Summary
Den nåværende protokollen beskriver menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede type 2 alveolar epitellignende celler (iAT2s). Disse cellene kan dyrkes som selvfornyende sfærer i 3D-kultur eller tilpasses luft-væske grensesnitt (ALI) kultur.
Abstract
I lungen er alveolar epitelet en fysisk barriere fra miljøstimuli og spiller en viktig rolle i homeostase og sykdom. Type 2 alveolar epitelceller (AT2s) er fakultetets forfedre til det distale lungeepitelet. Dysfunksjon og skade på AT2 kan skyldes og bidra til ulike lungesykdommer. Bedre forståelse av AT2-biologi er dermed avgjørende for å forstå lungebiologi og sykdom; Imidlertid er primære menneskelige AT2-er generelt vanskelig å isolere og begrenset i forsyning. For å overvinne disse begrensningene kan humanindusert pluripotent stamcelle (iPSC)-avledet type 2 alveolar epitelceller (iAT2s) genereres gjennom en rettet differensieringsprotokoll som recapitulates in vivo lungeutvikling. iAT2s vokser i materfrie forhold, deler et transkripsjonsprogram med humane voksne primære AT2-er, og utfører viktige funksjoner i AT2-er som produksjon, emballasje og sekresjon av overflateaktivt middel. Denne protokollen beskriver metodene for å opprettholde selvfornyende iAT2s gjennom seriell passivisering i tredimensjonal (3D) kultur eller tilpasning av iAT2s til luft-væske grensesnitt (ALI) kultur. En encellet suspensjon av iAT2s genereres før plating i 3D-solubilisert kjellermembranmatrise (heretter referert til som "matrise"), hvor de selv monteres i monolayered epitelale sfærer. iAT2s i 3D-kultur kan serialt dissosieres i encellede suspensjoner som skal passeres eller belagt i 2D ALI-kultur. I ALI-kulturen danner iAT2s en polarisert monolayer med den apikale overflaten utsatt for luft, noe som gjør denne plattformen lett egnet for miljøeksponeringer. Derfor genererer denne protokollen en uuttømmelig tilførsel av iAT2s, og produserer oppover 1 x 1030 celler per inndatacelle over 15 passasjer mens du opprettholder AT2-programmet indikert av SFTPCtdTomato-uttrykk . De resulterende cellene representerer en reproduserbar og relevant plattform som kan brukes til å studere genetiske mutasjoner, modellere miljøeksponeringer eller skjermmedisiner.
Introduction
I lungen er luftveiene og alveolar epitelceller de første som møter inhalerte miljøeksponeringer, inkludert patogener som overføres via inhalerte aerosoler og skadelige stimuli som sigarettrøyk. Type 2 alveolar epitelceller (AT2s) er avgjørende for å opprettholde lunge homeostase som de er fakultetets forfedre av distal lunge epitel, produsere overflateaktive midler for å lindre alveolar overflatespenning, og montere medfødt immunrespons på inhalert eksponering 1,2. AT2-dysfunksjon kan imidlertid skyldes lungeskader eller mutasjoner i gener som uttrykkes selektivt i AT2-er, for eksempel SFTPC, SFTPB og ABCA3 3,4,5. Tidligere tilnærminger for å studere disse genetiske mutasjonene har stolt på musemodeller6 eller konstruert, mutasjonsholdige vektorer introdusert i udødelige cellelinjer7. Derfor er plattformer som kan modellere effekten av genetiske og miljømessige perturbasjoner på AT2 i de fysiologisk relevante celletypene og i et produktivt in vitro-system, nødvendig for å forstå videre hvilken rolle AT2s spiller i helse og sykdom.
Når det gjelder modellering av luftbårne eksponeringer, har luft-væske grensesnitt (ALI) kulturer av primære luftveis epitelceller blitt brukt til å avsløre viktige molekylære responser på sigarettrøyk8 og for å modellere luftveisinfeksjon 9,10. Et sammenlignbart ALI-kultursystem for alveolar epitelet, et viktig sted for infeksjon eller sykdomsskade, er mye mindre utviklet sammenlignet med luftveis epitelmodellsystemet. Udødeliggjorte cellelinjer har blitt dyrket ved ALI som proxy for alveolar epitel11,12, men disse cellelinjene er transgrafisk forskjellig fra primære alveolar epitelceller13 og mangler viktige cellulære maskiner, for eksempel evnen til å skille ut overflateaktive stoffer eller danne tette veikryss ved ALI12. Primære menneskelige AT2-er kan dyrkes i 3D-sfærer i nærvær av fibroblaster 1,14, men er underlagt begrensninger, inkludert begrenset tilgjengelighet fra eklant lunger og deres tendens til å senesce eller miste cellulær fenotype i de fleste kulturer til dags dato. Disse egenskapene presenterer barrierer for den utbredte adopsjonen av primære AT2 in vitro-studier, selv om det nylig er gjort fremskritt i optimalisering av materfrie 3D-kulturer for utvidelse av primære AT2s 15,16,17,18.
Rettet differensieringsprotokoller er utviklet for å rekapitulere in vivo utviklingsmilepæler for å generere menneskeskapte pluripotente stamceller (iPSC)-avledet type 2 alveolar epitelceller (iAT2s)19. iAT2s vokser som selvfornyende sfærer i 3D serumfri kultur i et definert medium som inneholder CHIR99021, KGF, deksametason, cAMP og 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX), kalt "CK + DCI"19, i fravær av fibroblastmatere og kan dyrkes for >20 passasjer20,21. Videre deler iAT2s et transkripsjonsprogram med humane voksne primære AT2-er, danner lamelllegemer og produserer og pakker overflateaktivtmiddel 19,21,22. Denne protokollen beskriver seriell passivisering av iAT2s ved å dissosiere cellene til en encellet suspensjon. På dette tidspunktet kan iAT2s replatees og utvides ytterligere i 3D-kultur eller belagt i 2D ALI-kultur23. Disse metodene kan brukes til å studere at2s indre biologi i homeostase og sykdom 20,22 og for å forhøre effekten av forbindelser eller stimuli i en skalerbar, fysiologisk relevant plattform 23,24, som tidligere har vist.
Protocol
Alle eksperimenter som involverte differensiering av menneskelige iPSC-linjer ble utført i samsvar med Institutional Review Board of Boston University (protokoll H33122). Dermal fibroblasts, anskaffet for omprogrammering til iPSCs, ble hentet fra en donor med skriftlig informert samtykke, under godkjenning av Human Research Protection Office of Washington University School of Medicine, St. Louis, MO. Reprogrammed iPSCs ble generert ved Center for Regenerative Medicine ved Boston University og Boston Medical Center, Boston, MA.
1. Alveolosphere dissosiasjon
- Klargjør komplette serumfrie differensieringsmedier (cSFDM) i henhold til sammensetningen som er nevnt i tabell 1.
- Klargjør CK + DCI-medier i den forberedte cSFDM-basen i henhold til tabell 2.
- Tine 2D -matrise (humant embryonalt stamcellekvalifisert) og/eller 3D-matrise (vekstfaktor redusert) på is etter behov for de eksperimentelle behovene.
- Aspirer alle CK + DCI-mediet ved hjelp av en pipette eller aspirerende pipette med vakuum fra 3D-matrisedråpene som inneholder alveolospheres, avledet fra rettet differensiering19, i en 12-brønns plate.
- Tilsett 1 ml dispase (2 mg/ml) per dråpe. Rør forsiktig dråpen inn i dispasen ved hjelp av en P1000 pipette. Inkuber ved 37 °C i 1 time, pipetter opp og ned én gang etter 30 min.
- Overfør de dissosierte organoidene (fra trinn 1.5) fra en matrisedråpe i dispase til et 15 ml konisk rør. For å vaske, tilsett 10 ml av Iscoves modifiserte dulbeccos medium (IMDM, se Materialfortegnelse).
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur. Aspirer supernatanten ved hjelp av en pipette eller aspirerende pipette med vakuum, slik at den blir så lite supernatant som mulig.
MERK: Det er viktig å fjerne all dispase da eventuell gjenværende dispase kan oppløse matrisen som cellene senere vil bli sådd inn i. Hvis en klar disze ses over pelletsen, har dispasen ikke fullstendig oppløst matrisen, og mer dispase kan legges til pelletsen i ytterligere 20-30 min ved 37 °C. - Resuspend cellene i 1 ml av 0,05% trypsin per dråpe og overføre tilbake til 12-brønnsplaten. Inkuber ved 37 °C i 12-15 min. Vær oppmerksom på dissosiasjonen under et mikroskop. Unngå overpipettering av cellene på dette stadiet.
MERK: På slutten av inkubasjonen må cellene oppnå en encellet suspensjon etter pipettering 3-5 ganger med en P1000 pipette. For å sende iAT2s til ALI (trinn 3), må trypsiniseringstiden minimeres (maksimalt 12 min), slik at cellene er i 2-3-cellers klumper i stedet for encellet suspensjon når de er klare for plating på cellekulturinnsatsen. - Stopp virkningen av trypsin med et likt volum av FBS-inneholdende medium (10% ES-kvalifisert FBS i DMEM). Sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur.
- Vask cellene med 10 ml IMDM. Sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur.
- Resuspend cellene i et passende volum for telling, og tell deretter cellene ved hjelp av et hemocytometer (se Tabell over materialer).
MERK: Fra en konfluent 50 μL matrisedråpefrø ved 400 celler / μL er det forventede utbyttet 500.000 til 1,5 x 106 celler per dråpe. - Bruk encellet suspensjon av iAT2-celler til å generere alveolosfærer ved å plate i 3D-matrisen (trinn 2) og/eller plating på cellekulturinnlegg for ALI-kultur (trinn 3).
2.3D plating av iAT2s
- Etter telling (trinn 1.11), bestem antall ønskede celler som skal replates i 3D-matrisen (400 celler / μL av matrisen med 50-100 μL 3D matrisedråper per brønn av en 12-brønns plate). Sentrifuger cellene ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Fjern så mye supernatant som mulig ved hjelp av en pipette.
- Resuspend cellene i 3D-matrisen. Resuspend raskt og på is, om nødvendig, for å forhindre at matrisen polymeriserer (som oppstår når den er varm).
- Bruk en P200 pipette til å dispensere ett 3D-matrisedråpe per brønn i en forvarmet 12-brønnsplate. Pipette forsiktig for å unngå å lage bobler i matrisedråpen. Ikke la celleopphenget slå seg ned mens du dispenserer flere dråper.
- Plasser platen i en 37 °C inkubator i 20-30 min for å la matrisedråpene polymerisere seg.
- Tilsett 1 ml CK + DCI + 10 μM Y-27632 medium (se Materialfortegnelse) per brønn for å dekke matrisedråpen.
- Etter 72 timer, bytt medium til CK + DCI uten 10 μM Y-27632.
- Bytt ut mediet med frisk CK + DCI hver 48-72 timer.
MERK: iAT2-enheter må vanligvis passeres omtrent hver 10-14 dag, avhengig av cellelinje og platingtetthet.
3. Passaging av iAT2s til ALI
- Forbered nybelagte 6,5 mm cellekulturinnsatser 1 time før bruk ved å fortynne 2D-matrisen i Dulbeccos Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 (DMEM/F12) til arbeidsløsning i henhold til produsentens instruksjoner for 2D-matrisen (se Materialtabellen). Tilsett deretter 100 μL av den fortynnede matrisen per 6,5 mm cellekulturinnsats. La matrisen polymerisere i en 37 °C inkubator i 30 minutter eller ved romtemperatur i 1 time.
- Aspirer overflødig matrise fra cellekulturinnleggene ved hjelp av en pipette eller aspirerende pipette med vakuum og skyll en gang med DMEM / F12. Aspirer denne vasken umiddelbart før du legger til cellene.
- Etter telling, bestem antall nødvendige celler for å frø ønsket antall celler i kulturinnleggene (520.000 levende celler / cm2, tilsvarende 172.000 levende celler per 6,5 mm cellekulturinnsats). Sentrifuger cellene ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Fjern så mye supernatant som mulig.
- Resuspend cellene i riktig volum til frø med 100 μL av CK + DCI + 10 μM Y-27632 per cellekulturinnsats (celleoppheng skal være 1720 celler / μL ). Legg 100 μL til det apikale rommet i cellekulturinnsatsen. Rør platen forsiktig i et kryssmønster for å sikre en jevn fordeling av celler over cellekulturinnsatsen, og bekreft dette ved å sjekke under et mikroskop ved 4x mål.
MERK: Såtetthet er kritisk og kan kreve optimalisering, fra 160.000-300.000 celler per 6,5 mm cellekulturinnsats. Calcein grønn (se Tabell over materialer) cellegjennomtrengelig fargestoff kan legges til cellene og vises på et invertert fluorescerende mikroskop for å visualisere cellene etter sådd. - Tilsett 500 μL CK + DCI + 10 μM Y-27632 i basolateralrommet i hver cellekulturinnsats.
- Aspirat apikalt CK + DCI + 10 μM Y-27632 medium 48 timer etter sådd ved hjelp av en pipette for å starte ALI (kjent som "luftløft").
MERK: Cellene skal være 100% sammenfallende på dette tidspunktet. Hvis cellene ikke er 100% sammenfallende, bør trinn 3.7-3.8 fortsatt utføres på de angitte tidspunktene; det kan ta lengre tid å danne samtidige cellemonolag. - Endre basolateral CK + DCI + 10 μM av Y-27632 medium etter 72 h til CK + DCI uten 10 μM Y-27632.
MERK: Det bør være minimal hvis noen, "lekkasje" av medium til den apikale siden. Men hvis dette skjer i de første dagene, fortsett å aspirere den apikale siden daglig til det ikke er ytterligere lekkasje. - Bytt ut det basolaterale mediet med frisk CK + DCI hver 48-72 time.
MERK: IAT2-ene som brukes i ALI-kulturer, modnes maksimalt ved 5-14 dager etter plating. - Oppretthold cellene med nøye overvåking i opptil 28 dager etter plating, om nødvendig, for mer langvarig eksperimentering.
MERK: Synlige tegn på ALI-feil, for eksempel peeling av cellene bort fra kanten av innsatsen eller dannelsen av hull i monolayeren, kan observeres etter en overeksponert tid i kulturen, og da er ALI ikke lenger brukbar for eksperimenter.
Representative Results
IAT2-ene ble ført til en encellet suspensjon og deretter reskilt i 3D-matrise eller i 2D på cellekulturinnlegg for ALI-kultur (figur 1). Etter encellet dissosiasjon ble iAT2-ene analysert av strømningscytometri. Kort sagt, cellene resuspended i 1% fetal bovine serum (FBS) i fosfat-bufret saltvann (PBS) med calcein blå levedyktighet fargestoff (1:1000) ble analysert på en strømning cytometer, gating for ikke-fragmenter, singlets, og tdTomato. Her er for eksempel SPC2-linjen (SPC2-ST-B2 klone20), som har en tdTomato-reporter rettet mot den endogene SFTPC-locus for enkel visualisering og sporing av AT2-programmet over tid i kultur (figur 2A). IAT2 SFTPC-tdTomato-uttrykket ble opprettholdt når det ble replated i 3D-matrisen som sfærer (figur 2B) og når det er belagt på cellekulturinnlegg (figur 2C). Transepitelial elektrisk motstand (TEER) kan måles for å bestemme integriteten til ALI-kulturen (figur 2D). For å måle TEER ble det brukt et voltohmmeter (se Materialtabell), med 100 μL CK + DCI-medium lagt til det apikale kammeret. Cellekulturen setter inn belagt med Matrigel i fravær av frøceller ble behandlet som emner. Målinger ble tatt på tre steder i hver brønn.
Figur 1: Skjematisk representasjon av protokollarbeidsflyten. Klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative resultater av protokollen. (A) Representative strømningscytometriresultater for SFTPC-tdTomato i humant indusert pluripotent stamcelleavledet type 2 alveolar epitellignende celler (iAT2s) dyrket i 3D. Den negative kontrollen som vises er ikke-lunge endoderm (CD47lo). (B) Representativ live-celle bildebehandling av iAT2s dyrket i 3D på ulike dager etter passasje (dpp) (SFTPC-tdTomato, skala bar = 50 μm). (C) Representativ live-celle bildebehandling av iAT2s belagt ved luft-væske grensesnitt (SFTPC-tdTomato, skala bar = 500 nm). (D) Representativ transeptelial elektrisk motstand av iAT2s belagt ved luftvæskegrensesnittet. n = 3, feilfelt angir standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reagenser | Volum for 500 ml | Endelig konsentrasjon |
| Iscoves modifiserte dulbecco medium (IMDM) | 375 ml | 75% |
| Skinkes F-12 næringsblanding (F12) | 125 ml | 25% |
| B-27 (med RA) tillegg | 5 ml | 1% |
| N-2 supplement | 2,5 ml | 0.50% |
| BSA (7,5 % lager) | 3,3 ml | 0.05% |
| Primocin (50 mg/ml lager) | 1 ml | 100 μg/ml |
| Glutamax (100x lager) | 5 ml | 1x |
| Askorbinsyre (50 mg/ml lager) | 500 μL | 50 μg/ml |
| 1-Thioglycerol (MTG) (fra 26 μL i 2 ml IMDM) | 1,5 ml | 4,5 x 10-4 M |
Tabell 1: Sammensetning av komplette serumfrie differensieringsmedier (cSFDM).
| Reagent | Endelig konsentrasjon |
| CHIR99021 | 3 μM |
| rhKGF | 10 ng/ml |
| Deksametason | 50 nM |
| 8-bromoadenosin 30,50-syklisk monofosfat natriumsalt (cAMP) | 0,1 mM |
| 3-Isobutyl-1-metylxanthine (IBMX) | 0,1 mM |
Tabell 2: Komposisjoner av CK + DCI-mediet.
Discussion
AT2s opprettholder lunge homeostase, og dysfunksjon av disse viktige alveolarcellene kan både forårsake og skyldes ulike lungesykdommer. På grunn av vanskeligheten med å få tilgang til og isolere primære menneskelige AT2-er, genereres iAT2s. Ved å anvende de rettede differensieringsmetodene beskrevet andre steder25 og ekspansjons- og cellesåingen som er beskrevet her, kan iPSCer generert fra ethvert individ differensieres til robust selvfornyende iAT2s, og dermed gi pasientspesifikke celler for biomedisinsk forskning, inkludert grunnleggende biomedisinske forskningsutviklingsstudier, sykdomsmodellering, cellebaserte terapier eller narkotikaskjermer. Den nåværende protokollen beskriver en metode for å dissosiere iAT2s til en encellet suspensjon, som deretter kan replates i 3D Matrigel for å generere alveolospheres for celleutvidelse eller replated i 2D ALI kultur for videre eksperimenter.
Protokollen har flere kritiske skritt for å sikre vellykket passivisering og replating i både 3D- og ALI-kulturer. Mekanisk trianturasjon må minimeres, da overdreven pipettering kan redusere cellens levedyktighet. I tillegg er såddtettheten til iAT2s i både 3D- og 2D ALI-kulturer kritisk; for 3D-kultur er generelt 400 celler / μL 3D Matrigel optimal for de fleste iPSC-linjer. Imidlertid har en rekke tettheter fra 100-500 celler / μL til tider vært vellykket, og optimalisering av tettheten kan være nødvendig for forskjellige cellelinjer. For ALI-kulturen er optimalisering av såingstettheten til iAT2s på cellekulturinnleggene også viktig for å oppnå en sammenfallende monolayer av celler 48 timer etter sådd (dvs. på dagen for luftløft). Noen iAT2-linjer krever flere celler per innsetting. Hvis feilsøking er nødvendig, anbefales derfor et område fra 160 000-300 000 celler/innsats for cellekulturinnlegg med 24 brønner. 3D-kulturer kan også skaleres til 24- og 48-brønnsplater ved å opprettholde såddtettheten ved henholdsvis 400 celler/μL 3D-matrise og redusere matrisedråpestørrelsen til henholdsvis 25 μL og 20 μL. ALI-kulturer kan skaleres til 96-brønns cellekulturinnlegg ved å belegge hver innsats med 30 μL av matrisen, plating 80.000 celler i 30 μL per innsats, og fôring med 150 μL basolaterale medier per brønn. Såingstetthet og matrise- og medievolumer må skaleres og optimaliseres tilsvarende for andre plateformater.
En begrensning i denne protokollen er at cellene som brukes til ALI-plating må renses tilstrekkelig til å være NKX2-1+ og SFTPC + 19,20,21,23 for å danne iAT2 ALIer, og ALI-kulturdannelsen kan variere fra linje til linje. I tillegg tillater denne protokollen utvidelse og generering av kun AT2-kulturer, noe som gir et reduksjonistisk modellsystem basert på en enkelt nøkkel alveolarcelletype. Det er viktig at andre relevante alveolarcelletyper, for eksempel alveolar type 1-celler, manglet fra disse plattformene. Andre grupper har hatt suksess med å dyrke primære menneskelige AT2-er som sfæroider eller organotypiske kulturer med eller uten fibroblaster 1,14,15,16,17; Imidlertid har primære menneskelige AT2-er en tendens til å miste sitt uttrykk for viktige overflateaktive stoffer når de dyrkes i normal 2D-kultur uten ALI-forhold26. Videre har nyere arbeid vist at iAT2s uttrykker høyere proliferative markører og lavere AT2 modningsmarkører enn ferske, ukulturerte menneskelige primære AT2s27. Til tross for disse forskjellene mellom iAT2s og ferske primære menneskelige AT2-er, fant vi ut at selv kultiverte primære AT2-er viste transkripsjonsforskjeller fra fersk, ukulturert primær AT2s27, og dermed konkluderer med at disse in vitro-modellene har forskjellige styrker og begrensninger for modellering i vivo lungebiologi.
IAT2-plattformen kan brukes til å studere genetiske mutasjoner fra pasientavledede iPSCer19,20. Systemet kan også skaleres betydelig opp for å imøtekomme høy gjennomstrømning av narkotikascreening. I tillegg er iAT2 ALIer egnet for miljøeksponeringer som viral eller bakteriell infeksjon eller eksponering for sigarettrøyk, e-sigarettdamp eller andre aerosoler23. Oppsummert tillater denne protokollen for å generere både 3D- og 2D ALI-kulturer i iAT2s langsiktig kultur av en sykdomsrelevant celletype og gir en fysiologisk, skalerbar plattform som muliggjør bruk av disse cellene i mange applikasjoner.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker oppriktig medlemmer av Wilson-, Kotton- og Hawkins-laboratoriene for deres nyttige diskusjoner. Vi er også veldig takknemlige til Greg Miller (CReM Laboratory Manager) og Marianne James (iPSC Core Manager) for deres uvurderlige støtte. Vi takker Brian Tilton og BUMC Flow Cytometry Core for deres tekniske assistanse med cellesortering (støttet av NIH grant #1S10OD021587-01A1). Dette arbeidet ble støttet av et CJ Martin Early Career Fellowship fra Australian National Health and Medical Research Council tildelt RBW; NIH gir F30HL147426 til KMA; en I.M. Rosenzweig Junior Investigator Award fra The Pulmonary Fibrosis Foundation og en integrert Pilot Grant Award gjennom Boston University Clinical &Translational Science Institute (1UL1TR001430) til KDA; Swiss National Science Foundation (P2ELP3_191217) til ABA; NIH gir U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 og R01HL095993 til DNK; og NIH gir U01TR001810, R01DK101510 og R01DK117940 tildelt AAW; iPSC vedlikehold, banktjenester og deling støttes av NIH grant NO1 75N92020C00005. Figur 1 ble opprettet ved hjelp av Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | For CKDCI |
| 12 Well Cell Culture Plate | Corning | 3513 | Plates for culturing |
| 1-Thioglycerol (MTG) | M6145 | Sigma | For CKDCI |
| 2D Matrigel (matrix) - Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 8774552 | To coat ALI Transwells |
| 3D Matrigel (matrix) - Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 356230 | To grow iAT2 spheres in |
| 8-bromoadenosine 30,50-cyclic monophosphate sodium salt (cAMP) | Sigma | B7880 | For CKDCI |
| Ascorbic Acid | A4544 | Sigma | For CKDCI |
| B27 w/out retinoic acid | Life Technologies | 12587-010 | For CKDCI |
| Bovine Serum Albumin (BSA) (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | For CKDCI |
| Calcein blue | Life Technologies | C1429 | For live/dead discrimination in flow cytometry |
| Calcein green | Life Technologies | C1430 | Optional visualisation of cells on cell culture insert |
| Cell culture inserts - Costar 6.5 mm Clear Transwells with 0.4 µm pore size | Millipore-Sigma | CLS3470-48EA | ALI transwells |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | For CKDCI |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | For CKDCI |
| Dispase (2 mg/mL) | Thermo Fisher | 354235 | To dissolve matrigel |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11995 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher | A4192002 | To wash |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190 | For flow cytometric analyses |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone charaterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | For CKDCI |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture (F12) | Cellgro | 10-080-CV | For CKDCI |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | For cell counting |
| Invivogen Primocin 1 G (50 mg/mL) | Fisher Scientific | NC9392943 | For CKDCI |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | For CKDCI |
| Millicell ERS-2 Voltohmeter | Millipore | MERS00002 | To measure trans-epithlial electrical resistance |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | For CKDCI |
| Recombinant human KGF | R&D Systems | 251-KG-010 | For CKDCI |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | For CKDCI |
| Trypan blue | Thermo Fisher | 15250061 | For cell count during passaging |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25-300-062 | To dissociate iAT2 spheres |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Add to cells after passaging |
References
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- Mason, R. J., Williams, M. C. Type II alveolar cell. Defender of the alveolus. American Review of Respiratory Disease. 115 (6), Pt 2 81-91 (1977).
- Nogee, L. M., et al. A mutation in the surfactant protein C gene associated with familial interstitial lung disease. New England Journal of Medicine. 344 (8), 573-579 (2001).
- Nogee, L. M., et al. A mutation in the surfactant protein B gene responsible for fatal neonatal respiratory disease in multiple kindreds. Journal of Clinical Investigation. 93 (4), 1860-1863 (1994).
- Shulenin, S., et al. ABCA3 gene mutations in newborns with fatal surfactant deficiency. New England Journal of Medicine. 350 (13), 1296-1303 (2004).
- Nureki, S. I., et al. Expression of mutant Sftpc in murine alveolar epithelia drives spontaneous lung fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 128 (9), 4008-4024 (2018).
- Katzen, J., et al. An SFTPC BRICHOS mutant links epithelial ER stress and spontaneous lung fibrosis. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (6), 126125 (2019).
- Mathis, C., et al. Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (7), 489-503 (2013).
- Purkayastha, A., et al. Direct exposure to SARS-CoV-2 and cigarette Smoke increases infection severity and alters the stem cell-derived airway repair response. Cell Stem Cell. 27 (6), 869-875 (2020).
- Matrosovich, M. N., Matrosovich, T. Y., Gray, T., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Human and avian influenza viruses target different cell types in cultures of human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (13), 4620-4624 (2004).
- Tollstadius, B. F., Silva, A. C. G. d, Pedralli, B. C. O., Valadares, M. C. Carbendazim induces death in alveolar epithelial cells: A comparison between submerged and at the air-liquid interface cell culture. Toxicology in Vitro. 58, 78-85 (2019).
- Winton, H. L., et al. Cell lines of pulmonary and non-pulmonary origin as tools to study the effects of house dust mite proteinases on the regulation of epithelial permeability. Clinical and Experimental Allergy. 28 (10), 1273-1285 (1998).
- Kanagaki, S., et al. Hydroxypropyl cyclodextrin improves amiodarone-induced aberrant lipid homeostasis of alveolar cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 64 (4), 504-514 (2021).
- Sucre, J. M. S., et al. Successful establishment of primary type 2 alveolar epithelium with 3D organotypic co-culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 158-166 (2018).
- Kobayashi, Y., et al. Persistence of a regeneration-associated, transitional alveolar epithelial cell state in pulmonary fibrosis. Nature Cell Biology. 22, 934-946 (2020).
- Choi, J., et al. Inflammatory signals induce AT2 cell-derived damage-associated transient progenitors that mediate alveolar regeneration. Cell Stem Cell. 27 (3), 366-382 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Katsura, H., et al. Human lung stem cell-based alveolospheres provide insights into SARS-CoV-2-mediated interferon responses and pneumocyte dysfunction. Cell Stem Cell. 27 (6), 890-904 (2020).
- Jacob, A., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional lung alveolar epithelial cells. Cell Stem Cell. 21 (4), 472-488 (2017).
- Alysandratos, K. -D., et al. Patient-specific iPSCs carrying an SFTPC mutation reveal the intrinsic alveolar epithelial dysfunction at the inception of interstitial lung disease. Cell Reports. 36 (9), 109636 (2021).
- Hurley, K., et al. Reconstructed single-cell fate trajectories define lineage plasticity windows during differentiation of human PSC-derived distal lung progenitors. Cell Stem Cell. 26 (4), 593-608 (2020).
- Sun, Y. L., et al. Heterogeneity in human iPSC-derived alveolar epithelial type II cells revealed with ABCA3/SFTPC reporters. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 65 (4), 442-460 (2021).
- Abo, K. M., et al. Human pluripotent stem cell-derived alveolar type 2 cells mature and respond to environmental exposures in air-liquid interface culture. Journal of Clinical Investigation Insight. 7 (6), (2022).
- Huang, J., et al. SARS-CoV-2 infection of pluripotent stem cell-derived human lung alveolar type 2 cells elicits a rapid epithelial-intrinsic inflammatory response. Cell Stem Cell. 27 (6), 962-973 (2020).
- Jacob, A., et al. Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (12), 3303-3332 (2019).
- Beers, M. F., Moodley, Y. When is an alveolar type 2 cell an alveolar type 2 cell? A conundrum for lung stem cell biology and regenerative medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 18-27 (2017).
- Alysandratos, K. D., et al. Impact of cell culture on the transcriptomic programs of primary and iPSC-derived human alveolar type 2 cells. bioRxiv. , (2022).
