Summary
Het huidige protocol beschrijft de generatie van Drosophila melanogaster die eNpHR2.0 of ReaChR-opsinen in het hart tot expressie brengt voor OCT-beeldvorming en optogenetische hartpacing. Gedetailleerde instructies voor Drosophila OCT beeldvorming en hartslagmodulatie, inclusief de simulatie van herstelbare hartstilstand, bradycardie en tachycardie bij levende dieren in verschillende ontwikkelingsstadia, worden gerapporteerd.
Abstract
Het gebruik van Drosophila melanogaster (fruitvlieg) als modelorganisme heeft gezorgd voor aanzienlijke vooruitgang op vele gebieden van de biologische wetenschap, van cellulaire organisatie en genomisch onderzoek tot gedragsstudies. Vanwege de verzamelde wetenschappelijke kennis werd Drosophila de afgelopen jaren op het gebied van het modelleren van menselijke ziekten, waaronder hartaandoeningen, gebracht. Het gepresenteerde werk beschrijft het experimentele systeem voor het monitoren en manipuleren van de hartfunctie in de context van een heel levend organisme met behulp van rood licht (617 nm) en zonder invasieve procedures. Controle over het hart werd bereikt met behulp van optogenetische hulpmiddelen. Optogenetica combineert de expressie van lichtgevoelige transgene opsins en hun optische activering om het biologische weefsel van belang te reguleren. In dit werk werd een op maat gemaakt geïntegreerd optisch coherentietomografie (OCT) beeldvormings- en optogenetisch stimulatiesysteem gebruikt om het functionerende D. melanogaster-hart te visualiseren en te moduleren in de 3e instar larvale en vroege popontwikkelingsstadia. Het UAS/GAL4 duale genetische systeem werd gebruikt om halorhodopsine (eNpHR2.0) en rood verschoven kanaalrhodopsine (ReaChR) tot expressie te brengen, met name in het vlieghart. Details over het voorbereiden van D. melanogaster voor live OCT-beeldvorming en optogenetische pacing worden verstrekt. Een in het laboratorium ontwikkelde integratiesoftware verwerkte de beeldvormingsgegevens om visuele presentaties en kwantitatieve kenmerken van de Drosophila-hartfunctie te creëren. De resultaten tonen de haalbaarheid aan van het initiëren van een hartstilstand en bradycardie veroorzaakt door eNpHR2.0-activering en het uitvoeren van hartpacing bij ReaChR-activering.
Introduction
Eind 2010 selecteerde het tijdschrift Nature Methods optogenetica als methode van het jaar1. Het gebruik van genetische hulpmiddelen (transgene opsins) gereguleerd door licht om biologische weefsels van belang met ongekende precisie en snelheid te controleren, opende een vloedpoort voor nieuwe toepassingen. Tot op heden behoren de meeste prestaties tot de neurowetenschappen. De technologie werd geïntroduceerd als een nieuwe methode voor nauwkeurige controle van enkele neuronen2 en is gevorderd tot ontdekkingen op het gebied van cognitieve functies van levende organismen3. Vanaf het begin toonden neurowetenschappers het vermogen aan om het gedrag van het hele organisme te moduleren. Expressie en lichtactivering van ChR2-opsine in dopaminerge neuronen van muizen veroorzaakten hun activering en waren voldoende om gedragsconditionering te stimuleren4. Optogenetische remming van een subset van neuronen die halorhodopsine NpHR2.0 bevatten en die aan de epileptische focus van de knaagdierhersenen werd afgeleverd, resulteerde in verzwakking van elektro-encefalografische aanvallen5.
Optogenetische toepassingen in de cardiologie ontwikkelen zich in een gestaag tempo6. ChR2 werd met succes tot expressie gebracht in de celkweek van cardiomyocyten en in muizen; hartpacing werd uitgevoerd door flitsen van blauw licht (uitgevoerd met behulp van een geïmplanteerde vezel bij levende dieren)7. Bij zebravissen werd ChR2 uitgedrukt en gebruikt om het tempomakende hartgebied te identificeren; NpHR-activering veroorzaakte hartstilstand8. Optogenetische cardiale pacing heeft het unieke potentieel voor het ontwikkelen van nieuwe pacing- en resynchronisatietherapieën9. Pogingen om een autogeen aritmie-beëindigingssysteem op te zetten zijn onlangs ook gemeld10.
Uitgebreid onderzoek en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische behandelingen vereisen de toepassing van verschillende modelsystemen, van celkweek tot zoogdieren. Het hart van een gewerveld dier is een zeer complex orgaan. Cardiomyocyten (CM) omvatten een derde van alle hartcellen; andere cellen omvatten neuronen, vasculaire gladde spiercellen en niet-exciteerbare cellen (d.w.z. endotheelcellen, fibroblasten en immuuncellen). Onderzoek naar CM-celcultuur beperkt de vertaling van de verkregen resultaten naar menselijke medische toepassingen. De genetische manipulaties van zoogdiermodelorganismen zijn beperkt en tijdrovend. Kleinere ongewervelde modellen hebben veel voordelen; hun cardiovasculaire systeem draagt alle essentiële histologische elementen. Drosophila melanogaster (fruitvlieg) is een eenvoudig en krachtig genetisch modelsysteem om de rol van genen geassocieerd met menselijke ziekten, waaronder hartaandoeningen, te onderzoeken 11,12,13. Als kortlevende dieren vormen fruitvliegjes een uitstekende gelegenheid om leeftijds- of ziekteafhankelijke hartfunctieveranderingen te modelleren die gedurende het hele leven kunnen worden getraceerd 14,15,16,17. De hartbuis van de fruitvlieg bevindt zich aan de dorsale kant van zijn lichaam binnen 200 μm van het nagelriemoppervlak, waardoor zichtbaar voor nabij-infrarood licht de hartbuis kan bereiken. Deze anatomische functie maakt niet-invasieve optische pacing van het Drosophila-hart mogelijk met behulp van bestaande optogenetische hulpmiddelen.
Om het Drosophila-hart te monitoren, werd een aangepast spectraal-domein optische coherentietomografie (SD-OCT) beeldvormingssysteem met een geïntegreerde roodlicht LED-excitatiemodule ontwikkeld18. Morfologische en ritmische veranderingen in een relatief eenvoudig fruitvlieghart kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd met deze niet-invasieve biomedische beeldvormingstechnologie 12,19,20,21. Met verbeterde optische sectieprestaties en ruimtelijke resolutie op micronschaal is OCT met succes gebruikt om de structuur te onderzoeken en de functie van het Drosophila-hart in verschillende ontwikkelingsstadia te bewaken, waaronder de 3e instar-larve en vroege pop18. Dit systeem maakt ook gelijktijdige monitoring en stimulatie van de hartaandoening van de Drosophila bij het intacte dier mogelijk. Een schematische weergave van het OCT-systeem is weergegeven in figuur 1. Het SD-OCT systeem gebruikt een superluminescente diode (SLD) als lichtbron (middengolflengte: 850 nm ± 10 nm, FWHM: 165 nm, zie Materiaaltabel). Met behulp van een 10x objectief kan het OCT-beeldvormingssysteem een axiale resolutie bereiken van ~ 4,4 μm in lucht en ~ 3,3 μm in weefsel en een laterale resolutie van ~ 2,8 μm, voldoende om fijne details van de vlieghartstructuren op te lossen18,22. Interferentiesignalen van gereflecteerd licht van de referentiearm en de monsterarm worden gedetecteerd met behulp van een spectrometer met een 2048-pixel lijnscancamera (maximale lijnsnelheid: 80 kHz, zie Materiaaltabel). De gemeten systeemgevoeligheid van ~95,1 dB. Elke B-mode OCT-scan genereert een cross-sectionele afbeelding in het xz-afbeeldingsvlak. Herhaalde B-mode beelden worden op dezelfde locatie verkregen om M-mode beelden te maken die het kloppende hart vastleggen voor meer dan ~30 s 18,22,23. De framesnelheid voor M-mode beeldvorming is ~ 125 frames / s, voldoende om de hartslagdynamiek van de fruitvlieg vast te leggen.
Voor de optogenetische regulatie van de Drosophila-hartfunctie is een verlichtingsmodule met een 617 nm LED-lichtbron geïntegreerd met de monsterarm van het SD-OCT-systeem. Het stimulatielicht wordt gericht op een plek met een diameter van ~ 2,2 mm op het oppervlak van het monster, op dezelfde positie als de beeldfocusplek. Een op maat geschreven software wordt gebruikt om de verlichtingsmodus (lichtintensiteit, pulsbreedte en duty cycle) te regelen, de frequentie van de lichtpulsstimulatie aan te passen en de LED-moduleverlichting en M-mode OCT-beeldvormingsacquisitie22 te synchroniseren.
Recente publicaties beschreven het Drosophila transgene systeem bestaande uit spatiotemporaal gereguleerde ChR2, ReaChR en eNpHR2.0 opsins met behulp van het UAS / GAL4 genetische systeem. De verkregen resultaten hebben het vermogen aangetoond om hartstilstand en bradycardie veroorzaakt door roodlichtactivering van eNpHR2.0 en hartpacing met een hogere frequentie veroorzaakt door activering van ChR2 door blauw licht te initiëren. Vergelijkbare pacing-experimenten werden uitgevoerd met een ander kanaalrhodopsine, ReaChR, induceerbaar door roodlichtverlichting 22,23,24. De opsine-expressie in alle beschreven experimenten werd aangedreven door 24B-GAL4, waarbij opsine-expressie werd waargenomen in een breed scala van weefsels, waaronder cardiomyocyten en omliggende spiercellen. In de huidige studie werd 24B-GAL4 vervangen door een Hand-GAL4 driver om hartspecifieke eNpHR2.0 en ReaChR opsins expressie te bereiken.
Over het algemeen tonen de gepresenteerde experimentele resultaten herstelbare hartstilstand en induceerbare bradycardie en tachycardie hartaandoeningen. Een gedetailleerd protocol met stapsgewijze instructies voor het maken van transgene Drosophila-modellen en het uitvoeren van gelijktijdige OCT-beeldvorming en optogenetische pacing-experimenten bij levende dieren wordt verstrekt.
Protocol
Voor de huidige studie, eNpHR2.0 transgene lijn w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2, ReaChR transgene lijn w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO, en hartspecifieke GAL4 driver met Hand gen regulerend fragment w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] (deze driver stock wordt aangeduid als Hand-GAL4) werden gebruikt. y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 werd gebruikt als de GFP reporter lijn. De genoemde Drosophila-voorraden werden verkregen uit het Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, zie Materiaaltabel) en op standaard maïsmeelmedia bij kamertemperatuur of bij 18 °C gehouden. De Drosophila-modellen die in deze studie zijn ontwikkeld, zijn op aanvraag beschikbaar voor samenwerking.
1. Drosophila genetische kruisingen en mediavoorbereiding
- Verander de 3e chromosoom balancer TM3 Sb[1] in TM6 Sb Tb, waardoor w[1118] ontstaat; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb (Hand-GAL4/TM6 Sb Tb). Zie aanvullend figuur 1 voor het oversteekschema. Zet kruisjes in injectieflacons met gewone maïsmeelmedia.
OPMERKING: De aanwezigheid van een Tb-marker stelt gebruikers in staat om larven en poppen met opsinetransgen en de GAL4-driver te onderscheiden van dieren die opsine bevatten, maar geen driver25. - Bewaar de genetische kruisingen in een 25 °C, 70% vochtigheidsincubator op speciaal geformuleerde all-trans retinaI (ATR)-bevattende media (zie Materiaaltabel) gedurende 5 dagen in het donker voor het verzamelen van larven en 6 dagen voor het verzamelen van poppen.
- Combineer vijf Hand-GAL4 /TM6 Sb Tb maagdelijke vrouwtjes en twee tot drie mannetjes uit UAS-opsinevoorraden (eNpHR2.0, of ReaChR) per injectieflacon. Zie het kruisdiagram voor eNpHR2.0 en ReaChR opsin in respectievelijk figuur 2A en figuur 2B.
- Bereid de volgende dag ATR-bevattende mediaflacons voor.
- Bereid semi-gedefinieerd voedsel volgens de instructies van BDSC26. Voeg in plaats van sucrose en glucose alleen sucrose (5,14 g/100 ml) toe. Koel af tot ~60 °C met constant roeren.
- Bereid smalle injectieflacons en voeg 50 μL 100 mM ATR-ethanoloplossing toe aan elke injectieflacon.
- Gebruik een serologische pipet om vliegenvoer naar smalle vliegenflacons te brengen, 5 ml per injectieflacon. Vortex op maximale snelheid gedurende 10 s.
- Sluit de injectieflacons aan en wikkel ze in de donkere stof om ze tegen licht te beschermen. Laat de injectieflacons minstens 12 uur drogen ('s nachts).
- Breng de volgende dag de vliegen gestaag over en leg eieren vanaf stap 1.3. naar de injectieflacons met ATR-bevattend voedsel (stap 1.4.4.). Bescherm de rekken met injectieflacons tegen licht.
- Gooi na 24-48 uur (afhankelijk van het aantal gelegde eieren) de ouders weg om overbevolking van de injectieflacon te voorkomen.
- Verzamel niet-Tb-nakomelingen en gebruik ze voor beeldvorming van het hart.
OPMERKING: De fenotypische verschillen in de larvale en popstadia worden aangetoond in figuur 2C. De samenvatting en de geschatte tijdlijn van de voorbereidingsstappen van het specimen zijn weergegeven in figuur 3.
2. Optogenetische controle van het Drosophila hart
- Kies UAS-opsin/Hand-GAL4 larve/pop uit de injectieflacon (stap 1.7.), breng het weefsel aan en veeg de media voorzichtig van het lichaamsoppervlak af met een verfkwast.
- Bereid de microscoopglaasje voor en plaats een klein stukje dubbelzijdige tape in het midden.
- Plaats met een kwast of een fijn pincet de larve/pop voorzichtig op het tapeoppervlak met de dorsale kant naar boven en loodrecht op de lange zijde van de glijbaan. Oefen zachte druk uit om de larve/pop aan het tapeoppervlak te bevestigen.
- Stel de dia in op het beeldvormingsstadium, larve / pop naar beneden gericht.
- Schakel de OCT-lichtbron in via laserbesturingssoftware (zie Materiaaltabel). Open de op maat geschreven SD-OCT-besturingssoftware en klik vervolgens op het voorbeeldvenster .
- Stel de scanparameters in de SD-OCT-software in.
OPMERKING: Het doel is om het monster uit te lijnen voor een optimale beeldvorming van het kloppende hart, dus het selecteren van het X-bereik en het Y-bereik bestrijkt het hartgebied. Bij deze stap is zowel het aantal A-scans als B-scans 400. Het bereik in de x- en y-richting is ~ 490 μm en ~ 537 μm, met respectievelijk de twee orthogonale doorsneden van het hart (xz en yz). - Gebruik micromanipulators om de monsterfase te regelen om het vliegenhart in beeld te brengen. Pas de brandpuntspositie aan om de lichtreflectie van het oppervlak van de vliegenriem te minimaliseren. Overweeg het aanbrengen van minerale olie op het oppervlak van de larve / pop om reflectie te minimaliseren.
OPMERKING: Olie kan het risico op verplaatsing van dieren verhogen door de kleefeigenschappen van de tape in gevaar te brengen. - Zorg ervoor dat het vliegenhart volledig kan worden bekeken in het beeldvenster zonder vervormingen, geblokkeerd door weefsel en niet-verwaarloosbare schaduwen en reflecties; Ga anders terug naar stap 2.7.
- Stel de scanparameters in voor M-mode OCT-afbeeldingsacquisitie.
OPMERKING: Het aantal A-scans is verminderd in vergelijking met stap 2.7. voor de snellere framerate om de kloppende dynamiek van het vliegenhart (enkele Hz) vast te leggen. Het aantal B-scans geeft het aantal herhaalde frames aan voor M-mode imaging, dat kan worden aangepast op basis van de opnametijd en het beschikbare systeemgeheugen. In dit experiment kunnen 128 A-scans een snelheid van ~ 125 frames / s toestaan en worden 4.000 herhaalde B-scans opgenomen, wat een continue opname van ~ 32 s oplevert. - Verkrijg vijf sets controlegegevens zonder roodlichtstimulatiepulsen om de rusthartslag (RHR) te berekenen.
- Ontwerp de lichtpuls voor de pacingstimulatie in de aangepaste OCT-besturingssoftware. Voeg in "Instellingen" de ontworpen lichtpulssequenties toe om de pulsfrequentie, pulsbreedte, stimulatieduur en wachttijd te regelen volgens verschillende stimulatieprotocollen.
OPMERKING: De RHR wordt gemeten vanuit het controle-experiment zonder lichtverlichting en gebruikt om de frequentie te berekenen waarmee licht moet worden gepulseerd voor tachypacing- en bradypacing-experimenten22. - Open de lichtregelaarsoftware (zie Materiaaltabel) om roodlichtpulsen te genereren. Kies de pulsmodus in "Modusselectie". Dubbelklik op de afbeelding voor de instellingen van "Pulse Profile" en kies Follower Mode. Houd de UIT-intensiteit op 0 en stel het AAN-intensiteitspercentage in bij het berekenen van de werkelijke vermogensdichtheid.
OPMERKING: Stimulatielichtpulsen worden geactiveerd door een signaal van de OCT-besturingssoftware volgens de instellingen in stap 2.12. - Verkrijg M-mode video's van het kloppende Drosophila-hart met lichtstimulatie door te klikken op Verwerven in de OCT-besturingssoftware. Herhaal de metingen 5x.
3. Beeldanalyse
- Open de op maat ontwikkelde vlieghartsegmentatiesoftware.
- Klik op Bestand selecteren en selecteer vervolgens het bestand dat moet worden geanalyseerd in de GUI die verschijnt.
- Voer zowel de verticale als de horizontale grenzen van het hartgebied in pixels in de bovenste tekstvakken in. Klik op Formaat wijzigen. Zorg er met behulp van de schuifregelaar aan de onderkant voor dat het hele hartgebied zichtbaar is en dat het de hele doos voor de hele verzameling vult. Als dit niet het geval is, herhaalt u dit proces en past u de grenzen aan.
- Klik op Voorspellen om het hartgebied te voorspellen. Het programma zal nu elk segment in de collectie doornemen en het hartgebied selecteren, wat ongeveer 3 minuten duurt.
- Klik op HR Plot zodra de voorspelling is voltooid. Dit opent een nieuw venster met een plot van het hartgebied in de loop van de tijd. Zorg ervoor dat de juiste piek- of dalgebieden zijn geselecteerd. Kies Pulse en vervolgens HR om een eindcijfer te genereren en de functionele parameters worden tegelijkertijd opgeslagen in de .csv bestanden.
Representative Results
D. melanogaster-dieren die roodlichtgevoelige opsins eNpHR2.0 of ReaChR in de hartbuis tot expressie brachten, werden gegenereerd door nakomelingen te verkrijgen uit het kruisen tussen elke UAS-opsine transgene lijn en Hand-GAL4-driver . De weefselspecificiteit van de GAL4-driver werd geverifieerd door GFP-expressie in beeld te brengen (figuur 4). Drosophila 3e instarlarve en vroege ontwikkelingsstadia van de pop werden gebruikt om de effecten van eNpHR2.0 en ReaChR-activering door rood licht aan te tonen. Ontworpen ~ 617 nm roodlichtpulsen, geleverd door LED, verlichtten de larve / pop en activeerden de eNpHR2.0 en ReaChR in het hart. Hoewel de gerapporteerde maximale responsgolflengte van NpHR ~ 580 nm is en van ReaChR ~ 600 nm, kan 617 nm lichtverlichting dieper doordringen met verbeterde lichtenergielevering naar het opsine-expresserende hartweefsel22.
Gemonteerd op de microscoopglaas met de dorsale kant naar beneden in de omgekeerde microscoopopopstelling, werd de larve / pop verlicht door een LED-lichtstraal gericht op het A7-lichaamssegment. Voorbeelden van de lichaamsdoorsnedebeelden zijn weergegeven in figuur 5A en figuur 6A. Het hart verschijnt als een samentrekkende en verwijdende cirkelvorm in de video-opnames bestaande uit 4.000 frames (Aanvullende video's 1-6). Om verschillende hartaandoeningen na te bootsen, werden vier soorten lichtpulsen ontworpen. Een enkele puls van 10 s na 5 s wachttijd genereerde herstelbare hartstilstand geïnduceerd door eNpHR2.0, zoals weergegeven in figuur 5B. Voor de hartslagpacing op frequenties die langzamer zijn dan de rusthartslag (RHR), gemedieerd door eNpHR2.0, werden twee lichtpulssequenties gebruikt met pacingfrequenties gelijk aan RHR/2 en RHR/4 van 8 s met een wachttijd van 6 s ertussen (figuur 5C). De duty cycle van elke lichtpulssequentie was 90%. Dit lichtstimulatieregime veroorzaakte een hartaandoening die doet denken aan bradycardie. Het stimulatiepatroon om de hartslag te verhogen als gevolg van ReaChR-activering bestond uit drie reeksen lichtpulsen op frequenties van respectievelijk RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz en RHR + 1,5 Hz, met een pulsbreedte van 20 ms (figuur 5D). Dit polsregime was gericht op het veroorzaken van een tachycardische hartaandoening. De lichtvermogensdichtheid was 7,49 mW/mm2 tijdens alle experimenten. Voor besturingsexperimenten werd geen lichtverlichting ingesteld.
Elke experimentele variant werd vijf keer geregistreerd. M-mode video's van het vliegenhart werden verwerkt tot 2D-maskers met behulp van FlyNet 2.027. Deze software segmenteert automatisch het hartgebied om de cardiale functiegegevenssets te produceren. Het programma biedt een masker van het hart in elk frame, dat indien nodig handmatig verder kan worden gecorrigeerd om een nauwkeurige kwantificering van de functionele parameters van het kloppende hart te genereren, zoals hartslag (HR), einddiastolische dimensie (EDD) en eind-systolische dimensie (ESD), fractionele verkorting (FR), einddiastolisch gebied (EDA), eind-systolisch gebied (ESA), enz. De hartslag wordt gemeten door het hartgebied in de loop van de tijd te analyseren. De controlevideo zonder lichtpulsen wordt gebruikt om een basishartslag (bijv. RHR) voor elk dier vast te stellen.
Figuur 5B en figuur 6B tonen 10 s lange hartstilstand veroorzaakt door hand>eNpHR2.0 activering met rood licht (617 nm) in respectievelijk larve en poppen. Toen het rode licht werd ingeschakeld, stopte het hart van de Drosophila met kloppen en bleef in deze toestand tot het einde van de lichtverlichting. De hartfunctie werd hersteld nadat het rode licht was uitgeschakeld. Dieren die geen opsin-expressie hadden ("geen opsin"-controle) reageerden niet op de roodlichtverlichting (aanvullende figuur 2A en aanvullende figuur 3A). De controle-experimenten met Hand>eNpHR2.0-dieren waarbij de 10 s rode lichtverlichting niet was ingeschakeld ("geen licht" -controle) toonden aan dat het hart normaal klopte (aanvullende figuur 4A en aanvullende figuur 4C).
Met behulp van Hand>eNpHR2.0-dieren werden roodlichtpulsen toegepast op frequenties lager dan de RHR. De hartcontractiefrequentie werd verlaagd na de lichtsignalen; deze langzamere hartslag bootst één type hartritmestoornis na, bradycardie (figuur 5C en figuur 6C voor respectievelijk larve en pop). De tragere hartpacing werd niet waargenomen in "no opsin" (aanvullende figuur 2B en aanvullende figuur 3B) en in "geen licht" (aanvullende figuur 4A en aanvullende figuur 4C) controle-experimenten.
Het verhogen van de hartslag kan worden bereikt door Hand>ReaChR opsin te activeren met roodlichtpulstreinen met een frequentie die hoger is dan de RHR van het betreffende dier. Een reeks van drie lichtpulstreinen met verschillende stimulatiefrequenties (bijv. RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz, RHR + 1,5 Hz) werden toegepast op Hand>ReaChR-larven en poppenharten. De verkregen gegevens tonen duidelijk een verhoogde hartslag na de lichtpulsen (figuur 5D en figuur 6D voor respectievelijk larve en pop). De hartaandoening die in deze experimenten wordt aangetoond, bootst tachycardie na. Negatieve controle-experimenten worden weergegeven in aanvullende figuur 2C, aanvullende figuur 3C en aanvullende figuur 4B, D.
Over het algemeen tonen de resultaten de haalbaarheid aan van niet-invasieve en specifieke optogenetische controle van het hartritme in verschillende ontwikkelingsstadia in transgene diermodellen van D. melanogaster.
Figuur 1: OCT-beeldvormingssysteem geïntegreerd met 617 nm LED-module voor optogenetische controle van de Drosophila-hartfunctie . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Genereren van D. melanogaster dieren die opsine in het hart tot expressie brengen. (A) Genetisch kruisdiagram. Vrouwtjes Hand-GAL4/TM6 SbTb werden gekruist aan mannetjes die eNpHR2.0 droegen. De resulterende Hand-GAL4/eNpHR2.0 nakomelingen (gemarkeerd door de rode ster) werden verzameld voor OCT-beeldvorming en Hand-GAL4/TM6 Sb Tb werden weggegooid op basis van hun fenotypische uiterlijk. (B) Genetisch kruisdiagram. Vrouwtjes Hand-GAL4/TM6 SbTb werden gekruist aan mannetjes die ReaChR droegen. De resulterende Hand-GAL4/ReaChR-nakomelingen (gemarkeerd door de rode ster) werden verzameld voor OCT-beeldvorming en Hand-GAL4/TM6 Sb Tb werden weggegooid op basis van hun fenotypische uiterlijk. (C) Fenotypische verschillen tussen Hand-GAL4/opsin (rode ster) en Hand-GAL4/TM6 Tb nakomelingen. Dieren met de Tb-genmutatie op het TM6-chromosoom hebben een "tubby" lichaamsvorm in vergelijking met normale, niet-Tb-larve of pop. Het linkerpaneel toont larven; het rechterpaneel toont vroege poppen. Afbeeldingen bevatten ook een liniaal met 1 mm markeringen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schematische presentatie en tijdlijn van de beeldvormingsvoorbereidingsprocedures. Ouderlijke voorraden worden bewaard in vliegenflessen; maagdelijke vrouwtjes en mannetjes worden gekruist in smalle flesjes gevuld met gewoon voedsel (aangegeven door gele kleur). Actief leggende vliegen worden overgebracht naar ATR-bevattende media (weergegeven in bruine) injectieflacons. Flesjes met zich ontwikkelende nakomelingen moeten vanaf deze stap in het donker worden gehouden. 3e instarlarven en vroege poppen worden verzameld uit de injectieflaconwanden voor beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: D. melanogaster vroege pop die UAS-GFP (BDSC 6658) tot expressie brengt, aangedreven door Hand-GAL4 (BDSC 48396). Het fluorescentiepatroon bevestigt de hartspecificiteit van de Hand-GAL4 driver . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Simulatie van hartstilstand, bradycardie en tachycardie bij D. melanogaster larve. (A) OCT-afbeelding van een larvale lichaamsdoorsnede. Het hart verschijnt als een cirkel onder het oppervlak van het lichaam. (B) Grafische weergave van de herstelbare hartstilstand. Het bovenste paneel toont de timing (X-as) van de roodlichtverlichting (Y-as, lichtbronvermogensniveaupercentage). Het middelste paneel geeft de verandering in hartgebied (Y-as, vierkante micrometer) in de loop van de tijd (X-as) aan. Het onderste paneel toont de hartslagverandering (Y-as, hertz) in de loop van de tijd (X-as). (C) Grafische presentatie van eNpHR2.0-gemedieerde herstelbare bradycardie. Het bovenste paneel toont pulsen van de roodlichtverlichting, waardoor twee perioden van bradycardie worden geïnduceerd: 50% van de RHR en 25% van de RHR. Veranderingen in het hartgebied en de hartslag worden respectievelijk op het middelste en onderste paneel weergegeven. (D) Grafische weergave van de hartpacing door geactiveerde ReaChR. Het bovenste paneel toont een reeks roodlichtpulsen van 20 ms die optreden bij RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz en RHR + 1,5 Hz frequenties. De hartcontracties volgen de lichtpulsfrequenties, zoals te zien is op het midden- en onderste paneel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Simulatie van hartstilstand, bradycardie en tachycardie bij D. melanogaster pop. (A) OCT-afbeelding van de doorsnede van het poplichaam. Het hart verschijnt als een cirkel onder het oppervlak van het lichaam. (B) Grafische weergave van de herstelbare hartstilstand. Het bovenste paneel toont de timing (X-as) van de roodlichtverlichting (Y-as, lichtbronvermogensniveaupercentage). Het middelste paneel geeft de verandering in hartgebied (Y-as, vierkante micrometer) in de loop van de tijd (X-as) aan. Het onderste paneel toont de hartslagverandering (Y-as, hertz) in de loop van de tijd (X-as). (C) Grafische presentatie van eNpHR2.0-gemedieerde herstelbare bradycardie. Het bovenste paneel toont pulsen van de roodlichtverlichting, waardoor twee perioden van bradycardie worden geïnduceerd: 50% van de RHR en 25% van de RHR. De middelste en onderste panelen tonen respectievelijk veranderingen in het hartgebied en de hartslag. (D) Grafische weergave van de hartpacing door geactiveerde ReaChR. Het bovenste paneel toont een reeks roodlichtpulsen van 20 ms bij RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz en RHR + 1,5 Hz frequenties. De hartcontracties volgen de frequenties van de lichtpuls, zoals te zien is op het midden- en onderste paneel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Genetische kruisingen om het TM3 Sb balancerchromosoom te vervangen door TM6 Sb Tb. Maagdelijke vrouwtjes Hand-GAL4 w+/ TM3 Sb werden gekruist met nub-GAL4NP3537 tub-GAL80ts w+/ TM6 Sb Tb mannetjes. Hand-GAL4 w+/ TM6 Sb Tb nakomelingen, waaronder maagdelijke vrouwtjes en mannetjes, werden geselecteerd (screening op gepigmenteerde ogen in combinatie met tubby body shape). Geselecteerde vliegen werden zelf gekruist om een stabiele voorraad te vestigen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: In controle-experimenten verandert het hartritme van de wild-type (wt) larve niet bij verlichting door rood licht. (A) Er werd geen hartstilstand waargenomen tijdens de roodlichtverlichting bij wt-larve. Het bovenste paneel toont de M-mode hartbeelden. De rode lijn geeft de verlichtingstijd aan. De middelste en onderste panelen tonen het hartgebied en de hartslag tijdens de beeldvormingstijd van 32 s. (B,C) Roodlichtpulsen veranderen de hartslag in wt-larven niet. De bovenste panelen tonen de M-mode hartbeelden. De rode lijn geeft de verlichtingstijd aan. De middelste en onderste panelen tonen het hartgebied en de hartslag tijdens de beeldvormingstijd van 32 s. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: In controle-experimenten verandert het hartritme van de wild-type (wt) pop niet bij verlichting door rood licht. (A) Er werd geen hartstilstand waargenomen tijdens de roodlichtverlichting bij wt-larve. Het bovenste paneel toont de M-mode hartbeelden. De rode lijn geeft de verlichtingstijd aan. De middelste en onderste panelen tonen het hartgebied en de hartslag tijdens de beeldvormingstijd van 32 s. (B,C) Roodlichtpulsen veranderen de hartslag in de wt-pop niet. De bovenste panelen tonen de M-mode hartbeelden. De rode lijn geeft de verlichtingstijd aan. De middelste en onderste panelen tonen het hartgebied en de hartslag tijdens de beeldvormingstijd van 32 s. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 4: D. melanogasterlarven en poppen die Hand>eNpHR2.0 of Hand>ReaChR tot expressie brengen, vertonen geen significante HR-veranderingen tijdens OCT-beeldvorming zonder roodlichtverlichting. (A) De hartslag van hand>enpHR2.0 larve. (B) De hartslag van hand>reachr larve. (C) De hartslag van hand>enpHR2.0 pop. (D) De hartslag van hand>reachr poppen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende video 1: Geactiveerde eNpHR2.0 veroorzaakt hartstilstand bij D. melanogaster larve. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video 2: Geactiveerde eNpHR2.0 veroorzaakt hartstilstand bij D. melanogaster pop. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video 3: eNpHR2.0-gemedieerde herstelbare bradycardie bij D. melanogaster larve. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video 4: eNpHR2.0-gemedieerde herstelbare bradycardie bij D. melanogaster pop. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video 5: Hartpacing door geactiveerde ReaChR bij D. melanogaster larve. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video 6: Hartpacing door geactiveerde ReaChR in D. melanogaster pop. Klik hier om deze video te downloaden.
Discussion
Vergeleken met onze eerdere rapporten waar de expressie van opsins niet alleen in het hart, maar ook in de omliggende spierweefsels werd aangedreven, rapporteert het huidige werk met behulp van een hartspecifieke driver, Hand-GAL4. Deze nieuwe Hand> opsine genetische configuratie die wordt gebruikt voor optogenetische hartregulatie bevestigt verder eerder gerapporteerde resultaten en stelt een beter Drosophila cardiovasculair onderzoeksmodel vast.
Mediavoorbereiding is essentieel voor het succes van de experimenten. Opsine-eiwitten hebben een ligand nodig, all-trans retinal (ATR), om te functioneren28. Vliegen produceren niet genoeg ATR, dus ATR moet worden aangevuld met de vliegmedia. In deze studie werd het eerder gerapporteerde instant voedsel vervangen door Semi-Defined media29. Het nieuwe recept van ATR-bevattende media werd geïntroduceerd om een uniforme verdeling van ATR te garanderen. ATR is niet oplosbaar in water; wanneer 100 mM ATR-voorraad op basis van ethanol wordt toegevoegd aan media op waterbasis, wordt deze gedispergeerd door de injectieflacons met warme semi-gedefinieerde media te vortexen. Ook werd de eerder gerapporteerde ATR-concentratie verlaagd van 10 mM voor eNpHR2.0 en 3 mM voor ReaChR22 tot een 1 mM eindconcentratie voor beide. Deze concentratie is voldoende om een goede eNpHR2.0- en ReaChR-functie te garanderen.
Een essentieel onderdeel van het experimentele succes is de verbeterde gegevensverwerking met FlyNet 2.027. Het lab is doorgegaan met het ontwikkelen van deze software om zowel de computationele efficiëntie als de nauwkeurigheid van het geautomatiseerde vlieghartsegmentatiealgoritme te verbeteren. De cross-sectionele maskers die door deze software worden geproduceerd, worden gebruikt om drosophila fysiologische gegevens af te leiden, zoals fractionele verkorting en hartwandsnelheid. Deze aanpak heeft efficiënte data-analyse mogelijk gemaakt met minimaal menselijk toezicht, waardoor het sneller en betrouwbaarder is geworden om de hartfunctie te karakteriseren voor grote datasets voor beeldvorming van vliegharten.
Myocardinfarct blijft de belangrijkste doodsoorzaak en myocardiale ischemie draagt bij aan tweederde van alle gevallen van hartfalen, wat snel opduikt als een van de belangrijkste oorzaken van mortaliteit en morbiditeit in de Verenigde Staten30. De ontwikkeling van nieuwe therapieën en medische hulpmiddelen vereist diepgaande kennis van de mechanismen van hartaandoeningen op fysiologisch en biochemisch niveau. Deze doelen kunnen worden bereikt met behulp van modelorganismen. D. melanogaster heeft zich gevestigd als een van de meest betrouwbare en efficiënte modellen 31,32,33,34,35. Dit werk heeft de gesimuleerde Drosophila-hartziektemodellen gegenereerd die worden geïnduceerd door een niet-invasieve optogenetische benadering. De ontwikkeling van niet-invasieve optische hartpacingtechnologieën biedt een basis voor het ontwikkelen van een alternatief voor traditionele elektrische hartpacing-apparaten. Door OCT te gebruiken om de hartfunctie in realtime te observeren, kunnen studies de relevante hartfysiologie nauwkeurig karakteriseren in Drosophila-modellen voor geavanceerde onderzoeken, waaronder screening van kandidaat-geneesmiddelen. OCT-beeldvorming heeft een penetratiediepte van ~ 1 mm, wat goed werkt voor Drosophila-hartstudies, maar het gebruik ervan beperkt om de hartfunctie in grotere diermodellen te karakteriseren. Bovendien is het direct vertalen van Drosophila-onderzoek naar zoogdiermodellen een uitdaging. Nieuwe optogenetische hulpmiddelen moeten worden ontwikkeld om de gevoeligheid van de opsins te verbeteren en ze te vertalen naar verschillende modelsystemen, waaronder zebravissen, muizen, ratten en menselijke hartorganoïden, voor cardiovasculair onderzoek.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Andrey Komarov, Yuxuan Wang en Jiantao Zhu voor hun hulp bij data-analyse en bedanken de Zhou-lableden voor hun waardevolle discussies. Het werk in het laboratorium van Dr. Zhou werd ondersteund door een start-upfonds van de Washington University in St. Louis, de National Institutes of Health (NIH) subsidies R01-EB025209 en R01-HL156265, en de Clayco Foundation Innovative Research Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| All-trans retinal | Cayman Chemicals | 18449 | |
| Bacto Peptone | Gibco | 02-10-2025 | |
| BioLED Light Source Control Module, 4-channel | Migtex Systems | BLS-SA04-US | Part of the optogenetic stimulation module |
| Broadband Light Source Module | Superlum | cBLMD-T-850-HP | Part of the SD-OCT imaging system |
| Cobra-S 800 OCT Spectrometers | Wasatch Photonics | CS800-840/180-80-OC2K-U3 | Part of the SD-OCT imaging system |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professtional | 34155 | tissues |
| Drosophila agar | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Drosophila culture bottles | Genesee Scientific | 32-131 | |
| FlyNet 2.0 Software | Z-Lab | Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab | |
| High-Power LED Collimator Sources | Migtex Systems | BLS-LCS-0617-03-22 | Part of the optogenetic stimulation module |
| Inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-106 | |
| Microscope slides | AmScope | BS-72P | |
| Narrow plugs for Drosophila culture | Genesee Scientific | 59-200 | |
| Narrow vials for Drosophila culture | Genesee Scientific | 32-116SB | |
| Permanent double-sided tape | Scotch | ||
| Plugs for Drosophila bottles | Genesee Scientific | 59-194 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386-1L | |
| SD-OCT control software | Z-Lab | Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab | |
| SD-OCT imaging and optogenetic pacing system | Z-Lab | Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM) | |
| Sucrose | Carolina | 89-2871 | |
| w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 41752 | eNpHR2.0 transgenic line |
| w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 53748 | ReaChR transgenic line |
| w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 48396 | Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment |
| y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock #6658 | GFP reporter line |
| Yeast extract | Lab Scientific bioKEMIX | 978-907-4243 |
References
- Nature Methods.
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Tsai, H. -C. Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning. Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).
- Wykes, R. C., et al. Optogenetic and potassium channel gene therapy in a rodent model of focal neocortical epilepsy. Science Translational Medicine. 4 (161), (2012).
- Entcheva, E., Kay, M. W. Cardiac optogenetics: a decade of enlightenment. Nature Reviews Cardiology. 18 (5), 349-367 (2021).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
- Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y. R., Baier, H., Huisken, J.
- Nussinovitch, U., Gepstein, L. Optogenetics for in vivo cardiac pacing and resynchronization therapies. Nature Biotechnology. 33 (7), 750-754 (2015).
- Nyns, E. C. A., et al. An automated hybrid bioelectronic system for autogenous restoration of sinus rhythm in atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (481), (2019).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342 (1), 1-11 (2004).
- Wolf, M. J., Amrein, H., Izatt, J. A., Choma, M. A., Reedy, M. C., Rockman, H. A. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (5), 1394-1399 (2006).
- Yu, L., Lee, T., Lin, N., Wolf, M. J. Affecting rhomboid-3 function causes a dilated heart in adult Drosophila. PLOS Genetics. 6 (5), 1000969 (2010).
- Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. Journal of Visualized Experiments. (33), e1596 (2009).
- Zhu, Y. C., Yocom, E., Sifers, J., Uradu, H., Cooper, R. L. Modulatory effects on Drosophila larva hearts: Room temperature, acute and chronic cold stress. Journal of Comparative Physiology. B, Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 186 (7), 829-841 (2016).
- Zhu, Y. C., Uradu, H., Majeed, Z. R., Cooper, R. L. Optogenetic stimulation of Drosophila heart rate at different temperatures and Ca2+ concentrations. Physiological Reports. 4 (3), 12695 (2016).
- Malloy, C., et al. Using optogenetics to assess neuroendocrine modulation of heart rate in Drosophila melanogaster larvae. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 203 (10), 791-806 (2017).
- Men, J., et al. Drosophila preparation and longitudinal imaging of heart function in vivo using optical coherence microscopy (OCM). Journal of Visualized Experiments. (118), e55002 (2016).
- Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), 35-36 (2006).
- Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Current Alzheimer Research. 8 (3), 313-322 (2011).
- Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3798-3806 (2013).
- Men, J., Li, A., Jerwick, J., Li, Z., Tanzi, R. E., Zhou, C. Non-invasive red-light optogenetic control of Drosophila cardiac function. Communications Biology. 3 (1), 1-10 (2020).
- Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C.
- Stanley, C. E., Mauss, A. S., Borst, A., Cooper, R. L. The effects of chloride flux on Drosophila heart rate. Methods and Protocols. 2 (3), 73 (2019).
- Lindsley, D. L., Zimm, G. G. The Genome of Drosophila melanogaster. , Elsevier. (1992).
- Bloomington Drosophila Stock Center. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/germanfood.html (2022).
- Dong, Z., et al. FlyNet 2.0: Drosophila heart 3D (2D + time) segmentation in optical coherence microscopy images using a convolutional long short-term memory neural network. Biomedical Optics Express. 11 (3), 1568-1579 (2020).
- Deisseroth, K.
- Backhaus, B., Sulkowski, E., Schlote, F. W. A semi-synthetic, general-purpose medium for Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 60, 210-212 (1984).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 139 (10), 56 (2019).
- Wolf, M. J., Rockman, H. A. Drosophila, genetic screens, and cardiac function. Circulation Research. 109 (7), 794-806 (2011).
- Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 411-420 (2011).
- Ocorr, K., Vogler, G., Bodmer, R. Methods to assess Drosophila heart development, function and aging. Methods [Supplement to Methods in Enzymology]. 68 (1), 265-272 (2014).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
- Rotstein, B., Paululat, A.
