Summary
Det nuvarande protokollet beskriver humant inducerade pluripotenta stamcellsderiverade typ 2 alveolära epitelliknande celler (iAT2s). Dessa celler kan odlas som självförnyande sfärer i 3D-odling eller anpassas till luft-vätskegränssnitt (ALI) -kultur.
Abstract
I lungan är det alveolära epitelet en fysisk barriär från miljöstimuli och spelar en viktig roll i homeostas och sjukdom. Typ 2 alveolära epitelceller (AT2s) är de fakultativa förfäderna till det distala lungepitelet. Dysfunktion och skada på AT2 kan bero på och bidra till olika lungsjukdomar. Förbättrad förståelse av AT2-biologi är därför avgörande för att förstå lungbiologi och sjukdom; emellertid, primära mänskliga AT2s är i allmänhet svåra att isolera och begränsad i utbudet. För att övervinna dessa begränsningar kan humaninducerade pluripotenta stamceller (iPSC) -härledda typ 2 alveolära epitelceller (iAT2s) genereras genom ett riktat differentieringsprotokoll som rekapitulerar lungutveckling in vivo . iAT2s växer under matarfria förhållanden, delar ett transkriptomiskt program med humana vuxna primära AT2 och utför nyckelfunktioner för AT2s såsom produktion, förpackning och utsöndring av ytaktivt medel. Detta protokoll beskriver metoderna för att upprätthålla självförnyande iAT2s genom seriell passaging i tredimensionell (3D) kultur eller anpassa iAT2s till luft-vätskegränssnitt (ALI) -kultur. En encellssuspension av iAT2s genereras före plätering i 3D-solubiliserad källarmembranmatris (nedan kallad "matris"), där de självmonteras i monolagerade epitelsfärer. iAT2s i 3D-odling kan seriellt dissocieras i encellssuspensioner för att passeras eller pläteras i 2D ALI-kultur. I ALI-kulturen bildar iAT2s ett polariserat monolager med den apikala ytan utsatt för luft, vilket gör denna plattform lätt mottaglig för miljöexponeringar. Därför genererar detta protokoll en outtömlig tillförsel av iAT2s, som producerar upp till 1 x 1030 celler per ingångscell över 15 passager samtidigt som AT2-programmet som indikeras av SFTPCtdTomato-uttryck bibehålls. De resulterande cellerna representerar en reproducerbar och relevant plattform som kan användas för att studera genetiska mutationer, modellera miljöexponeringar eller screena läkemedel.
Introduction
I lungan är luftvägarna och alveolära epitelceller de första som stöter på inhalerade miljöexponeringar, inklusive patogener som överförs via inhalerade aerosoler och skadliga stimuli som cigarettrök. Typ 2 alveolära epitelceller (AT2) är väsentliga för att upprätthålla lunghomeostas eftersom de är fakultativa föregångare till det distala lungepitelet, producerar ytaktiva ämnen för att lindra alveolära ytspänningar och monterar det medfödda immunsvaret mot inhalerade exponeringar 1,2. AT2-dysfunktion kan dock bero på lungskador eller mutationer i gener som selektivt uttrycks i AT2s, såsom SFTPC, SFTPB och ABCA3 3,4,5. Tidigare metoder för att studera dessa genetiska mutationer har förlitat sig på musmodeller6 eller konstruerade, mutationsinnehållande vektorer som införts i odödliga cellinjer7. Därför behövs plattformar som kan modellera effekterna av genetiska och miljömässiga störningar på AT2 i de fysiologiskt relevanta celltyperna och i ett produktivt in vitro-system för att ytterligare förstå den roll AT2 spelar för hälsa och sjukdom.
När det gäller modellering av luftburna exponeringar har luft-vätskegränssnittskulturer (ALI) av primära luftvägsepitelceller framgångsrikt använts för att avslöja viktiga molekylära svar på cigarettrök8 och för att modellera luftvägsinfektion 9,10. Ett jämförbart ALI-odlingssystem för det alveolära epitelet, en nyckelplats för infektion eller skada vid sjukdom, är mycket mindre utvecklad jämfört med luftvägsepitelmodellsystemet. Odödliga cellinjer har odlats vid ALI som en proxy för det alveolära epitelet11,12, men dessa cellinjer skiljer sig transkriptomiskt från primära alveolära epitelceller13 och saknar viktiga cellulära maskiner, såsom förmågan att utsöndra ytaktiva ämnen eller bilda täta korsningar vid ALI12. Primära mänskliga AT2 kan odlas i 3D-sfärer i närvaro av fibroblaster 1,14 men är föremål för begränsningar, inklusive den begränsade tillgängligheten från explant lungor och deras tendens att senesce eller förlora cellulär fenotyp i de flesta kulturer hittills. Dessa egenskaper utgör hinder för det utbredda antagandet av primära AT2-in vitro-studier, även om de senaste framstegen har gjorts för att optimera matarfria 3D-kulturer för expansion av primära AT2s 15,16,17,18.
Riktade differentieringsprotokoll har utvecklats för att rekapitulera in vivo-utvecklingsmilstolpar för att generera humant inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) -härledda typ 2 alveolära epitelceller (iAT2s)19. iAT2s växer som självförnyande sfärer i 3D-serumfri kultur i ett definierat medium innehållande CHIR99021, KGF, dexametason, cAMP och 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX), kallat "CK + DCI"19, i frånvaro av fibroblastmatare och kan odlas för >20 passager20,21. Dessutom delar iAT2s ett transkriptomiskt program med mänskliga vuxna primära AT2s, bildar lamellära kroppar och producerar och förpackar ytaktivt medel 19,21,22. Detta protokoll beskriver den seriella passaging av iAT2s genom att dissociera cellerna till en encellssuspension. Vid denna tidpunkt kan iAT2s plattas om och utökas ytterligare i 3D-kultur eller pläteras i 2D ALI-kultur23. Dessa metoder kan användas för att studera den inneboende biologin hos AT2 vid homeostas och sjukdom20,22 och för att undersöka effekterna av föreningar eller stimuli i en skalbar, fysiologiskt relevant plattform23,24, vilket tidigare har visats.
Protocol
Alla experiment som involverade differentiering av mänskliga iPSC-linjer utfördes i enlighet med Institutional Review Board vid Boston University (protokoll H33122). De dermala fibroblasterna, som anskaffades för omprogrammering till iPSCs, erhölls från en givare med skriftligt informerat samtycke, under godkännande av Human Research Protection Office of Washington University School of Medicine, St. Louis, MO.
1. Alveolosphere dissociation
- Bered kompletta serumfria differentieringsmedier (cSFDM) enligt den sammansättning som anges i tabell 1.
- Förbered CK + DCI-media i den beredda cSFDM-basen enligt tabell 2.
- Tina 2D-matris (human embryonal stamcellskvalificerad) och/eller 3D-matris (tillväxtfaktorreducerad) på is efter behov.
- Aspirera alla CK + DCI-mediet med hjälp av en pipett eller aspirerande pipett med vakuum från 3D-matrisdropparna innehållande alveosfärer, härledda från riktad differentiering19, i en 12-brunnsplatta.
- Tillsätt 1 ml dispas (2 mg/ml) per droppe. Pipettera försiktigt droppen i dispasen med en P1000-pipett. Inkubera vid 37 °C i 1 timme, pipettera upp och ner en gång efter 30 min.
- Överför de dissocierade organoiderna (från steg 1.5) från en matrisdroppe i dispasen till ett 15 ml koniskt rör. För att tvätta, tillsätt 10 ml Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM, se materialtabell).
- Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten med en pipett eller aspirerande pipett med vakuum och lämna så lite supernatant som möjligt.
OBS: Det är viktigt att ta bort alla dispas eftersom eventuella återstående dispas kan lösa upp matrisen som cellerna därefter kommer att seedas i. Om ett klart dis ses ovanför pelleten har dispasen inte helt löst upp matrisen, och mer dispas kan tillsättas till pelleten i ytterligare 20-30 minuter vid 37 °C. - Resuspendera cellerna i 1 ml 0,05% trypsin per droppe och överför tillbaka till 12-brunnsplattan. Inkubera vid 37 °C i 12-15 min. Observera dissociationen under ett mikroskop. Undvik att pipettera cellerna i detta skede.
OBS: I slutet av inkubationen måste cellerna uppnå en encellssuspension efter pipettering 3-5 gånger med en P1000-pipett. För att överföra iAT2s till ALI (steg 3) måste trypsiniseringstiden minimeras (maximalt 12 min), så att cellerna är i 2-3-cells klumpar snarare än encellssuspension när de är redo för plätering på cellodlingsinsatsen. - Stoppa trypsinverkan med en lika stor volym FBS-innehållande medium (10% ES-kvalificerad FBS i DMEM). Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna med 10 ml IMDM. Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Resuspendera cellerna i en lämplig volym för räkning och räkna sedan cellerna med hjälp av en hemocytometer (se materialtabell).
OBS: Från en sammanflytande 50 μL matrisdroppe sådd vid 400 celler / μL är det förväntade utbytet 500 000 till 1,5 x 106 celler per droppe. - Använd encellssuspensionen av iAT2-celler för att generera alveolosfärer genom plätering i 3D-matrisen (steg 2) och / eller plätering på cellodlingsinsatser för ALI-odling (steg 3).
2.3D plätering av iAT2s
- Efter räkning (steg 1.11), bestäm antalet önskade celler som ska repleras i 3D-matrisen (400 celler / μL av matrisen med 50-100 μL 3D-matrisdroppar per brunn på en 12-brunnsplatta). Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 min vid rumstemperatur. Ta bort så mycket supernatant som möjligt med en pipett.
- Återsuspendera cellerna i 3D-matrisen. Resuspend snabbt och på is, om det behövs, för att förhindra att matrisen polymeriseras (vilket uppstår när det är varmt).
- Använd en P200-pipett för att dosera en 3D-matrisdroppe per brunn i en förvärmd 12-brunnsplatta. Pipettera försiktigt för att undvika att skapa bubblor i matrisdroppen. Låt inte cellsuspensionen sätta sig när du doserar flera droppar.
- Placera plattan i en 37 °C inkubator i 20-30 min så att matrisdropparna polymeriseras.
- Tillsätt 1 ml CK + DCI + 10 μM Y-27632 medium (se materialtabell) per brunn för att täcka matrisdroppen.
- Efter 72 h, byt medium till CK + DCI utan 10 μM Y-27632.
- Byt ut mediet med färsk CK + DCI var 48-72: e timme.
OBS: iAT2s måste vanligtvis passeras ungefär var 10-14 dagar, beroende på cellinje och pläteringstäthet.
3. Överföring av iAT2s till ALI
- Förbered nybelagda 6,5 mm cellodlingsinsatser 1 h före användning genom att späda ut 2D-matrisen i Dulbeccos modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) till arbetslösning enligt tillverkarens instruktioner för 2D-matrisen (se materialtabell). Tillsätt sedan 100 μl av den utspädda matrisen per 6,5 mm cellodlingsinsats. Låt matrisen polymerisera i en 37 °C inkubator i 30 min eller vid rumstemperatur i 1 timme.
- Aspirera överskottsmatrisen från cellodlingsinsatserna med hjälp av en pipett eller aspirerande pipett med vakuum och skölj en gång med DMEM / F12. Aspirera denna tvätt omedelbart innan du lägger till cellerna.
- Efter räkning bestämmer du antalet celler som krävs för att så det önskade antalet celler i odlingsinsatserna (520 000 levande celler/cm2, vilket motsvarar 172 000 levande celler per 6,5 mm cellodlingsinlägg). Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 min vid rumstemperatur. Ta bort så mycket supernatant som möjligt.
- Resuspendera cellerna i lämplig volym för att fröa med 100 μL CK + DCI + 10 μM Y-27632 per cellodlingsinsats (cellsuspension bör vara 1 720 celler / μL ). Tillsätt 100 μL till det apikala facket i cellodlingsinsatsen. Agitera försiktigt plattan i ett korsmönster för att säkerställa en jämn fördelning av celler över cellodlingsinsatsen och bekräfta detta genom att kontrollera under ett mikroskop vid 4x mål.
OBS: Sådddensiteten är kritisk och kan kräva optimering, allt från 160 000-300 000 celler per 6,5 mm cellodlingsinsats. Calceingrönt (se materialtabell) cellgenomsläppligt färgämne kan tillsättas till cellerna och ses på ett inverterat fluorescerande mikroskop för att visualisera cellerna efter sådd. - Tillsätt 500 μL CK + DCI + 10 μM Y-27632 till basolateralfacket i varje cellodlingsinsats.
- Aspirera apikal CK + DCI + 10 μM Y-27632 medium 48 h efter sådd med en pipett för att initiera ALI (känd som "luftlyft").
OBS: Cellerna ska vara 100% konfluenta vid denna tidpunkt. Om cellerna inte är 100% sammanflytande bör steg 3.7-3.8 fortfarande utföras vid de angivna tidpunkterna; sammanflytande cellmonolager kan ta längre tid att bilda. - Ändra basolateral CK + DCI + 10 μM Y-27632 medium efter 72 h till CK + DCI utan 10 μM Y-27632.
OBS: Det bör finnas minimal om någon, "läcka" av medium till den apikala sidan. Men om detta inträffar under de första dagarna, fortsätt att aspirera den apikala sidan dagligen tills det inte finns något ytterligare läckage. - Byt ut det basolaterala mediet med färsk CK + DCI var 48-72: e timme.
OBS: IAT2s som används i ALI-kulturer mognar maximalt vid 5-14 dagar efter plätering. - Underhåll cellerna med noggrann övervakning i upp till 28 dagar efter plätering, om det behövs, för mer långvarig experimentering.
OBS: Synliga tecken på ALI-fel, såsom skalning av cellerna bort från skärets kant eller bildning av hål i monolagret, kan observeras efter en överansträngd tid i odling, vid vilken tidpunkt ALI inte längre är användbar för experiment.
Representative Results
IAT2:orna överfördes till en encellssuspension och pläterades sedan om i 3D-matris eller i 2D på cellodlingsinsatser för ALI-odling (figur 1). Efter encellsdissociation analyserades iAT2:orna med flödescytometri. Kortfattat analyserades cellerna som återsuspenderades i 1% fetalt bovint serum (FBS) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med kalceinblått viabilitetsfärgämne (1:1000) på en flödescytometer, gating för icke-fragment, singlets och tdTomato. Här, som ett exempel, är SPC2-linjen (SPC2-ST-B2 klon20), som har en tdTomato-reporter riktad mot den endogena SFTPC-platsen för enkel visualisering och spårning av AT2-programmet över tid i kultur (Figur 2A). IAT2 SFTPC-tdTomato-uttrycket bibehölls när det pläterades om i 3D-matrisen som sfärer (figur 2B) och när det pläterades på cellodlingsinsatser (figur 2C). Transepitelial elektrisk resistans (TEER) kan mätas för att bestämma ALI-kulturens integritet (figur 2D). För att mäta TEER användes en voltohmmeter (se materialtabell), med 100 μL CK + DCI-medium tillsatt till den apikala kammaren. Cellodlingsinsatserna belagda med Matrigel i frånvaro av utsäde celler behandlades som ämnen. Avläsningar gjordes på tre platser i varje brunn.
Figur 1: Schematisk representation av protokollarbetsflödet.
Figur 2: Representativa resultat av protokollet. (A) Representativa flödescytometriresultat för SFTPC-tdTomato i humant inducerade pluripotenta stamcellsderiverade typ 2 alveolära epitelliknande celler (iAT2s) odlade i 3D. Den negativa kontrollen som visas är icke-lungendoderm (CD47lo). (B) Representativ levande cellavbildning av iAT2s odlade i 3D vid olika dagar efter passage (dpp) (SFTPC-tdTomato, skalstreck = 50 μm). (C) Representativ avbildning av levande celler av iAT2:or pläterade vid luft-vätskegränssnittet (SFTPC-tdTomato, skalstreck = 500 nm). (D) Representativt transepitelialt elektriskt motstånd hos iAT2s pläterade vid gränssnittet mellan luft och vätska. n = 3, felstaplar indikerar standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagenser | Volym för 500 ml | Slutlig koncentration |
| Iscoves modifierade Dulbeccos medium (IMDM) | 375 ml | 75% |
| Skinkans F-12 näringsblandning (F12) | 125 ml | 25% |
| B-27 (med RA) tillägg | 5 ml | 1% |
| N-2 tillägg | 2,5 ml | 0.50% |
| BSA (7,5% aktier) | 3,3 ml | 0.05% |
| Primocin (50 mg/ml lager) | 1 ml | 100 μg/ml |
| Glutamax (100x lager) | 5 ml | 1x |
| Askorbinsyra (50 mg/ml lager) | 500 μl | 50 μg/ml |
| 1-Thioglycerol (MTG) (från 26 μL i 2 ml IMDM) | 1,5 ml | 4,5 x 10-4 M |
Tabell 1: Sammansättning av det fullständiga serumfria differentieringsmediet (cSFDM).
| Reagens | Slutlig koncentration |
| CHIR99021 | 3 μM |
| rhKGF | 10 ng/ml |
| Dexametason | 50 nM |
| 8-bromadenosin 30,50-cykliskt monofosfatnatriumsalt (cAMP) | 0,1 mM |
| 3-Isobutyl-1-metylxantin (IBMX) | 0,1 mM |
Tabell 2: Sammansättningar av CK + DCI-media.
Discussion
AT2s upprätthåller lunghomeostas, och dysfunktion av dessa viktiga alveolära celler kan både orsaka och bero på olika lungsjukdomar. På grund av svårigheten att komma åt och isolera primära mänskliga AT2 genereras iAT2s. Genom att tillämpa de riktade differentieringsmetoder som beskrivs någon annanstans25 och expansionen och cellsådden som beskrivs här kan iPSC: er som genereras från vilken individ som helst differentieras till robust självförnyande iAT2s, vilket ger patientspecifika celler för biomedicinsk forskning, inklusive grundläggande biomedicinska forskningsutvecklingsstudier, sjukdomsmodellering, cellbaserade terapier eller läkemedelsskärmar. Det nuvarande protokollet beskriver en metod för att dissociera iAT2s till en encellssuspension, som sedan kan ompläteras i 3D Matrigel för att generera alveolosfärer för cellexpansion eller ompläteras i 2D ALI-odling för ytterligare experiment.
Protokollet har flera kritiska steg för att säkerställa framgångsrik passaging och omplating i både 3D- och ALI-kulturer. Mekanisk trituration måste minimeras, eftersom överdriven pipettering kan minska cellviabiliteten. Dessutom är sådddensiteten hos iAT2s i både 3D- och 2D ALI-kulturer kritisk; för 3D-odling är i allmänhet 400 celler/μl 3D Matrigel optimalt för de flesta iPSC-linjer. En rad densiteter från 100-500 celler/μl har dock tidvis varit framgångsrika, och optimering av densiteten kan krävas för olika cellinjer. För ALI-odling är det också viktigt att optimera sådddensiteten hos iAT2s på cellodlingsinsatserna för att uppnå ett sammanflytande monolager av celler 48 timmar efter sådd (dvs. på dagen för luftlyft). Vissa iAT2-linjer kräver fler celler per inlägg; Därför, om felsökning krävs, rekommenderas ett intervall från 160 000-300 000 celler / insats för cellodlingsinsatser med 24 brunnar. 3D-kulturer kan också skalas till 24- och 48-brunnsplattor genom att bibehålla sådddensiteten vid 400 celler / μL 3D-matris och minska matrisdroppsstorleken till 25 μL respektive 20 μL. ALI-kulturer kan skalas till 96-brunns cellodlingsinsatser genom att belägga varje insats med 30 μL av matrisen, plätera 80 000 celler i 30 μL per insats och mata med 150 μL basolaterala medier per brunn. Sådddensitet och matris- och medievolymer måste skalas och optimeras i enlighet därmed för andra plattformat.
En begränsning med detta protokoll är att cellerna som används för ALI-plätering måste renas tillräckligt för att vara NKX2-1+ och SFTPC + 19,20,21,23 för att bilda iAT2 AMI, och ALI-odlingsbildning kan variera från linje till linje. Dessutom tillåter detta protokoll expansion och generering av endast AT2-kulturer, vilket ger ett reduktionistiskt modellsystem baserat på en enda nyckel alveolär celltyp. Viktigt är att andra relevanta alveolära celltyper, såsom alveolära typ 1-celler, saknades från dessa plattformar. Andra grupper har haft framgång med att odla primära mänskliga AT2s som sfäroider eller organotypiska kulturer med eller utan fibroblaster 1,14,15,16,17; emellertid tenderar primära mänskliga AT2: er att förlora sitt uttryck av viktiga ytaktiva ämnen när de odlas i normal 2D-kultur utan ALI-tillstånd26. Dessutom har nyligen utfört arbete visat att iAT2s uttrycker högre proliferativa markörer och lägre AT2-mognadsmarkörer än färska, okulturerade mänskliga primära AT2s27. Trots dessa skillnader mellan iAT2s och färska primära mänskliga AT2s fann vi att även odlade primära AT2s visade transkriptomiska skillnader från färska, okulturerade primära AT2s27, och drar därmed slutsatsen att dessa in vitro-modeller har olika styrkor och begränsningar för modellering in vivo lungbiologi.
iAT2-plattformen kan användas för att studera genetiska mutationer från patient-härledda iPSCs19,20. Systemet skulle också kunna skalas upp avsevärt för att tillgodose läkemedelsscreening med hög kapacitet. Dessutom är iAT2 AMI lämpliga för miljöexponeringar som virus- eller bakterieinfektion eller exponering för cigarettrök, e-cigarettånga eller andra aerosoler23. Sammanfattningsvis möjliggör detta protokoll för att generera både 3D- och 2D ALI-kulturer av iAT2s långsiktig odling av en sjukdomsrelevant celltyp och ger en fysiologisk, skalbar plattform som möjliggör användning av dessa celler i många applikationer.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar uppriktigt medlemmar i Wilson- Kotton- och Hawkins-laboratorierna för deras hjälpsamma diskussioner. Vi är också mycket tacksamma mot Greg Miller (CReM Laboratory Manager) och Marianne James (iPSC Core Manager) för deras ovärderliga stöd. Vi tackar Brian Tilton och BUMC Flow Cytometry Core för deras tekniska hjälp med cellsortering (stöds av NIH-bidrag #1S10OD021587-01A1). Detta arbete stöddes av ett CJ Martin Early Career Fellowship från Australian National Health and Medical Research Council som tilldelades RBW; NIH-bidrag F30HL147426 till KMA; ett I.M. Rosenzweig Junior Investigator Award från The Pulmonary Fibrosis Foundation och ett Integrated Pilot Grant Award genom Boston University Clinical &Translational Science Institute (1UL1TR001430) till KDA; Swiss National Science Foundation (P2ELP3_191217) till ABA; NIH beviljar U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 och R01HL095993 till DNK; och NIH-bidrag U01TR001810, R01DK101510 och R01DK117940 som tilldelats AAW; iPSC-underhåll, bankverksamhet och delning stöds av NIH-bidrag NO1 75N92020C00005. Bild 1 skapades med hjälp av Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | For CKDCI |
| 12 Well Cell Culture Plate | Corning | 3513 | Plates for culturing |
| 1-Thioglycerol (MTG) | M6145 | Sigma | For CKDCI |
| 2D Matrigel (matrix) - Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 8774552 | To coat ALI Transwells |
| 3D Matrigel (matrix) - Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 356230 | To grow iAT2 spheres in |
| 8-bromoadenosine 30,50-cyclic monophosphate sodium salt (cAMP) | Sigma | B7880 | For CKDCI |
| Ascorbic Acid | A4544 | Sigma | For CKDCI |
| B27 w/out retinoic acid | Life Technologies | 12587-010 | For CKDCI |
| Bovine Serum Albumin (BSA) (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | For CKDCI |
| Calcein blue | Life Technologies | C1429 | For live/dead discrimination in flow cytometry |
| Calcein green | Life Technologies | C1430 | Optional visualisation of cells on cell culture insert |
| Cell culture inserts - Costar 6.5 mm Clear Transwells with 0.4 µm pore size | Millipore-Sigma | CLS3470-48EA | ALI transwells |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | For CKDCI |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | For CKDCI |
| Dispase (2 mg/mL) | Thermo Fisher | 354235 | To dissolve matrigel |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11995 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher | A4192002 | To wash |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190 | For flow cytometric analyses |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone charaterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | For CKDCI |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture (F12) | Cellgro | 10-080-CV | For CKDCI |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | For cell counting |
| Invivogen Primocin 1 G (50 mg/mL) | Fisher Scientific | NC9392943 | For CKDCI |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | For CKDCI |
| Millicell ERS-2 Voltohmeter | Millipore | MERS00002 | To measure trans-epithlial electrical resistance |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | For CKDCI |
| Recombinant human KGF | R&D Systems | 251-KG-010 | For CKDCI |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | For CKDCI |
| Trypan blue | Thermo Fisher | 15250061 | For cell count during passaging |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25-300-062 | To dissociate iAT2 spheres |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Add to cells after passaging |
References
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- Mason, R. J., Williams, M. C. Type II alveolar cell. Defender of the alveolus. American Review of Respiratory Disease. 115 (6), Pt 2 81-91 (1977).
- Nogee, L. M., et al. A mutation in the surfactant protein C gene associated with familial interstitial lung disease. New England Journal of Medicine. 344 (8), 573-579 (2001).
- Nogee, L. M., et al. A mutation in the surfactant protein B gene responsible for fatal neonatal respiratory disease in multiple kindreds. Journal of Clinical Investigation. 93 (4), 1860-1863 (1994).
- Shulenin, S., et al. ABCA3 gene mutations in newborns with fatal surfactant deficiency. New England Journal of Medicine. 350 (13), 1296-1303 (2004).
- Nureki, S. I., et al. Expression of mutant Sftpc in murine alveolar epithelia drives spontaneous lung fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 128 (9), 4008-4024 (2018).
- Katzen, J., et al. An SFTPC BRICHOS mutant links epithelial ER stress and spontaneous lung fibrosis. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (6), 126125 (2019).
- Mathis, C., et al. Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (7), 489-503 (2013).
- Purkayastha, A., et al. Direct exposure to SARS-CoV-2 and cigarette Smoke increases infection severity and alters the stem cell-derived airway repair response. Cell Stem Cell. 27 (6), 869-875 (2020).
- Matrosovich, M. N., Matrosovich, T. Y., Gray, T., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Human and avian influenza viruses target different cell types in cultures of human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (13), 4620-4624 (2004).
- Tollstadius, B. F., Silva, A. C. G. d, Pedralli, B. C. O., Valadares, M. C. Carbendazim induces death in alveolar epithelial cells: A comparison between submerged and at the air-liquid interface cell culture. Toxicology in Vitro. 58, 78-85 (2019).
- Winton, H. L., et al. Cell lines of pulmonary and non-pulmonary origin as tools to study the effects of house dust mite proteinases on the regulation of epithelial permeability. Clinical and Experimental Allergy. 28 (10), 1273-1285 (1998).
- Kanagaki, S., et al. Hydroxypropyl cyclodextrin improves amiodarone-induced aberrant lipid homeostasis of alveolar cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 64 (4), 504-514 (2021).
- Sucre, J. M. S., et al. Successful establishment of primary type 2 alveolar epithelium with 3D organotypic co-culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 158-166 (2018).
- Kobayashi, Y., et al. Persistence of a regeneration-associated, transitional alveolar epithelial cell state in pulmonary fibrosis. Nature Cell Biology. 22, 934-946 (2020).
- Choi, J., et al. Inflammatory signals induce AT2 cell-derived damage-associated transient progenitors that mediate alveolar regeneration. Cell Stem Cell. 27 (3), 366-382 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Katsura, H., et al. Human lung stem cell-based alveolospheres provide insights into SARS-CoV-2-mediated interferon responses and pneumocyte dysfunction. Cell Stem Cell. 27 (6), 890-904 (2020).
- Jacob, A., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional lung alveolar epithelial cells. Cell Stem Cell. 21 (4), 472-488 (2017).
- Alysandratos, K. -D., et al. Patient-specific iPSCs carrying an SFTPC mutation reveal the intrinsic alveolar epithelial dysfunction at the inception of interstitial lung disease. Cell Reports. 36 (9), 109636 (2021).
- Hurley, K., et al. Reconstructed single-cell fate trajectories define lineage plasticity windows during differentiation of human PSC-derived distal lung progenitors. Cell Stem Cell. 26 (4), 593-608 (2020).
- Sun, Y. L., et al. Heterogeneity in human iPSC-derived alveolar epithelial type II cells revealed with ABCA3/SFTPC reporters. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 65 (4), 442-460 (2021).
- Abo, K. M., et al. Human pluripotent stem cell-derived alveolar type 2 cells mature and respond to environmental exposures in air-liquid interface culture. Journal of Clinical Investigation Insight. 7 (6), (2022).
- Huang, J., et al. SARS-CoV-2 infection of pluripotent stem cell-derived human lung alveolar type 2 cells elicits a rapid epithelial-intrinsic inflammatory response. Cell Stem Cell. 27 (6), 962-973 (2020).
- Jacob, A., et al. Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (12), 3303-3332 (2019).
- Beers, M. F., Moodley, Y. When is an alveolar type 2 cell an alveolar type 2 cell? A conundrum for lung stem cell biology and regenerative medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 18-27 (2017).
- Alysandratos, K. D., et al. Impact of cell culture on the transcriptomic programs of primary and iPSC-derived human alveolar type 2 cells. bioRxiv. , (2022).
