Summary
본 프로토콜은 OCT 영상화 및 광유전학적 심장 페이싱을 위해 심장에서 eNpHR2.0 또는 ReaChR 옵신을 발현하는 초파리 멜라노가스터의 생성을 기술한다. 초파리 OCT 영상 및 심장 박동 조절에 대한 자세한 지침, 다른 발달 단계에서 살아있는 동물에서 회복 가능한 심장 마비, 서맥 및 빈맥의 시뮬레이션을 포함하여보고됩니다.
Abstract
초파리 멜라노가스트r(초파리)을 모델 유기체로 사용하여 세포 조직 및 게놈 조사에서 행동 연구에 이르기까지 생물 과학의 많은 분야에서 상당한 진전을 보장했습니다. 축적 된 과학 지식으로 인해 최근 몇 년 동안 초파리는 심장 질환을 포함한 인간 질병을 모델링하는 분야로 옮겨졌습니다. 제시된 연구는 침습적 인 절차없이 적색 광 (617 nm)을 사용하여 전체 살아있는 유기체의 맥락에서 심장 기능을 모니터링하고 조작하기위한 실험 시스템을 설명합니다. 심장에 대한 제어는 광유전학적 도구를 사용하여 달성되었다. 광유전학은 광-민감성 트랜스제닉 옵신의 발현과 이들의 광학적 활성화를 결합하여 관심있는 생물학적 조직을 조절한다. 이 연구에서는 맞춤형 통합 광학 간섭 단층 촬영 (OCT) 이미징 및 광유전 자극 시스템을 사용하여 3 번째 인스타 애벌레 및 초기 번데기 발달 단계에서 기능하는 D. melanogaster 심장을 시각화하고 변조했습니다. UAS/GAL4 이중 유전 시스템은 특히 파리 심장에서 할로로돕신(eNpHR2.0)과 적색 편이 채널로돕신(ReaChR)을 발현하기 위해 사용되었다. 살아있는 OCT 이미징 및 광유전학적 페이싱을 위한 D. melanogaster를 준비하는 것에 대한 세부사항이 제공된다. 실험실에서 개발한 통합 소프트웨어는 이미징 데이터를 처리하여 초파리 심장 기능의 시각적 프리젠테이션과 정량적 특성을 생성했습니다. 결과는 eNpHR2.0 활성화로 인한 심장 마비 및 서맥을 시작하고 ReaChR 활성화시 심장 박동을 수행 할 수있는 타당성을 보여줍니다.
Introduction
2010 년 말에 Nature Methods 저널은 광유전학을Year 1의 방법으로 선택했습니다. 빛에 의해 조절되는 유전자 도구(트랜스제닉 옵신)를 사용하여 관심 있는 생물학적 조직을 전례 없는 정밀도와 속도로 제어함으로써 새로운 응용을 위한 홍수 게이트가 열렸습니다. 현재까지 대부분의 업적은 신경 과학에 속합니다. 이 기술은 단일 뉴런2의 정밀한 조절을 위한 새로운 방법으로 도입되었으며, 살아있는 유기체 인지 기능3의 영역에서 발견으로 발전했다. 처음부터 신경 과학자들은 전체 유기체의 행동을 조절하는 능력을 보여주었습니다. 마우스 도파민성 뉴런에서 ChR2 옵신의 발현 및 광 활성화는 그들의 활성화를 야기하고 행동 컨디셔닝을 유도하기에 충분하였다4. 설치류 뇌의 간질 초점으로 전달된 할로로돕신 NpHR2.0을 함유하는 뉴런의 서브세트의 광유전학적 억제는 뇌전도 발작의 감쇠를 초래하였다5.
심장학에서의 광유전학적 응용은 꾸준한 속도로 발전하고 있다6. ChR2는 심근세포 세포 배양물 및 마우스에서 성공적으로 발현되었고; 심장 간격은 청색광의 섬광에 의해 수행되었다(살아있는 동물에 이식된 섬유를 사용하여 수행됨)7. 제브라피쉬에서, ChR2는 페이스-메이킹 심장 영역을 식별하기 위해 표현되고 사용되었다; NpHR 활성화는 심장 마비를 유도했다8. 광유전학적 심장 페이싱은 새로운 페이싱 및 재동기화 요법을 개발할 수 있는 독특한 잠재력을 가지고 있다9. 자생 부정맥 종결 시스템을 구축하려는 시도는 최근10 개뿐만 아니라보고되었습니다.
광범위한 연구와 새로운 치료 치료법의 개발은 세포 배양에서 포유류에 이르기까지 다양한 모델 시스템의 적용을 필요로합니다. 척추 동물의 심장은 매우 복잡한 기관입니다. 심근 세포 (CM)는 모든 심장 세포의 삼분의 일을 포함한다; 다른 세포는 뉴런, 혈관 평활근 세포, 및 비-흥분성 세포 (즉, 내피 세포, 섬유아세포, 및 면역 세포)를 포함한다. CM 세포 배양을 연구하는 것은 얻어진 결과의 번역을 인간 의료 응용에 제한한다. 포유류 모델 유기체의 유전자 조작은 제한적이고 시간이 많이 걸립니다. 더 작은 무척추 동물 모델에는 많은 장점이 있습니다. 그들의 심장 혈관 시스템은 모든 필수 조직 학적 요소를 운반합니다. 초파리 멜라노가스터(fruit fly)는 심장 질환11,12,13을 포함한 인간 질병과 관련된 유전자의 역할을 조사하는 간단하고 강력한 유전자 모델 시스템이다. 수명이 짧은 동물로서, 초파리는 일생 동안 추적 할 수있는 연령 또는 질병 의존적 인 심장 기능 변화를 모델링 할 수있는 훌륭한 기회를 나타냅니다14,15,16,17. 초파리의 심장 튜브는 큐티클 표면에서 200 μm 이내에 신체의 등쪽 측면에 위치하여 가시 광선에서 근적외선이 심장 튜브에 도달 할 수 있도록합니다. 이 해부학 적 특징은 기존의 광유전학 도구를 사용하여 초파리 심장의 비 침습적 광 페이싱을 가능하게합니다.
초파리 심장을 모니터링하기 위해, 적색광 LED 여기 모듈이 통합된 맞춤형 스펙트럼 도메인 광학 간섭 단층촬영(SD-OCT) 이미징 시스템이 개발되었다(18). 비교적 단순한 초파리 심장의 형태학적 및 리듬적 변화는 이러한 비침습적 생물의학 영상 기술(12,19,20,21)로 쉽게 분석될 수 있다. 향상된 광학 단면화 성능과 미크론 스케일 공간 분해능을 갖춘 OCT는 구조를 조사하고 3 번째 인스타 유충과 초기 번데기18을 포함한 다양한 발달 단계에서 초파리 심장의 기능을 모니터링하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 시스템은 또한 손상되지 않은 동물의 초파리 심장 상태를 동시에 모니터링하고 자극 할 수 있습니다. OCT 시스템의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. SD-OCT 시스템은 광원으로 초발광 다이오드(SLD)를 사용합니다(중심 파장: 850nm± 10nm, FWHM: 165nm, 재료 표 참조). 10x 대물 렌즈를 사용하여, OCT 이미징 시스템은 공기 중에서 ~4.4 μm, 조직에서 ~3.3 μm의 축방향 분해능 및 ~2.8 μm의 측방 분해능을 달성할 수 있으며, 이는 파리 심장 구조(18,22)의 미세한 디테일을 해결하기에 충분하다. 기준 암과 샘플 암으로부터의 반사광의 간섭 신호는 2048픽셀 라인 스캔 카메라가 장착된 분광계를 사용하여 검출된다(최대 라인 레이트: 80kHz, 재료 표 참조). 측정된 시스템 감도는 ~95.1dB입니다. 각 B 모드 OCT 스캔은 xz 이미지 평면에서 횡단면 이미지를 생성합니다. 반복되는 B 모드 이미지는 동일한 위치에서 획득되어 ~ 30 초이상 18,22,23 동안 박동하는 심장을 캡처하는 M 모드 이미지를 생성합니다. M 모드 이미징의 프레임 속도는 ~ 125 프레임 / 초이며 초파리의 심장 박동 역학을 포착하기에 충분합니다.
초파리 심장 기능의 광유전학적 조절을 위해, 617nm LED 광원을 가진 조명 모듈이 SD-OCT 시스템의 샘플 암과 통합된다. 자극광은 이미징 초점 스폿과 동일한 위치에서 시편 표면의 ~2.2mm 직경 스폿에 초점을 맞춥니다. 사용자 정의 서면 소프트웨어는 조명 모드(광도, 펄스 폭 및 듀티 사이클)를 제어하고, 광 펄스 자극 주파수를 조정하고, LED 모듈 조명과 M 모드 OCT 이미징 획득(22)을 동기화하는데 이용된다.
최근 간행물은 UAS/GAL4 유전자 시스템을 사용하여 시공간적으로 조절된 ChR2, ReaChR 및 eNpHR2.0 옵신으로 구성된 초파리 트랜스제닉 시스템을 기술하였다. 얻어진 결과는 eNpHR2.0의 적색광 활성화와 ChR2의 청색광 활성화로 인한 더 높은 주파수 심장 간격으로 인한 심정지 및 서맥을 개시하는 능력을 입증하였다. 유사한 페이싱 실험은 적색광 조명22,23,24에 의해 유도되는 또 다른 채널로돕신, ReaChR과 함께 수행되었다. 기술된 모든 실험에서 옵신 발현은 24B-GAL4에 의해 구동되었고, 여기서 옵신 발현은 심근세포 및 주변 근육 세포를 포함하는 광범위한 조직에서 관찰되었다. 현재 연구에서, 24B-GAL4는 심장 특이적 eNpHR2.0 및 ReaChR 옵신 발현을 달성하기 위해 Hand-GAL4 드라이버로 대체되었다.
전반적으로, 제시된 실험 결과는 회복 가능한 심장 마비 및 유도성 서맥 및 빈맥 심장 상태를 보여줍니다. 트랜스제닉 초파리 모델을 만들고 살아있는 동물에서 동시에 OCT 이미징 및 광유전학적 페이싱 실험을 수행하는 방법에 대한 단계별 지침이 포함된 상세한 프로토콜이 제공됩니다.
Protocol
본 연구를 위해, eNpHR2.0 트랜스제닉 라인 w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2, ReaChR 트랜스제닉 라인 w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO, 및 손 유전자 조절 단편 w[1118]을 포함하는 심장 특이적 GAL4 드라이버; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] (이 드라이버 스톡은 Hand-GAL4로 표시됨)가 사용되었다. y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 을 GFP 리포터 라인으로 사용하였다. 언급된 초 파리 스톡을 블루밍턴 초파리 스톡 센터(BDSC, Table of Materials)로부터 수득하고, 표준 콘밀 배지 상에서 실온 또는 18°C에서 유지하였다. 이 연구에서 개발 된 Drosophila 모델은 공동 작업 요청에 따라 사용할 수 있습니다.
1. 초파리 유전자 십자가 및 배지 준비
- 3 염색체 밸런서 TM3 Sb[1]를 TM6 Sb Tb로 변경하여 w[1118]을 생성; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb (Hand-GAL4/TM6 Sb Tb). 횡단 계획에 대한 보충 그림 1을 참조하십시오. 일반 옥수수 가루 배지가있는 바이알에 십자가를 놓으십시오.
참고 : Tb 마커의 존재는 사용자가 옵신 전이유전자를 함유 한 유충과 번데기와 GAL4 드라이버를 옵신을 함유하지만 드라이버25는 포함하지 않는 동물과 구별 할 수있게합니다. - 유전자 십자가를 특별히 제형화된 모든 트랜스 망막I(ATR) 함유 배지( 물질 표 참조) 상의 25°C, 70% 습도 인큐베이터에서 유충 수집을 위해 5일, 번데기 수집을 위해 6일 동안 어둠 속에서 보관한다.
- 바이알 당 다섯 명의 Hand-GAL4 / TM6 Sb Tb 처녀 암컷과 UAS-opsin 주식 (eNpHR2.0 또는 ReaChR)의 남성 2 ~ 세 명을 결합하십시오. eNpHR2.0 및 ReaChR 옵신에 대한 교차도를 각각 도 2A 및 도 2B에서 참조한다.
- 다음날 ATR 함유 미디어 바이알을 준비하십시오.
- BDSC26의 지시에 따라 반 정의 식품을 준비하십시오. 자당과 포도당 대신 자당 (5.14 g / 100 mL) 만 첨가하십시오. 일정한 교반으로 ~ 60 °C로 냉각하십시오.
- 좁은 플라이 바이알을 준비하고, 50 μL의 100 mM ATR-에탄올 용액을 각 바이알에 첨가한다.
- 혈청 학적 피펫을 사용하여 플라이 푸드를 좁은 플라이 바이알, 바이알 당 5 mL로 폐기하십시오. 10 초 동안 최대 속도로 소용돌이.
- 바이알을 꽂고 어두운 천에 싸서 빛으로부터 보호하십시오. 바이알을 적어도 12 시간 (하룻밤) 동안 말리십시오.
- 다음날 1.3 단계에서 꾸준히 알을 낳는 파리를 옮깁니다. 바이알을 ATR 함유 식품으로 한다(단계 1.4.4.). 유리병으로 랙을 빛으로부터 보호하십시오.
- 24-48 시간 후 (낳은 알의 수에 따라 다름), 바이알 과잉 인구를 방지하기 위해 부모를 버리십시오.
- 비 Tb 자손을 수집하여 심장 영상에 사용하십시오.
참고 : 애벌레와 번데기 단계에서의 표현형 차이는 그림 2C에서 보여줍니다. 시편 준비 단계의 요약 및 대략적인 타임라인은 그림 3에 나와 있습니다.
2. 초파리 심장의 광유전학적 조절
- 바이알에서 UAS-opsin/Hand-GAL4 애벌레/번데기를 골라 (1.7 단계) 티슈를 착용하고 페인팅 브러시를 사용하여 신체 표면에서 미디어를 부드럽게 닦아냅니다.
- 현미경 슬라이드를 준비하고 중간에 양면 테이프의 작은 조각을 놓습니다.
- 브러시 또는 미세한 핀셋을 사용하여 유충 / 번데기를 테이프 표면에 부드럽게 놓고 등쪽을 위로 향하게하고 슬라이드의 긴 쪽에 수직으로 놓습니다. 애벌레 / 번데기를 테이프 표면에 부착하기 위해 부드러운 압력을 가하십시오.
- 이미징 단계에서 슬라이드를 설정하고 유충 / 번데기가 아래를 향하게하십시오.
- 레이저 제어 소프트웨어로 OCT 광원을 켭니다( 재료 표 참조). 사용자 정의 작성된 SD-OCT 제어 소프트웨어를 열고 미리보기 창을 클릭하십시오.
- SD-OCT 소프트웨어에서 스캔 파라미터를 설정합니다.
참고: 목표는 박동하는 심장의 최적 이미징을 위해 샘플을 정렬하는 것이므로 X 범위와 Y 범위를 선택하면 심장 영역이 포함됩니다. 이 단계에서 A-스캔과 B-스캔의 수는 모두 400개입니다. x 및 y 방향의 범위는 ~ 490 μm 및 ~ 537 μm이며, 심장의 두 직교 단면 (xz 및 yz)을 각각 보여줍니다. - 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 샘플 단계를 제어하여 플라이 심장에 초점을 맞춥니다. 초점 위치를 조정하여 플라이 큐티클 표면에서 빛의 반사를 최소화합니다. 반사를 최소화하기 위해 애벌레 / 번데기 표면에 미네랄 오일을 바르는 것을 고려하십시오.
참고: 오일은 테이프 접착 특성을 손상시켜 동물의 움직임 위험을 증가시킬 수 있습니다. - 비행 심장이 왜곡없이 이미지 창에서 완전히 볼 수 있는지, 조직에 의해 차단되고, 무시할 수없는 그림자와 반사가 될 수 있는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 2.7단계로 돌아갑니다.
- M 모드 OCT 이미지 획득을 위한 스캔 매개변수를 설정합니다.
참고: A-스캔 횟수는 2.7단계에 비해 줄었습니다. 더 빠른 프레임 속도를 위해 비행 심장 (몇 Hz)의 박동 역학을 포착합니다. B 스캔의 수는 M 모드 이미징을 위한 반복 프레임 수를 나타내며, 이는 기록 시간 및 사용 가능한 시스템 메모리에 따라 조정될 수 있습니다. 이 실험에서는 128개의 A-스캔이 ~125프레임/s의 속도를 허용할 수 있으며, 4,000개의 반복된 B-스캔이 기록되어 ~32초의 연속 레코딩을 제공합니다. - 적색광 자극 펄스 없이 다섯 세트의 제어 데이터를 획득하여 휴지 심박수(RHR)를 계산합니다.
- 맞춤형 OCT 제어 소프트웨어에서 간격 자극을 위한 광 펄스를 설계합니다. "설정"에서 설계된 광 펄스 시퀀스를 추가하여 펄스 주파수, 펄스 폭, 자극 지속 시간 및 대기 시간을 다른 자극 프로토콜에 따라 제어합니다.
참고: RHR은 조명 없이 제어 실험에서 측정되며 타키페이싱 및 브래디페이싱 실험(22)을 위해 빛이 펄스되어야 하는 주파수를 계산하는 데 사용됩니다. - 라이트 컨트롤러 소프트웨어( 재료 표 참조)를 열어 적색광 펄스를 생성합니다. "모드 선택"에서 펄스 모드를 선택하십시오. "펄스 프로파일" 설정에 대한 그림을 두 번 클릭하고 팔로워 모드를 선택합니다. OFF 강도를 0으로 유지하고 실제 전력 밀도를 계산할 때 ON 강도 백분율을 설정합니다.
참고: 자극 광 펄스는 2.12단계의 설정에 따라 OCT 제어 소프트웨어의 신호에 의해 트리거됩니다. - OCT 제어 소프트웨어에서 획득을 클릭하여 빛 자극으로 박동하는 초파리 심장의 M 모드 비디오를 획득 하십시오. 측정을 5배 반복합니다.
3. 이미지 분석
- 맞춤 개발 된 플라이 하트 세분화 소프트웨어를 엽니 다.
- 파일 선택을 클릭 한 다음 나타나는 GUI에서 분석 할 파일을 선택하십시오.
- 위쪽 텍스트 상자에 하트 영역의 세로 및 가로 경계를 픽셀 단위로 입력합니다. 크기 조정을 클릭하십시오. 아래쪽의 슬라이더를 사용하여 전체 심장 영역이 표시되고 전체 컬렉션에 대한 전체 상자가 채워지는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 이 프로세스를 반복하고 경계를 조정합니다.
- 예측을 클릭하여 심장 영역을 예측합니다. 이 프로그램은 이제 컬렉션의 모든 슬라이스를 살펴보고 심장 영역을 선택하여 약 3 분이 소요됩니다.
- 예측이 완료되면 HR 플롯 을 클릭합니다. 그러면 시간이 지남에 따라 심장 영역의 플롯을 표시하는 새 창이 열립니다. 올바른 피크 또는 계곡 지역이 선택되었는지 확인하십시오. 펄스를 선택한 다음 HR 을 선택하여 최종 수치를 생성하면 기능 매개 변수가 .csv 파일에 동시에 저장됩니다.
Representative Results
D. 심장 튜브에서 적색광에 민감한 옵신 eNpHR2.0 또는 ReaChR을 발현하는 멜라노가스터 동물은 각각의 UAS-옵신 트랜스제닉 라인과 Hand-GAL4 드라이버 사이의 교차로부터 자손을 획득함으로써 생성되었다. GAL4 구동기의 조직 특이성은 GFP 발현을 영상화함으로써 검증하였다(도 4). 초파리 3 번째 인스타 유충과 초기 번데기 발달 단계는 적색광에 의한 eNpHR2.0 및 ReaChR 활성화의 효과를 입증하기 위해 사용되었습니다. LED로 전달되는 ~ 617nm 적색광 펄스를 설계하여 애벌레 / 번데기를 비추고 심장에서 eNpHR2.0 및 ReaChR을 활성화했습니다. NpHR의 보고된 최대 반응 파장은 ∼580 nm이고 ReaChR의 최대 반응 파장은 ∼600 nm이지만, 617 nm 광 조명은 옵신-발현 심장 조직(22)을 향한 향상된 광 에너지 전달과 함께 더 깊이 침투할 수 있다.
거꾸로 된 현미경 설정에서 등쪽 측면을 아래로 내려 현미경 슬라이드에 장착 된 유충 / 번데기는 A7 신체 세그먼트로 향하는 LED 광선에 의해 조명되었습니다. 신체 단면 이미지의 예는 도 5A 및 도 6A에 도시되어 있다. 심장은 4,000 프레임으로 구성된 비디오 녹화에서 수축하고 팽창하는 원형으로 나타납니다 (보충 비디오 1-6). 서로 다른 심장 상태를 모방하기 위해 네 가지 유형의 광 펄스가 설계되었습니다. 5초 대기 시간 후 10초 동안 지속되는 단일 펄스는 도 5B에 도시된 바와 같이 eNpHR2.0에 의해 유도된 회복 가능한 심정지를 생성하였다. eNpHR2.0에 의해 매개되는 휴지 심박수(RHR)보다 느린 주파수에서의 심장 페이싱의 경우, RHR/2 및 RHR/4와 동일한 페이싱 주파수가 8초 동안 지속되고 그 사이에 6초의 대기 시간을 갖는 2개의 광 펄스 시퀀스가 사용되었다(도 5C). 각 광 펄스 시퀀스의 듀티 사이클은 90%였다. 이 가벼운 자극 요법은 서맥을 연상시키는 심장 상태를 일으켰습니다. ReaChR 활성화로 인해 심박수를 증가시키는 자극 패턴은 펄스 폭이 20ms인 RHR + 0.5Hz, RHR + 1Hz 및 RHR + 1.5Hz의 주파수에서 각각 세 개의 광 펄스 시퀀스로 구성되었습니다(그림 5D). 이 맥박 요법은 빈맥 심장 상태를 일으키는 것을 목표로했습니다. 광출력 밀도는 모든 실험 중에 7.49mW/mm2이었다. 제어 실험을 위해, 조명 조명은 설정되지 않았다.
각각의 실험 변이체는 다섯 번 기록되었다. 플라이 하트의 M 모드 비디오는 FlyNet 2.027을 사용하여 2D 마스크로 처리되었습니다. 이 소프트웨어는 심장 기능 데이터 세트를 생성하기 위해 심장 영역을 자동으로 분할합니다. 이 프로그램은 각 프레임에 심장의 마스크를 제공하며, 필요한 경우 심박수 (HR), 말단 확장기 치수 (EDD) 및 말단 수축기 치수 (ESD), 분수 단축 (FR), 말단 확장기 영역 (EDA), 말단 수축기 영역 (ESA) 등과 같은 박동하는 심장의 기능적 매개 변수의 정확한 정량화를 생성하기 위해 수동으로 추가 교정 할 수 있습니다. 심박수는 시간에 따른 심장 영역을 분석하여 측정됩니다. 광 펄스가 없는 제어 비디오는 각 동물에 대한 기준선 심박수(예를 들어, RHR)를 확립하는데 사용된다.
도 5B 및 도 6B는 각각 유충과 번데기에서 적색광(617nm)을 이용한 손>eNpHR2.0 활성화에 의한 10초 긴 심정지를 보여준다. 붉은 빛이 켜졌을 때, 초파리의 심장은 뛰는 것을 멈추고 빛 조명이 끝날 때까지이 상태로 남아있었습니다. 붉은 빛이 꺼진 후에 심장 기능이 회복되었습니다. 옵신 발현이 없는 동물("옵신 없음" 대조군)은 적색광 조명에 반응하지 않았다(보충 도 2A 및 보충 도 3A). 10초 적색광 조명이 켜지지 않은 Hand>eNpHR2.0 동물을 사용한 대조군 실험("조명 없음" 대조군)은 정상적으로 심장이 뛰는 것을 보여주었다(보충 도 4A 및 보충 도 4C).
Hand>eNpHR2.0 동물을 사용하여, RHR보다 낮은 주파수에서 적색광 펄스를 적용하였다. 심장 수축 주파수는 광 신호에 따라 감소되었다; 이 느린 심박수는 한 종류의 심장 부정맥, 서맥을 모방합니다 (유충과 번데기의 경우 각각 그림 5C 및 그림 6C). 더 느린 심장 간격은 "옵신 없음"(보충 도 2B 및 보충 도 3B) 및 "빛 없음"(보충 도 4A 및 보충 도 4C) 대조군 실험에서 관찰되지 않았다.
심박수 증가는 주어진 동물의 RHR보다 높은 주파수에서 적색광 펄스 트레 인으로 Hand>ReaChR 옵신을 활성화시킴으로써 달성될 수 있다. 상이한 자극 주파수들(예를 들어, RHR + 0.5 Hz, RHR + 1 Hz, RHR + 1.5 Hz)에서 일련의 세 개의 광 펄스 트레인을 핸드>ReaChR 유충 및 번데기 심장에 적용하였다. 획득 된 데이터는 광 펄스에 따른 심박수 증가를 명확하게 보여줍니다 (유충과 번데기의 경우 각각 그림 5D 및 그림 6D ). 이 실험에서 입증 된 심장 상태는 빈맥을 모방합니다. 음성 대조군 실험은 보충도 2C, 보충도 3C 및 보충도 4B, D에 도시되어 있다.
전반적으로, 결과는 D. melanogaster의 트랜스제닉 동물 모델에서 다양한 발달 단계에서 심장 리듬의 비침습적이고 특이적인 광유전학적 조절의 실현 가능성을 입증한다.
그림 1: 초파리 심장 기능의 광유전학적 제어를 위해 617nm LED 모듈과 통합된 OCT 이미징 시스템. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 심장에서 옵신을 발현하는 D. 멜라노가스터 생성 동물. (A) 유전적 교차도. 암컷 핸드-GAL4/TM6 SbTb는 eNpHR2.0을 운반하는 수컷에게 교차되었다. 생성된 Hand-GAL4/eNpHR2.0 자손(적색 별로 표시됨)은 OCT 이미징을 위해 수집되었고, Hand-GAL4/TM6 Sb Tb는 표현형 외관에 기초하여 폐기되었다. (B) 유전 교차도. 암컷 핸드 GAL4 / TM6 SbTb는 ReaChR을 운반 한 남성에게 교차되었습니다. 생성된 Hand-GAL4/ReaChR 자손(적색 별로 표시됨)은 OCT 이미징을 위해 수집되었고, Hand-GAL4/TM6 Sb Tb는 표현형 외관에 따라 폐기되었다. (C) Hand-GAL4/opsin (적색 별)과 Hand-GAL4/TM6 Tb 자손 사이의 표현형 차이. TM6 염색체에 Tb 유전자 돌연변이를 가진 동물은 정상, 비 Tb 유충 또는 번데기에 비해 "tubby"몸 모양을 가지고 있습니다. 왼쪽 패널은 애벌레를 보여줍니다. 오른쪽 패널은 초기 번데기를 보여줍니다. 이미지에는 1mm 마크가 있는 눈금자도 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 이미징 준비 절차의 개략적인 프레젠테이션 및 타임라인. 부모 주식은 비행 병에 보관됩니다. 처녀 암컷과 수컷은 일반 음식 (노란색으로 표시)으로 채워진 좁은 유리병에서 교차합니다. 활발히 알을 낳는 파리는 ATR 함유 배지 (갈색으로 표시됨) 바이알로 옮겨집니다. 자손이 발달하는 바이알은이 단계에서 어둠 속에 보관해야합니다. 제 3 회 인스타 유충과 초기 번데기는 이미징을 위해 바이알 벽에서 수집됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: D. 멜라노가스터는 Hand-GAL4(BDSC 48396)에 의해 구동되는 UAS-GFP(BDSC 6658)를 발현하는 초기 번데기이다. 형광 패턴은 Hand-GAL4 드라이버의 심장 특이성을 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: D. melanogaster 유충의 심장 마비, 서맥 및 빈맥의 시뮬레이션. (A) 애벌레 신체 단면의 OCT 이미지. 심장은 신체 표면 아래에 원으로 나타납니다. (B) 회복 가능한 심장 마비의 그래픽 프리젠 테이션. 상단 패널은 적색 조명 조명의 타이밍 (X 축) (Y 축, 광원 전력 레벨 비율)을 보여줍니다. 중간 패널은 시간에 따른 심장 영역(Y축, 제곱 마이크로미터)의 변화(X축)를 나타냅니다. 하단 패널은 시간에 따른 심박수 변화(Y축, 헤르츠)(X축)를 보여줍니다. (C) eNpHR2.0 매개 회복 가능한 서맥의 그래픽 프리젠 테이션. 상단 패널은 적색 광 조명의 펄스를 보여 주며 RHR의 50 %와 RHR의 25 %의 서맥의 두 기간을 유도합니다. 심장 영역과 심박수 변화는 각각 중간 및 하부 패널에 표시됩니다. (D) 활성화된 ReaChR에 의한 심장 간격의 그래픽 프리젠테이션. 상단 패널은 RHR + 0.5Hz, RHR + 1Hz 및 RHR + 1.5Hz 주파수에서 발생하는 일련의 20ms 적색광 펄스를 보여줍니다. 심장 수축은 중간 및 하부 패널에 표시된 것처럼 가벼운 펄스 주파수를 따릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: D. melanogaster 번데기의 심장 마비, 서맥 및 빈맥의 시뮬레이션 . (A) 번데기 신체 단면의 OCT 이미지. 심장은 신체 표면 아래에 원으로 나타납니다. (B) 회복 가능한 심장 마비의 그래픽 프리젠 테이션. 상단 패널은 적색 조명 조명의 타이밍 (X 축) (Y 축, 광원 전력 레벨 비율)을 보여줍니다. 중간 패널은 시간에 따른 심장 영역(Y축, 제곱 마이크로미터)의 변화(X축)를 나타냅니다. 하단 패널은 시간에 따른 심박수 변화(Y축, 헤르츠)(X축)를 보여줍니다. (C) eNpHR2.0 매개 회복 가능한 서맥의 그래픽 프리젠 테이션. 상단 패널은 적색 광 조명의 펄스를 보여 주며 RHR의 50 %와 RHR의 25 %의 서맥의 두 기간을 유도합니다. 중간 및 하부 패널은 각각 심장 영역과 심박수 변화를 보여줍니다. (D) 활성화된 ReaChR에 의한 심장 간격의 그래픽 프리젠테이션. 상단 패널은 RHR + 0.5Hz, RHR + 1Hz 및 RHR + 1.5Hz 주파수에서 일련의 20ms 적색광 펄스를 보여줍니다. 심장 수축은 중간 및 하부 패널에 표시된 것처럼 광 펄스의 주파수를 따릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: TM3 Sb 밸런서 염색체를 TM6 Sb Tb로 대체하는 유전자 교차. 버진 암컷 핸드-GAL4 w+/TM3 Sb를 nub-GAL4NP3537 tub-GAL80ts w+/TM6 Sb Tb 수컷과 교차시켰다. 처녀 암컷 및 수컷을 포함하는 손-GAL4 w+/TM6 Sb Tb 자손을 선별하였다(욕조 체형과 결합된 색소성 눈에 대한 스크리닝). 선택된 파리는 안정적인 재고를 확보하기 위해 자체 교차되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2 : 대조 실험에서 야생형 (wt) 유충의 심장 리듬은 적색 조명 조명시 변하지 않습니다. (A) wt 유충에서 적색광 조명 동안 심장 마비가 관찰되지 않았다. 상단 패널에는 M 모드 심장 이미지가 표시됩니다. 빨간색 선은 조명 타이밍을 나타냅니다. 중간 및 하부 패널은 32 s 이미징 시간 동안 심장 영역과 심박수를 보여줍니다. (B,C) 붉은 빛 펄스는 wt 애벌레의 심박수를 변화시키지 않습니다. 상단 패널에는 M 모드 심장 이미지가 표시됩니다. 빨간색 선은 조명 타이밍을 나타냅니다. 중간 및 하부 패널은 32 s 이미징 시간 동안 심장 영역과 심박수를 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3 : 대조 실험에서 야생형 (wt) 번데기의 심장 리듬은 적색 조명 조명시 변하지 않습니다. (A) wt 유충에서 적색광 조명 동안 심장 마비가 관찰되지 않았다. 상단 패널에는 M 모드 심장 이미지가 표시됩니다. 빨간색 선은 조명 타이밍을 나타냅니다. 중간 및 하부 패널은 32 s 이미징 시간 동안 심장 영역과 심박수를 보여줍니다. (B,C) 붉은 빛 펄스는 wt 번데기의 심박수를 변화시키지 않습니다. 상단 패널에는 M 모드 심장 이미지가 표시됩니다. 빨간색 선은 조명 타이밍을 나타냅니다. 중간 및 하부 패널은 32 s 이미징 시간 동안 심장 영역과 심박수를 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 4: D. 멜라노가스터 유충 및 번데기 발현 Hand> eNpHR2.0 또는 Hand>ReaChR은 적색광 조명 없이 OCT 이미징 동안 유의한 HR 변화를 나타내지 않는다. (A) 손>eNpHR2.0 유충의 심박수. (B) Hand>ReaChR 유충의 심박수. (C) 손>eNpHR2.0 번데기의 심박수. (D) 손>ReaChR 번데기의 심박수. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 1 : 활성화 된 eNpHR2.0은 D. melanogaster 애벌레에서 심장 마비를 일으 킵니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 2 : 활성화 된 eNpHR2.0은 D. melanogaster 번데기에서 심장 마비를 일으 킵니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 3 : eNpHR2.0 매개 회복 가능한 서맥 D. melanogaster 유충. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 4 : eNpHR2.0 매개 회복 가능한 서맥 D. melanogaster 번데기. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 5 : D. melanogaster 애벌레에서 활성화 된 ReaChR에 의한 심장 진정. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 6 : D. melanogaster 번데기에서 활성화 된 ReaChR에 의한 심장 박동. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
옵신의 발현이 심장뿐만 아니라 주변 근육 조직에서도 주도 된 이전 보고서와 비교할 때, 본 연구는 심장 특정 운전자 인 Hand-GAL4를 사용하여보고합니다. 광유전학적 심장 조절에 사용되는 이 새로운 손> 옵신 유전자 구성은 이전에 보고된 결과를 더욱 확인하고 더 나은 초파리 심혈관 연구 모델을 확립한다.
미디어 준비는 실험의 성공을 위해 필수적입니다. 옵신 단백질은28을 기능하기 위해 리간드, 모든 트랜스 망막 (ATR)을 필요로 한다. 파리는 충분한 ATR을 생산하지 못하기 때문에 ATR을 비행 매체에 보충해야합니다. 이 연구에서, 이전에 보고된 인스턴트 식품은 세미-정의 미디어(Semi-Defined media)(29)로 대체되었다. ATR의 균일한 분포를 보장하기 위해 ATR 함유 배지의 새로운 레시피가 도입되었습니다. ATR은 물에 용해되지 않습니다; 에탄올계 100 mM ATR 스톡이 수성 배지에 첨가될 때, 따뜻한 세미-정의 배지를 함유하는 바이알을 볼텍싱함으로써 분산된다. 또한, 이전에 보고된 ATR 농도는 eNpHR2.0의 경우 10 mM, ReaChR22의 경우 3 mM에서 둘 다에 대해 1 mM 최종 농도로 감소되었다. 이 농도는 적절한 eNpHR2.0 및 ReaChR 기능을 보장하기에 충분합니다.
실험 성공의 중요한 구성 요소는 FlyNet 2.027을 사용한 향상된 데이터 처리입니다. 실험실은 자동화 된 비행 심장 세분화 알고리즘의 계산 효율성과 정확성을 향상시키기 위해이 소프트웨어를 계속 개발해 왔습니다. 이 소프트웨어에 의해 생성 된 횡단면 마스크는 분수 단축 및 심벽 속도와 같은 초파리 생리 학적 데이터를 도출하는 데 사용됩니다. 이 접근 방식은 최소한의 인간 감독으로 효율적인 데이터 분석을 가능하게하여 대형 비행 심장 영상 데이터 세트에 대한 심장 기능을 특성화하는 것이 더 빠르고 신뢰할 수 있도록합니다.
심근 경색은 여전히 사망의 주요 원인으로 남아 있으며, 심근 허혈은 심부전의 모든 사례의 3 분의 2에 기여하며, 이는 미국에서 사망률과 이환의 주요 원인 중 빠르게 부상하고 있습니다30. 새로운 치료제 및 의료 기기의 개발은 생리 학적 및 생화학 적 수준에서 심장 장애의 메커니즘에 대한 깊은 지식을 필요로합니다. 이러한 목표는 모델 유기체의 도움으로 달성 될 수 있습니다. D. melanogaster는 가장 신뢰할 수 있고 효율적인 모델31,32,33,34,35 중 하나로 자리 매김했습니다. 이 연구는 비침습적 광유전학적 접근법에 의해 유도된 시뮬레이션된 초파리 심장 장애 모델을 생성하였다. 비침습적 광 심장 페이싱 기술의 개발은 전통적인 전기 심장 페이싱 장치에 대한 대안을 개발하기위한 기반을 제공합니다. OCT를 사용하여 심장 기능을 실시간으로 관찰하면 약물 후보 선별을 포함한 고급 조사를 위해 초파리 모델에서 관련 심장 생리학을 정확하게 특성화하는 연구가 가능합니다. OCT 이미징은 ~ 1mm의 침투 깊이를 가지며, 이는 초파리 심장 연구에 적합하지만 더 큰 동물 모델에서 심장 기능을 특성화하는 데 사용이 제한됩니다. 또한, 초파리 연구를 포유류 모델로 직접 번역하는 것은 어려운 과제입니다. 옵신의 민감도를 개선하고 심혈관 연구를 위해 제브라피쉬, 생쥐, 쥐 및 인간 심장 오가노이드를 포함한 다양한 모델 시스템으로 변환하기 위해 새로운 광유전학 도구를 개발해야 합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 Andrey Komarov, Yuxuan Wang 및 Jiantao Zhu에게 데이터 분석에 도움을 준 것에 대해 감사하고 Zhou 실험실 회원들에게 귀중한 토론에 감사드립니다. 저우 박사의 실험실에서의 작업은 세인트루이스의 워싱턴 대학의 창업 기금, 국립 보건원 (NIH) 보조금 R01-EB025209 및 R01-HL156265 및 클레이코 재단 혁신 연구 상.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| All-trans retinal | Cayman Chemicals | 18449 | |
| Bacto Peptone | Gibco | 02-10-2025 | |
| BioLED Light Source Control Module, 4-channel | Migtex Systems | BLS-SA04-US | Part of the optogenetic stimulation module |
| Broadband Light Source Module | Superlum | cBLMD-T-850-HP | Part of the SD-OCT imaging system |
| Cobra-S 800 OCT Spectrometers | Wasatch Photonics | CS800-840/180-80-OC2K-U3 | Part of the SD-OCT imaging system |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professtional | 34155 | tissues |
| Drosophila agar | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Drosophila culture bottles | Genesee Scientific | 32-131 | |
| FlyNet 2.0 Software | Z-Lab | Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab | |
| High-Power LED Collimator Sources | Migtex Systems | BLS-LCS-0617-03-22 | Part of the optogenetic stimulation module |
| Inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-106 | |
| Microscope slides | AmScope | BS-72P | |
| Narrow plugs for Drosophila culture | Genesee Scientific | 59-200 | |
| Narrow vials for Drosophila culture | Genesee Scientific | 32-116SB | |
| Permanent double-sided tape | Scotch | ||
| Plugs for Drosophila bottles | Genesee Scientific | 59-194 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386-1L | |
| SD-OCT control software | Z-Lab | Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab | |
| SD-OCT imaging and optogenetic pacing system | Z-Lab | Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM) | |
| Sucrose | Carolina | 89-2871 | |
| w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 41752 | eNpHR2.0 transgenic line |
| w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 53748 | ReaChR transgenic line |
| w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 48396 | Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment |
| y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock #6658 | GFP reporter line |
| Yeast extract | Lab Scientific bioKEMIX | 978-907-4243 |
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