
- Щелкните Настроить образец пластины на сенсорном экране. Выберите все столбцы на пластине образца, содержащие образцы/заготовки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ввод названия пластины и деталей эксперимента на этом этапе является необязательным и не требуется для продолжения настройки эксперимента. - Нажмите кнопку ОК , чтобы подтвердить конфигурацию пластины; на палубе приборов загораются оранжевые огни, указывающие места, где необходимо загрузить расходные материалы.
- Загрузите картриджи генератора капель в положение B на приборной палубе так, чтобы все огни загорелись зеленым.
- Поместите пустой желоб для отходов наконечника в положение C на палубе приборов.
- Снимите крышки с фильтрующих наконечников и загрузите их в положение D на сцене прибора, чтобы все индикаторы стали зелеными.
- Снимите уплотнение клейкой пластины с пластины образца и загрузите его в положение F на палубе прибора, чтобы индикатор стал зеленым.
- Поместите пустую пластину для сбора капель из 96 лунок в холодный блок (предварительно охлажденный при -20 °C) и загрузите в положение G приборной палубы так, чтобы свет стал зеленым.
- Нажмите кнопку Начать генерацию дроплетов на сенсорном экране прибора.
- Нажмите кнопку Начать запуск на сенсорном экране прибора. Крышка прибора закроется автоматически. После инициализации время, оставшееся до завершения генерации капель, будет отображаться на сенсорном экране прибора.
- После завершения генерации капель визуально проверьте пластину сбора проб, чтобы подтвердить, что слой капельной эмульсии присутствует над масляной фазой в каждой скважине (рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если слой капельной эмульсии не виден, не приступайте к эксперименту и не проверяйте наличие ошибок, которые могли возникнуть во время предыдущих шагов протокола. - Очистите использованные расходные материалы от инструментальной палубы и опорожните желоб для отходов наконечников.
- Включите герметик пластины, установите температуру на 180 °C и время уплотнения на 5 с, и позвольте машине достичь рабочей температуры.
- Поместите пластину для сбора проб в держатель пластины герметика и поместите свежее фольгированное уплотнение поверх пластины с красной линией, обращенной вверх. Следите за тем, чтобы не касаться нижней стороны уплотнения из фольги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держатель пластины следует хранить при комнатной температуре (RT) и помещать в ящик уплотнителя пластин только при нанесении фольгированного уплотнения для предотвращения теплопередачи на пластину для сбора проб. - Когда уплотнитель пластины достигнет рабочей температуры, нажмите Eject на сенсорном экране прибора; ящик откроется автоматически.
- Поместите держатель пластины в ящик уплотнителя пластины и нажмите Seal. Ящик автоматически закроется, а затем снова откроется после завершения запечатывания.
- Замените герметичную пластину на холодном блоке, выключите герметик пластины и немедленно перейдите к шагу 5.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе капли нестабильны, поэтому убедитесь, что этап ПЦР начинается в течение 1 ч после окончания генерации капель.
5. ПЦР
- Поместите герметичную пластину для сбора капель на циклический аппарат ПЦР, оснащенный блоком скважины глубиной 96, и запустите протокол термоциклирования, описанный в таблице 3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установите температуру нагретой крышки на уровне 105 °C и объем образца на 40 мкл. Этапы денатурации и отжига/удлинения должны включать температурную скорость 2 °C/с, чтобы гарантировать, что масло успевает уравновешиваться до правильной температуры. - Перейдите к шагу 6.
ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения протокола термоциклирования капли становятся более стабильными, и пластину можно хранить до 4 дней при 4 °C, прежде чем приступить к следующему шагу.
6. Считывание капель
- Включите устройство считывания капель и подключенный компьютер.
- Проверьте уровень жидкости в бутылках для сливочного масла и капельного считывателя и заполните/опорожните их, соответственно, если это необходимо.
- Загрузите пластину, содержащую образцы после ПЦР, в держатель капельного считывателя, поместите крышку поверх держателя и закрепите ее на месте черными зажимами. Не снимайте крышку из фольги с пластины для образца.
- Нажмите кнопку «Открыть/Закрыть» на крышке устройства считывания капель, чтобы открыть его.
- Загрузите держатель пластины капельного считывателя, содержащий пластину образца, в камеру считывания и надежно расположите его на магнитном основании.
- Нажмите кнопку Открыть/Закрыть на крышке устройства считывания капель, чтобы закрыть его.
- Откройте интерфейс аналитического программного обеспечения, выберите вкладку Добавить пластину и подготовьте новый образец пластины следующим образом:
- Нажмите кнопку Добавить пластину , а затем Настроить пластину.
- На вкладке Информация о пластине введите Имя пластины, выберите Супермикс для зондов (без dUTP) в раскрывающемся меню Супермикс и введите имя файла в разделе Сохранить файл данных как.
- На вкладке Выбор скважин выделите анализируемые скважины и нажмите Включить выбранные скважины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 6.7.4 – 6.7.7 являются факультативными. - На вкладке Информация о скважине выберите скважины для аннотирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пример интерфейса вкладки «Информация о скважине» приведен на рисунке 1D. - Выберите «Прямая количественная оценка» (DQ) в раскрывающемся меню «Тип эксперимента », заполните поля «Описание образца», «Тип образца» и «Имя цели» и при необходимости добавьте «Заметки о скважине» и/или «Заметки на пластине ».
- Нажмите кнопку Применить. Информация на месторождениях будет применена к выбранным скважинам.
- Повторяйте шаги 6.7.4–6.7.6 до тех пор, пока все пробные колодцы не будут аннотированы.
- После завершения настройки пластины нажмите кнопку Начать запуск.
- Когда запуск будет завершен, выбросьте пустую пластину для образца и при необходимости опорожните бутылку для считывателя капель.
- Перейдите к шагу 7.
7. Анализ результатов
ПРИМЕЧАНИЕ: Считыватель капель измеряет интенсивность флуоресценции в канале FAM и HEX для каждой капли в образце. При успешном анализе капли попадают в одну из двух категорий для каждого зонда: отрицательные (это означает, что мишень не присутствовала в капле) или положительные (то есть мишень присутствовала в капле). Перед анализом образцов убедитесь, что каждая скважина содержит >10 000 капель и имеет две четко разделенные популяции капель с низкой флуоресценцией (отрицательной) и высокой флуоресценцией (положительной) в каждом канале (рисунок 2А).
- Выберите вкладку Анализ данных и откройте файл для анализа в меню Мои файлы данных .
- Перейдите на вкладку «Амплитуда 1D» для одноцветных экспериментов или вкладку «Амплитуда 2D » для двухцветных экспериментов.
- Примените порог флуоресценции к каждому каналу, чтобы дифференцировать положительные и отрицательные капли. Аналитическое программное обеспечение попытается применить автоматическое пороговое значение на основе выборки за выборкой и канала за каналом, но если это окажется неудачным или выглядит неточным, то вручную примените пороговое значение следующим образом:
- Выберите скважины, требующие пороговых значений.
- Вручную примените пороговое значение в свободном пространстве между положительной и отрицательной популяциями на амплитудном графике с помощью инструмента «Режим пороговой линии ». При установке ручных пороговых значений в 2D-представлении убедитесь, что перекрестие расположено так, чтобы четыре популяции капель (двойная отрицательная, одинарная положительная FAM, одинарная положительная HEX и двойная положительная) были четко разделены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пороговое значение может быть выполнено либо хорошо, либо применено к нескольким скважинам одновременно.
- После того, как ко всем образцам будет применено пороговое значение, экспортируйте результаты в виде файла .csv для дальнейшего анализа, щелкнув вкладку Таблица данных , щелкнув Импорт/Экспорт и выбрав Экспорт видимых данных в CSV. Введите подходящее имя файла и нажмите кнопку Сохранить.
- Рассчитайте номер копии мтДНК в исходном образце следующим образом:
Число копий = целевая концентрация мтДНК × 22 × 1/доля от общего поступления лизата
ПРИМЕЧАНИЕ: Если используются два митохондриальных зонда, то концентрация двух мишеней усредняется перед проведением расчета. Для образцов, содержащих более одной ячейки, число копий на ячейку вычисляется путем деления на количество ячеек в образце. Важно использовать значение «Концентрация» (т.е. количество копий на микролитр), умноженное на начальный объем образца в 22 мкл, а не значение «Количество копий на 20 мкл», рассчитанное в файле .csv, поскольку копии мтДНК, оставленные при превышении 2 мкл, требуемом генератором капель, должны учитываться при расчете абсолютного числа копий исходного образца. - Для клеток, несущих гетероплазматические делеции мтДНК, рассчитайте число копий, используя результаты мишени мтДНК за пределами удаленной области (т.е. мишень, присутствующую как в удаленных, так и в WT молекулах мтДНК). Гетероплазма делеции рассчитывается с использованием концентраций мишени внутри удаленной области и цели вне удаленной области следующим образом:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После генерации капель виден прозрачный слой непрозрачных капель, плавающих поверх нефтяной фазы в каждой скважине (рисунок 1B). На образование капель может негативно повлиять наличие моющих средств во входном лизате при проведении экспериментов на одиночных клетках. Используя протокол лизиса, описанный в 2.1.2., выход капель выше рекомендуемого уровня 10 000 обычно достигается, несмотря на наличие небольшого остаточного количества TWEEN-20 в конечном образце (рисунок 1C). Однако с другими буферами лизиса, такими как буфер RLT Plus, наблюдается резкое сокращение количества образующихся капель (рисунок 1C), что, вероятно, отрицательно скажется на точности измерения числа копий.
После ПЦР и считывания капель четко разделенные популяции положительных и отрицательных капель будут видны в каждом из каналов, используемых для каждой пробной скважины (рисунок 2A), причем скважины NTC содержат только отрицательные капли. Потенциальные проблемы, которые могут возникнуть при анализе результатов, включают:
Отсутствие четкого разделения между положительными и отрицательными популяциями и наличие капель в разрыве между двумя популяциями, называемые «дождем» (рисунок 2B). Это может произойти, если используется неоптимальная температура отжига/растяжения, особенно в анализах, где разница в флуоресценции между положительными и отрицательными каплями относительно невелика. Запуск градиента температур отжига/расширения может помочь определить оптимальную температуру для использования. В качестве альтернативы, может потребоваться перепроектирование грунтовок/зондов для повышения производительности анализа.
«Двойная полоса» капель в отрицательной популяции при использовании представления «Амплитуда 1D». В некоторых случаях в канале HEX можно увидеть двойную полосу отрицательных капель (рисунок 2Bii); это является результатом различных уровней фоновой флуоресценции между двойными отрицательными и одноотрицательными (т.е. FAM-положительными, HEX-отрицательными) популяциями капель, как показано на рисунке 2Biii), где показана одноположительная популяция FAM (верхний левый квадрант) с более низкой средней флуоресценцией в канале HEX, чем двойная отрицательная популяция (нижний левый квадрант). Этот флуоресцентный артефакт не влияет на результаты анализа, и использование «2D-амплитуды» позволяет четко идентифицировать четыре популяции капель.
Отсутствие положительных капель (рисунок 2С). Для валидированных анализов это, скорее всего, связано с ошибкой во время подготовки образца (например, неполный лизис клеток, неправильные праймеры / зонд, добавленные в мастер-микс, неудача одноэлементной сортировки и т. Д.).
Отсутствие отрицательных капель (рисунок 2D). Это происходит, когда анализ насыщается входным сигналом ДНК с высокой мишенью, в результате чего каждая капля содержит одну или несколько целевых последовательностей. Это, скорее всего, будет замечено при измерении образцов с большим количеством копий (например, ооцитов) и может быть решено путем разбавления лизата до этапа 3.5. Последовательное разбавление входной ДНК (рисунок 2D) может быть использовано для определения подходящего коэффициента разбавления при возникновении этой проблемы.
При использовании двух независимых зондов мтДНК целостность образца ДНК может быть оценена путем выбора представления «2D-амплитуда»: неповрежденные молекулы мтДНК несут обе целевые последовательности; поэтому капли, содержащие полные геномы мтДНК, будут положительными в обоих каналах (рисунок 3А). При анализе образцов, несущих делеции мтДНК, смесь двойных положительных капель и капель, положительных только для неудаленной целевой последовательности, будет присутствовать даже в недеградировавших образцах (рисунок 3B). Когда мтДНК деградирует, некоторые целевые последовательности, вероятно, существуют на отдельных фрагментах ДНК, и поэтому капли с большей вероятностью будут положительными только для одного зонда, и меньше капель будет положительным для обоих (рисунок 3C). Эти различия учитываются в ходе анализа данных, поскольку концентрации всегда оцениваются независимо для каждой цели с использованием общей популяции всех положительных капель в этом флуоресцентном канале, а затем либо усредняются для оценки числа копий, либо используются для расчета гетероплазмы (см. шаги 7.3.-7.4.).
Этот метод может быть использован для измерения числа копий в широком спектре типов клеток как из тканей мыши, так и из тканей человека, включая лабораторные клеточные линии, такие как HeLa, HEK 293T и увековеченные эмбриональные фибробласты мыши (MEF) и первичные клетки, такие как дермальные фибробласты человека и первичные половые клетки мыши (PGC) (рисунок 4A). В тестируемых типах соматических клеток виден диапазон числа копий от нескольких сотен (например, дермальные фибробласты) до нескольких тысяч (например, клетки HeLa). Для количественной оценки точности анализа зрелые мышиные ооциты, которые имеют очень высокое число копий (>150 000 копий на клетку)2, были лизированы, и полученный лизат был разделен поровну на 22 отдельные реакции на клетку. После запуска протокола ПЦР генерации капель было замечено очень мало различий в количестве копий, обнаруженных в каждой реакции, причем две репрезентативные клетки (рисунок 4B) дали в общей сложности 229 647 копий (среднее значение 10 439 на лунку, стандартное отклонение 380) и 330 121 копию (среднее значение 15 006 на лунку, стандартное отклонение 340) на яйцеклетку. Коэффициенты вариации (CV) для этих двух клеток составили 3,64% и 2,26% соответственно. Чтобы проверить воспроизводимость на биологических образцах, PCC были собраны из гонад четырех эмбриональных мышей на 13,5-й день после зачатия, и полученное число одноклеточных копий этих клеточных популяций сравнивали с различными эмбрионами (рисунок 4C). Хотя следует ожидать некоторых биологических вариаций, среднее число копий и стандартное отклонение оставались сопоставимыми по четырем испытуемым эмбрионам, и эти результаты соответствовали данным о количестве копий, ранее сообщенным в этом типе клеток на аналогичной стадии эмбрионального развития21.
В дополнение к измерению числа копий, этот метод также может быть использован для измерения уровня гетероплазмы в клетках цибрид, несущих гетероплазматическую делецию мтДНК. Для этого необходимо использовать два зонда мтДНК, один из которых попадает внутрь удаленной области мтДНК, а другой - снаружи (рисунок 5А). После анализа уровень гетероплазмы может быть найден путем сравнения концентрации каждого зонда для расчета доли копий, содержащих обе мишени (т.е. геномы мтДНК WT), и пропорции, содержащей только зонд, который выходит за пределы удаленной области (т.е. удаленных геномов мтДНК), как описано на этапе 7.4. Поскольку целевой объект, расположенный за пределами удаленной области, присутствует во всех копиях мтДНК, это также может быть использовано для расчета общего номера копий ячейки. В клетках с высокой делецией гетероплазмы обнаруживается относительно мало копий зонда внутри удаленной области (рисунок 5Bi), в то время как в клетках с низкой делецией гетероплазмы концентрации двух зондов гораздо более похожи (рисунок 5Bii). Использование зондовых анализов «in-out» для измерения делеционной гетероплазмы путем ПЦР капельной генерации в объемно экстрагированных образцах ДНК показало улучшенную точность по сравнению с методами на основе qPCR, но не имеет чувствительности при работе с очень низкими уровнями гетероплазмы (<5%)22 и, следовательно, не рекомендуется в клетках с очень небольшим бременем делеции. Наборы праймеров/зондов как для мышиной, так и для человеческой мтДНК, описанные в таблице 1, содержат одну мишень в пределах большой дуги мтДНК и одну мишень снаружи и, следовательно, подходят для наиболее распространенных делеций мтДНК23,24.
| Вид | Цель | Букварь/Имя зонда | Последовательность | 5' Зонд | 3' Квенчер | ||
| Человеческий | НД4 | huND4_F Букварь | AGTGCGATGAGTAGGGGAAGG | ||||
| huND4_R Букварь | ACCTTGGCTATCATCACCCGAT | ||||||
| huND4_FAM зонд | CAACCAGCCAGAACGCCTGAACGCA | ФАМ | БХК 2 | ||||
| НД1 | huND1_F Букварь | GGGTTCATAGTAGAAGAGCGATGG | |||||
| huND1_R Букварь | ACGCCATAAAACTCTTCACCAAAG | ||||||
| huND1_HEX зонд | ACCCGCCACATCTACCATCACCCTCC | ЗАЧАРОВЫВАТЬ | БХК 1 | ||||
| Мышь | НД1 | musND1_F Грунтовка | GAGCCTCAAACTCCAAATACTCACT | ||||
| musND1_R Грунтовка | ГААКГАТААААГГАТААТА GCTATGGTTACTTCA |
||||||
| musND1_FAM зонд | CCGTAGCCCAAACAAT | ФАМ | БХК 1 | ||||
| ЦОГ3 | musCOX3_F Букварь | CCTCGTACCAACACATGATCTAGG | |||||
| musCOX3_R Букварь | AGTGGGACTTCTAGAGGGTTAAGTG | ||||||
| musCOX3_HEX зонд | ACCTCCAACAGGAATTTCA | ЗАЧАРОВЫВАТЬ | БХК 1 | ||||
Таблица 1: Проверенные наборы для ПЦР-праймера и зондов для использования в клетках человека и мыши. Наборы праймеров и зондов для ранее проверенных анализов, усиливающих две независимые мишени мтДНК для человеческих16,17 и мышиных клеток18.
| Компонент | Объем на образец | Конечная концентрация |
| 2X ddPCR Супермикс для зондов (без dUTP) | 11 мкл | в 1 раз |
| Целевой показатель 1 Грунтовка F (20 мкМ) | 1 мкл | 900 нМ |
| Мишень 1 Грунтовка R (20 мкМ) | 1 мкл | 900 нМ |
| Мишень 2 Грунтовка F (20 мкМ) | 1 мкл | 900 нМ |
| Мишень 2 Грунтовка R (20 мкМ) | 1 мкл | 900 нМ |
| Датчик Target 1 (FAM, 10 мкМ) | 0.55 мкл | 250 нМ |
| Датчик Target 2 (HEX, 10 мкМ) | 0.55 мкл | 250 нМ |
| Образец ДНК (добавлен на этапе 3.4) | Переменная | Переменная |
| Вода без нуклеаз | Переменная | |
| Общий объем | 22 мкл |
Таблица 2: Рецепт смеси для ПЦР-генерации капель. Реакционная смесь, необходимая для ПЦР-анализа генерации капель с одной лункой. Рекомендуемые последовательности праймера/зонда приведены в таблице 1; рецепт можно масштабировать при запуске нескольких образцов.
| Шаг | Температура (°C) | Время | Нет. Циклов |
| Активация ферментов | 95 | 10 мин | 1 |
| Денатурация | 94 | 30 сек | 40 |
| Отжиг/Расширение | 58 | 1 мин | |
| Дезактивация ферментов | 98 | 10 мин | 1 |
| Держать | 4 | Бесконечный | 1 |
Таблица 3: Протокол термоциклирования ПЦР капельной генерации. Циклический протокол для амплификации целевой ДНК после генерации капель.
Рисунок 1: Генерация капель. (A) Схематическая компоновка колоды приборов генератора капель поколения капель PCR, позиции следующие: A = автоматизированный модуль обработки жидкости, B = картридж генератора капель (x3), C = ковш для отходов наконечника, D = коробка с наконечником фильтра (x2), E = масляный держатель генератора капель, F = пластина для отбора проб, G = сборная пластина (размещенная в охлаждающем блоке). (B) Репрезентативное изображение капельной эмульсии, плавающей поверх масляной фазы сразу после образования капель. с) влияние различных буферов лизиса на количество капель; при 1% TWEEN-20 наблюдается небольшое уменьшение количества капель, в то время как буфер RLT Plus приводит к почти трехкратному сокращению количества капель, что значительно ниже рекомендуемого числа 10 000 (результаты показаны как среднее значение трех технических повторов на состояние со стандартными отклонениями). (D) Снимок экрана вкладки программного обеспечения «Информация о скважине», показывающей полную информацию о образце, примененную к скважине A1 шаблона из 96 скважин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные анализы ПЦР-анализа генерации капель, показывающие ожидаемые результаты и общие проблемы. (A) Результаты зондового анализа двойной мтДНК из трех одноклеточных лизатов HeLa, показывающие четко разделенные положительные и отрицательные популяции капель в (i) канале FAM, (ii) канале HEX и (iii) комбинированном 2D-амплитудном представлении. (B) Результаты анализа четырех объемных образцов HeLa 20-клеток, показывающих «дождь» между положительными и отрицательными популяциями в (i) канале FAM, (ii) плохое разделение между положительными и отрицательными каплями в канале HEX и (iii) двойной капельный диапазон в отрицательных каплях HEX-канала (ii) из-за различных уровней фоновой флуоресценции в HEX-отрицательных популяциях; как видно в 2D амплитудном представлении. (C) Пример одноклеточного лизата WT-цибрида без положительных капель (i) в любом флуоресцентном канале с успешным анализом WT-цибрид из того же эксперимента (ii) для сравнения. (D) Репрезентативные результаты 10-кратного серийного разбавления ПЦР-ампликона мишени ND1 человека с известной концентрацией, показывающей насыщение ПЦР-генерации капель выше верхнего предела анализа в 120 000 копий. РФС = единицы относительной флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Оценка целостности мтДНК с использованием представления «амплитуда 2D». (A) Репрезентативная ПЦР генерации капель получена из одноклеточного лизата WT-цибрида, содержащего в основном интактные геномы мтДНК, о чем свидетельствует наличие в основном двойных положительных капель FAM и HEX. (B) ПЦР капельной генерации является результатом гетероплазматической делеционной цибридной одноклеточной лизата, показывающей смесь HEX-одноположительных капель (содержащих удаленные молекулы мтДНК, несущие только мишень HEX) и двойных положительных капель FAM и HEX (содержащих полные молекулы мтДНК, несущие обе мишени), с очень небольшим количеством одноположительных капель FAM, что указывает на отсутствие значительной деградации мтДНК. (C) ПЦР капельной генерации является результатом одноклеточного лизата ооцита мыши, содержащего смесь одноположительных FAM, HEX одноположительных и FAM и HEX двойных положительных капель, что указывает на то, что в этом образце, вероятно, произошла некоторая деградация мтДНК. РФС = единицы относительной флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Измерения числа одноклеточных копий показывают различия между типами клеток, но показывают надежную внутри- и межэкспериментальную повторяемость. (A) Репрезентативные измерения числа одноклеточных копий из диапазона клеточных линий как из тканей человека (квадраты), так и из тканей мыши (треугольники) (n = 12 клеток на ткань). (B) серийное измерение номера копии в лизате из двух отдельных мышиных ооцитов; общий объем лизата был разделен на 22 отдельные реакции ПЦР-генерации капель; каждая точка на участках коробки и усов представляет собой номер копии, измеренный в одном колодце. Среднее, стандартное отклонение (SD) и коэффициент вариации (CV) сообщаются для каждого ооцита. (C) Число одноклеточных копий первичных половых клеток мыши, собранных из четырех отдельных эмбрионов через 13,5 дней после оплодотворения (n = 94 одиночные клетки на эмбрион). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Измерение одноклеточной гетероплазмы в линии делеции цибрид. (A) Схема, показывающая область мтДНК, удаленную в цибридной линии, используемой для этого исследования, и расположение зондов ND1 и ND4 мтДНК. (B) Репрезентативные результаты из (i) одноклеточного лизата с высокой гетероплазмой и (ii) одноклеточного лизата с низкой гетероплазмой, показывающие различные соотношения зонда ND4:ND1 и результирующие измерения числа копий и гетероплазмы. РФС = единицы относительной флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, применим к широкому кругу типов клеток и видов в дополнение к тем, которые обсуждались выше, хотя тщательная оптимизация новых конструкций анализов будет иметь ключевое значение для обеспечения точности и повторяемости метода при отходе от ранее проверенных комбинаций праймера / зонда. При работе с одиночными клетками жизненно важно обеспечить, чтобы сбор образцов выполнялся как можно точнее (например, с использованием строгих одноклеточных параметров при сортировке клеток с помощью FACS), чтобы гарантировать, что полученные результаты действительно отражают результаты отдельных клеток, а также что все подготовительные работы проводятся в чистой области перед ПЦР для снижения риска возникновения загрязнения. Эффективный лизис клеток также имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы копии мтДНК могли быть успешно разделены на отдельные капли; однако это должно быть сбалансировано с риском нарушения образования капель при использовании более высоких концентраций моющего средства.
Поскольку разработка анализа и этапы лизиса являются наиболее важными в протоколе, это также шаги, которые, скорее всего, потребуют устранения неполадок. Наборы грунтовок/зондов, которые изначально не производят хорошо разделенных популяций положительных и отрицательных капель, могут показать улучшенную производительность, если оптимизирована температура отжига/расширения протокола ПЦР. Предлагаемая температура 58°С приведена на этапе 5.1. был проверен на соответствие наборам грунтовок/зондов (таблица 1); однако оптимальная температура может варьироваться в пределах 55-65 °C, и градиентная ПЦР в этом диапазоне может быть запущена, чтобы найти наиболее подходящую температуру для новых наборов праймеров / зондов. Если это не удастся, то может потребоваться перепроектировать грунтовки и / или зонды для повышения производительности, ссылаясь на рекомендации производителя по проектированию анализов (см. Таблицу материалов).
Если условия лизиса отличаются от описанных на этапе 2.1.2. требуются, затем необходимо оценить влияние альтернативного буфера лизиса на образование капель. Возможно, удастся улучшить образование капель за счет снижения концентрации моющего средства в буфере лизиса или разбавления лизата в большем объеме воды без нуклеазы, хотя мы обнаружили, что некоторые буферы (например, буфер RLT Plus) все еще оказывают значительное влияние на образование капель даже при очень низких концентрациях. Одним из возможных решений этой проблемы является выполнение очистки ДНК после лизиса, например, с использованием шариков SPRI для связывания ДНК и смывания моющих средств. В то время как шарики SPRI используются для очистки как геномной ДНК25 , так и мтДНК26 от одноклеточных лизатов, любая потеря геномов мтДНК во время этого процесса повлияет на последующее измерение числа копий, и в настоящее время нет данных, которые количественно определяют этот потенциальный источник ошибки при использовании коммерчески доступных продуктов SPRI на одноклеточных лизатах.
Традиционно число копий мтДНК и гетероплазма делеции измерялись с помощью анализов qPCR27. Хотя базовая концепция подхода qPCR очень похожа на метод ПЦР капельной генерации, описанный здесь, одним из основных недостатков использования qPCR является его неспособность напрямую измерить абсолютное число копий11. Для каждого образца qPCR измеряет пороговое значение цикла (ct) - количество циклов ПЦР, необходимых для достижения определенного количества продукта из исходной входной ДНК. Поскольку это пороговое значение является произвольным, необходимо создать стандартную кривую из входных данных, содержащих диапазон известных целевых концентраций, прежде чем образцам могут быть присвоены абсолютные номера копий. На объемном уровне ДНК этот процесс очень точен и сопоставим с ПЦР капельной генерации по своей способности измерять число копий мтДНК. Однако при очень низких числах копий, таких как те, которые обычно встречаются в одиночных ячейках, становится все труднее точно генерировать стандартные кривые для qPCR и, следовательно, труднее получить точные измерения абсолютной копии no11. Следует отметить, что ПЦР капельной генерации в настоящее время дороже, чем qPCR, причем расходные материалы и реагенты стоят примерно в 2,5 раза дороже на выборку, в дополнение к более высоким первоначальным затратам на оборудование. Это означает, что стоимость ПЦР капельной генерации может быть непомерно высокой для некоторых высокопроизводительных приложений, и в этом случае qPCR по-прежнему представляет собой жизнеспособную альтернативу.
Поскольку ПЦР капельной генерации непосредственно измеряет количество копий данной мишени, присутствующих в образце, нет необходимости в стандартной кривой при измерении абсолютного числа копий, и поэтому метод ПЦР генерации капель чрезвычайно чувствителен даже при очень небольших количествах входной ДНК11,12. Учитывая растущую важность одноклеточных технологий в области митохондриальной биологии, этот подход, основанный на ПЦР-генерации капель, представляет собой ключевой шаг вперед по сравнению с предыдущими методологиями и позволяет продолжать измерение ключевых митохондриальных параметров в условиях одной клетки. Также можно использовать ПЦР капельной генерации для измерения количества копий мтДНК в ДНК, извлеченной из объемных образцов тканей; это требует измерения числа копий ядерной ДНК в дополнение к номеру копии мтДНК, чтобы обеспечить нормализацию числа клеток. Поэтому требуется включение набора праймера/зонда, нацеленного на ядерный ген, наряду с набором праймера/зонда, нацеленным на мтДНК. Как указывалось выше, на объемном тканевом уровне ПЦР капельной генерации и стандартные методы qPCR имеют сопоставимую точность, и, следовательно, ПЦР капельной генерации не предлагает существенных преимуществ по сравнению с существующими технологиями в этих условиях.
Одним из основных ограничений метода, представленного здесь, является неспособность измерить уровни гетероплазмы в клетках, несущих гетероплазматические SNP, а не делеции мтДНК, что требует дополнительного анализа (например, пиросеквенирования или qPCR) для измерения как числа копий, так и гетероплазмы из одной клетки. Сообщалосьоб успешном обнаружении SNP, демонстрирующих аллель-специфическую экспрессию (ASE) с использованием этой платформы, и в недавнем отчете описано использование этого метода для измерения гетероплазмы общей мутации m.3243A>G MELAS29. Поэтому, хотя кажется, что это ограничение может быть преодолено с помощью тщательно разработанных пар зондов, оно требует разработки / проверки отдельного набора праймеров / зондов для каждого отдельного SNP, а параметры конструкции гораздо более ограничены необходимостью зондов нацеливаться на конкретное основание в последовательности мтДНК. Таким образом, включение обнаружения SNP в протокол ПЦР генерации капель, описанный здесь, еще не было предпринято.
Важно отметить, что цифровые платформы ПЦР на основе капель, такие как тип, используемый в этом исследовании, не являются единственными технологиями, способными к абсолютной количественной оценке мишеней ДНК, и коммерческие продукты, использующие альтернативные методы, такие как секционирование на основе пластин, также доступны30. Кроме того, технологии, использующие альтернативы ПЦР, такие как петлевая изотермическая амплификация (LAMP)31 и амплификация полимеразы рекомбиназы (RPA)32, могут оказаться более подходящими, чем ПЦР капельной генерации для использования в клинических условиях.
В целом, этот протокол представляет собой высокочувствительный метод измерения числа копий мтДНК и гетероплазмы делеции в отдельных клетках, который может быть применен к широкому спектру различных типов клеток и видов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Отсутствие конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Благодарим доктора Л. Божилову за советы по статистическому анализу данных ПЦР капельной генерации. Спасибо доктору Х. Чжану за предоставление ооцитов, используемых для генерации данных на рисунках 3C и 4B. Эта работа была выполнена SPB в Отделе митохондриальной биологии Совета по медицинским исследованиям (MC_UU_00015/9 Кембриджского университета и финансировалась Главной исследовательской стипендией Wellcome Trust, проводимой PFC (212219/ Z / 18 / Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Tween-20 solution | Novex | 3005 | |
| Automated droplet-generating oil | Bio Rad | 1864110 | Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1) |
| C1000 PCR machine with deep-well block | Bio Rad | 1851197 | PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5) |
| Collection plate cooling block | Bio Rad | 12002819 | Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3) |
| ddPCR 96-well plates | Bio Rad | 12001925 | 96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3) |
| ddPCR droplet reader oil | Bio Rad | 1863004 | Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1) |
| ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio Rad | 1863023 | Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3) |
| DG32 automated droplet generator cartridges | Bio Rad | 1864108 | Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3) |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Qualified fetal bovine serum |
| Foil plate covers | Bio Rad | 1814040 | Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6) |
| HEK 293T cells | Takara | 632180 | Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen |
| HeLa cells | ECACC | 93021013 | Human cervix epitheloid carcinoma cells |
| High glucose DMEM | Gibco | 13345364 | 4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Human cybrids | University of Miami | ||
| Mouse embryonic fibroblasts | Newcastle University | Immortalized from C57Bl/6 mice | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PCR plate seals | Pierce | SP-0027 | Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6) |
| Pipet Tip Waste Bins | Bio Rad | 1864125 | Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Pipet tips for AutoDG system | Bio Rad | 1864120 | Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Primary human dermal fibroblast cells | Newcastle Biobank | ||
| Primers/Probes | IDT | N/A | Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1 |
| Proteinase K 20 mg/mL solution | Ambion | AM2546 | |
| PX1 PCR plate sealer | Bio Rad | 1814000 | Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6) |
| QX Manager software | Bio Rad | 12012172 | Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7) |
| QX200 AutoDG droplet generator | Bio Rad | 1864101 | Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4) |
| QX200 droplet reader | Bio Rad | 1864003 | Droplet reader (used in Protocol Step 6) |
| Trizma pre-set crystals pH 8.3 | Sigma | T8943-100G |
References
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Wai, T., et al. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility. Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).
- D'Erchia, A. M., et al. Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity. Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A-->G. American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).
- Liu, H., et al. Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases. PloS One. 8 (6), 67146 (2013).
- Filograna, R., et al. Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Wang, Y., et al. The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues. Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).
- Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF). American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).
- Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Herbst, A., et al. Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).
- O'Hara, R., et al. Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution. Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).
- Diaz, F., et al. Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).
- Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells. Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).
- Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis. Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).
- Perier, C., et al. Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms. Brain. 136, Pt 8 2369-2378 (2013).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Espina, V., et al.
- Cree, L. M., et al. A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes. Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).
- Belmonte, F. R., et al. Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions. Scientific Reports. 6, 25186 (2016).
- Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. Two direct repeats cause most human mtDNA deletions. Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).
- Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation. Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).
- Macaulay, I. C., et al. Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&T-seq. Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).
- Ludwig, L. S., et al. Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics. Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).
- Rooney, J. P., et al. PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species. Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).
- Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression. Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).
- Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 10821 (2020).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E.
- Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane. ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).
- Li, Z., et al. Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care. Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952 (2021).
